CN111825749B - 一种抗肿瘤多肽及其制备方法与用途 - Google Patents

一种抗肿瘤多肽及其制备方法与用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗肿瘤多肽及其制备方法与用途。本发明将CLDN18.2的胞外片段的目的基因导入原核表达载体，经诱导后带有载体标签的重组蛋白大量表达。经纯化后，得到较纯的重组蛋白(His)6‑CLDN18.2。随机十二肽噬菌体文库中的噬菌体与之结合，经过淘选，富集得到具有高亲和力的噬菌体。将淘选到的单克隆噬菌体扩增提取后进行测序，筛选出现频率最高的多肽。本发明所提供的抗肿瘤多肽具有显著的抗肿瘤活性，没有急性或慢性毒性作用。本发明所提供的多肽序列较短，在体内容易运输；整个多肽生产过程耗时短、成本低、操作易行，易于实现规模化生产，具有广阔的临床应用价值和前景。

Description

一种抗肿瘤多肽及其制备方法与用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗肿瘤多肽及其制备方法与用途。
背景技术
噬菌体展示技术是将蛋白质片段的编码基因片段克隆到噬菌体外壳蛋白基因的适当位置，使外源蛋白片段与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内，使得大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立直接联系。被展示的蛋白片段可以保持相对独立的空间结构，结合靶分子。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过多轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。目前有研究表明，靶点紧密连接分子claudin-18亚型2（CLDN18.2）可以在多种人类恶性肿瘤中被激活，CLDN18.2是胃上皮细胞的一个谱系特异性标记，在绝大多数健康组织中都不存在。CLDN18.2仅在分化胃细胞中的表达，不在十二指肠或胃的干细胞中表达。如若以CLDN18.2为靶标，可以避免胃肠道中毒之类的不良事件，现有技术中尚缺少CLDN18.2在抗肿瘤靶向药物中的研究。
发明内容
有鉴于此，本发明针对现有技术中存在的不足，本发明的主要目的是提供一种抗肿瘤多肽及其制备方法。本发明利用噬菌体展示技术筛选出一种具有抗肿瘤活性的多肽，其多肽序列较短，具有显著的抗肿瘤活性，无急性或慢性毒性作用，具有广阔的临床应用价值和前景。
本发明的上述目的通过如下技术方案得以实现：
一方面，本发明所提供一种抗肿瘤多肽，其氨基酸序列为：Gly Gly Ala Gln ValAsp Ile Ala Gly Lys His Gly。
另一方面，本发明还提供了一种抗肿瘤多肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）CLDN18.2的胞外片段目的基因导入原核表达载体pET-30a，构建靶蛋白表达载体pET-30a/(His)6-CLDN18.2：
（2）IPTG诱导靶蛋白表达载体大量表达，纯化得到重组蛋白(His)6-CLDN18.2；
（3）重组蛋白(His)6-CLDN18.2包被固定后与噬菌体结合淘选特异性结合靶蛋白的生物活性肽，得到抗肿瘤多肽。
另一方面，本发明还提供了前文所述抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的用途。在某一优选实施方案中，所述的抗肿瘤为治疗胃癌。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明利用噬菌体展示技术筛选得到的一种抗肿瘤多肽。本发明将CLDN18.2的胞外片段的目的基因导入原核表达载体pET-30a，经IPTG诱导后，带有载体标签的重组蛋白(His)6-CLDN18.2大量表达。经亲和层析纯化后，得到较纯的重组蛋白(His)6-CLDN18.2。包被固定后，随机十二肽噬菌体文库中的噬菌体与之结合，经过3轮淘选，富集得到具有高亲和力的噬菌体。将淘选到的单克隆噬菌体扩增提取之后，对其进行测序，并合成了出现频率最高的多肽。经验证，本发明所提供的抗肿瘤多肽具有显著的抗肿瘤活性，没有急性或慢性毒性作用。本发明所提供的多肽序列较短，在体内容易运输；整个多肽生产过程耗时短、成本低、操作易行，易于实现规模化生产，在抗肿瘤药物研发方面具有重要应用价值，具有广阔的临床应用价值和前景。
