CN109136410B - 猫泛白细胞减少症病毒lamp检测引物组、试剂盒以及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测引物组,以及应用该引物组的试剂盒和检测方法,具有以下优点:(1)扩增效率高、产量大,反应稳定、可重复性好,产物的种间特异性良好,可靠性高;检测的灵敏度达到5.01×102拷贝/uL,比传统PCR高一个数量级;(2)反应条件简单,只需要设置一个反应温度和一个终止温度即可;(3)实验设备要求较低,恒温水浴锅即可满足;(4)普通PCR方法检测至少需要2~3个小时,LAMP检测只需要60min可得到检测结果,监测更加快速、高效;(5)借助荧光染料,可目测扩增结果,检测结果直观、清晰。本发明可为FPV的早期诊断提供一种灵敏、快速的检测方法,适用于一线动物医疗或检疫人员进行大规模病原检测。
Description
技术领域
本发明属于病原微生物检测技术领域,特别涉及一种猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法。
背景技术
猫泛白细胞减少症病毒(feline panleukopenia virus,FPV),又称猫瘟热病毒,属于细小病毒科细小病毒属,该病毒为单链DNA病毒,基因组全长约5200nt,编码VP1、VP2两种结构蛋白,其中VP2蛋白为主要衣壳蛋白,是FPV的主要免疫保护性抗原蛋白。FPV感染范围较广,可感染猫科、鼬科及浣熊科动物,如猫、狮、虎、豹等;该病毒传播较快,可通过感染动物的粪便、尿液及呕吐物进行水平传播,妊娠母猫可垂直传播给胎儿;FPV致病性较强,可导致妊娠母猫流产或产畸形胎,死亡率高且无任何病前征兆。目前该病的检测主要依赖于病毒分离及血清学诊断,这些方法耗时长,成本高,不适用于临床样品的快速检测。随着动物园猫科动物及宠物猫的养殖量增多,疫病监测及防控需高度重视,建立一种适于临床检测FPV的快速检测方法迫在眉睫。
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种新型的核酸扩增技术,该技术依赖具有链置换活性的BstDNA聚合酶,利用4条特异性引物在等温条件下扩增出LAMP特有的梯状条带。LAMP技术特异性好、检测快速、操作简单,已在禽流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒及猪流行性腹泻病毒等方面成功建立了快速检测方法。本研究旨在利用LAMP技术建立一种检测FPV的高效、快速、特异性的检测方法,用于FPV的早期诊断和防控。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法。
本发明具体技术方案如下:
本发明一方面提供了一种猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测引物组,包括如下引物序列:
F3:5’-TGCATCATTGATGGTTGC-3’(如SEQ ID NO.1所示);
B3:5’-AGTAAGTGTACTGGCACAG-3’(如SEQ ID NO.2所示);
FIP:5’-GGTTGGTTTCCATGGATAAAAACCTATGCCATTTACTCCAGCAG-3’(如SEQ ID NO.3所示);
BIP:5’-CATCTCATACTGGAACTAGTGGCATGAACATCATCTGGATCTGTAC-3’(如SEQ IDNO.4所示)。
上述引物能特异性地识别FPV病毒DNA上VP2基因(长度约468bp)保守序列两端的6个位点,并使VP2基因在LAMP扩增过程中产生茎环结构,扩增效率高,且种间特异性良好,可以准确识别FPV病毒。
本发明另一方面提供了一种猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测试剂盒,所述试剂盒包括上述LAMP检测引物组,还包括LAMP反应液,所述LAMP反应液包括如下成分:
Tris-HCl 20mM、(NH4)2SO4 10mM、KCl 10mM、Triton X-100 0.1%、MgSO4 6mM、dNTP Mix 10mM、FIP引物1.6μM、BIP引物1.6μM、F3引物0.2μM、B3引物0.2μM、Bst DNA聚合酶9~12U、甜菜碱1mM以及可视化染料指示剂。
上述反应液性质温和、稳定性好,可以为LAMP反应提供适宜的反应条件,并能有效避免引物二聚体的形成,得到的反应产物特异性好、杂质少,可以提高后续分析结果的精确度。
进一步地,所述可视化染料指示剂包括钙黄绿素20μM以及氯化锰300μM。
荧光染料中含有钙黄绿素,在LAMP反应初期因与锰离子结合而处于荧光淬灭状态;随着LAMP反应的进行,钙黄绿素逐渐恢复游离、发出荧光,从而可以实时进行肉眼观察,阳性呈绿色、阴性呈橘黄色;或将扩增产物置于凝胶成像***下观察,阳性由明亮的荧光、阴性为透明或颜色较浅。通过添加荧光染料,可以将LAMP反应结果以可视化的形式进行呈现,从而获取直观的定性结果。
本发明还提供了一种应用上述试剂盒的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法,包括如下步骤:
S1:对待检样品的DNA进行提取,作为模板添加到LAMP反应液中,进行LAMP扩增;
S2:通过琼脂糖凝胶电泳以及肉眼判断,对得到的LAMP扩增产物进行分析。
