CN111856016B - 一种涎液化糖链抗原测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种涎液化糖链抗原测定试剂盒，包括胶乳试剂，所述胶乳试剂包括第一KL‑6单克隆抗体胶乳试剂和第二KL‑6单克隆抗体胶乳试剂；将胶乳微球使用pH5.5～6.0的活化缓冲液活化，后调节pH值至7.0～7.4获得第一活化微球溶液，与第一KL‑6单克隆抗体偶联获得第一偶联反应液；将胶乳微球使用pH6.5～7.0的活化缓冲液活化，后调节pH值至7.5～8.0获得第二活化微球溶液，与所述第二KL‑6单克隆抗体偶联获得第二偶联反应液；将第一偶联反应液和第二偶联反应液分别封闭，后固液分离获得的固体重悬，获得所述第一和第二KL‑6单克隆抗体胶乳试剂。该试剂盒准确度较高，线性范围较宽，有利于放大生产。

Description

一种涎液化糖链抗原测定试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种涎液化糖链抗原测定试剂盒及其制备方法。
背景技术
近年来，随着医学各种检查技术的不断发展，尤其是肺部影像学如高分辨CT在临床中的广泛应用，提高了ILD患者早期诊断准确率，但ILD治疗并未取得实质性进展，部分患者的预后差，死亡率高。早期诊断和治疗可改善患者预后，故目前除临床已用于ILD诊断的肺CT、肺功能、血气分析、支气管镜及肺活检等手段外，与ILD疾病发展及转归有关的血清学检测亦成为研究热点，其中涎液化糖链抗原-6(KL-6)被认为是比较有前景的血清学指标，目前较多研究认为KL-6与ILD病变的发生、进展、药物疗效及预后均有明显相关性。目前在日本已经确立KL-6了诊断间质性肺炎的临床医学意义，使用KL-6指标诊断间质性肺炎已经得到广泛应用。
KL-6是5000kDa以上的MUC黏蛋白中的一种糖类蛋白，在肺部，主要由Ⅱ型肺泡上皮细胞产生。KL-6对判断Ⅱ型肺泡上皮细胞的功能具有特异性。若肺部基底膜的损害，可致血管通透性增加，使KL-6入血。血清KL-6可反映肺泡损伤，II型肺泡细胞再生和多种间质性肺疾病的活动度。KL-6水平的升高与组织的纤维化损伤程度成正比。近年的多项研究报道了KL-6高水平表达可能与间质性肺疾病(ILD)、急性肺损伤、放射性肺炎、病毒性肺炎、药物相关性间质性肺炎、肿瘤等疾病相关联,其作用可能是促进成纤维细胞增殖和迁徙,从而影响纤维化的发生和发展。
目前临床上广泛使用胶乳免疫比浊法检测KL-6的方法有：(1)方法1：将两株单抗先混合起来，然后一起活化偶联；然而该种方法的准确度和精密度均不高；因为每株单抗有它自己合适的活化偶联条件，如果两株单抗放在同一条件下，一起活化偶联，则不能把每株单抗最合适的性能展现出来，从而影响准确度和精密度。(2)方法2：将两株单抗分别偶联在大胶乳和小胶乳上来增加线性和灵敏度，该种方法使用两株单抗偶联大小胶乳(同一条件)虽然可以增加灵敏度和线性范围，但是工艺里面涉及多次离心和超声步骤，不利于放大生产。
因此，如何开发一种准确度和精密度高，同时可以省去了离心、超声步骤，有利于放大生产的涎液化糖链抗原测定试剂盒及其制备方法，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明目的是提供一种涎液化糖链抗原测定试剂盒，运用本发明的技术所制备的胶乳免疫比浊试剂准确度、线性均较高，且其它各项性能结果也能满足临床使用需求；同时省去了离心、超声步骤，有利于放大生产。
为了实现上述目的，本发明提供了一种涎液化糖链抗原测定试剂盒，所述试剂盒包括胶乳试剂，所述胶乳试剂包括第一KL-6单克隆抗体胶乳试剂和第二KL-6单克隆抗体胶乳试剂；所述第一KL-6单克隆抗体胶乳试剂和所述第二KL-6单克隆抗体胶乳试剂的制备方法为：
获得活化剂、pH5.5～6.0的活化缓冲液、pH6.5～7.0的活化缓冲液、第一KL-6单克隆抗体、第二KL-6单克隆抗体、pH调节液、封闭液和复溶溶液；所述pH5.5～6.0的活化缓冲液和所述pH6.5～7.0的活化缓冲液均为50mmol/L～100mmol/L硼酸缓冲液；所述pH调节液为20mmol/L～100mmol/L硼酸钠缓冲溶液；