附图说明
图1是蛋白表达载体pET-30a/(His)6-CLDN18.2的构建图；
图2是SDS-PAGE验证重组蛋白(His)6-CLDN18.2的表达和纯化图；
图3是噬菌体淘选序列分布结果图。
具体实施方式
本发明公开了一种抗肿瘤多肽及其制备方法与用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。
试剂：BamHI、Hind III、T4 DNA连接酶、DH5α感受态细胞、BL21（DE3）菌株、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）均来自于上海生工生物工程公司，载体pET-30a来自于金斯瑞生物科技公司，Ni-NTA来自于李记生物科技有限公司。
实施例1：pET-30a/(His)6-CLDN18.2蛋白表达载体的构建
如图1所示构建靶蛋白表达载体pET-30a/(His)6-CLDN18.2，从Genebank数据库查找CLDN18.2的基因序列（ 1-125 AA，NM_001002026.3），设计PCR引物，上游引物序列为：5’-CGGGATCCATGGCCGTGACTGCCTGTCAC-3’，下游引物序列为：5’-CCAAGCTTGATGCCTACGATCATCAGGG-3’，下划线部分为酶切位点序列。PCR产物和载体pET-30a经BamHI和Hind III 37 ℃酶切3 h之后，用T4 DNA连接酶在16 ℃连接12 h。将连接产物转化进入 DH5α感受态细胞，然后将转化产物涂布在卡那霉素抗性（50 μg/ml）LB平板上培养直至单菌落长出，挑取单菌落，提取质粒进行酶切验证，将重组质粒测序，得到重组质粒pET-30a/(His)6-CLDN18.2。
实施例2：(His)6-CLDN18.2的表达、纯化及验证
将实施例1中制备的将重组质粒pET-30a/(His)6-CLDN18.2转化到BL21（DE3）菌株中，用卡那霉素抗性LB平板筛选重组质粒，挑取单菌落于10 ml LB液体培养基（含50 μM卡那霉素）中培养至OD600约为0.5后将培养物以体积比1: 10的比例接种于LB液体培养基，37℃剧烈震荡培养至OD600 约为0.5，加入终浓度为1 mM的IPTG于37 ℃诱导10 h，得菌液。
将菌液离心，去上清，按菌液与裂解液（50 mM Tris–HCl，20 mM 咪唑，100 mMNaCl，10% 甘油，1% 曲拉通，1 mM 蛋白酶抑制剂PMSF，1 mg/ml溶菌酶，PH 8.0）的体积比为20:1的比例将菌液重悬于裂解液中，在冰上放置30 min，超声，12000 g离心30 min收集上清得到总蛋白。将总蛋白进行BCA定量后，每10 mg总蛋白中加入1 ml的Ni-NTA，在4 ℃下结合5 h，去上清；装柱，用裂解液平衡，5倍体积的裂解液洗柱，最后用10倍柱体积的洗脱液（250 mM 咪唑，其他组分与裂解液相同）收集洗脱下来的靶蛋白。
使用SDS-PAGE验证靶蛋白的表达和纯化，将收集的靶蛋白用BCA方法定量后，每孔加入30~50 μg（纯化后蛋白为2~5 μg）的蛋白量上样。12%聚丙烯酰胺凝胶( SDS－PAGE)100V恒压下电泳100 min分离蛋白，结果如图2所示，在18kD处有较明显的目的条带。
实施例3. 噬菌体展示淘选特异性结合CLDN18.2的生物活性肽
