CN111826336A - 一种提取杜仲含胶细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取杜仲含胶细胞的方法。方法包括：新鲜杜仲叶经预处理、变性处理、整体透明处理和含胶细胞解离，提取杜仲含胶细胞。所述预处理包括：新鲜杜仲叶放入烘箱中进行杀青处理，并中低温下烘干至重量不变。本发明通过对新鲜杜仲叶片的预处理，改善其工艺条件，大大缩短了从杜仲叶中提取杜仲含胶细胞这一实验工艺的工艺时长，有效解决了杜仲含胶细胞在实验过程中容易破坏的问题，提高了提取效率。
Description
技术领域
本发明涉及杜仲胶技术领域，进一步地说，是涉及一种提取杜仲含胶细胞的方法。
背景技术
对于杜仲含胶细胞提取方式的研究，目前相关文献报道较少，最近的相关文献报道采用的是新鲜的杜仲植株，将其洗净沥水，剪成小段，未用固定液固定而直接采用变性试剂处理40-60小时，通过变性处理后，再经高浓度氢氧化钠水溶液并配合水浴加热进行整体透明处理约20-40小时，之后将样品过滤，流水冲洗，并用果胶酶水溶液在室温下进行离析作用45-65小时直至将杜仲含胶细胞分离出来。该技术工艺主要存在以下不足：
(1)该技术工艺反应时间过长即在实验过程中含胶细胞需要长时间与具有强氧化性的化学试剂反应，极易导致含胶细胞细胞壁破裂溶解，使得胶体流出溶解，进而影响杜仲含胶细胞的提取率。
(2)未经预处理的新鲜植株在变性反应阶段难以与化学试剂充分反反应，导致褪色不彻底，进而影响后续反应，不利于杜仲含胶细胞的提取甚至使得该实验失败。
目前所存在的杜仲含胶细胞的提取方法存在着化学污染大，提取效率不高，提取物杜仲含胶细胞纯度过低等一系列不足。
发明内容
为解决现有技术工艺时间过长，提取效率低下且提取率不高的问题。本发明提供了一种提取杜仲含胶细胞的方法。着重解决了在反应过程中尤其第一阶段即变性处理阶段，杜仲叶褪色不彻底的问题。本发明通过对新鲜杜仲叶片的预处理，改善其工艺条件，大大缩短了从杜仲叶中提取杜仲含胶细胞这一实验工艺的工艺时长，有效解决了杜仲含胶细胞在实验过程中容易破坏的问题，提高了提取效率。
本发明的目的之一是提供一种提取杜仲含胶细胞的方法。
包括：
新鲜杜仲叶经预处理、变性处理、整体透明处理和含胶细胞解离，提取杜仲含胶细胞。
其中，
所述预处理包括：新鲜杜仲叶放入烘箱中进行杀青处理，并中低温下烘干至重量不变。
杀青处理时，烘箱温度为100℃～130℃，杀青处理时间10-20分钟；然后将温度调至55℃～65℃，烘至重量不变。
所述变性处理包括：经预处理的杜仲干叶片加入到变性试剂中，搅拌使其混合均匀，密封避光保存40～50小时；
杜仲干叶片的体积为变性试剂体积的三十分之一到二十分之一。
所述整体透明处理包括：
将变性处理后的杜仲干叶片过滤，取其滤渣，并用去离子水反复冲洗干净，将过滤后的叶片加入氢氧化钠溶液中，搅拌，使得叶片完全浸入到溶液中，之后放入水浴锅中，50～65℃加热反应10～20小时。
去离子水冲洗的流速为1.5米/秒～3米/秒；
氢氧化钠溶液的质量浓度为5％～20％。
所述含胶细胞的解离包括：
将经过整体透明后的杜仲干叶片过滤，用去离子水反复冲洗滤渣，然后将滤渣放入果胶酶溶液中，35℃～55℃水浴加热30～40小时。
去离子水冲洗流速为1.5米/秒～3米/秒；
果胶酶溶液的质量浓度范围为2％～5％。
将经过果胶酶溶液处理后的杜仲干叶片过滤，用去离子水反复冲洗滤渣，直到滤渣颜色变为透明色。