将所述胶乳微球使用所述活化剂和所述pH5.5～6.0的活化缓冲液活化，后使用所述pH调节液调节pH值至7.0～7.4，获得第一活化微球溶液；将所述第一活化微球溶液与所述第一KL-6单克隆抗体混匀进行偶联反应，获得第一偶联反应液；将所述第一偶联反应液使用所述封闭液封闭，后离心和/或固液分离，获得第一固体，将所述第一固体使用所述复溶溶液重悬后混匀，获得所述第一KL-6单克隆抗体胶乳试剂；
将所述胶乳微球使用所述活化剂和所述pH6.5～7.0的活化缓冲液活化，后调节pH值至7.5～8.0，获得第二活化微球溶液；将所述第二活化微球溶液与所述第二KL-6单克隆抗体混匀进行偶联反应，获得第二偶联反应液；将所述第二偶联反应液使用所述封闭液封闭，后离心和/或固液分离，获得第二固体，将所述第二固体用所述复溶溶液重悬后混匀，获得所述第二KL-6单克隆抗体胶乳试剂。
进一步地，所述第一KL-6单克隆抗体胶乳试剂和第二KL-6单克隆抗体胶乳试剂的重量比为1：0.8～1.2；所述第一KL-6单克隆抗体的货号为DM-KL-6mab-1，第二KL-6单克隆抗体的货号为DM-KL-6mab-2。
进一步地，所述胶乳微球的粒径为200nm～250nm。
进一步地，所述活化剂为EDC溶液。
进一步地，所述封闭液包括封闭液1和封闭液2，所述封闭液1为吐温-20，所述封闭液2为BSA。
进一步地，所述复溶溶液为25mmol/L～50mmol/L HEPES，0.5g/L EDTA-2Na，5％海藻糖，0.05％吐温-20，0.1％PC-300，pH值为7.0～7.5。
进一步地，所述获得所述第一KL-6单克隆抗体胶乳试剂时，所述胶乳微球与pH5.5～6.0的活化缓冲液的体积比为1：2～4；所述获得所述第二KL-6单克隆抗体胶乳试剂时，所述胶乳微球与pH6.5～7.0的活化缓冲液的体积比为1：2～4。
进一步地，所述试剂盒还包括样本预处理试剂，所述样本预处理试剂包括如下的终浓度组分为：100mmol/L 2-(N-***啉)乙磺酸(MES)，0.08mol/L氯化钠，0.2％Thesit，0.1％叠氮化钠，pH 6～8。
进一步地，所述试剂盒还包括校准试剂，所述校准试剂包括不同浓度梯度的涎液化糖链抗原和基质液，所述基质液包括磷酸盐缓冲液，EDTA二钠或EDTA二钾，丙三醇，海藻糖，BSA，盐类物质，氯化钾中的至少一种。
本发明还提供了一种涎液化糖链抗原测定试剂盒的制备方法，采用所述的配方配制而得。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供的一种涎液化糖链抗原测定试剂盒及其制备方法，将2株KL-6单克隆抗体分开偶联在胶乳微球上，最后将两组胶乳试剂混合起来，即为最终的KL-6胶乳试剂，因为每株单抗有它自己合适的活化偶联条件，将两株单抗分别用其最适宜的条件进行活化偶联，减少胶乳微凝状态，提高了试剂的准确度、精密度、线性范围，具体地：第一KL-6单克隆抗体的包被时，采用pH5.5～6.0的偏酸性条件进行活化，pH7.0～7.4的偏碱性条件偶联；第二KL-6单克隆抗体的包被时，采用pH6.5～7.0的偏酸性条件进行活化，pH7.5～8.0的偏碱性条件偶联；从而使得活化酯键更容易断裂才能更好地与氨基反应，采用缓冲对的形式(50mmol/L～100mmol/L硼酸缓冲液；以及20mmol/L～100mmol/L硼酸钠缓冲溶液)来调整活化pH与偶联pH的差异，这样省去了离心、超声步骤，有利于放大生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例1提供的一种涎液化糖链抗原测定试剂盒的校准曲线图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种涎液化糖链抗原测定试剂盒，所述试剂盒包括胶乳试剂，所述胶乳试剂包括第一KL-6单克隆抗体胶乳试剂和第二KL-6单克隆抗体胶乳试剂；其中，所述第一KL-6单克隆抗体胶乳试剂和所述第二KL-6单克隆抗体胶乳试剂的制备方法为：
