CN107903307B - 一种高亲和力edb-fn蛋白靶向肽及其应用 - Google Patents

一种高亲和力edb-fn蛋白靶向肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种纤连蛋白EDB亚型特异性的靶向短肽A16，其氨基酸序列为ATYRLFQGVEVV。本发明所述靶向短肽A16能特异性识别肿瘤细胞表达的EDB‑FN蛋白，对EDB‑FN的亲和力高，能携带具有诊断或治疗活性的功能分子到肿瘤细胞上，发挥诊断或治疗作用。

Description

一种高亲和力EDB-FN蛋白靶向肽及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学和免疫学技术领域，具体涉及噬菌体展示肽库技术和重组表达技术，特别是涉及一种高亲和力EDB-FN蛋白靶向肽的筛选、鉴定、制备及应用。
背景技术
众所周知，恶性肿瘤都处在一个独一无二的微环境中，促进肿瘤细胞的生长、发散与转移。在肿瘤细胞外基质中通常会异常的高表达与肿瘤相关的蛋白，其中，纤连蛋白(fibronectin)是肿瘤细胞外基质中最重要的蛋白之一，在肿瘤的发生、生长与转移的过程中起关键作用。另外，在长期的科学研究中发现，纤连蛋白的一个重要的亚型extradomain-B fibronectin(EDB-FN)在病人体内与肿瘤的生长过程高度相关，成为医学界公认的肿瘤发生与上皮间质分化重要生物标志物。EDB蛋白在人体大多数肿瘤中都有很高的表达，包括乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠直肠癌、***癌、头颈癌以及淋巴瘤、神经胶质瘤和黑色素瘤等。所以，EDB是一个极具发展前景的标志物对于肿瘤的精准检查、诊断以及治疗。
短肽对人体的生理过程(激素、神经递质、生长因子、离子通道配体以及抗感染)有着重要的作用。目前，得到确认的天然多肽超过7000条。通常短肽可以作为细胞表面受体高亲和性的信号分子，可以触发细胞内效应。由于短肽具有诱惑力的药理作用以及成本低的特点，一种新型的短肽靶向药物以及肿瘤精准成像正在成为医药领域的热门研究方向。应用短肽筛选技术获得与EDB蛋白具有高度结合力的十二肽具有广阔的应用前景。
噬菌体展示技术是一种快速高通量的蛋白多肽展示技术，利用噬菌体展示技术，能快速高通量的筛选高亲和的靶向抗体及功能性多肽。目前利用随机合成的方法，可以将多达109的不同多肽序列展示到噬菌体表面，建立起一个大库容的多肽库，通过优化筛选方法有可能筛选出不同需求的短肽分子。短肽分子较小易于穿膜，但通常亲和力较低，特别是当携带其它分子时经常发生脱靶现象。能否获得高亲和力的靶向多肽，除了受到筛选方法的条件和参数影响以外，很大程度上取决于随机因素。另外，短肽分子结构相对简单，作为靶向标记物时特异性通常也不高，特异性不足也影响了短肽作为靶向分子的应用。
发明内容
为解决上述问题，本发明通过多次对噬菌体随机肽库进行反复筛选，获得了一条对EDB-FN蛋白具有特异靶向性、高度亲和力的十二肽，并验证了其携带诊断标记特异性靶向表达EDB-FN的肿瘤细胞的功能。
一方面，一种EDB-FN蛋白靶向肽A16，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明所述EDB-FN蛋白靶向肽还可以在SEQ ID NO:1的基础上进一步通过氨基酸的取代、缺失、添加衍生，优选在SEQ ID NO:1的基础上进行1、2、3个氨基酸的取代、缺失、添加，例如在1个位点上进行氨基酸保守性取代。
第二方面，本发明提供一种缀合物，包含靶向部分和功能性部分，其特征在于所述靶向部分为所述靶向肽A16。
本发明所述的缀合物，其特征在于所述缀合物中含有一个或多个拷贝的靶向肽A16。
本发明所述的缀合物，其特征在于所述功能性部分包括选自由诊断标记、化疗药物、活性分子组成的组。
本发明所述的缀合物，其特征在于所述缀合物的各组件之间可直接连接或通过接头连接，例如所述功能性部分与所述靶向部分之间、所述多个功能性部分之间、所述多个靶向部分之间直接连接或通过接头连接。
所述直接连接优选为肽键直接连接；所述接头连接的接头例如(GGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n，其中n为2-6。
第三方面，本发明提供一种核酸，其编码：
(1)本发明所述EDB-FN蛋白靶向肽A16；或
(2)本发明所述缀合物。