本申请的方法步骤中，高温下的杀青处理是为了在短时间内使得植物里面的酶失活，新鲜的植物样品里面仍然进行着很多代谢反应,尤其是酶，可能会将想要的物质分解掉，从而影响实验结果。而低温烘干主要是将新鲜植株内的水分除去，选择这个低温范围主要是考虑杜仲叶片中杜仲胶的结晶温度为65℃，在这个温度下烘干不会影响杜仲胶的结晶。
选择两个温度的原因是短时间内把新鲜植株内部的活性酶杀死以保证植株内部理化环境不变最大限度保证植株内部的一个完整形态，较低温度下长时间烘干是为了除去叶片中的水分，这样既不影响杜仲胶的结晶形态，也可以破坏掉非胶组分(例如某些离子)的生存环境，能更好的为后续的变性处理除去非胶组分(包括色素，无机盐离子等)作准备。选择两个温度范围，能够在不影响杜仲胶结晶状态下使得后续变性处理结果更好，即杜仲叶片褪色更完全，能够最大限度的除去非胶组分。
整体透明处理过程中本申请将以往技术时长缩短，(得益于预处理阶段，即高温杀青处理和中低温下烘干至重量不变)整体透明过程中的水浴加热过程缩短至20小时以内。
本发明在含胶细胞解离过程加入了一个水浴加热过程，即将整体透明后的样品放入35℃～55℃的水浴中加热，大大缩短了工艺时长，将含胶细胞的解离时间由48小时缩短到36小时以内。
本发明具体可采用以下技术方案：
(1)新鲜杜仲叶片预处理：取适当杜仲鲜叶，洗净沥水，擦拭干净，然后将其预处理，即放入105℃的烘箱中杀青处理约10-20分钟，然后将温度调至65℃，烘至重量不变。冷却至室温后将其剪成小段，留取备用。
(2)变性处理：
变形处理是指将干燥后的叶片通过与强氧化性试剂反应，进而除去叶片中存在的叶绿素，部分无机盐离子等，即初步除去(或者说部分除去)叶片中的非胶组分。
变性试剂的配置可采用现有技术的常规方法，本发明中，可以优选按以下步骤配置：取饱和溴水约40～70毫升，加入固体碘单质2～5克，之后加入冰醋酸溶液至100～150毫升，轻轻晃动烧杯，搅拌使其充分混合。加入处理好的杜仲干叶片，使杜仲干叶片的体积约为变性试剂体积的三十分之一到二十分之一。轻轻搅拌使其混合均匀，之后密封避光保存40～50小时。
(3)整体透明处理：将变性处理后的杜仲干叶片过滤，取其滤渣，并用去离子水反复冲洗，控制水流流速使其冲去叶片上的残余化学溶剂且不破坏叶片组织结构。配置5％～20％的氢氧化钠水溶液，搅拌并轻轻震荡使其充分混合，待溶液变为透明后，将过滤后的叶片倾倒入溶液中，用玻璃棒轻轻搅拌，使得叶片完全浸入到溶液中，之后放入水浴锅中，50℃～65℃度加热反应10～20小时。
(4)含胶细胞的解离：将(3)中样品过滤，去掉滤液后用去离子水反复冲洗滤渣，控制水流流速使其缓慢流出，以便能够冲掉滤渣上的残留化学试剂且不破坏植物组织。之后称取果胶酶2克～5克，注入100毫升去离子水，轻轻搅拌使其混合均匀，之后将处理好的滤渣放入果胶酶溶液中，35℃～55℃下水浴加热30～40小时。
(5)取实验(4)中样品，用0.5mm×0.5mm网筛过滤，除掉滤液，并用去离子水反复冲洗滤渣，直到滤渣颜色变为透明色。
发明的效果
本技术发明通过对新鲜杜仲叶片的预处理，改善其工艺条件，大大缩短了从杜仲叶中提取杜仲含胶细胞这一实验工艺的工艺时长，其工艺时长缩短约为现有技术工艺时长的二分之一且有效解决了杜仲含胶细胞在实验过程中容易破坏的问题，提高了杜仲含胶细胞的提取效率。
附图说明
图1为本发明的方法流程示意图。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步说明本发明。
实施例中所用原料均为市售。
实施例1
包括如下步骤：
(1)取适当杜仲鲜叶，洗净沥水，擦拭干净，放入100℃烘箱中杀青处理10分钟，后将烘箱温度调至55℃继续烘干至叶片重量不变。取出叶片并将其裁剪为5mm×5mm的小段。