获得活化剂、pH5.5～6.0的活化缓冲液、pH6.5～7.0的活化缓冲液、第一KL-6单克隆抗体、第二KL-6单克隆抗体、pH调节液、封闭液和复溶溶液；所述pH5.5～6.0的活化缓冲液和所述pH6.5～7.0的活化缓冲液均为50mmol/L～100mmol/L硼酸缓冲液；所述pH调节液为20mmol/L～100mmol/L硼酸钠缓冲溶液；
将所述胶乳微球使用所述活化剂和所述pH5.5～6.0的活化缓冲液活化，获得胶乳溶液，后使用所述pH调节液调节pH值至7.0～7.4，获得第一活化微球溶液；将所述第一活化微球溶液与所述第一KL-6单克隆抗体混匀进行偶联反应，获得第一偶联反应液；将所述第一偶联反应液使用所述封闭液封闭，后离心和/或固液分离，获得第一固体，将所述第一固体使用所述复溶溶液重悬后混匀，获得所述第一KL-6单克隆抗体胶乳试剂；
将所述胶乳微球使用所述活化剂和所述pH6.5～7.0的活化缓冲液活化，获得胶乳溶液，后调节pH值至7.5～8.0，获得第二活化微球溶液；将所述第二活化微球溶液与所述第二KL-6单克隆抗体混匀进行偶联反应，获得第二偶联反应液；将所述第二偶联反应液使用所述封闭液封闭，后离心和/或固液分离，获得第二固体，将所述第二固体用复溶溶液重悬后混匀，获得所述第二KL-6单克隆抗体胶乳试剂。
本发明将2株KL-6单克隆抗体分开偶联在胶乳微球上，最后将两组胶乳试剂混合起来，即为最终的KL-6胶乳试剂，具体地：第一KL-6单克隆抗体的包被时，采用pH5.5～6.0的偏酸性条件进行活化，pH7.0～7.4的偏碱性条件偶联；第二KL-6单克隆抗体的包被时，采用pH6.5～7.0的偏酸性条件进行活化，pH7.5～8.0的偏碱性条件偶联；这样使得每株单抗有更合适的活化偶联条件，将两株单抗分别用其最适宜的条件进行活化偶联，减少胶乳微凝状态，提高了试剂的准确度、精密度、线性范围，且使得活化酯键更容易断裂才能更好地与氨基反应，采用缓冲对的形式来调整活化pH与偶联pH的差异，这样省去了离心、超声步骤，有利于放大生产。
本发明中第一KL-6单克隆抗体的货号为DM-KL-6mab-1，第二KL-6单克隆抗体的货号为DM-KL-6mab-2。
本发明在第一KL-6单克隆抗体的包被时，采用pH5.5～6.0的偏酸性条件进行活化，pH7.0～7.4的偏碱性条件偶联的原因为：这样有利于第一KL-6单克隆抗体更好的结合到胶乳微球上，制备出来的试剂准确度，精密度，线性范围更优；活化时若pH小于5.5，制备出来的试剂高端测值偏低，线性范围达不到要求，若pH大于6.0制备出来的试剂精密度及线性范围均达不到要求；偶联时若pH小于7.0制备出来的试剂准确度及线性范围均达不到要求，若pH大于7.4制备出来的试剂准确度及线性范围均达不到要求。
本发明在第二KL-6单克隆抗体的包被时，采用pH6.5～7.0的偏酸性条件进行活化，pH7.5～8.0的偏碱性条件偶联的原因为：这样有利于第二KL-6单克隆抗体更好的结合到胶乳微球上，制备出来的试剂准确度，精密度，线性范围更优；活化时若pH小于6.5制备出来的试剂精密度及线性范围均达不到要求，若pH大于7.0则胶乳活化效率降低，制备出来的试剂灵敏度及线性范围均达不到要求不；偶联时若pH小于7.5制备出来的试剂准确度及线性范围均达不到要求，若pH大于8.0制备出来的试剂线性范围达不到要求。
作为可选的实施方式，所述第一KL-6单克隆抗体胶乳试剂和第二KL-6单克隆抗体胶乳试剂的重量比为1：0.8～1.2。
作为可选的实施方式，所述胶乳微球的粒径为200nm～250nm。
作为可选的实施方式，所述活化剂为EDC溶液。
作为可选的实施方式，所述封闭液包括封闭液1和封闭液2，所述封闭液1为吐温-20，所述封闭液2为BSA。
作为可选的实施方式，所述复溶溶液为25mmol/L～50mmol/L HEPES，0.5g/LEDTA-2Na，5％海藻糖，0.05％吐温-20，0.1％PC-300，pH值为7.0～7.5。