本发明所述核酸既包括适应于原核细胞表达、经过原核密码子优化的核酸(例如使用大肠杆菌密码子等)，也包括适应于真核细胞表达、经过真核密码子优化的核酸(例如使用酵母密码子、哺乳动物细胞密码子等)。
本发明所述核酸可为核糖核酸(RNA)，也可为脱氧核糖核酸(DNA)。
第四方面，本发明提供一种核酸构建体，其包含本发明所述的编码核酸。
本发明所述核酸构建体中，所述编码核酸可操作的连接至启动子下游，并且含有原核和/或真核复制起始序列。
本发明所述核酸构建体可以为表达盒、操纵子、质粒、粘粒、病毒/噬菌体载体等。
第五方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明所述编码基因、或包含本发明所述核酸构建体；
本发明所述宿主能够表达本发明所述EDB-FN蛋白靶向肽A16或本发明所述包含EDB-FN蛋白靶向肽A16的缀合物。
本发明所述宿主，可以为基因工程领域常用的宿主，包括原核宿主、真核宿主。所述原核宿主包括但不限于大肠杆菌，所述真核宿主包括但不限于酵母(毕赤酵母、酿酒酵母)、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞等。
第六方面，本发明提供一种生产所述EDB-FN蛋白靶向肽A16或所述包含EDB-FN蛋白靶向肽A16的缀合物的方法，包括：
(1)制备本发明所述重组宿主细胞；
(2)在适合的条件下培养步骤(1)的宿主细胞，使其增殖；
(3)宿主细胞的状态和数量达到满足生产需求时，在适合重组生产EDB-FN蛋白靶向肽A16或其缀合物的条件下培养宿主细胞；
(4)从宿主细胞产物中分离纯化包含EDB-FN蛋白靶向肽A16或缀合物的级份。
第七方面，本发明提供所述EDB-FN蛋白靶向肽A16缀合物或其缀合物的用途，其用于制备检测或诊断EDB-FN蛋白的试剂盒。
本发明所述EDB-FN蛋白靶向肽A16缀合物或其缀合物的用途，还可以用于制备诊断或治疗与EDB-FN蛋白异常表达相关的肿瘤的药物；所述与EDB-FN蛋白异常表达相关的肿瘤包括包括乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠直肠癌、***癌、头颈癌以及淋巴瘤、神经胶质瘤和黑色素瘤。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
(1)分子较小，易于递送。本发明所述EDB-FN蛋白靶向肽A16仅有12个氨基酸的长度，容易递送和分布，从而能够对表达EDB-FN蛋白的肿瘤细胞进行检测和追踪，且不引起过敏反应、不易被患者免疫***清除。克服了现有技术以抗体分子作为靶向剂递送困难、易引起过敏反应、持续时间短快速被清除的技术问题。
(2)亲和力高，不易脱靶。本发明所述EDB-FN蛋白靶向肽A16是通过多次对噬菌体随机肽库进行反复筛选获得的对EDB-FN蛋白具有特异靶向性、高度亲和力的十二肽。动力学实验结果表明，重组表达的A16与EDB-FN的Kd值达到了1.92×10-7。
(3)耐受性好，不易失活。本发明所述EDB-FN蛋白靶向肽A16通过线性结构模拟的方式实现对肿瘤细胞EDB-FN的结合，对空间构象的依赖较低，从而能耐受其他功能活性分子的缀合，可位于缀合物的任意位置如N端、C端、中间。另外，本发明的EDB-FN蛋白靶向肽A16还可以多拷贝串联使用，从而进一步增加靶向性和可靠性。
(4)特异性高，能识别并结合表达EDB-FN的肿瘤细胞。本发明通过噬菌体随机展示肽库筛选到的EDB-FN蛋白靶向肽A16能够特异性结合表达EDB-FN的U87细胞，而不结合EDB-FN阴性的293T细胞。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1：PHAGE-ELISA试验结果。
横坐标1-12为挑取的阳性克隆，
Positive为阳性对照，
Negative为阴性对照，
纵坐标为450nm吸光度值，
结果表明第1、3、6、9、11号克隆对EDB-FN蛋白的亲和力较高，克隆1中***的外源12肽为A16。
图2：重组表达的十二肽A16与EDB-FN蛋白的结合力示意图。
三条曲线分别代表A16浓度为80μg/mL、40μg/mL及20μg/mL的结合解离示意图，测得A16对EDB-FN蛋白的结合力为：Kd＝1.92×10-7。
图3：十二肽A16的Cell immunofluorescence验证图。