(2)配置变性试剂：取饱和溴水45ml，单质碘2.5克，加入冰醋酸至溶液体积为100ml,将裁剪后的叶片小段放入变性试剂溶液中，混合均匀，其中干叶片的体积约为变性试剂体积的三十分之一，之后放入干燥避光处，密封保存40小时，此时叶片由绿色变为金黄色，之后过滤，用去离子水反复冲洗，控制水流流速为1.5米/秒，直到叶片上无化学试剂残留。
(3)将滤渣放入质量分数为5％氢氧化钠水溶液中，充分混合使滤渣完全浸入到氢氧化钠水溶液中，并在50℃水浴中加热10小时，此时叶片几乎变为透明状，之后过滤，用去离子水反复冲洗，控制水流流速为1.5米/秒，之后再过滤，再冲洗，重复上述冲洗步骤6遍。
(4)取滤渣将其放入2％的果胶酶溶液中，35℃水浴加热30小时，之后用去离子水反复冲洗去除残留，控制水流流速为1.5米/秒，所得滤渣即为含胶细胞，所得的含胶细胞用去离子水储存，成团聚状，显微镜下表明此时含胶细胞的纯度可达95％以上。
实施例2
(1)取适当杜仲鲜叶，洗净沥水，擦拭干净，放入105℃烘箱中杀青处理15分钟，后将烘箱温度调至60摄氏度继续烘干至叶片重量不变。取出叶片并将其裁剪为5mm×5mm的小段。
(2)配置变性试剂：取饱和溴水180ml，单质碘10克，加入冰醋酸至溶液体积为400ml,将裁剪后的叶片小段放入变性试剂溶液中，混合均匀，其中，干叶片的体积约为变性试剂体积的三十分之一，之后放入干燥避光处，密封保存50小时，之后取出，此时叶片由原来的墨绿色变为金黄色，过滤，用去离子水反复洗涤，控制水流流速为2米/秒，直到滤渣上无化学试剂残留。
(3)将滤渣放入质量分数为15％氢氧化钠水溶液中，搅拌使其充分混合，并在55℃水浴中加热15小时，之后取出，此时叶片已经完全变为透明状，过滤，用去离子水洗涤，控制水流流速为2米/秒，再过滤，再冲洗，重复上述冲洗步骤6遍。
(4)取滤渣将其放入2.5％的果胶酶溶液中，40摄氏度水浴加热35小时，此时滤渣已经充分分解，之后过滤并反复冲洗滤渣以除去残留，控制去离子水水流速度为2米/秒，直到滤渣变为透明色，滤渣即为含胶细胞。所得的含胶细胞用去离子水储存，成团聚状，显微镜下表明此时含胶细胞的纯度可达95％以上.
实施例3
(1)取适当杜仲鲜叶，洗净沥水，擦拭干净，放入130℃烘箱中杀青处理20分钟，后将烘箱温度调至65摄氏度继续烘干至叶片重量不变。取出叶片并将其裁剪为5mm×5mm的小段。
(2)配置变性试剂：取饱和溴水90ml，单质碘5克，加入冰醋酸至溶液体积为200ml,将裁剪后的叶片小段放入变性试剂溶液中，混合均匀，其中，干叶片的体积约为变性试剂体积的二十分之一，之后放入干燥避光处，密封保存48小时，之后取出，此时叶片由原来的墨绿色变为金黄色，过滤，用去离子水反复洗涤，控制水流流速为3米/秒，直到滤渣上无化学试剂残留。
(3)将滤渣放入质量分数为20％氢氧化钠水溶液中，搅拌使其充分混合，并在65℃水浴中加热20小时，之后取出，此时叶片已经完全变为透明状，过滤，用去离子水洗涤，控制水流流速为3米/秒，再过滤，再冲洗，重复上述冲洗步骤6遍。
(4)取滤渣将其放入5％的果胶酶溶液中，55摄氏度水浴加热35小时，此时滤渣已经充分分解，溶液明显分层，之后过滤并反复冲洗滤渣以除去残留，控制去离子水水流速度为3米/秒，直到滤渣变为透明色，滤渣即为含胶细胞。所得的含胶细胞用去离子水储存，成团聚状，显微镜下表明此时含胶细胞的纯度可达96％以上
对比例
采用现有技术的方法：