作为可选的实施方式，所述胶乳微球与pH5.5～6.0的活化缓冲液的体积比为1：2～4。
作为可选的实施方式，所述试剂盒还包括样本预处理试剂，所述样本预处理试剂包括如下的终浓度组分为：100mmol/L 2-(N-***啉)乙磺酸(MES)，0.08mol/L氯化钠，0.2％Thesit，0.1％叠氮化钠，pH 6～8。
作为可选的实施方式，所述试剂盒还包括校准试剂，所述校准试剂包括不同浓度梯度的涎液化糖链抗原和基质液，所述基质液包括磷酸盐缓冲液，EDTA二钠或EDTA二钾，丙三醇，海藻糖，BSA，盐类物质，氯化钾中的至少一种。
所述校准品的校准曲线如图1所示。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种涎液化糖链抗原测定试剂盒的制备方法，采用所述的配方配制而得，具体地：
样本预处理试剂(即试剂R1)：样本处理液，主要作用是为了稀释样本，同时处理掉样本中的背景干扰，提高检测结果的准确性。
胶乳试剂(即试剂R2)：核心反应组分，包括包被抗体的胶乳微球颗粒，本发明中具体包括第一KL-6单克隆抗体胶乳试剂和第二KL-6单克隆抗体胶乳试剂。
校准品\质控品：主要是对试剂进行测试前的质量控制，常为液体或干粉状态。用于获得标准曲线。
1、样本预处理试剂(即试剂R1)的制备
2、胶乳试剂(即试剂R2)的制备
(1)材料的准备
胶乳微球：粒径为200～250nm，固体含量为10％。
KL-6抗体：为小鼠单克隆抗体。第一KL-6单克隆抗体的货号为DM-KL-6mab-1，第二KL-6单克隆抗体的货号为DM-KL-6mab-2。
溶液的制备
a、活化缓冲液：50～100mmol/L硼酸缓冲液，pH值为5.5～7.0。
b、硼酸钠缓冲溶液：20～100mmol/L，用于调整活化结束后的胶乳pH，调至7.0～8.0
c、活化剂：按照5mg/ml的浓度称量EDC，现配现用。
d、封闭液1：1％吐温-20
e、封闭液2：10％BSA。
f、复溶溶液：25-50mmol/L HEPES，0.5g/L的EDTA-2Na，5％海藻糖，0.05％吐温-20，0.1％PC-300，pH值为7.0～7.5。
(2)包被第一KL-6单克隆抗体制备第一KL-6单克隆抗体胶乳试剂
①取粒径为200～250nm的胶乳微球1mL与活化缓冲液pH5.5～6.0(溶液a)按体积比1：2～4进行混合后混匀；
②向步骤(1)中加入0.5～1mL的5mg/ml的活化剂(溶液c)，混匀，并置于恒温摇床中反应20～30min，温度范围：30～37℃；
③向步骤(2)中加入硼酸钠溶液(溶液b)，调整胶乳溶液的pH值至7.0～7.4；
④向步骤(3)中加入0.8～1mg第一KL-6单克隆抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应2～3h，温度范围：30～37℃；
⑤向步骤(4)中加入0.5mL～1mL的封闭液1(1％，吐温-20)，混匀，并置于恒温摇床中反应0.5～1h，温度范围：30～37℃；
⑥向步骤(5)中加入0.5mL～1mL的封闭液2(10％，BSA)，混匀，并置于恒温摇床中反应0.5～1h，温度范围：30～37℃；
⑦反应完成后离心并去除上清液，转速为16000rpm，离心时间为40分钟。
⑧去除上清液，并用50～70mL复溶溶液复溶，重悬胶乳微球，重悬过程中可以使用细胞破碎仪辅助重悬。
(3)包被第二KL-6单克隆抗体制备第一KL-6单克隆抗体胶乳试剂
①取粒径为200～250nm的胶乳微球1mL与活化缓冲液pH6.5～7.0(溶液a)按体积比1：2～4进行混合后混匀；
②向步骤①中加入0.5～1mL的5mg/ml的活化剂(溶液c)，混匀，并置于恒温摇床中反应20～30min，温度范围：30～37℃；
③向步骤②中加入硼酸钠溶液(溶液b)，调整胶乳溶液的pH值至7.5～8.0；