(1) 固定靶蛋白：将600 μl浓度为17 μg/ml的靶蛋白溶液（0.1 M的NaHCO3 pH8.6）加入六孔板中，置于摇床上轻微振荡，4℃孵育过夜。用TBST（50 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl，0.1%[v/v] Tween-20 ）清洗6次后，用封阻液（0.1 M NaHCO3 pH 8.6，5 mg/ml BSA，0.02% NaN3）封闭1 h。
(2) 筛选特异性结合的噬菌体：用TBST清洗六孔板10次。扩增后的噬菌体用TBST稀释到拷贝数在109~1011之间，将稀释好的噬菌体加入到六孔板上使之与靶蛋白结合，室温孵育约60 min。TBST清洗10次，每次清洗后拍干。加洗脱液，收集特异性结合靶蛋白的噬菌体。
(3) 单克隆噬菌体信息的提取：噬菌体扩增并再经过3轮淘选后，将最后一轮洗脱下来的噬菌体感染宿主菌ER2738后铺在LB/IPTG/Xgal板上。12 h后，噬菌体蓝斑长成，挑取蓝斑并进行单克隆噬菌体扩增。以单克隆噬菌体为模板，设计PCR引物5’-TTATTCGCAATTCCTTTAG-3’ 和5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’扩增随机多肽序列，对扩增产物进行测序并分析各种随机多肽所占比例。
经3轮噬菌体淘选后，共挑取23个噬菌体蓝斑，对其分别进行扩增后收集噬菌体，设计引物对其随机多肽***序列进行了PCR扩增，对得到的噬菌体随机多肽序列进行测序。图3是噬菌体淘选序列分布结果图，如图3所示，经3轮淘选之后，共得到了5种多肽序列，分别占比例78%，11%，4%，4%，3%，最终选择比例最高的多肽序列，其序列为：Gly Gly Ala GlnVal Asp Ile Ala Gly Lys His Gly。
实施例4. 多肽抗肿瘤作用检测
本实施例采用MTT法检测实施例3中所筛选多肽序列的抗肿瘤作用。分别培养健康的MKN45、HGC27 和BGC823细胞（均购自于中科院），胰酶消化后离心，进行细胞计数，使用96孔板，每孔90 μLRPMI1640或DMEM培养基含2500个细胞。PBS稀释得到不同浓度的多肽，每孔加10 μL 不同浓度的多肽溶液，每组种3个复孔，分别在含有5% CO2、37 ℃细胞培养箱中培养，72 h后待测。每个待检测孔加10 μL 5 mg/mL的MTT溶液，于培养箱中孵育1.5 h，显微镜下观察有蓝紫色甲瓒结晶，倒出上清液，每孔加100 μL DMSO溶解结晶，摇匀，最后用酶标仪在550 nm波长处测定每孔吸光值，计算细胞的相对存活率。
表1. 针对胃癌细胞株的细胞存活率对比图。
MKN45 HGC27 BGC823
IC50（μM) 5.19 18.74 7.98
当IC50（抑制率达到50%时的多肽的浓度）处在较低的浓度范围内时就能够很好的抑制肿瘤细胞的增殖，由表1可见，本发明所筛选得到的多肽能够杀伤胃癌肿瘤细胞，可以应用于肿瘤治疗中的靶向药物。
实施例5. 多肽在体内对小鼠毒性作用观察
取6-8周昆明鼠，随机分为4组，其中三组分别为高中低剂量试验组，第四组为对照组（生理盐水），每组6只；将实施例3中得到的多肽分别用生理盐水稀释到200（低剂量组）、1000（中剂量组）、5000 μg/Kg（高剂量组）后，尾静脉注射到小鼠体内。观察并记录小鼠的各种行为学指征变化。
表2.多肽在小鼠体内毒性作用的观察
Figure 549965DEST_PATH_IMAGE002
由表2可见，将本发明所提供的多肽分别按低中高剂量尾静脉注射入小鼠体内后，对小鼠的正常饮食、***与运动等因素均未见明显的影响，，所记录各项行为学指征均正常，且在注射后一天及一周后均未发现小鼠死亡现象，说明本发明中的多肽进入小鼠体内对其没有明显的急性或慢性毒性作用。
以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (2)

1.一种抗肿瘤多肽，其特征在于，所述抗肿瘤多肽的氨基酸序列为：Gly Gly Ala GlnVal Asp Ile Ala Gly Lys His Gly。
2.权利要求1所述的抗肿瘤多肽用于制备抗肿瘤药物的用途，所述肿瘤为胃癌。
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