CN111848736B - 自组装多肽、制备方法、自组装多肽制剂及应用 - Google Patents

自组装多肽、制备方法、自组装多肽制剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种自组装多肽、制备方法、自组装多肽制剂及应用，涉及生物技术领域，本发明提供的自组装多肽，具有如AC‑Pro‑X1‑X3‑X2‑X3‑X1‑X3‑X2‑Pro‑amide所示的通式。本发明的发明人通过实验发现，本发明提供的自组装多肽因其与传统的自组装多肽相比溶解度高，合成和纯化难度低，更易于工业化生产，并且制造成本更低。在大批量合成纯化时，纯化次数降低，单次纯化量提高，粗肽的纯品率可以达到90％以上，成本大大下降。

Description

自组装多肽、制备方法、自组装多肽制剂及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种自组装多肽、制备方法、自组装多肽制剂及应用。
背景技术
自组装技术是一种新型的生物纳米技术，其中自组装多肽是一个研究焦点，多种类型的自组装多肽相继展现了其独特的性能。离子互补型自组装多肽具有亲疏水性氨基酸交替的结构，在水溶液中呈β折叠构象，具有带电氨基酸形成的亲水面和疏水性氨基酸形成的疏水面。这种特殊的构象使得多肽分子可以自组装形成纳米纤维，在达到接触金属离子等触发条件后继续组装形成水凝胶。这种多肽自组装形成的水凝胶含水量可以达到99％，同时又具有良好的生物相容性。
自组装多肽被应用于多种用途，包括三维细胞培养支架，止血剂，鼻窦手术后止血和防粘连剂，黏膜填充剂，3D打印和组织工程支架，药物控释等领域。已经被开发为自组装多肽止血剂和水凝胶敷料等医疗产品并商业化的自组装多肽序列为AC-RADARADARADARADA-amide或简写为AC-(RADA)4-amide或简写为RADA16(CN101267831，CN106459154A)，此外常用的自组装多肽序列还有IEIK13(CN106459154A)，KLD12(CN106459154A)等。这些自组装多肽多为正电氨基酸、负电氨基酸和疏水氨基酸相交替排列构成。其中一个比较典型的应用是将该自组装多肽作为胃肠道黏膜止血剂使用，即将自组装多肽溶液经过长导管输送至胃或肠道并释放至创面；在该自组装多肽溶液接触胃肠道创面时，由于创面血液含有金属离子触发自组装多肽组装成胶，由输送时的溶液状态变为凝胶状，产生其物理止血的作用。
自组装多肽的应用受到其本身性质的影响。比如RADA16，在应用时，配制成较高浓度比如1％或2％水溶液后，在很短的时间内就变成粘稠的液体，虽然也保留有一定的流动性，但是仍然不易在长导管中输送，局限了其作为自组装材料的应用。该类材料理想的情况是在自组装成胶前完全是溶液状态，即粘度低或者完全接近于水的粘度，在应用时接触到触发剂或达到触发条件后再形成凝胶；这样才能保证自组装多肽在输送时，容易在管道或通道输送，并且在作为止血剂接触到创面止血时在其接触血液触发成胶过程中容易在创面延展并顺应创面结构。因此，对于该类自组装还需要进一步的研究以促进其应用。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种自组装多肽，以缓解至少现有技术中存在的技术问题之一。
为实现上述目的，本发明提供了一种自组装多肽，所述自组装多肽具有如下通式：
AC-Pro-X1-X3-X2-X3-X1-X3-X2-Pro-amide；
其中，N端为乙酰基，C端为酰胺基；
X1为带正电荷的氨基酸，X2为带负电荷的氨基酸，X3为疏水性氨基酸。
进一步的，所述X1包括Lys、Arg或His中的一种或多种。
进一步的，所述X2包括Asp和/或Glu。
进一步的，所述X3包括Val、Leu、Ile或Phe中的一种或多种。
本发明还提供了上述的自组装多肽的制备方法，所述制备方法包括固相多肽合成方法。
本发明还提供了一种自组装多肽制剂，所述自组装多肽制剂包括上述的自组装多肽。
进一步的，所述自组装多肽制剂的剂型包括粉剂或液体制剂。
进一步的，所述自组装多肽制剂还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