④向步骤③中加入0.8-1.0mg第二KL-6单克隆抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应2～3h，温度范围：30～37℃；
⑤向步骤④中加入0.5mL～1mL的封闭液1(1％，吐温-20)，混匀，并置于恒温摇床中反应0.5～1h，温度范围：30～37℃；
⑥向步骤⑤中加入0.5mL～1mL的封闭液2(10％，BSA)，混匀，并置于恒温摇床中反应0.5～1h，温度范围：30～37℃；
⑦反应完成后离心并去除上清液，转速为16000rpm，离心时间为40分钟。
⑧去除上清液，并用50mL～70mL复溶溶液复溶，重悬胶乳微球，重悬过程中可以使用细胞破碎仪辅助重悬。
(4)胶乳试剂的制备
将所述制备好的第一KL-6单克隆抗体胶乳试剂与第二KL-6单克隆抗体胶乳试剂按体积比1：(0.8～1.2)的比例混合制备得到胶乳试剂。
3、校准试剂的制备
(1)校准品缓冲液的配制
(2)用校准品缓冲液稀释KL-6重组蛋白，配置校准品浓度点依次为：200U/mL、1000U/mL、2000U/mL、4000U/mL、8000U/mL。
本发明的一种涎液化糖链抗原测定试剂盒的检测原理为：
该试剂盒采用胶乳免疫比浊法研制而成，基本原理是将KL-6单克隆抗体交联于胶乳颗粒上，与待测样本中KL-6在液相中相遇，形成抗原-抗体复合物，在线性范围内形成的浊度成一定比例。在570nm波长下，通过检测的浊度与通过同样处理的校准品比较，即可计算出样本中唾液酸化糖链抗原(KL-6)含量。
本发明的一种涎液化糖链抗原测定试剂盒的使用方法为：
将涎液化糖链抗原试剂盒，用全自动生化仪进行测试，参数如下，在570nm主波长下，先加入样本3ul，再加入300ul样本预处理试剂(即试剂R1)，37℃孵育约5min，加入100ul胶乳试剂(即试剂R2)，约30s读取吸光度A1，约4min后读取吸光度A2，计算吸光度的差值△A＝A2-A1；使用配套校准品进行多点定标，得到定标曲线并进行线性拟合，则样本浓度(单位U/mL)可通过其检测的吸光度差值在定标曲线上计算得到。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的涎液化糖链抗原测定试剂盒的制备方法进行详细说明。
实施例1
1、R1试剂的配制
2、R2试剂的制备：
(1)溶液制备
a.活化缓冲液1：100mmol/L硼酸缓冲液，pH值为5.5。
活化缓冲液2：100mmol/L硼酸缓冲液，pH值为6.5。
b.硼酸钠缓冲溶液：100mmol/L,用于调整活化结束后的胶乳pH
c.活化剂：按照5mg/ml的浓度称量EDC，现配现用。
d.封闭液1：1％吐温-20
e.封闭液1：10％BSA。
f.复溶溶液：50mmol/L HEPES，0.5g/L的EDTA-2Na，5％海藻糖，0.05％吐温-20，0.1％PC-300，pH值为7.0。
(2)第一KL-6单克隆抗体的包被
①取粒径为230nm的胶乳微球1mL与溶液a(活化缓冲液1pH5.5)按体积比1：3进行混合后混匀；
②向步骤①中加入0.6mL的5mg/ml的活化剂(溶液c)，混匀，并置于恒温摇床中反应25min，温度：37℃；
③向步骤②中加入硼酸钠溶液(溶液b)，调整胶乳溶液的pH值至7.0；
④向步骤③中加入0.9mg第一KL-6单克隆抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应2h，温度：37℃；
⑤向步骤④中加入0.8mL的封闭液1(1％，吐温-20)，混匀，并置于恒温摇床中反应1h，温度：37℃；
⑥向步骤⑤中加入0.8mL的封闭液2(10％，BSA)，混匀，并置于恒温摇床中反应1h，温度：37℃；
⑦反应完成后离心并去除上清液，转速为16000rpm，离心时间为40分钟。
⑧去除上清液，并用60mL R2组分缓冲液复溶，重悬胶乳微球，重悬过程中可以使用细胞破碎仪辅助重悬。
(3)第二KL-6单克隆抗体的包被
①取粒径为230nm的胶乳微球1mL与溶液a(活化缓冲液2pH6.5)按体积比1：3进行混合后混匀；
