CN114934000A - 耐盐性解淀粉芽孢杆菌及其筛选与应用 - Google Patents

耐盐性解淀粉芽孢杆菌及其筛选与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114934000A
CN114934000A CN202210758627.8A CN202210758627A CN114934000A CN 114934000 A CN114934000 A CN 114934000A CN 202210758627 A CN202210758627 A CN 202210758627A CN 114934000 A CN114934000 A CN 114934000A
Authority
CN
China
Prior art keywords
strain
salt
growth
soil
application
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210758627.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114934000B (zh
Inventor
刘鹏
阚凤玲
陈日远
马倩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Golden Way Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Golden Way Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Golden Way Biotechnology Co Ltd filed Critical Beijing Golden Way Biotechnology Co Ltd
Priority to CN202210758627.8A priority Critical patent/CN114934000B/zh
Publication of CN114934000A publication Critical patent/CN114934000A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114934000B publication Critical patent/CN114934000B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01B—SOIL WORKING IN AGRICULTURE OR FORESTRY; PARTS, DETAILS, OR ACCESSORIES OF AGRICULTURAL MACHINES OR IMPLEMENTS, IN GENERAL
    • A01B79/00—Methods for working soil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01C—PLANTING; SOWING; FERTILISING
    • A01C1/00—Apparatus, or methods of use thereof, for testing or treating seed, roots, or the like, prior to sowing or planting
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K17/00—Soil-conditioning materials or soil-stabilising materials
    • C09K17/14—Soil-conditioning materials or soil-stabilising materials containing organic compounds only
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2101/00—Agricultural use
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Soil Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及微生物菌种应用技术领域，尤其涉及耐盐性解淀粉芽孢杆菌及其筛选与应用。本发明提供了耐盐性解淀粉芽孢杆菌及其筛选与应用，该菌株可适应耐盐环境，并具有较强的促生功能，具有使植物在盐渍化土壤中可正常生长的特性。使用本方案的保藏编号为CGMCC No.24545的芽孢杆菌改良盐渍化土壤，具有绿色、简便、低廉的优势，在实际应用具有较为明显的优点。本发明的盐渍化农业生防菌株具有耐盐，促进农作物生长，提高作物耐盐抗逆的特性，植物促生试验发现，与不接种相比，接种该菌株可显著促进种子萌发，并可提高作物耐盐抗逆性，可在28℃～32℃正常生长，能够显著促进植株生长，可用于实际生产实践中。