此外，本发明还提供了上述的自组装多肽或自组装多肽制剂在如下(a)-(c)任一项中的应用：
(a)制备止血材料；
(b)制备黏膜填充剂；
(c)制备防粘连剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的自组装多肽，具有如AC-Pro-X1-X3-X2-X3-X1-X3-X2-Pro-amide所示的通式，将自组装多肽的首尾两端设计为Pro，能够利用Pro侧链的吡咯环有促进无序卷曲的形成，可以增加多肽的溶解度，有利于肽合成时的氨基酸的缩合。同时，该自组装多肽序列中同时含有交替设置的带正电荷的氨基酸、带负电荷的氨基酸和疏水性氨基酸，能够使得多肽分子之间通过氢键、静电相互作用、疏水相互作用等非共价键自发形成稳定的聚集体，并且通过接触金属离子，或改变溶液pH值或改变溶液渗透压后发生，形成稳定的凝胶。
本发明的发明人通过实验发现，本发明提供的自组装多肽因其与传统的自组装多肽相比溶解度高，合成和纯化难度低，更易于工业化生产，并且制造成本更低。在大批量合成纯化时，纯化次数降低，单次纯化量提高，粗肽的纯品率可以达到90％以上，成本大大下降。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的多肽序列①粗肽的高效液相图谱；
图2为本发明实施例1提供的合成多肽序列①纯化后的液相图谱；
图3为本发明实施例1提供的多肽序列①的质谱图谱；
图4A为本发明实施例2提供的多肽序列①在频率扫描0.1hz-10hz条件下的储能模量；
图4B为本发明实施例2提供的多肽序列②在频率扫描0.1hz-10hz条件下的储能模量；
图4C为本发明实施例2提供的多肽序列③在频率扫描0.1hz-10hz条件下的储能模量；
图4D为本发明实施例2提供的多肽序列④在频率扫描0.1hz-10hz条件下的储能模量；
图4E为本发明实施例2提供的多肽序列⑤在频率扫描0.1hz-10hz条件下的储能模量；
图5A为本发明实施例2提供的多肽序列①在频率扫描1hz条件下的储能模量；
图5B为本发明实施例2提供的多肽序列②在频率扫描1hz条件下的储能模量；
图5C为本发明实施例2提供的多肽序列③在频率扫描1hz条件下的储能模量；
图5D为本发明实施例2提供的多肽序列④在频率扫描1hz条件下的储能模量；
图5E为本发明实施例2提供的多肽序列⑤在频率扫描1hz条件下的储能模量；
图6A为本发明实施例4提供的多肽水溶液喷涂伤口后约20s的兔背部皮肤伤口出血情况；
图6B为本发明实施例4提供的移除表面覆盖的水凝胶后的兔背部皮肤伤口出血情况；
图7A为本发明实施例5提供的多肽水溶液喷涂伤口后约15s的肝脏伤口出血情况；
图7B为本发明实施例5提供的移除多余水凝胶后的肝脏伤口出血情况；
图8A为本发明实施例6提供的注射生理盐水的兔胃后壁黏膜苏木精伊红染色的结果图；
图8B为本发明实施例6提供的注射0.5ml 10mg/ml透明质酸钠溶液的兔胃后壁黏膜苏木精伊红染色的结果图；
图8C为本发明实施例6提供的注射0.5ml 3％多肽①的兔胃后壁黏膜苏木精伊红染色的结果图；
图9A为本发明实施例7提供的未处理的兔结肠黏膜苏木精伊红染色的结果图；
图9B为本发明实施例7提供的注射生理盐水的兔结肠黏膜苏木精伊红染色的结果图；
图9C为本发明实施例7提供的注射0.5ml 10mg/ml透明质酸钠溶液的兔结肠黏膜苏木精伊红染色的结果图；
图9D为本发明实施例7提供的注射0.5ml 3％多肽①水溶液的兔结肠黏膜苏木精伊红染色的结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
目前的自组装多肽主要是AC-(RADA)4-amide为代表的多肽类型。经过广泛的研究筛选，本发明研制了一系列新型自组装多肽序列，其主要特征之一是在自组装多肽序列的两端，即氨基端和羧基端含脯氨酸。脯氨酸简称Pro或P。
具体地，根据本发明的第一个方面，提供了一种自组装多肽，所述自组装多肽具有如下通式：
AC-Pro-X1-X3-X2-X3-X1-X3-X2-Pro-amide；
其中，N端为乙酰基，C端为酰胺基；
X1为带正电荷的氨基酸，X2为带负电荷的氨基酸，X3为疏水性氨基酸。
本发明所述的自组装多肽，首、尾特别地设计为Pro，Pro侧链的吡咯环有利于无序卷曲的形成，可以增加多肽的溶解度，有利于肽合成时的氨基酸缩合。而现有的AC-(RADA)4-amide自组装多肽，在合成过程中通常需要重复投料，因此收率下降，又会带来复杂的副产物，粗肽通常要溶解到0.1％甚至更低的浓度纯化，纯化难度大，成本高。本发明提供的具有氨基酸Pro的多肽，每个位点单次投料即可反应完全，合成难度更低，收率高，粗肽的纯度即可达到90％，而且粗肽溶解度大，更利于工业化生产。通过对储能模量和粘度的综合对比，发现在一条多肽中首尾位置加两个Pro时最佳组合。同时，该自组装多肽序列中同时含有交替设置的带正电荷的氨基酸、带负电荷的氨基酸和疏水性氨基酸，能够使得多肽分子之间通过氢键、静电相互作用、疏水相互作用等非共价键自发形成稳定的聚集体，并且通过接触金属离子，或改变溶液pH值或改变溶液渗透压后发生，形成稳定的凝胶。
本发明的发明人通过实验发现，本发明提供的自组装多肽因其与传统的自组装多肽相比溶解度高，合成和纯化难度低，更易于工业化生产，并且制造成本更低。在大批量合成纯化时，纯化次数降低，单次纯化量提高，粗肽的纯品率可以达到90％以上，成本大大下降。
在一些优选的实施方式中，所述X1包括Lys、Arg或His中的一种或多种，例如可以同时为Lys、同时为Arg、同时为His，或者其中一个为Lys、另一个为Arg，或者其中一个为Lys、另一个为His等，本发明对此不做限定。
在一些优选的实施方式中，所述X2包括Asp和/或Glu，例如可以同时为Asp、同时为Glu，或者其中一个为Asp、另一个为Glu，本发明对此不做限定。
在一些优选的实施方式中，所述X3包括Val、Leu、Ile或Phe中的一种或多种，例如可以同时为Val、同时为Leu、同时为Ile、同时为Phe，或者分别为Val、Leu、Ile，分别为Leu、Ile、Phe，或者其中两个为Val、另一个为Leu，或者其中两个为Ile、另外一个为Phe等，本发明对此不做限定。
根据本发明的第二个方面，提供了上述自组装多肽的制备方法，所述制备方法包括固相多肽合成方法。
本发明所述自组装多肽，合成工艺简单，成本低，更有利于工业化生产，同时也为纳米医学材料提供更多的选择。
在一个具体的实施方式中，可以采用如下方式进行制备：
采用Fmoc保护的氨基酸为原料，树脂选用Rink Amide-MBHA Resin，用20％哌啶/DMF剪切掉树脂上的保护基团，连接第一个氨基酸，缩合剂为TBTU、HOBT，用Kaiser试剂检测连接是否完全。按照从C端到N端的顺序依次连接每个氨基酸，最后一个剪切掉保护基后用乙酸酐、DIEA对N端进行乙酰化。合成完毕后用甲醇、二氯甲烷交替冲洗5次，减压抽滤过夜除去有机溶剂。多肽剪切液比例TFA：水：TIS＝95:2.5:2.5，剪切液滴入预冷的无水***中，G4漏斗过滤得到粗肽。粗肽用制备型高效液相分离纯化，冻干后得到纯度大于95％的多肽纯品。
根据本发明的第三个方面，提供了一种自组装多肽制剂，所述自组装多肽制剂包括上述的自组装多肽。
本发明所述的自组装多肽可以制备为多种制剂剂型进行使用，例如可制成粉剂或液体制剂单独使用，也可以与甲壳素、胶原、淀粉等混合，以喷雾剂、糊剂、水凝胶来应用。此外，该自组装多肽还可以以装置的涂层来展现，如支架、导管等。自组装多肽可以分散或吸收在绷带、泡沫中，发挥止血和防止感染的作用。自组装多肽与血管收缩药物、着色剂、镇痛剂或麻醉剂等组合使用，可以混合在一起做成制剂，也可以独立包装。
需要进行说明的是，在本发明提供的自组装多肽制剂中，所述自组装多肽可以根据实际需要调整为任意浓度，例如0.1％-99％，本发明对此不作限定。在一些优选的实施方式中，所述自组装多肽的浓度不大于4％，例如可以为，但不限于4％、3％、2％、1％或分布于上述数值中的其他数值。
基于本发明自组装多肽具有较高的溶解性，在配置成1％-4％的浓度时，仍然具有较好的流动性，而商业化的AC-(RADA)4-amide多肽在2.5％的浓度下已经几乎失去流动性。对其流变性能进行对比，在接触金属离子触发或改变pH值触发自组装后，具有Pro氨基酸的多肽储能模量可达1000pa以上，而AC-(RADA)4-amide储能模量在2.5％的浓度仍不足700pa。本发明所述自组装多肽必要时需加大浓度实现较高的强度，但合成纯化简单易行，最终的成本并不会增加。AC-(RADA)4-amide多肽即使在1％的浓度下也具有很强的粘度，临床应用的多肽浓度要高达2.5％，在腔镜手术中，使用导管输送粘度较高的液体比较费力，而且用量不好把握，具有Pro的多肽在同样的储能模量条件下具有这么更低的粘度，因此在使用时更方便。
此外，本发明提供的自组装多肽在接触金属离子条件下自组装成为纳米纤维网状结构的水凝胶，具有优良的保水性和透气性，可以达到快速止血的目的，并可以为伤口愈合提供有利的环境。本发明提供的自组装多肽溶液施用于出血部位或皮肤创面，与本身含金属离子的体液接触后可以快速形成凝胶，快速封闭，起到止血和护理伤口的作用。人工合成的多肽无免疫原性，代谢产物为天然氨基酸，可以被人体吸收利用。
基于此，本发明的第四个方面提供了上述自组装多肽或自组装多肽制剂的应用。
可选地，本发明提供的自组装多肽可以作为止血材料使用：人工设计合成的多肽区别于自然材料中获得的原料，更安全，无免疫原性；高效快速的止血功效，动物实验中对皮肤肝脏的止血均在十几秒内完成；固体、液体多种剂型，可在导管、喷瓶中使用，方便快捷；液体制剂能够顺应和填充不规则创面，不需要任何组织加压，可用于体内脏器、脑部，也可用于体表止血。当用于急性或慢性创面，不但可以快速止血，高达99％的含水量能保持伤口湿润，并且适应干燥创面。区别于传统的水凝胶，多肽水凝胶是纳米纤维网与水结合的结构，吸收渗出液，隔离污染物，又具有一定的透气性，从而促进伤口愈合。
可选地，本发明提供的自组装多肽可以作为黏膜填充剂使用。内镜下黏膜切除术是一种常用的微创技术，由于其简单性和安全性，可去除大息肉(≥2cm)和早期肿瘤，而得到广泛应用。通常通过黏膜下注射，在表面黏膜和肌肉组织层之间建立垫层抬高黏膜辅助切除。自1984年以来，生理盐水(0.9wt％氯化钠)一直是用于内镜黏膜切除术的主要注射液。近来，包括高渗盐水，高渗葡萄糖水，自体血，透明质酸钠，甘油，透明质酸，琥珀酰明胶，羟丙基甲基纤维素，泊洛沙姆和纤维蛋白原在内的其他流体已被用于通过增加流体的粘度来延长垫层稳定性。但是，这些解决方案的应用在很大程度上受到未满足的安全性和持续时间的限制。具体来说，高渗盐水，右旋糖水和甘油在30分钟内将垫层的高度降低至不足50％。例如，羧甲基纤维素溶液由于粘度高，可能需要特殊的18号粘膜下注射针头导管，以最大程度地降低注射阻力。而且，透明质酸潜在地刺激残留肿瘤组织的生长。纤维蛋白原和自体血液是生物材料，可能会增加通过污染引起的感染风险。黏膜下注射液对于成功，安全，完整地清除病变起着至关重要的作用，因为它们不仅可以提起患病的黏膜，而且可以在两者之间提供一定的空隙有助于切除病灶。确保完整，安全的切除术可以减轻局部复发的风险，因此，理想的用于粘膜下抬高的注射溶液必须具有生物相容性，易于注射并提供耐用的黏膜下垫等特性。与目前消化道内窥镜中使用的黏膜***剂透明质酸钠相比，本发明提供的自组装多肽或其水凝胶制剂更易于操作，水溶液流动性更好，更易输送注射，并且在接触体液前不发生自组装，没有堵塞注射针的风险。该多肽水溶液遇体液凝胶化，无需任何光照，剪切等额外操作。并且，自组装多肽水凝胶制剂具有一定的强度，强大的保水功能使凝胶能长时间维持一定厚度，无需重复注射，切割病变黏膜后仍然维持固体形状，不外流。
可选地，本发明提供的自组装多肽可以作为防粘连剂使用。由于本发明的自组装多肽含水量高，能够占据一定的空间，具有一定的润滑防粘连作用。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
需要进行说明的是，在本发明各实施例中，多肽序列中的“AC-”表明其为乙酰基，“-amide”表明其为酰胺基，因此在序列表中不予体现。
实施例1多肽的合成
序列①(SEQ ID NO.1)：AC-Pro-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Pro-a mide(或简写为AC-PRVDVRVDP-amide)的合成
1.材料
Fmoc-Pro-OH(N-芴甲氧羰基-脯氨酸)、Fmoc-Val-OH(N-芴甲氧羰基-缬氨酸)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(N-芴甲氧羰酰基-2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-精氨酸)、Fmoc-Asp(OtBu)-OH(N-芴甲氧羰基-4叔丁酯-天冬氨酸)、Rink Amide-MBHA Resin(树脂)、TBTU(O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸)、HOBT(1-羟基苯并三氮唑)购自上海吉尔生化有限公司。哌啶、醋酸酐、DMF(N、N-二甲基甲酰胺)、TFA(三氟乙酸)、NMM(N-甲基吗啉)、***、甲醇和DCM(二氯甲烷)购自国药集团化学试剂北京有限公司。
2.合成方法
采用Fmoc固相合成法：称取1g Rink Amide-MBHA Resin用24ml DCM浸泡过夜，减压抽滤除去DCM，加入DMF清洗两变，加入30ml 20％哌啶/DMF溶液，30min后减压抽滤，依次用DMF和甲醇冲洗。茚三酮检测树脂保护基是否脱除干净。加入540mg Fmoc-Pro-OH、432.4mg HOBt、488.4mg TBTU、352μl NMM，加入30ml DMF，反应2h，取少量树脂检测是否连接完全，连接完全后加入20％哌啶/DMF溶液，脱除氨基酸Fmoc保护基，从C端到N端每个氨基酸重复以上步骤，所有氨基酸连接完成后，剪切掉最后一个氨基酸的保护基，加入2ml乙酸酐，3.2ml DIEA，反应20min，对N端进行乙酰化。DCM、DMF反复冲洗后真空干燥过夜。加入20ml的TFA剪切液，滴入预冷无水***萃取，产生白色絮状沉淀，G4漏斗过滤，冻干，得到粗肽粉末。经高效液相色谱仪纯化，收集目标峰，冻干后得到纯品。粗肽高效液相图谱可以看出精肽的含量可达到90％。质谱显示合成出的多肽具有相符合的表征。
按照此方法可以合成多种组合方式的多肽序列：
AC-Pro-Lys-Val-Glu-Val-Lys-Val-Glu-Pro-amide序列②(SEQ ID NO.2)；
AC-Pro-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-amide序列③(SEQ ID NO.3)；
AC-Pro-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Pro-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Pro-amide序列④(SEQ ID NO.4)。
粗肽进行高效液相分析，多肽纯品进行色谱和质谱测试，实验结果如图所示，其中图1为多肽序列①粗肽的高效液相图谱，图2为合成多肽序列①纯化后的液相图谱，图3为多肽序列①的质谱图谱。
实施例2流变性能检测
配制不同浓度的多肽溶液，加入适量10×PBS使溶液PBS的最终浓度为1×，溶液在接触PBS触发变成凝胶后，用勺子慢慢取出凝胶放置在流变仪平板上。将40mm平板放置在约450μm的间隙处，37℃保持5分钟，1pa的压力下，频率扫描0.1hz-10hz。多肽③④⑤(SEQ IDNO.5)在溶解时随着浓度增加粘度增大。以完全溶解时不会立刻形成凝胶的浓度为参考设置最高浓度，配置不同浓度的各多肽溶液进行储能模量检测。以①②为代表的首尾为Pro的多肽，在PBS触发成胶后储能模量可以达到1000pa以上，甚至更高，而成胶前溶液还可以保持较好的性能。
溶液浓度统计：
Figure BDA0002619617990000131
频率扫描0.1hz-10hz储能模量的结果如图4A-图4E所示。从图中可以看出在最高浓度下，两端为P的多肽储能模量可以高达1000Pa以上，高于常用的AC-(RADA)4-amide两端无P的序列在最高浓度的储能模量，显示了两端为P的序列在最高浓度可以达到更高的强度，具有更大的应用潜力。
频率扫描1hz储能模量的结果如图5A-图5E所示，与图4A-图4E所示结果一致，更直观的看到两端为P的序列具有形成更高强度凝胶的能力。
实施例3粘度测试
配制多肽溶液，流变仪选用50mm平板，设置1mm的间隙，取2ml多肽溶液，放置在平板中间。剪切速率设置为10 1/s。记录平均值。①②在4％的浓度时未检测到粘度数值，体现了溶液良好的流动性。而AC-RVDVRVDV-amide和AC-(RADA)4-amide在1％的浓度时就有较高的粘度。
Figure BDA0002619617990000141
实施例4兔背部止血实验
止血过程：配制浓度为3％的多肽①水溶液，用于兔背部止血。新西兰兔耳缘静脉注射麻醉后，在背部制造长约1.5cm的皮肤切口，切口深度至血管破裂，血液流出。用纱布搽拭掉流出的血液后，立即在伤口部位喷涂多肽水溶液，并计时。在止血过程中，不断用纱布擦拭渗出的血液，直到血液不再流出，停止计时，1分钟后移除多余的凝胶，观察伤口是否还有血液渗出。
结果：多肽水溶液喷涂伤口后，立即形成凝胶，约20s，血液不再流出(图6A)，移除表面覆盖的水凝胶后，伤口清晰可见，并不再渗血(图6B)。
实施例5兔子肝脏止血实验
止血过程：配制浓度为3％的多肽①水溶液，兔子麻醉后腹腔打开，暴露出肝脏，划破肝脏血管后血液流出。用纱布搽拭掉流出的血液后，立即在伤口部位喷涂多肽水溶液，并计时。在止血过程中，不断用纱布擦拭渗出的血液，直到血液不再流出，停止计时，1分钟后移除多余的凝胶，观察伤口是否还有血液渗出。
结果：多肽溶液水溶液喷涂伤口后遇到血液立刻形成凝胶，约15s后出血完全停止(图7A)，移除多余水凝胶后，止血仍保持(图7B)。
实施例6兔子胃黏膜下注射
新西兰兔禁食24小时，耳缘静脉注射麻醉，打开腹腔，胃前壁造口暴露胃黏膜，使用25G针将0.5ml生理盐水注射到后壁黏膜下层，观察30min后，处死兔子，取出组织在***中固定2天，石蜡包埋，切片，并用苏木精伊红染色(图8A)。
同样的方法注射0.5ml 10mg/ml透明质酸钠溶液(图8B)和0.5ml 3％多肽①水溶液(图8C)。
从结果图中可以看出，图8C中多肽注射后形成的垫层细密，不松散。图8B透明质酸钠溶液已经扩散，而图8A生理盐水并没有在黏膜层和黏膜下层之间形成充分的支撑。
实施例7兔子结肠黏膜下注射实验
新西兰兔禁食24小时，耳缘静脉注射麻醉，打开腹腔，沿结肠中线剪开，暴露结肠黏膜，使用25G针将0.5ml生理盐水注射到黏膜下层，观察30min后，处死兔子，取出组织在***中固定2天，石蜡包埋，切片，并用苏木精伊红染色(图9B)。
同样的方法注射0.5ml 10mg/ml透明质酸钠溶液(图9C)和0.5ml 3％多肽①水溶液(图9D)。取未处理的正常组织作为对照(图9A)。
从结果图中可以看出，与正常组织(图9A)相比，图9D中明显观察到细密的多肽凝胶充满***的黏膜下，经过切片固定染色等操作无松散迹象。图9C中，透明质酸钠已经流出，只有部分填充，在手术中往往需要重复注射达到持续填充的目的。而图9B中生理盐水同样没有起到填充的目的。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 赛克赛斯生物科技股份有限公司
<120> 自组装多肽、制备方法、自组装多肽制剂及应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Pro Arg Val Asp Val Arg Val Asp Pro
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Pro Lys Val Glu Val Lys Val Glu Pro
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Pro Arg Val Asp Val Arg Val Asp Val
1 5
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Pro Arg Val Asp Val Arg Pro Asp Val Arg Val Asp Pro
1 5 10
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala
1 5 10 15

Claims (8)

1.一种自组装多肽，其特征在于，所述自组装多肽的序列为SEQ ID NO.1：AC-Pro-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Pro-amide。
2.如权利要求1所述的自组装多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括固相多肽合成方法。
3.一种自组装多肽制剂，其特征在于，所述自组装多肽制剂包括权利要求1所述的自组装多肽。
4.根据权利要求3所述的自组装多肽制剂，其特征在于，所述自组装多肽制剂中自组装多肽的浓度不大于4%。
5.根据权利要求4所述的自组装多肽制剂，其特征在于，所述自组装多肽制剂中自组装多肽的浓度为4%、3%、2%或1%。
6.根据权利要求3所述的自组装多肽制剂，其特征在于，所述自组装多肽制剂的剂型包括粉剂或液体制剂。
7.根据权利要求3所述的自组装多肽制剂，其特征在于，所述自组装多肽制剂还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
8.如权利要求1所述的自组装多肽或权利要求3-7任一项所述的自组装多肽制剂在如下（a）-（c）任一项中的应用：
（a）制备止血材料；
（b）制备黏膜填充剂；
（c）制备防粘连剂。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111848736B (zh) * 2020-08-05 2021-12-31 赛克赛斯生物科技股份有限公司 自组装多肽、制备方法、自组装多肽制剂及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101037471A (zh) * 2007-04-12 2007-09-19 四川大学 一种半程电荷匹配九肽及其应用
CN102199195A (zh) * 2011-03-07 2011-09-28 华南理工大学 一类半程电荷匹配两亲性自组装短肽及其用作纳米止血材料及疏水性药物载体
CN103665110A (zh) * 2013-12-06 2014-03-26 华南理工大学 半程电荷互补型手性自组装短肽纳米生物医药材料及应用
CN106459154A (zh) * 2014-03-10 2017-02-22 三维矩阵有限责任公司 自组装肽组合物

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010041636A1 (ja) * 2008-10-06 2010-04-15 株式会社スリー・ディー・マトリックス 組織閉塞剤
CN111848736B (zh) * 2020-08-05 2021-12-31 赛克赛斯生物科技股份有限公司 自组装多肽、制备方法、自组装多肽制剂及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101037471A (zh) * 2007-04-12 2007-09-19 四川大学 一种半程电荷匹配九肽及其应用
CN102199195A (zh) * 2011-03-07 2011-09-28 华南理工大学 一类半程电荷匹配两亲性自组装短肽及其用作纳米止血材料及疏水性药物载体
CN103665110A (zh) * 2013-12-06 2014-03-26 华南理工大学 半程电荷互补型手性自组装短肽纳米生物医药材料及应用
CN106459154A (zh) * 2014-03-10 2017-02-22 三维矩阵有限责任公司 自组装肽组合物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Designed amphiphilic peptide forms stable nanoweb,slowly releases encapsulated hydrophobic drug, and accelerates animal hemostasis;Liping Ruan等;《PANS》;20090331;第106卷(第13期);5105-5109 *
手性九肽自组装及其止血活性研究;邓淑晶;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（医药卫生科技辑）》;20140515(第5期);摘要 *

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