②向步骤①中加入0.6mL的5mg/ml的活化剂(溶液c)，混匀，并置于恒温摇床中反应25min，温度：37℃；
③向步骤②中加入硼酸钠溶液(溶液b)，调整胶乳溶液的pH值至7.5；
④向步骤③中加入0.9mg第二KL-6单克隆抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应2h，温度：37℃；
⑤向步骤④中加入0.8mL的封闭液1(1％，吐温-20)，混匀，并置于恒温摇床中反应1h，温度：37℃；
⑥向步骤⑤中加入0.8mL的封闭液2(10％，BSA)，混匀，并置于恒温摇床中反应1h，温度：37℃；
⑦反应完成后离心并去除上清液，转速为16000rpm，离心时间为40分钟。
⑧去除上清液，并用60mL R2组分缓冲液复溶，重悬胶乳微球，重悬过程中可以使用细胞破碎仪辅助重悬。
(4)胶乳试剂的制备
第一KL-6单克隆抗体胶乳试剂与第二KL-6单克隆抗体胶乳试剂按体积比1：1的比例混合。
实施例2
在实施例1的基础上，第一KL-6单克隆抗体的包被使用活化液pH6.0。活化结束后，调整胶乳溶液的pH值至7.4。其它组分和工艺与实施例1相同。
实施例3
在实施例1的基础上，第二KL-6单克隆抗体的包被使用活化液pH7.0。活化结束后，调整胶乳溶液的pH值至8.0。其它组分和工艺与实施例1相同。
实施例4
在实施例1的基础上，胶乳微球粒径为200nm，其它组分和工艺与实施例1相同。
实施例5
在实施例1的基础上，第一KL-6单克隆抗体包被时，活化缓冲液pH为5.8，胶乳溶液pH为7.2；第二KL-6单克隆抗体包被时，活化缓冲液pH为6.8，胶乳溶液pH为7.8；其它组分和工艺与实施例1相同。
对比例1
按照实施例1中第一KL-6单克隆抗体的包被方法，将第一KL-6单克隆抗体和第二KL-6单克隆抗体两株单抗混合起来，一起活化偶联。其它组分和工艺与实施例1相同。
对比例2
按照实施例1中第二KL-6单克隆抗体的包被方法，将第一KL-6单克隆抗体和第二KL-6单克隆抗体两株单抗混合起来，一起活化偶联。其它组分和工艺与实施例1相同。
对比例3
按照实施例1中第一KL-6单克隆抗体的包被方法，将第一KL-6单克隆抗体和第二KL-6单克隆抗体两株单抗分开包被，最后胶乳试剂按体积比1：1的比例混合。其它组分和工艺与实施例1相同。
对比例4
按照实施例1中第二KL-6单克隆抗体的包被方法，将第一KL-6单克隆抗体和第二KL-6单克隆抗体两株单抗分开包被，最后胶乳试剂按体积比1：1的比例混合。其它组分和工艺与实施例1相同。
对比例5
在实施例1的基础上，第一KL-6单克隆抗体的包被使用活化液pH5.0。活化结束后，调整胶乳溶液的pH值至7.0进行包被。其它组分和工艺与实施例1相同。
对比例6
在实施例1的基础上，第二KL-6单克隆抗体的包被使用活化液pH5.5。活化结束后，调整胶乳溶液的pH值至7.5进行包被。其它组分和工艺与实施例1相同。
对比例7
在实施例1的基础上，第二KL-6单克隆抗体的包被使用活化液pH6.0。活化结束后，调整胶乳溶液的pH值至7.5。其它组分和工艺与实施例1相同。
对比例8
在实施例1的基础上，第一KL-6单克隆抗体的包被使用活化液pH5.5。活化结束后，调整胶乳溶液的pH值至6.5。其它组分和工艺与实施例1相同。
对比例9
在实施例1的基础上，第一KL-6单克隆抗体的包被使用活化液pH5.5。活化结束后，调整胶乳溶液的pH值至7.5。其它组分和工艺与实施例1相同。
对比例10
在实施例1的基础上，第二KL-6单克隆抗体的包被使用活化液pH6.5。活化结束后，调整胶乳溶液的pH值至7.0。其它组分和工艺与实施例1相同。
对比例11
在实施例1的基础上，第二KL-6单克隆抗体的包被使用活化液pH6.5。活化结束后，调整胶乳溶液的pH值至8.5。其它组分和工艺与实施例1相同。
为方便统计，先将各实施例和对比例的参数列表如表1所示。
表1
试验例
使用各实施例和各对比例的涎液化糖链抗原测定试剂盒进行性能评价：