Description

耐盐性解淀粉芽孢杆菌及其筛选与应用
技术领域
本发明涉及微生物菌种应用技术领域，尤其涉及耐盐性解淀粉芽孢杆菌及其筛选与应用。
背景技术
随着化学肥料不合理利用、大量元素肥料过量使用、不合理的农田灌溉，土壤盐渍化现象越来越加剧。当代盐渍化产生的原因主要是人类不适当的生产活动造成的，主要包括地质变化、地下水源开采，改变了原有的自然水盐平衡状态。
盐渍化一般的解决途径主要分为3种，水利、化学和生物3种，其中水利和化学方法主要是通过人为改良灌溉措施及方法，改变土壤的理化性质及团粒结构等进行治理。生物措施主要是通过植物及微生物的作用进行土壤修复，利用耐盐及对盐分吸收效果较好的植物，在植物生长时吸收土壤中盐分，降低土壤中盐分含量，改善土壤盐渍化水平。微生物措施主要利用微生物对土壤盐分的耐受性，与作物协同作用，提高作物对盐分耐受性，进而提高作物对盐渍化土壤的适应性，有些微生物还可自身固化土壤中盐分，如里氏木霉等。
化学方法存在低效、高耗、反应条件苛刻、有化学毒性和存在二次污染等问题；生物净化法由于其高效、低耗、反应条件温和、二次污染小等优点受到广泛关注，利用微生物来处理盐渍化土壤在国内外报道较少，国内也发现较少量菌株可同时促进植物生长和修复盐渍化土壤的微生物。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供耐盐性解淀粉芽孢杆菌及其筛选与应用，该菌株具有适宜耐盐环境，并具有较强的促生功能，具有使植物在盐渍化土壤中可正常生长的特性。
本发明提供了保藏编号为CGMCC No.24545的芽孢杆菌。
本发明提供的所述芽孢杆菌，营养细胞呈杆状、圆端，多数为单个、少数成对或链状排列，细胞壁为革兰阳性结构，需氧或兼性厌氧，在营养琼脂培养基的菌落表面粗糙不透明，污白色，边缘粗糙，稠状或冻状。
本发明为鉴定本菌株的***发育地位，从NCBI(GenBank)数据库中获取参比菌株序列，运用软件BioEdit和MEGA11对分离菌株和参比菌株的16S rDNA序列进行分析，构建分离菌株与参比菌株的***发育树。从而确定芽孢杆菌株系为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的菌株系(附图3)，并命名为BGB-95R。
本发明提供的所述芽孢杆菌生长条件包括：pH6～8，温度18℃～35℃，转速120r/min～180r/min，可利用广泛的碳源和氮源。
一些实施例中，本发明提供的所述芽孢杆菌最适生长条件为：pH7.0，温度28℃～32℃，转速160r/min，可利用广泛的碳源和氮源。
本发明所述的芽孢杆菌可促进种子萌发，促进植物在盐渍化土壤中正常生长，并可提高植物在盐渍化的抗逆作用。所述菌体被释放到土壤中，对人、动物和植物无害，不会污染环境，还可在一定情况下丰富自然界菌群结构，提高自然界菌群多样性。
所以，本发明还提供了保藏编号为CGMCC No.24545的芽孢杆菌在促进植物生长和/或修复盐渍化土壤中的应用。
本发明所述的应用，其中，所述促进植物生长包括如下I)～III)中至少一种：
I)促进种子萌发；
II)、促进植物根系生长和/或发育；
III)、提高生物量积累。
本发明所述应用中，所述提高种子萌发率包括提高种子萌发指数，具体的将种子萌发指数提高至5％～15％；
所述促进植物根系生长提高至20％～30％；
所述提高生物量积累至60％～70％。
本发明所述的应用，其中，所述植物包括黄瓜或水稻。
本发明所述的应用，其中，所述盐渍化土壤中的含盐量大于2％。
一些实施例中，本发明所述的应用，其中所述盐渍化土壤中的含盐量为0％～4％。
另一些实施例中，本发明所述的应用，其中所述盐渍化土壤中的含盐量为1％、2％、3％、4％。
一些具体实施例中，所述盐渍化土壤中的含盐量为2％。
另一些具体实施例中，使用NaCl模拟土壤中盐浓度，当NaCl浓度为2％，发酵得到的菌浓度最高为64.3亿CFU/ml，而在NaCl浓度为4％时，发酵菌量仍可达到8.4亿CFU/ml。
本发明提供了促进植物生长和/或修复盐渍化土壤的产品，其包括保藏编号为CGMCC No.24545的芽孢杆菌。
本发明所述的产品，其中，所述产品菌含量为1×107CFU/g～9×107CFU/g。
本发明还提供了所述产品的制备方法，其包括：培养保藏编号为CGMCC No.24545的芽孢杆菌，收集菌体。
本发明所述的制备方法，其中，所述收集菌体后，还包括重悬菌体制备菌悬液的步骤；或者还包括将菌体与冻干保护剂混合，经冻干制得冻干粉的步骤。
本发明还提供了促进植物生长和/或修复盐渍化土壤的方法，其包括施用所述的产品、或所述制备方法制备得到的产品。
本发明利用盐渍化土壤分离筛选得到的微生物，在盐渍化土壤及植物生长中应用，可显著促进植物种子萌发，并促进作物生长，对盐渍化土壤修复具有显著的实际应用意义。