(1)取适当杜仲鲜叶，洗净沥水，擦拭干净，将其裁剪为5mm×5mm的小段，配置变性试剂：取饱和溴水180ml，单质碘10克，加入冰醋酸至溶液体积为400ml,将裁剪后的叶片小段放入变性试剂溶液中，其中，叶片的体积约为变性试剂体积的三十分之一，混合均匀，放入干燥避光处，密封保存50小时，取出，此时发现叶片只是四周小范围变为金黄色，叶片几乎还是之前的墨绿色，过滤，用去离子水反复洗涤，控制水流流速为2米/秒，直到滤渣上无化学试剂残留。
(2)将滤渣放入质量分数为15％氢氧化钠水溶液中，搅拌使其充分混合，并在55℃水浴中加热15小时，之后取出，此时叶片并未完全变为透明状，叶片仍旧呈现绿色，叶片中的非胶组分并未除去，用去离子水洗涤，控制水流流速为2米/秒，再过滤，再冲洗，重复上述冲洗步骤6遍。
(3)取滤渣将其放入2.5％的果胶酶溶液中，40摄氏度水浴加热35小时，
取出后观察，样品呈现浑浊状态，过滤并反复冲洗滤渣，控制去离子水水流速度为2米/秒，此时发现滤渣中有大量非胶组分剩余，杜仲含胶细胞无法从中分离出来，实验失败。
Claims (10)
1.一种提取杜仲含胶细胞的方法，其特征在于所述方法包括：
新鲜杜仲叶经预处理、变性处理、整体透明处理和含胶细胞解离，提取杜仲含胶细胞。
2.如权利要求1所述的提取杜仲含胶细胞的方法，其特征在于：
所述预处理包括：新鲜杜仲叶放入烘箱中进行杀青处理，并中低温下烘干至重量不变。
3.如权利要求2所述的提取杜仲含胶细胞的方法，其特征在于：
杀青处理时，烘箱温度为100℃～130℃，杀青处理时间10-20分钟；然后将温度调至55℃～65℃，烘至重量不变。
4.如权利要求1所述的提取杜仲含胶细胞的方法，其特征在于：
所述变性处理包括：
经预处理的杜仲干叶片加入到变性试剂中，搅拌使其混合均匀，密封避光保存40～50小时。
5.如权利要求4所述的提取杜仲含胶细胞的方法，其特征在于：
杜仲干叶片的体积为变性试剂体积的三十分之一到二十分之一。
6.如权利要求1所述的提取杜仲含胶细胞的方法，其特征在于：
所述整体透明处理包括：
将变性处理后的杜仲干叶片过滤，取其滤渣，并用去离子水反复冲洗干净，将过滤后的叶片加入氢氧化钠溶液中，搅拌，使得叶片完全浸入到溶液中，之后放入水浴锅中，50℃～65℃加热反应10～20小时。
7.如权利要求6所述的提取杜仲含胶细胞的方法，其特征在于：
去离子水冲洗的流速为1.5米/秒～3米/秒；
氢氧化钠溶液的质量浓度为5％～20％。
8.如权利要求1所述的提取杜仲含胶细胞的方法，其特征在于：
所述含胶细胞的解离包括：
将经过整体透明后的杜仲干叶片过滤，用去离子水反复冲洗滤渣，然后将滤渣放入果胶酶溶液中，35℃～55℃水浴加热30～40小时。
9.如权利要求8所述的提取杜仲含胶细胞的方法，其特征在于：
去离子水冲洗流速为1.5米/秒～3米/秒；
果胶酶溶液质量浓度范围为2％～5％。
10.如权利要求8所述的提取杜仲含胶细胞的方法，其特征在于：
将经过果胶酶溶液处理后的杜仲干叶片过滤，用去离子水反复冲洗滤渣，控制水流流速为1.5米/秒～3米/秒，直到滤渣颜色变为透明色。
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|---|
| 周莉英等: "不同无性系杜仲含胶细胞长度的动态研究", 《陕西中医学院学报》 * |
| 崔跃华等: "杜仲含胶细胞的形态学研究", 《植物学通报》 * |
| 张康健等: "杜仲叶次生代谢物与个体生长发育特性的研究", 《林业科学》 * |
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