实验仪器选择：HITACHI7180/7100，用对比例1-11、实施例1-5制备好的试剂上机检测，检测准确度、精密度、线性。
1、准确度：测定第三方质控品，计算与靶值的偏差Bias＝(测定均值-靶值)/靶值╳100％；实施例和对比例的准确度数据如表1-表2所示。
表1-实施例1-5准确度数据
表2-对比例1-11准确度数据
2、精密度评价：取样本200mg/L左右值测试10次，计算精密度CV，结果如表3-表4所示。
表3 实施例1-5精密度数据
表4 对比例1-11精密度数据
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3、线性范围数据如表5所示。
表5-实施例1-5、对比例1-11线性范围数据
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4、将实施例1-5、对比例1-11准确度、精密度、线性范围的综合比较结果列表如表6所示。
表6 实施例1-5、对比例1-11准确度、精密度、线性范围的综合比较
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由表6数据可知：
对比例1-2中，将两株单抗混合起来一起包被，制备得到的试剂盒准确度、精密度及线性范围均不符合要求。
对比例3-4中，将两株单抗按照相同的工艺进行分开包被，制备得到的试剂盒虽准确度符合要求，但是精密度及线性范围不符合要求。
对比例5中，采用第一KL-6单克隆抗体的包被使用活化液pH5.0，小于本发明的5.5～6.0的范围，制备得到的试剂盒精密度符合要求，但是准确度及线性范围均不符合要求。
对比例6中，采用第二KL-6单克隆抗体的包被偶联时调整胶乳溶液的pH5.5，小于本发明的6.5～7.0的范围，制备得到的试剂盒精密度符合要求，但是准确度及线性范围均不符合要求。
对比例7中，采用第二KL-6单克隆抗体的包被使用活化液pH6.0，小于本发明的6.5～7.0的范围，制备得到的试剂盒精密度符合要求，但是准确度及线性范围均不符合要求。
对比例8中，采用第一KL-6单克隆抗体的包被偶联时调整胶乳溶液的pH6.5，小于本发明的7.0～7.4的范围，制备得到的试剂盒精密度符合要求，但是准确度及线性范围均不符合要求。
对比例9中，采用第一KL-6单克隆抗体的包被偶联时调整胶乳溶液的pH7.5，大于本发明的7.0～7.4的范围，制备得到的试剂盒精密度符合要求，但是准确度及线性范围均不符合要求。
对比例10中，采用第二KL-6单克隆抗体的包被偶联时调整胶乳溶液的pH7.0，小于本发明的7.5～8.0的范围，制备得到的试剂盒精密度符合要求，但是准确度及线性范围均不符合要求。
对比例11中，采用第二KL-6单克隆抗体的包被偶联时调整胶乳溶液的pH8.5，大于本发明的7.5～8.0的范围，制备得到的试剂盒精密度符合要求，但是准确度及线性范围均不符合要求。
实施例1-5的准确度、精密度及线性范围均符合要求。
综上可知，2株KL-6单克隆抗体混合在一起包被，或者是分开用同一条件进行包被制成的试剂性能不符合要求，而当2株KL-6单克隆抗体分开包被，第一KL-6单克隆抗体的包被时，采用pH5.5～6.0的偏酸性条件进行活化，pH7.0～7.4的偏碱性条件偶联；第二KL-6单克隆抗体的包被时，采用pH6.5～7.0的偏酸性条件进行活化，pH7.5～8.0的偏碱性条件偶联，制备的试剂各项性能良好，精密度高-精密度CV值为1.42％～2.47％；准确度偏差为0.89％～1.56％；线性相关系数达到0.9998～0.9999。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (8)

1.一种涎液化糖链抗原测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒包括胶乳试剂，所述胶乳试剂包括第一KL-6单克隆抗体胶乳试剂和第二KL-6单克隆抗体胶乳试剂；所述第一KL-6单克隆抗体胶乳试剂和所述第二KL-6单克隆抗体胶乳试剂的制备方法为：