与现有技术相比，本发明具有如下效果:使用本方案的保藏编号为CGMCCNo.24545的芽孢杆菌改良盐渍化土壤，具有绿色、简便、低廉的优势，在实际应用具有较为明显的优点；本发明的盐渍化农业生防菌株具有耐盐，促进农作物生长，提高作物耐盐抗逆的特性，植物促生试验发现，与不接种相比，接种该菌株可显著促进种子萌发，并可提高作物耐盐抗逆性，可在28℃～32℃正常生长，能够显著促进植株生长，可用于实际生产实践中。
生物保藏说明
生物材料：BGB-95R，分类命名：解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，于2022年03月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.24545。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：
图1示光学显微镜下×1000，解淀粉芽孢杆菌BGB-95R照片；
图2中的A示解淀粉芽孢杆菌BGB-95R，28℃培养在营养琼脂培养基上的菌落形态；图2中的B示菌落图；
图3示基于16S rDNA序列构建的***发育树；
图4示解淀粉芽孢杆菌BGB-95R耐盐培养；
图5中的a示解淀粉芽孢杆菌BGB-95R在培养皿中促进黄瓜种子的萌发；图5中的b示解淀粉芽孢杆菌BGB-95R在培养皿中促进萌发的黄瓜种子与量尺对照图；
图6示解淀粉芽孢杆菌BGB-95R对黄瓜幼苗的促生长作用；
图7示解淀粉芽孢杆菌BGB-95R高盐分条件下促进水稻种子的萌发；
图8中的A示解淀粉芽孢杆菌BGB-95R促进生长的水稻幼苗与量尺的对照图；图8中的B示种植在花盆中的解淀粉芽孢杆菌BGB-95R促进生长的水稻幼苗与量尺的对照图；
图9示解淀粉芽孢杆菌BGB-95R在花盆中促进水稻幼苗生长及提高耐盐性，其中T示处理组，CK示对照组。
具体实施方式
本发明提供了耐盐性解淀粉芽孢杆菌筛选与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
1、菌株的分离、纯化
1)土壤样品采集：采集自江苏省盐城市射阳县临海镇临建村(东经120°23′20″，北纬33°58′44″)含盐量为2％的滩涂盐碱地盐渍化土壤并进行日期及其他信息登记，并对样品基本理化性质进行检测。
2)目标菌初分离：称取上述采集的样品10g，无菌条件下加入到预先灭菌的盛有100ml生理盐水的三角瓶中，充分振荡，28℃，30min，按照比例稀释至10-5，选择稀释浓度为10-3、10-4、10-5的稀释度分别吸取0.1ml～0.2ml，于高盐分营养琼脂(NaCl含量为30.5g/L)进行涂布(配方见表1)平板，待液体吸尽，28℃倒置培养15h～30h。于平板上挑取单克隆，根据板上微生物形态，挑取不同菌落划线分离纯化(按照上述培养条件培养)2～3次，直至菌落单一，编号，记录，保存。
3)初步鉴定：将分离纯化得到的菌株于显微镜下镜检并观察，附图1。
表1 高盐分营养琼脂培养基配方
Figure BDA0003723513470000051
2、单菌株的性质
1)形态特征
菌株：营养细胞呈杆状、圆端、多数为单个、少数成对或链状排列，细胞壁为革兰阳性结构。最佳生长温度为28℃～32℃，最高生长温度为35℃，最低生长温度为18℃，需氧或兼性厌氧。在营养琼脂培养基28℃培养18h的菌落表面粗糙不透明，污白色，边缘粗糙，稠状或冻状(附图2)。
2)培养特性
菌株最适生长条件为：pH＝7.0，温度28℃～32℃，转速160r/min，可利用广泛的碳源和氮源。
3)功能特性
在植物生长过程中，主要功能为可促进种子萌发，促进植物在盐渍化土壤中正常生长，并可提高植物在盐渍化的抗逆作用。菌体被释放到土壤中，对人、动物和植物无害，不会污染环境，还可在一定情况下丰富自然界菌群结构，提高自然界菌群多样性。
3、菌株的16S rDNA序列测序
为鉴定本菌株的***发育地位，对所分离菌株的16S rDNA序列进行测序。从NCBI(GenBank)数据库中获取参比菌株序列，运用软件BioEdit和MEGA11对分离菌株和参比菌株的16S rDNA序列进行分析，构建分离菌株与参比菌株的***发育树。从而确定芽孢杆菌株系为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的菌株系(附图3)，并命名为BGB-95R。
与现有技术相比，本发明具有如下效果，本发明的盐渍化农业生防菌株具有耐盐，促生作物生长，提高作物耐盐抗逆的特性，植物促生试验发现，与不接种相比，接种该菌株可显著促进种子萌发，并可提高作物耐盐抗逆性，可在28℃～32℃正常生长，能够显著促进植株生长，可用于实际生产。
实施例2菌株的分离和纯化
1、菌株的分离及筛选
在土壤样品采集之后，在低温环境下保藏送至实验室，利用无菌水分别将上述样品稀释100倍至三角瓶中，于28℃，30min，160rpm振荡后，静置15min。分别在营养培养基、高氏Ⅰ号和PDA培养基涂板培养，并在28℃恒温培养箱培养温度。待平板上长出单个菌落，对单个菌落进行编号，并挑取具有代表性的菌落，进行分离并纯化。
2、菌株的纯化