U87细胞为高表达EDB-FN蛋白的阳性细胞，293T细胞为EDB-FN蛋白的阴性细胞，结果表明A16短肽可以特异性结合细胞表面的EDB-FN蛋白，对于EDB-FN蛋白阴性的293T细胞则不结合。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例一、EDB-FN蛋白靶向肽的筛选
本方法利用固定化的重组EDB-FN蛋白与十二肽库(NEB公司)混合进行筛选，步骤如下：
1.原核表达纯化EDB-FN蛋白
将构建好的pGEX-4T-3-EDB-FN的质粒转入到BL21的表达菌株中，IPTG 16℃诱导表达蛋白，GST柱纯化蛋白，得到纯度大于90％的重组EDB-FN蛋白。
2.EDB蛋白的噬菌体十二肽的筛选，步骤如下：
(1)采用固相筛选的方法，将EDB蛋白用1xPBS稀释到30-100ug/uL，包被到ELISA板条上，每孔加入100uL，4℃过夜包被；
(2)PBS洗三遍，每孔加入300uL 4％的脱脂牛奶，37℃封闭2小时；
(3)PBS洗三遍后加入十二肽噬菌体展示库(约有1x1012CFU)，37℃1小时；
(4)吸出未结合的噬菌体，加入PBS洗5-10遍(逐轮增加洗涤次数)，再用PBST洗三遍后加入100uL的PH＝2.2的甘氨酸-盐酸溶液，37℃7分钟；
(5)轻轻吹打板孔将吸附的噬菌体洗下来，然后加入Tris-HCl溶液(PH＝8.8)15uL，充分混合后取10uL测定滴度；
(6)将200uL过夜复苏的ER2738菌液加入到20mL LB-Tet培养基中，放入摇床，37℃，220rpm，2h；待菌液OD值达到0.3-0.5时，将上述洗脱库的一半加入至LB-Tet培养基中，37℃，220rpm，4h；
(7)将培养基倒入50ml试管中，配平离心(12000rpm，10min)加入4.5mlPEG-Nacl，混匀，放入冰盒，4℃冰箱保存2.5h；
(8)取出冰盒中的试管，配平离心(12000rpm，10min)，去掉上清，加1mLPBS，混匀，转移至EP管，配平离心(12000rpm,2min)，吸取上清于新的EP管中，标明名称，时间及操作者并取10uL测定滴度；
(9)根据扩增后的滴度，取噬菌体扩增库库(约有1x1012CFU)进行洗脱；
(10)经过三轮淘选后，随机从测滴度的平板上挑取克隆用辅助噬菌体M13K07进行救援，得到展示目的蛋白的噬菌粒，用PHAGE-ELISA进行验证。
表1：PHAGE-ELISA实验方案
Figure BDA0001436638520000061
PHAGE-ELISA实验结果如图1所示。挑取1号克隆，提质粒进行核酸测序确定噬菌体中***的外源12肽，并将所述外源12肽的序列命名为A16。
噬菌体质粒核酸测序结果如SEQ ID NO:2所示，其中第7-42位核苷酸片段编码***的外源十二肽，经过序列分析1号噬菌体克隆中***的十二肽A16的氨基酸序列为：ATYRLFQGVEVV(SEQ ID NO:1)。
实施例二、十二肽A16与EDB-FN蛋白的结合力测定
将十二肽A16的核酸序列***到PET28a质粒上，与EGFP编码序列融合表达，转入BL21中重组表达、纯化获得十二肽A16与EGFP的融合蛋白。
用Thermo Scientific的EZ-link Sulfo-NHS-LC-Biotin and BiothnylationKits生物素化试剂盒对实施例一中重组表达的EDB-FN蛋白进行生物素化，使得每个EDB-FN蛋白标记上2个生物素。
使用仪器：Octet RED/QK测定生物素化EDB-FN蛋白与重组A16-EGFP的结合力。
把生物素化的EDB蛋白稀释到10ug/ml(每孔200μL)，十二肽A16稀释到80μg/mL、40μg/mL及20μg/mL(每孔200μL)稀释液为PBS+0.1％的吐温-20+0.1％的BSA，按表2加样：
表2十二肽A16与EDB-FN蛋白结合力测定方案
实验组 对照组
平衡液 PBST+BSA PBST+BSA
传感器包被液 EDB+PBST+BSA EDB+PBST+BSA
平衡液 PBST+BSA PBST+BSA
反应液 PBST+BSA+A16 PBST+BSA
解离液 PBST+BSA PBST+BSA
设置检测步骤及时间如下：
(1)PBST平衡阶段，SA传感器在200μL平衡液中反应60s；
(2)Loading阶段，SA传感器在200μL蛋白稀释液中反应200s；
(3)Association阶段，SA传感器在200μL A16梯度稀释液中反应200s；
(4)Dissociation阶段，SA传感器在200μL解离液中反应200s。
注：所有阶段都在30℃，1000rpm.