进一步地,LAMP扩增的反应体系中,模板DNA的拷贝数不少于100个拷贝。
进一步地,LAMP扩增的反应条件如下:
将所述反应体系置于60~65℃的恒温水浴中反应30~60min。
进一步地,LAMP扩增反应中,恒温水浴结束后,将所述反应体系取出、置于80℃水浴中10min,终止反应。
进一步地,肉眼判断的方法如下:样品呈黄绿色则为阳性,呈橘黄色则为阴性。
应用上述反应体系、通过上述反应条件对VP2基因进行LAMP扩增,操作简便,反应灵敏、快速,终止反应后可直接通过荧光染料目测颜色反应,也可以通过2%琼脂糖凝胶电泳进行进一步验证,检测方便、准确性好。
本发明的有益效果如下:本发明提供了一种猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测引物组,以及应用该引物组的试剂盒和检测方法,应用上述试剂盒和方法对猫泛白细胞减少症病毒进行检测时,具有以下优点:(1)扩增效率高、产量大,反应稳定、可重复性好,产物的种间特异性良好;检测的灵敏度达到5.01×102拷贝/uL,比传统PCR高一个数量级;(2)不需要设置一系列温度,只需要设置一个反应温度和一个终止温度即可;(3)实验设备要求较低,恒温水浴锅即可满足;(4)普通PCR方法检测至少需要2~3个小时,LAMP检测只需要60min可得到检测结果,能在更短的时间内完成对FPV的检测;(5)借助荧光染料,可目测扩增结果,检测结果直观、清晰。本发明可为FPV的早期诊断提供一种灵敏、快速的检测方法,适用于一线动物医疗或检疫人员进行大规模病原检测。
附图说明
图1为实验例1中不同反应温度下的LAMP结果比较;
其中:1:60℃;2:63℃;3:64℃;4:65℃;5:阳性对照;6:阴性对照;M:DL2000Marker;
图2为实验例1中不同反应时间下的LAMP结果比较;
其中:7:30min;8:45min;9:60min;M:DL 2000Marker;
图3为实验例2中PCR与LAMP的敏感性实验的凝胶电泳结果比较;
其中:1:106;2:105;3:104;4:103;5:102;6:101;7:阴性对照;M:DL 2000Marker;
图4为实验例2中LAMP的荧光成像结果:
其中:1:106;2:105;3:104;4:103;5:102;6:101;7:阴性对照;M:DL 2000Marker;
图5为实验例3中LAMP的特异性实验的凝胶电泳结果;
其中:1:FPV;2:FHV;3:CAV;4:CPV;5:阴性对照;M:DL 2000Marker;
图6为实验例3中LAMP的特异性试验的荧光成像结果;
其中:1:FPV;2:FHV;3:CAV;4:CPV;5:阴性对照;M:DL 2000Marker;
图7为实验例4中临床样品的特异性实验的凝胶电泳结果;
图8为实验例4中LAMP的特异性试验的荧光成像结果。
具体实施方式
下面结合附图和以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
一种猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测引物组,其特征在于,包括如下引物序列:
F3:5’-TGCATCATTGATGGTTGC-3’;
B3:5’-AGTAAGTGTACTGGCACAG-3’;
FIP:5’-GGTTGGTTTCCATGGATAAAAACCTATGCCATTTACTCCAGCAG-3’;
BIP:5’-CATCTCATACTGGAACTAGTGGCATGAACATCATCTGGATCTGT AC-3’。
实施例2
一种猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测试剂盒,包括实施例1提供的LAMP检测引物组,还包括LAMP反应液,LAMP反应液包括如下成分:
Tris-HCl 20mM、(NH4)2SO4 10mM、KCl 10mM、Triton X-100 0.1%、MgSO4 6mM、dNTP Mix 10mM、FIP引物1.6μM、BIP引物1.6μM、F3引物0.2μM、B3引物0.2μM、Bst DNA聚合酶9~12U、甜菜碱1mM以及可视化染料指示剂。
实施例3
一种猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测试剂盒,包括实施例1提供的LAMP检测引物组以及实施例2提供的LAMP反应液,其中可视化染料指示剂包括钙黄绿素20μM以及氯化锰300μM。
实施例4
一种应用实施例3提供的试剂盒的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法,包括如下步骤:
S1:对待检样品的DNA进行提取,作为模板添加到LAMP反应液中,构建25μL的LAMP反应体系,进行LAMP扩增,反应体系中模板DNA的浓度为0.2μM;LAMP扩增的反应条件如下:
将LAMP反应体系置于60℃的恒温水浴中反应60min,恒温水浴结束后,将所述反应体系取出、置于80℃水浴中10min,终止反应;
S4:通过琼脂糖凝胶电泳以及肉眼判断,对得到的LAMP扩增产物进行分析。
实施例5
一种应用实施例3提供的试剂盒的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法,包括实施例4提供的各步骤;其中LAMP的反应条件为:将LAMP反应体系置于63℃的恒温水浴中反应60min。