接上述平板长出菌落后，用灭菌的牙签从平板上刮取少量菌落，用无菌水稀释后再次于平板上划线培养。如无单克隆菌落出现，则需反复在平板上划线纯化，直到出现单克隆菌落为止，多次纯化，待菌落形态统一，无其他不同形态菌落出现为止。
菌株：营养细胞呈杆状、圆端、多数为单个、少数成对或链状排列，细胞壁为革兰阳性结构。最佳生长温度为28℃～32℃，最高生长温度为35℃，最低生长温度为18℃，需氧或兼性厌氧。在营养琼脂培养基28℃培养20h的菌落表面粗糙不透明，污白色，边缘粗糙，挑取为粘稠状或冻状(附图2)。
运用此分离纯化方法，经若干代反复纯化，在改良营养固体培养基(表1)中划线培养，得到单一菌株，菌株经平板培养基培养具有较强耐盐能力，本实施例分离纯化得到具有较强的耐盐能力的菌株系。
实施例3菌株株系单菌株的16S rDNA序列测序
对菌株单克隆菌液进行PCR特异性扩增，引物分别为27F(SEQ ID NO:2)和1492R(SEQ ID NO:3)，酶选用2×star Mix。PCR扩增产物做电泳成像技术进行检测，观察其是否具有条带，将剩余PCR扩增产物用于序列测定。测序结果如SEQ ID NO:1所示。其PCR反应体系如下：
表2 16SrDNA 2×starMix酶反应体系
Figure BDA0003723513470000071
从NCBI(GenBank)数据库中获取多个参比菌株序列，运用软件BioEdit和MEGA11对分离菌株和参比菌株的16S rDNA序列全长进行分析，构建分离菌株与参比菌株的***发育树(附图3)。从而确定菌株的菌属关系为解淀粉芽孢杆菌，并命名为BGB-95R(嘉博文95号)。
实施例4菌株耐盐促生试验
1试验目的：检测菌株耐盐促生效果。
2试验材料
2.1供试材料：黄瓜种子(中农16号)、嘉博文土壤调理剂(主要物料为厨余垃圾筛分腐熟后添加辅料所形成的可用于土壤改良的有机物质)-厨余垃圾资源化有机物、珍珠岩、蛭石、椰糠等。
2.2供试菌株：解淀粉芽孢杆菌BGB-95R菌株
2.3主要试验仪器和器材：超净工作台、高压灭菌锅、恒温振荡培养箱、紫外分光光度计、500mL锥形瓶、镊子、培养皿、玻璃棒、接种环、1.5ml离心管、打孔器、涂布棒、育苗盘、2.5L花盆等。
2.4试验药品和试剂
(1)试验药品：蛋白胨、H2O、NaCl、酵母粉、牛肉膏、琼脂、次氯酸钠。
(2)试验试剂：
1)营养液体培养基：称取蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl10g，溶于1L纯水中，pH：6.8～7.5，121℃，30min，灭菌。
2)营养固体培养基：称取蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl10g、琼脂20g，溶于1L纯水中，pH：6.8～7.5，121℃，30min，灭菌。
3)营养土配制及营养指标：将嘉博文土壤调理剂与珍珠岩、蛭石、椰糠按照3:1:2:4体积比配制营养土，灭菌后常规营养指标(干基)分别为：有机质65％，氮1.45％，磷0.37％，钾0.16％。
3试验步骤
3.1菌株培养
将-80℃保存的供试菌株3次活化后转接于营养液体培养基培养，培养至对数期，其菌株的生长情况用紫外分光光度计检测，利用OD值估算含菌量，并利用稀释涂布平板计数，用无菌水稀释至1×109CFU/ml～9×109CFU/ml，待用。并将供试菌株于营养固体培养基进行划线培养，待用。
3.2菌株耐盐实验
将上述在营养培养基培养得到的BGB-95R菌株平板，利用无菌5mm打孔器打孔，放置于分别加入质量分数为0、1％、2％、3％、4％氯化钠且已灭菌的营养液体培养基中，其中每100ml锥形瓶装50ml营养液，每瓶放置1片菌片，置于28℃，180rpm恒温摇床培养，每处理三个重复，并做空白处理，培养34h后观察营养液OD值，并利用稀释涂布平板法检测菌含量。统计结果如下表3，培养结果如图4：
表3 不同浓度NaCl菌株BGB-95R菌量培养情况
NaCl浓度·％ OD值 菌量·亿CFU/ml
CK 0.000±0.000 0.0±0.0
0 0.492±0.005 48.0±0.0
1 0.527±0.014 64.3±3.1
2 0.484±0.010 46.0±3.0
3 0.361±0.012 32.3±3.1
4 0.225±0.022 8.4±1.8
结果显示，解淀粉芽孢杆菌在添加NaCl浓度为0％～4％时均可正常生长，且在NaCl浓度为2％，发酵得到的菌浓度最高为64.3亿CFU/ml，而在NaCl浓度为4％时，发酵菌量仍可达到8.4亿CFU/ml。解淀粉芽孢杆菌BGB-95R在高浓度的盐环境下可正常生长，并且具有一定的耐盐环境的能力，可在盐分含量较高的土壤中应用。
3.3菌株促进种子萌发实验
按照耐盐实验方法利用营养液体培养基培养BGB-95R，培养34h后，利用离心机将上述发酵液在8000rpm离心，取下层沉淀，并用无菌水稀释菌含量至1×109CFU/ml～9×109CFU/ml。取新鲜饱满黄瓜种子，利用溶质质量分数为0.2％次氯酸钠灭菌冲洗15s，反复冲洗2～3次，确保黄瓜种子表面灭菌完全而不损伤黄瓜种子。