结果如图2所示，测得A16对EDB-FN蛋白的结合力为：Kd＝1.92×10-7S-1。
实施例三、十二肽A16的Cell immunofluorescence验证
操作步骤如下：
(1)将U87和293T细胞分别传代至6孔板，培养至细胞融合度约为40％；
(2)将标记cy5.5的十二肽A16按5ug的量分别加入至U87和293T细胞中，放入二氧化碳培养箱，10min后取出用共聚焦显微镜进行观察。
结果如图3所示，高表达EDB-FN蛋白的U87细胞特异性结合有十二肽A16，而EDB-FN蛋白阴性的293T细胞表面则没有A16的结合。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序 列 表
<110> 申请人名称 北京大学
<120> 一种高亲和力EDB-FN蛋白靶向肽及其应用
<130> 无
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ala Thr Tyr Arg Leu Phe Gln Gly Val Glu Val Val
1 5 10
<210> 2
<211> 148
<212> DNA
<213> M13噬菌体
<400> 2
cactctgcta cgtatcggct ttttcagggg gtggaggttg ttggtggagg ttcggccgaa 60
actgttgaaa gttgtttagc aaaatcccat acagaaaatt catttactaa cgtctggaaa 120
gacgacaaac tagatgagcg aagtcccc 148

Claims (10)

1.一种EDB-FN蛋白靶向肽A16，其序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种缀合物，包含靶向部分和功能性部分，其特征在于所述靶向部分为权利要求1所述靶向肽A16；所述功能性部分包括选自由诊断标记、化疗药物、活性蛋白组成的组。
3.如权利要求2所述的缀合物，其特征在于所述缀合物中含有一个或多个拷贝的靶向肽A16。
4.如权利要求2至3任一所述的缀合物，其特征在于，所述缀合物的各组件之间直接连接或通过接头连接；所述直接连接为肽键直接连接；所述通过接头连接的接头为(GGS)n、(GGGS)n或(GGGGS)n，其中n为2-6。
5.如权利要求4所述的缀合物，其特征在于，所述功能性部分为多肽或蛋白质。
6.一种核酸，其编码：
(1)权利要求1所述EDB-FN蛋白靶向肽A16；或
(2)权利要求5所述缀合物。
7.一种核酸构建体，其包含权利要求6所述核酸。
8.一种宿主细胞，其包含权利要求6所述核酸、或包含权利要求7所述核酸构建体；所述宿主为原核细胞或真核细胞，能够表达权利要求1所述靶向肽A16或权利要求5所述缀合物。
9.一种生产权利要求1所述靶向肽A16或权利要求5所述缀合物的方法，包括：
(1)制备权利要求8的宿主细胞；
(2)在适合的条件下培养步骤(1)的宿主细胞，使其增殖；
(3)宿主细胞的状态和数量达到满足生产需求时，在适合生产权利要求1所述靶向肽A16或权利要求5所述缀合物的条件下培养宿主细胞；
(4)从宿主细胞产物中分离纯化含权利要求1所述靶向肽A16或权利要求5所述缀合物的级份。
10.权利要求1所述靶向肽A16或权利要求2至5任一项所述缀合物的用途，其用于制备检测或诊断EDB-FN蛋白的试剂盒；或用于制备诊断或治疗与EDB-FN蛋白异常表达相关的肿瘤的药物，所述与EDB-FN蛋白异常表达相关的肿瘤包括乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠直肠癌、***癌、头颈癌以及淋巴瘤、神经胶质瘤和黑色素瘤。
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