获得活化剂、pH5.5～6.0的活化缓冲液、pH6.5～7.0的活化缓冲液、第一KL-6单克隆抗体、第二KL-6单克隆抗体、pH调节液、封闭液和复溶溶液；所述pH5.5～6.0的活化缓冲液和所述pH6.5～7.0的活化缓冲液均为50mmol/L～100mmol/L硼酸缓冲液；所述pH调节液为20mmol/L～100mmol/L硼酸钠缓冲溶液；
将胶乳微球使用所述活化剂和所述pH5.5～6.0的活化缓冲液活化，后使用所述pH调节液调节pH值至7.0～7.4，获得第一活化微球溶液；将所述第一活化微球溶液与所述第一KL-6单克隆抗体混匀进行偶联反应，获得第一偶联反应液；将所述第一偶联反应液使用所述封闭液封闭，后离心和/或固液分离，获得第一固体，将所述第一固体使用所述复溶溶液重悬后混匀，获得所述第一KL-6单克隆抗体胶乳试剂；
将胶乳微球使用所述活化剂和所述pH6.5～7.0的活化缓冲液活化，后调节pH值至7.5～8.0，获得第二活化微球溶液；将所述第二活化微球溶液与所述第二KL-6单克隆抗体混匀进行偶联反应，获得第二偶联反应液；将所述第二偶联反应液使用所述封闭液封闭，后离心和/或固液分离，获得第二固体，将所述第二固体用所述复溶溶液重悬后混匀，获得所述第二KL-6单克隆抗体胶乳试剂；
所述第一KL-6单克隆抗体胶乳试剂和第二KL-6单克隆抗体胶乳试剂的重量比为1：0.8～1.2；所述第一KL-6单克隆抗体的货号为DM-KL-6mab-1，第二KL-6单克隆抗体的货号为DM-KL-6mab-2；
所述获得所述第一KL-6单克隆抗体胶乳试剂时，所述胶乳微球与pH5.5～6.0的活化缓冲液的体积比为1：2～4；所述获得所述第二KL-6单克隆抗体胶乳试剂时，所述胶乳微球与pH6.5～7.0的活化缓冲液的体积比为1：2～4。
2.根据权利要求1所述的一种涎液化糖链抗原测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述胶乳微球的粒径为200nm～250nm。
3.根据权利要求1所述的一种涎液化糖链抗原测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述活化剂为EDC溶液。
4.根据权利要求1所述的一种涎液化糖链抗原测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述封闭液包括封闭液1和封闭液2，所述封闭液1为吐温-20，所述封闭液2为BSA。
5.根据权利要求1所述的一种涎液化糖链抗原测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述复溶溶液为25mmol/L～50mmol/L HEPES，0.5g/L EDTA-2Na，5％海藻糖，0.05％吐温-20，0.1％PC-300，pH值为7.0～7.5。
6.根据权利要求1所述的一种涎液化糖链抗原测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒还包括样本预处理试剂，所述样本预处理试剂包括如下的终浓度组分为：
50mmol/L～100mmol/L 2-(N-***啉)乙磺酸(MES)，0.08mol/L氯化钠，0.2％Thesit，0.1％叠氮化钠，pH 6～8。
7.根据权利要求1所述的一种涎液化糖链抗原测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒还包括校准试剂，所述校准试剂包括不同浓度梯度的涎液化糖链抗原和基质液，所述基质液包括磷酸盐缓冲液，EDTA二钠或EDTA二钾，丙三醇，海藻糖，BSA，盐类物质，氯化钾中的至少一种。
8.一种涎液化糖链抗原测定试剂盒，其特征在于，采用权利要求1-7任一所述的制备方法制备而得。
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