将已稀释至1×109CFU/ml～9×109CFU/ml菌悬液利用无菌水稀释100倍，待用。在9cm无菌培养皿放置1张无菌滤纸，其上放置20粒大小基本一致、饱满的已灭菌的黄瓜种子，加入上述已稀释100倍的菌悬液10ml，盖上培养皿盖，在28℃培养箱避光培养48h，统计发芽种子的粒数，并用直尺逐一测量主根长。以无菌水作对照，做空白试验。
种子发芽率按照以下方式计算。
种子发芽指数G，以％表示，按照公式计算，公式如下：
G＝(A1*A2)/(B1*B2)
注：A1-处理组种子中发芽粒数占放入总粒数的百分比；A2-处理组全部种子的平均根长数值；B1-对照组种子中发芽粒数占放入总粒数的百分比；B2-处理组全部种子的平均根长数值。
3.4菌株促生实验
将营养土放置于育苗盘中，利用无菌水浇透，将处理好的育苗盘放置于28℃温室中12h，利用0.2％次氯酸钠处理黄瓜种子15s，并用无菌水洗3～5次，按照穴播的方式种植于育苗盘，18天后黄瓜种子萌发，进行黄瓜苗的移栽。将营养土放置于另一育苗盘中，利用已稀释为菌含量为1×109CFU/ml～9×109CFU/ml BGB-95R的发酵菌液浇透作为处理组(按照加入盆栽土质量，保证盆栽土菌含量为1×109CFU/ml～9×109CFU/ml，对照组则利用无菌水浇透，并保证浇水量一致。将黄瓜苗分别移栽至上述处理组与对照组育苗盘中，放置于人工生长室进行培养，生长室(光周期为：日/夜＝16h/8h，温度为：日/夜＝30℃/24℃)。做10个重复，培养30天后收获检测，以植株鲜重、根长等生物指标作为BGB-95R促生效果的判断指标。
表4 BGB-95R对黄瓜种子发芽指数及幼苗生长的影响情况
实验处理 发芽指数·％ 根长·cm 整株鲜重·g
处理组 93.45±1.03 12.82±1.70 2.99±0.22
对照组 83.33±2.06 10.06±0.99 1.80±0.18
实验结果显示，如图5、图6及表4中，使用BGB-95R发酵菌液可促进黄瓜种子萌发，与对照相比呈现显著性差异，发芽指数提高10％左右。使用BGB-95R发酵菌液可在苗期促进黄瓜幼苗生长，与对照相比，可提高黄瓜苗期鲜重65％以上，提高根长25％以上，统计数据显示，黄瓜根长及鲜重均呈现显著性差异。
因此，BGB-95R可在黄瓜种子及幼苗期促进种子萌发及植株生长，对黄瓜的生长具有显著的促进作用，且可在低于盐含量为4％的环境下正常生长，具有一定的耐盐生长能力。
综上，解淀粉芽孢杆菌BGB-95R，可应用于盐分含量较高的土壤，并在此环境中可促进种子萌发及植株生长，对植株提高耐盐性具有一定的促进作用。
实施例5菌株盐碱土水稻促生试验
1试验目的：检测菌株在盐碱土中对水稻的促生效果。
2试验材料
2.1供试材料：水稻种子(徐稻10号)、由江苏省盐城市射阳县临海镇临建村采集的盐渍化土壤等。盐渍化土壤养分含量：全氮0.23％，速效磷69.20mg/kg，速效钾204mg/kg，pH7.81，全盐量20.12g/kg。
2.2供试菌株：解淀粉芽孢杆菌BGB-95R菌株
2.3主要试验仪器和器材：超净工作台、高压灭菌锅、恒温振荡培养箱、紫外分光光度计、500mL锥形瓶、镊子、培养皿、玻璃棒、接种环、1.5ml离心管、打孔器、涂布棒、育苗盘、2.5L花盆等。
2.4试验药品和试剂
(1)试验药品：蛋白胨、H2O、NaCl、酵母粉、牛肉膏、琼脂、次氯酸钠等。
(2)试验试剂：
1)营养液体培养基：称取蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl10g，溶于1L纯水中，pH：6.8～7.5，121℃，30min，灭菌。
2)营养固体培养基：称取蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl10g、琼脂20g，溶于1L纯水中，pH：6.8～7.5，121℃，30min，灭菌。
3)土壤灭菌及基质配置：将盐渍化土壤在121℃，灭菌40min，将灭菌土壤盛放在已用次氯酸钠灭菌的2.5L花盆中，待用。
3试验步骤
3.1菌株培养
同实施例4中，将-80℃保存的供试菌株3次活化后转接于营养液体培养基培养，培养至对数期，其菌株的生长情况用紫外分光光度计检测，利用OD值估算含菌量，并利用稀释涂布平板计数，用无菌水稀释至1×109CFU/ml～9×109CFU/ml，待用。并将供试菌株于营养固体培养基进行划线培养，待用。
3.2菌株促进水稻种子萌发实验
同实施例4中，按照耐盐实验方法利用营养液体培养基培养BGB-95R，培养34h后，利用离心机将上述发酵液在8000rpm离心，取下层沉淀，并用无菌水稀释菌含量至1×109CFU/ml～9×109CFU/ml。取新鲜饱满水稻种子，利用溶质质量分数为0.2％次氯酸钠灭菌冲洗15s，反复冲洗2～3次，确保水稻种子表面灭菌完全而不损伤水稻种子。