实施例6
一种应用实施例3提供的试剂盒的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法,包括实施例4提供的各步骤;其中LAMP的反应条件为:将LAMP反应体系置于64℃的恒温水浴中反应60min。
实施例7
一种应用实施例3提供的试剂盒的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法,包括实施例4提供的各步骤;其中LAMP的反应条件为:将LAMP反应体系置于65℃的恒温水浴中反应60min。
实施例8
一种应用实施例3提供的试剂盒的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法,包括实施例4提供的各步骤;其中LAMP的反应条件为:将LAMP反应体系置于65℃的恒温水浴中反应30min。
实施例9
一种应用实施例3提供的试剂盒的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法,包括实施例4提供的各步骤;其中LAMP的反应条件为:将LAMP反应体系置于65℃的恒温水浴中反应45min。
实验例1
LAMP扩增条件的优化
分别采用实施例4~7提供的方法对同一批次的FPV病毒样品的保守序列VP2片段进行LAMP扩增,以去离子水作为阴性对照,并以PCDNA作为阳性对照。用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测,比较各组扩增情况。结果如图1所示,除阴性对照(第6泳道)以外的所有泳道均可见典型的“梯形”条带,表明本发明提供的LAMP反应体系成立。根据条带形状和颜色,判定泳道5的条带效果最好,即最佳反应温度为65℃。
分别采用实施例7~9提供的方法对同一批次的FPV病毒样品的保守序列VP2片段进行LAMP扩增,并以去离子水作为阴性对照。用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测,比较各组扩增情况。结果如图2所示,除阴性对照以外的所有泳道均可见典型的“梯形”条带,根据条带形状和颜色,判定泳道9的条带效果最好,即最佳反应时间为60min。
实验例2
LAMP扩增敏感性实验
将FPV病毒VP2片段的PCR扩增产物亚克隆到pMD18-T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)上,构建阳性重组质粒,测序鉴定后,用紫外分光光度计测定阳性质粒的浓度,并换算成拷贝数,得到原始阳性质粒的拷贝数为5.01×1010拷贝/μL。对于原始阳性质粒进行10倍梯度稀释,分别以5.01×106拷贝/μL、5.01×105拷贝/μL、5.01×104拷贝/μL、5.01×103拷贝/μL、5.01×102拷贝/μL以及5.01×101拷贝/μL的阳性质粒作为模板,并以去离子水作为阴性对照,采用实施例7提供的方法进行LAMP扩增。同时采用如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示引物进行PCR扩增,PCR反应体系如下:模板DNA 0.2μM、引物FPV-F 0.5μM、引物FPV-R 0.5μM以及20μL的2×PCR反应液(优选为购自于TransGene Biological Science&Technology Company的2×EasyTap SuperMix),余量为ddH20;PCR反应条件如下:94℃预变性5min;94℃变性30s,46℃退火30s,72℃延伸45s,共35个循环;循环结束后72℃延伸10min,最后4℃终止反应。
用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测,比较各组PCR扩增和LAMP扩增效果。结果如图3所示,PCR能够扩增出清晰条带的对滴拷贝数为5.01×103拷贝/μL,而LAMP能够扩增出清晰条带的最低拷贝数为5.01×102拷贝/μL,仅有5.01×101拷贝/μL以及阴性对照(第7泳道)没有荧光。表明LAMP检测的灵敏度比PCR的灵敏度高。
另外,同时对LAMP扩增产物进行肉眼观察,结果如图4所示,在凝胶成像***下,发出荧光的的LAMP样品的最小浓度为5.01×102拷贝/μL,仅有5.01×101拷贝/μL以及阴性对照(7号样品)没有荧光。由此可见,LAMP方法的目视检测下限为5.01×102拷贝/μL。
综上所述,LAMP方法的检测下限为5.01×102拷贝/μL。由此可见,LAMP检测的灵敏度比PCR的灵敏度高出一个数量级,表明LAMP法相比于PCR更适用于少量样品的检测。
实验例3
LAMP扩增特异性实验
采用实施例7提供的方法,分别对FPV、FHV(猫疱疹病毒)、CAV(犬腺病毒)以及CPV(猫细小病毒)四种临床上猫易感的病毒进行LAMP扩增,并以去离子水作为阴性对照。分别以2%琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像***对扩增产物进行检测,比较扩增结果。
琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示,只有泳道1(FPV)出现条带,包括阴性对照(第5泳道)在内的其他泳道均为出现条带。荧光成像结果如图6所示,只有FPV样品发出明显的荧光,包括阴性对照(5号样品)在内的其他样品均未出现荧光。表明本发明提供的LAMP检测方法对FPV病毒具有良好的特异性、不易产生假阳性结果。
实验例4
临床样品检测
采集10份疑似FPV病毒感染猫血清临床样品,提取病毒DNA样品,利用实施例7提供的LAMP检测方法以及实验例2提供的PCR方法同时对10份样品进行检测,比较实验结果。琼脂糖凝胶电泳结果如图7所示,其中1号、7号以及11号泳道在PCR方法和LAMP方法中均出现明显条带;荧光成像结果如图8所示,其中1号、7号以及11号样品发出明显的荧光。综上所述,根据PCR和LAMP的检测结果均能确定1号、7号以及11号样品为FPV阳性,表明LAMP检测方法与PCR检测方法同样具有高度的可靠性。同时LAMP电泳图中,5号样品也可隐约观察到梯形条带,表明LAMP检测方法可能比PCR方法灵敏度更高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)
<120> 猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测引物组、试剂盒以及检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
tgcatcattg atggttgc 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
agtaagtgta ctggcacag 19
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ggttggtttc catggataaa aacctatgcc atttactcca gcag 44
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
catctcatac tggaactagt ggcatgaaca tcatctggat ctgtac 46
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
tgtaacacct tggtcatt 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
attcatcacc tgttctta 18
Claims (7)
1.一种猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒由LAMP反应液组成,所述LAMP反应液由如下成分组成:
Tris-HCl 20mM、(NH4)2SO4 10mM、KCl 10mM、Triton X-100 0.1%、MgSO4 6mM、dNTP Mix10mM、FIP引物 1.6μM、BIP引物 1.6μM、F3引物0.2μM、B3引物0.2μM、Bst DNA聚合酶 9~12U、甜菜碱 1mM以及可视化染料指示剂;
所述FIP引物、所述BIP引物、所述F3引物以及所述B3引物的序列如下:
F3: 5’-TGCATCATTGATGGTTGC-3’;
B3: 5’-AGTAAGTGTACTGGCACAG-3’;
FIP: 5’-GGTTGGTTTCCATGGATAAAAACCTATGCCATTTACTCCAGCAG-3’;
BIP: 5’-CATCTCATACTGGAACTAGTGGCATGAACATCATCTGGATCTGTAC-3’。
2.如权利要求1所述的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测试剂盒,其特征在于,所述可视化染料指示剂包括钙黄绿素20μM以及氯化锰300μM。
3.一种应用权利要求1~2中任一项所述试剂盒的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法,其特征在于,所述方法应用于非诊断目的,包括如下步骤:
S1:对待检样品的DNA进行提取,作为模板添加到LAMP反应液中,进行LAMP扩增;
S2:通过琼脂糖凝胶电泳以及肉眼判断,对得到的LAMP扩增产物进行分析。
4.如权利要求3所述的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法,其特征在于,LAMP扩增的反应体系中,模板DNA的拷贝数不少于100个拷贝。
5.如权利要求3所述的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法,其特征在于, LAMP扩增的反应条件如下:
将所述反应体系置于60~65℃的恒温水浴中反应30~60min。
6.如权利要求5所述的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法,其特征在于,LAMP扩增反应中,恒温水浴结束后,将所述反应体系取出、置于80℃水浴中10min,终止反应。
7.如权利要求3所述的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法,其特征在于,肉眼判断的方法如下:样品呈黄绿色则为阳性,呈橘黄色则为阴性。
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