将已稀释至1×109CFU/ml～9×109CFU/ml菌悬液利用无菌水稀释100倍，待用。在9cm无菌培养皿放置1张无菌滤纸，其上放置20粒大小基本一致、饱满的已灭菌的水稻种子，加入上述已稀释100倍的菌悬液10ml，盖上培养皿盖，在28℃培养箱避光培养48h，统计发芽种子的粒数，并用直尺逐一测量主根长、芽长。其中对照组为：10ml无菌水+1.5g灭菌NaCl，实验组为：10ml菌悬液+1.5g灭菌NaCl，空白组为：10ml无菌水。
种子发芽率按照以下方式计算。
种子发芽指数G，以％表示，按照公式计算，公式如下：
G＝(A1*A2)/(B1*B2)
注：A1-处理组种子中发芽粒数占放入总粒数的百分比；A2-处理组全部种子的平均根长数值；B1-对照组种子中发芽粒数占放入总粒数的百分比；B2-处理组全部种子的平均根长数值。
3.3菌株对水稻幼苗的促生试验
利用上述已灭菌盐渍化土壤，将上述菌含量为1×109CFU/ml～9×109CFU/ml的菌悬液，与盐渍化土壤按照质量比为1:100均匀混合，此时土壤菌含量为1×107CFU/ml～9×107CFU/ml，并设置不加菌空白对照。选择步骤3.2中空白组长势相近的水稻幼苗，将水稻幼苗分别移栽至上述处理组与对照组育苗盘中，放置于人工生长室进行培养，生长室(光周期为：日/夜＝16h/8h，温度为：日/夜＝30℃/24℃)。每盆设置3株，每处理4盆，共计12株，培养20天后收获检测，以植株鲜重、株高等生物指标作为BGB-95R促生耐盐效果的判断指标。
表5 BGB-95R对水稻种子发芽指数及幼苗生长的影响情况
实验处理 萌发率·％ 芽长·cm 发芽指数·％ 株高·cm 整株鲜重·g
处理组 96.7 2.06±0.23 92.00 26.61±0.81 0.59±0.01
对照组 83.3 1.72±0.24 65.06 21.75±3.45 0.37±0.01
空白组 96.7 2.25±0.27 - - -
实验结果显示，如图7、及表5中，使用BGB-95R发酵菌液可促进水稻种子萌发，与对照相比呈现显著性差异，种子发芽指数提高27％左右，萌发率提高13％左右，芽长和根长增加较为明显。与对照组相比，利用BGB-95R，在盐分含量为1.5％左右，可显著提高水稻种子的萌发率及种子萌发指数。
如图8、9及表5中，使用BGB-95R发酵菌液可在苗期促进水稻幼苗生长，与对照相比，可提高水稻苗期鲜重37％以上，统计数据显示，处理组与对照组相比，水稻株高及鲜重均呈现显著性差异。
因此，BGB-95R可在水稻种子及幼苗期促进种子萌发及植株生长，提高水稻在盐渍化土壤中的耐盐性，并对水稻的生长具有显著的促进作用，且可在低于盐含量为2％的环境下正常生长，并可提高植物的耐盐性。
综上，解淀粉芽孢杆菌BGB-95R，可应用于盐分含量较高的土壤，并在此环境中可促进种子萌发及植株生长，对水稻在盐碱地种植生长并提高其耐盐性具有一定的促进作用，可对植株提高耐盐性具有一定的促进作用。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 北京嘉博文生物科技有限公司
<120> 耐盐性解淀粉芽孢杆菌及其筛选与应用
<130> MP22003427
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1450
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)
<400> 1
gcgtgtgcta tagatgcaag tcgagcggac agatgggagc ttgctccctg atgttagcgg 60
cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact ccgggaaacc 120
ggggctaata ccggatggtt gtttgaaccg catggttcag acataaaagg tggcttcggc 180
taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag 240
gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc 300
agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc 360
aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag ggaagaacaa 420
gtgccgttca aatagggcgg caccttgacg gtacctaacc agaaagccac ggctaactac 480
gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa 540
gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc ggggagggtc 600
attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt gtagcggtga 660
aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc tgtaactgac 720
gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 780
aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct aacgcattaa 840
gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg 900
cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg 960
acatcctctg acaatcctag agataggacg tccccttcgg gggcagagtg acaggtggtg 1020
catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1080
cttgatctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg 1140
gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc 1200
tacaatggac agaacaaagg gcagcgaaac cgcgaggtta agccaatccc acaaatctgt 1260
tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc tagtaatcgc 1320
ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac 1380
gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagg taacctttat ggagccagcc gccgaaggtc 1440
acagagtttg 1450
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacggctacc ttgttacgac tt 22

Claims (10)

1.保藏编号为CGMCC No.24545的芽孢杆菌。
2.保藏编号为CGMCC No.24545的芽孢杆菌在促进植物生长和/或修复盐渍化土壤中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述促进植物生长包括如下I)～III)中至少一种：
I)促进种子萌发；
II)、促进植物根系生长和/或发育；
III)、提高生物量积累。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述植物包括黄瓜或水稻。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述盐渍化土壤中的含盐量大于2％。
6.促进植物生长和/或修复盐渍化土壤的产品，其特征在于，包括保藏编号为CGMCCNo.24545的芽孢杆菌。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品菌含量为1×107CFU/g～9×107CFU/g。
8.权利要求7所述产品的制备方法，其特征在于，包括：培养保藏编号为CGMCCNo.24545的芽孢杆菌，收集菌体。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述收集菌体后，还包括重悬菌体制备菌悬液的步骤；或者还包括将菌体与冻干保护剂混合，经冻干制得冻干粉的步骤。
10.促进植物生长和/或修复盐渍化土壤的方法，其特征在于，包括施用权利要求6或7所述的产品、或权利要求8或9所述制备方法制备得到的产品。
CN202210758627.8A 2022-06-30 2022-06-30 耐盐性解淀粉芽孢杆菌及其筛选与应用 Active CN114934000B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210758627.8A CN114934000B (zh) 2022-06-30 2022-06-30 耐盐性解淀粉芽孢杆菌及其筛选与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210758627.8A CN114934000B (zh) 2022-06-30 2022-06-30 耐盐性解淀粉芽孢杆菌及其筛选与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114934000A true CN114934000A (zh) 2022-08-23
CN114934000B CN114934000B (zh) 2023-12-15

Family

ID=82869240

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210758627.8A Active CN114934000B (zh) 2022-06-30 2022-06-30 耐盐性解淀粉芽孢杆菌及其筛选与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114934000B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117356221A (zh) * 2023-11-23 2024-01-09 西藏自治区农牧科学院草业科学研究所 利用土壤促生菌提高垂穗披碱草种子萌发的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106591193A (zh) * 2016-12-23 2017-04-26 河北省农林科学院遗传生理研究所 一株具有广谱促生抗逆作用的解淀粉芽孢杆菌
CN106635903A (zh) * 2016-12-23 2017-05-10 河北省农林科学院遗传生理研究所 一种提高中重度盐碱地作物耐盐性的促生菌组合

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106591193A (zh) * 2016-12-23 2017-04-26 河北省农林科学院遗传生理研究所 一株具有广谱促生抗逆作用的解淀粉芽孢杆菌
CN106635903A (zh) * 2016-12-23 2017-05-10 河北省农林科学院遗传生理研究所 一种提高中重度盐碱地作物耐盐性的促生菌组合

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117356221A (zh) * 2023-11-23 2024-01-09 西藏自治区农牧科学院草业科学研究所 利用土壤促生菌提高垂穗披碱草种子萌发的方法
CN117356221B (zh) * 2023-11-23 2024-04-19 西藏自治区农牧科学院草业科学研究所 利用土壤促生菌提高垂穗披碱草种子萌发的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114934000B (zh) 2023-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106987541B (zh) 一株具有抗逆、促生性能的高效苜蓿根瘤菌及其应用
CN112358974B (zh) 一株植物内生真菌黑附球菌fzt214及其应用
CN110669691B (zh) 一种防治植物线虫病害的巨大芽孢杆菌及其应用
CN113416675A (zh) 一种耐盐碱的根际促生菌及其应用
CN113801818B (zh) 一种芽孢杆菌及其应用
CN108641989B (zh) 一株甲基营养型芽孢杆菌及其应用
CN111484950A (zh) 一种解磷芽孢杆菌及其应用
CN111808783B (zh) 一株阴沟肠杆菌及其活菌制剂生产方法与应用
CN111690572A (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用和制剂
CN108913625B (zh) 耐盐链霉菌、其菌剂及其菌剂在促进植物生长中的应用
CN110892805A (zh) 一种提高玉米种子萌发耐盐性生物刺激素制备及应用方法
CN114934000B (zh) 耐盐性解淀粉芽孢杆菌及其筛选与应用
CN113755389A (zh) 一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用
CN114350559B (zh) 一株耐盐促生的辽宁慢生根瘤菌ry6菌株及其应用
CN116676234A (zh) 耐盐芽孢杆菌jk-25、菌剂及其制备方法和应用
CN104312945A (zh) 一株油菜内生菌解淀粉芽孢杆菌4-3及其应用方法
CN109355235B (zh) 一种根瘤菌famb126及其应用
CN109355234B (zh) 一种根瘤菌yzm0144及其应用
CN116218742B (zh) 一株拮抗掘氏疫霉菌的地衣芽孢杆菌及其应用
CN117645954B (zh) 一株胶冻样类芽孢杆菌mssw03及其应用
CN114806924B (zh) 一种反硝化无色杆菌及其应用
CN117229985B (zh) 一株生防菌株萎缩芽孢杆菌bgb-98r及其应用
CN113930344B (zh) 一种盐碱地蒙古柳根部内生木霉菌及其应用
CN113943684B (zh) 一种松嫩盐单胞菌及其在盐渍化农田生产中的应用
CN117106668B (zh) 一株耐盐碱促生天津假单胞菌p522及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant