CN108918725A - 有效鉴别不同种类中华鳖的分析检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种有效鉴别不同种类中华鳖的分析检测方法，包括以下步骤：取待测中华鳖的肌肉组织碾磨均匀后加入二氯甲烷‑甲醇混合提取溶液作为提取液；将提取液进行超声辅助提取后加入超纯水再冷冻离心；在冷冻离心所得的首次水相中加入二氯甲烷进行二次提取，将冷冻离心所得的首次有机相以及二次提取获得的二次有机相进行合并，得萃取液；将萃取液放置在氮吹仪下吹干，用乙腈定容，过0.22μm有机滤膜，作为待测液；将待测液通过液相色谱质谱法进行分析检测，利用m/z790,816,818和866的磷脂离子作为潜在标记物用于中华鳖种类鉴别。采用该方法能有效区分浙乌二号、清溪乌鳖、浙新花鳖这三种中华鳖。

Description

有效鉴别不同种类中华鳖的分析检测方法
技术领域
本发明涉及建立一种分析鳖体内磷脂的脂质组学方法，特别是利用这种方法对不同种类的中华鳖和其是否掺假进行有效鉴别。
背景技术
中华鳖是一种高价值的商业物种，在中国、日本、韩国等亚洲国家，常被作为中药补品和食物进行食用。中华鳖中含有蛋白质、必需氨基酸、多不饱和脂肪酸、微量元素和其他活性物质等营养因素，可以提高人体免疫力，促进新陈代谢，预防糖尿病、贫血等。近年来，通过杂交育种得到了几种新品系中华鳖，预计将取代目前未改良的品种。然而在市场上，这些高价值的中华鳖及其加工产品被廉价甚至劣质的肉取代，以牟取商家的经济利益。由于它们外形相似，这种欺骗手段很难通过中华鳖的外部特征和解剖特征来识别，而且当其被处理加工后会进一步增加其识别的难度。因此，相关部门需要一种有效可靠的方法对中华鳖类别进行分析检测以保障消费者的食品安全。
目前对中华鳖种类的鉴定方法大多为聚合酶链式反应(PCR)、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(CAPs)、多功能靶向蛋白质组学等基因型方法。然而常用的这些方法耗时长且较为昂贵，而且当分析物较为复杂或者存在DNA污染时分析检测会受到较大的限制。此外，当所研究的物种不存在于数据库中时，需要特定的探针序列和相关的DNA测序，这使得物种鉴定的基因型方法在技术上的要求较为苛刻。
随着样品的复杂性增加，中华鳖种类鉴定需要具有高灵敏度、高选择性和较大检测范围的强大分析仪器。
浙乌二号、清溪乌鳖、浙新花鳖这三种中华鳖品系相近、外形相似，较难从肉眼上进行区分，因此急需开发能对其进行有效区分的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种有效鉴别不同种类中华鳖的分析检测方法。该方法具有高分辨率、高灵敏度、快速、可靠、经济的特点；能对浙乌二号、清溪乌鳖、浙新花鳖这三种中华鳖品系进行有效鉴定。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种有效鉴别不同种类中华鳖的分析检测方法，包括以下步骤：
1)、取待测中华鳖的肌肉组织0.2g，碾磨均匀后加入1.2±0.1mL二氯甲烷-甲醇混合提取溶液，于30±5℃振荡均匀(振荡时间约为5±1分钟)，得提取液(A品)；
所述二氯甲烷-甲醇混合提取溶液中，二氯甲烷：甲醇＝1.9～2.1：1(优先2：1)的体积比(v/v)；
2)、将提取液(A品)进行超声辅助提取后，加入0.8±0.1mL的超纯水，并将其冷冻后离心；
3)、在步骤2)冷冻离心所得的首次水相(上层)中加入2±0.2mL二氯甲烷进行二次提取，获得位于上层的二次水相和位于下层的二次有机相层；
4)、步骤2)冷冻离心所得的首次有机相(下层)以及步骤3)二次提取获得的二次有机相进行合并，得萃取液；
将萃取液放置在氮吹仪下吹干，用1mL的乙腈定容，过0.22μm有机滤膜，作为待测液；
5)、将待测液通过液相色谱质谱法(液相色谱和质谱联用的方法)进行分析检测，利用m/z790,816,818和866的磷脂离子作为潜在标记物用于中华鳖种类鉴别。
作为本发明的有效鉴别不同种类中华鳖的分析检测方法的改进：步骤5)中，
液相色谱为：液相色谱柱为YMC Triart diol液相色谱柱，4.6*250mm，3μm；色谱柱温度为40℃，流速为0.2mL·min-1，进样量为2mL；
流动相A为：先配乙酸浓度为53±5mM的乙酸乙腈溶液，再调pH至4.0～4.5；
流动相B为：在60±5mmol乙酸铵和53±5mmol乙酸中加入纯水定容至1L，并调pH至3.0±0.2；
梯度洗脱为：0-3分钟，流动相A保持在95％；3-13分钟，流动相A由95％均匀降至70％； 13-18分钟，流动相A均匀下降至50％；梯度洗脱中，每个时间段内，余量为流动相B，上述％为体积％。
备注说明：后续的18-25分钟，用纯水和乙腈对柱子进行冲洗，纯水和乙腈的体积用量比为1:1；冲洗后的柱子可重复使用。
作为本发明的有效鉴别不同种类中华鳖的分析检测方法的进一步改进：步骤5)中，
质谱测定方式：使用针泵注射器以200μL·min-1的流速，进样量为2μL将步骤4)所得的待测液(作为样品)注入大气压离子化学源中，以负离子的方式进行电离；
质谱条件为：在负离子模式下将离子喷雾电压设置在4500V，离子源温度保持在500℃；离子源气体，包括干燥气体(GS1)、雾化器气体(GS2)和气帘气分别设置为50psi、60psi 和25psi；质谱测量范围为m/z450-950，扫描速率为每个光谱1s；
使用Analyst1.5.1软件进行仪器控制和数据采集、处理和分析。
作为本发明的有效鉴别不同种类中华鳖的分析检测方法的进一步改进：步骤5)中，
当m/z816的磷脂离子丰度的相对范围在15％-21％，而且m/z790的磷脂离子丰度的相对范围在2％-4％，m/z818的磷脂离子丰度的相对范围在10％-12％时，待测中华鳖为浙乌二号；
当m/z816的磷脂离子丰度的相对范围在6％-10％时，待测中华鳖为清溪乌鳖。
当m/z816的磷脂离子丰度的相对范围在11％-14％时，待测中华鳖为浙新花鳖。
作为本发明的有效鉴别不同种类中华鳖的分析检测方法的进一步改进：步骤4)中：于 4±1℃的环境温度下，将萃取液用氮气流(40±5℃)吹干，然后再用1mL的乙腈定容，过 0.22μm有机滤膜，作为待测液。
注：控制环境温度，目的是为了最大限度地降低脂质氧化的风险。
作为本发明的有效鉴别不同种类中华鳖的分析检测方法的进一步改进，所述步骤2)中：将提取液(A品)于提取温度为50℃，53KHz的条件下超声辅助提取30±5分钟后，加入0.8 ±0.1mL的超纯水，于-20±2℃下冷冻离心15±2分钟。
作为本发明的有效鉴别不同种类中华鳖的分析检测方法的进一步改进，所述步骤3)中：在步骤2)离心所得的首次水相(上层)中加入2±0.2mL二氯甲烷进行二次提取，获得位于上层的二次水相和位于下层的二次有机相层；以二次水相替代步骤2)离心所得的首次水相重复上述二次提取1～2次；
步骤2)离心所得的首次有机相(下层)以及步骤3)所有的提取获得的二次有机相进行合并，得萃取液。
与现有的鉴定技术相比，本发明利用脂质组学的方法，通过较高的分辨率和灵敏度，以及高质量准确度的磷脂分析和测定，来区分不同品系的中华鳖。质谱(MS)、核磁共振(NMR)、气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)等分析方法的进步，加速了脂质组学的发展。而高效液相色谱和质谱联用的技术是最常用的分离和检测脂质的方法，因为它具有令人满意的分辨率、灵敏度和重现性，可以对复杂样品中的脂质进行检测分析；本发明根据磷脂酰胆碱 (PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)的特性分别设置了相应的液相色谱法和质谱法的检测条件，使得高效液相色谱和质谱联用在对样品进行检测时有较好的效果。并且根据大量实验得知，磷脂很容易在负离子模式下被电离，PE和PI分子物种被电离为[M-H]-，而 PC分子物种容易电离为[M+CH3COO]-(这是因为在流动相中添加了乙酸)，因此通过负离子的电离方式能够得到最佳的电离信号，使检测准确度和效果得到提高。
本发明为了以最小的成本获得最佳的提取性能，对影响提取过程的各种因素，例如提取温度、溶剂用量和提取时间进行了优化。在提取温度方面，当温度较低时，样品粘度随着提取温度升高而降低，使其在有机相中分散良好，但当温度升至一定程度，样品可能被氧化降解，因此步骤2)的超声提取中选择50℃为最佳提取温度；在溶剂(步骤1)中的二氯甲烷- 甲醇混合提取溶液与步骤2)中的超纯水的用量之和)用量方面，当其从0.5mL升至2mL时，磷脂样品的回收率逐渐增加，当其继续增加时回收率则保持不变，因此选择溶剂用量为2mL；在步骤2)的超声提取时间方面，提取时间为10-30分钟时，提取效率显著提高，随着提取时间的延长，标准物质与提取介质之间的接触更加充分，导致了标准物质在两相间迁移的频率较高，使提取效率保持不变，因此选择提取时间为30分钟。
此外，本发明使用乙腈作为适当的洗脱溶液，是因为其能在很大程度上有效保留目标分析物并除去干扰基质对检测结果产生的干扰，从而产生更大的丰度和更清晰的光谱，洗脱效果较好。而其他溶液例如氯仿和甲醇则会导致磷脂的严重损失。同时本发明为了提高质谱检测的灵敏度，降低基质效应，实现脂质类的最佳分离，在质谱分析前对流动相的pH值进行了优化。离子强度在亲水色谱分离中发挥了关键作用，而低pH值的流动相离子强度较弱，另外，由于带负电荷的磷酸盐基团和带正电荷的头基，PC和PE以阳离子或中性的形式存在，而pH值可能会影响这两种形态的比例。因此本发明对添加和未添加乙酸的光谱进行对比，发现加入0.1％乙酸后的光谱峰形较好，保留时间相对较短，而未酸化的流动相的光谱峰宽，呈尾状，对称性差。因此本发明选择流动相A(乙酸浓度为53±5mM的乙酸乙腈溶液，调 pH至4.0～4.5)进行液相色谱分离。
综上所述，采用本发明的方法能通过较高的分辨率和灵敏度，以及高质量准确度的磷脂分析和测定，有效鉴别不同品系的中华鳖，并且还可对复杂样品中的脂质进行检测分析。本方法还根据磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)的特性分别设置了相应的液相色谱法和质谱法的检测条件，使得高效液相色谱和质谱联用在对样品进行检测时有较好的效果。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是当(A)提取温度，(B)洗脱溶剂体积和(C)提取时间变化时磷脂标准品的回收率；
图2是清溪乌鳖(A)和磷脂标准品(B)PC,(C)PE和(D)PI的质谱图；
图3是浙新花鳖样品的(A)PC，(B)PE和(C)PI的HILIC-MS/MS色谱图；
图4是不同中华鳖品种的磷脂分子种类的主成分分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下案例中，离心的转速为8000g。
实施例1、一种有效鉴别不同种类中华鳖的分析检测方法，依次以下步骤：
1)、取待测中华鳖的肌肉组织0.2g均匀碾磨成浆状物后加入1.2mL的二氯甲烷-甲醇混合提取溶液，于30℃振荡均匀5分钟，得提取液(A品)。
二氯甲烷-甲醇混合提取溶液中，二氯甲烷：甲醇＝2：1的体积比(v/v)；
2)、将提取液(A品)于提取温度为50℃，53KHz条件下超声辅助提取30分钟后，加入0.8mL的超纯水，迅速于-20℃下冷冻离心15分钟。
3)、在步骤2)冷冻离心所得的首次水相(上层)中加入2mL二氯甲烷进行二次提取，分别得位于上层的二次水相和位于下层的二次有机相层；
以二次水相替代步骤2)离心所得的首次水相重复上述二次提取2次，
4)、步骤2)冷冻离心所得的首次有机相(下层)以及步骤3)3次提取获得的二次有机相进行合并，得萃取液；
于4±1℃的环境温度下，将萃取液放置在氮吹仪下用氮气流(40±5℃)吹干，用1mL 的乙腈定容，过0.22μm有机滤膜，作为待测液；
注：控制环境温度，目的是为了最大限度地降低脂质氧化的风险。
5)、将待测液通过液相色谱质谱法(液相色谱和质谱联用的方法)进行分析检测，利用m/z790,816,818和866的磷脂离子作为潜在标记物用于中华鳖种类鉴别，从而得到检测结果；具体如下：
液相色谱柱为YMC Triart diol液相色谱柱，4.6*250mm,3μm；
流动相A为：先配制乙酸浓度为53mM的乙酸乙腈溶液，再调pH至4.0～4.5；
流动相B为：在60mmol乙酸铵和53mmol乙酸中加入纯水定容至1L，并调pH至3.0 ±0.2；
色谱柱温度为40℃，流速为0.2mL·min-1，进样量为2mL。
梯度洗脱为：0-3分钟，流动相A保持在95％；3-13分钟，流动相A由95％均匀降至70％； 13-18分钟，流动相A均匀下降至50％；梯度洗脱中，每个时间段内，余量为流动相B，上述％为体积％。
备注说明：后续的18-25分钟，用纯水和乙腈对柱子进行冲洗，纯水和乙腈的体积用量比为1:1；冲洗后的柱子可重复使用。
液相色谱质谱法中质谱测定方式：
使用针泵注射器以200μL·min-1的流速，进样量为2μL将样品(步骤4)所得的待测液) 注入大气压离子化学源中，以负离子的方式进行电离；
质谱条件为：在负离子模式下将离子喷雾电压设置在4500V，离子源温度保持在500℃；离子源气体，包括干燥气体(GS1)、雾化器气体(GS2)和气帘气分别设置为50psi、60psi 和25psi；质谱测量范围为m/z450-950，扫描速率为每个光谱1s；
使用Analyst1.5.1软件进行仪器控制和数据采集、处理和分析。
分别选用已知为浙乌二号、清溪乌鳖、浙新花鳖品种的鳖作为样品，按照上述方法进行检测，所得结果如下：
清溪乌鳖得到的总离子色谱(TIC)和萃取离子色谱(XIC)如图2A所示，PC14：0/14：0，PE15：0/15：0和PI16：0/16：0的外标分离良好，各组间均达到基线分离。先洗脱PC14： 0/14：0(9.33分钟)，再洗脱PE15：0/15：0(11.15分钟)和PI16：0/16：0(16.17分钟)。目标物在HILIC柱上的保留能力与流动相的pH值、化合物的电离度、固定相的表面以及吸附水层之间的复杂关系有关。由于同一类内不同的磷脂分子物种具有相同的极性头，它们的保留时间非常接近，因此，通过对磷脂标准相关质谱分析，可以找到所有的磷脂分子物种。浙新花鳖，如图3所示，所显示的峰对应于不同的磷脂分子物种，这是由甘油骨架上不同的脂肪酰基取代引起的。共检测到22种PC分子，其中m/z816离子最为丰富。如表1所述；PE的光谱表现出多样性，共检测到23种PE分子物种，如m/z772([PE 38：1-H]-)、m/z742([PE 36： 2-H]-)、m/z746([O-PE 38：7-H]-)等。PI的光谱简单，离子比较容易阐明，光谱中以m/z885([PI 38：4-H]-)离子为主，在m/z909处，高不饱和[PI 40：6-H]-也很丰富。共鉴定出10种PI分子，少于PC和PE。然后，利用XIC函数的单离子电流响应得到各磷脂分子物种的峰面积，并对其相对含量进行归一化处理，利用不同中华鳖物种在处理后出现的明显特征对其进行鉴别。
表1、三种甲鱼中磷脂分子种类的特征和数量
根据上表，可以得知如下的针对清溪乌鳖、浙乌二号和浙新花鳖这三种中华鳖的判定规则；
当m/z816的磷脂离子丰度的相对范围在15％-21％，而且m/z790的磷脂离子丰度的相对范围在2％-4％，m/z818的磷脂离子丰度的相对范围在10％-12％时，待测中华鳖为浙乌二号；
当m/z816的磷脂离子丰度的相对范围在6％-10％时，待测中华鳖为清溪乌鳖。
当m/z816的磷脂离子丰度的相对范围在11％-14％时，待测中华鳖为浙新花鳖。
实施例2、将实施例1步骤2中的超声提取温度参数分别设置成40℃、50℃、60℃；其余等同于实施例1。所得回收率的结果的对比如图1A所述。
根据该图1A，可得知其最佳提取温度为50℃。
实施例3、
将实施例1步骤1)中的二氯甲烷-甲醇混合提取溶液与步骤2)中的超纯水的用量之和分别设置成0.5mL、1mL、2mL和3mL(二氯甲烷-甲醇混合提取溶液：超纯水＝1.5:1的体积比)；其余等同于实施例1。所得回收率的结果的对比如图1B所述。
根据该图1B，可得知最佳提取溶剂体积为2mL。
实施例4、将实施例1步骤2)中的超声提取时间参数分别设置成10、20、30、40和50分钟；其余等同于实施例1。所得回收率的结果的对比如图1C所述。
根据该图1C，可得知最佳提取时间为30分钟。
实验1：在PC、PE、PI这3种磷脂标准品均设置5种浓度水平(0.1、1、10、100、 200μg·mL-1)的基础上，采用截距线性回归和1/x加权因子线性回归，建立了磷脂标准的校正曲线。如表2所示，在LOQ～200μg·mL-1范围内线性关系良好，相关系数R2在0.9978-0.9985 之间，峰面积(Y)与所考察的化合物浓度(x，μg·mL-1)呈良好的线性关系。
LOD和LOQ可以准确识别和确定分析物的最小浓度。这两个参数用于评估所提出的基于HILIC的脂质组学方法的灵敏度。通过采用分别为3和10的信噪比(噪声和峰值强度之比)来计算LOD和LOQ值。如表2所示，LOD和LOQ值小于0.48μg·mL-1和1.36μg·mL-1，表明在优化的色谱和光谱参数下，该方法具有较高的灵敏度。
表2、三种磷脂标准品的校准曲线，相关系数，检测限(LOD)和定量限(LOQ)
方法的精密度以相应的日间精密度和日内精密度来评价。以50μg·mL-1的磷脂标准加入中华鳖样品。然后，使用前面描述的方法提取强化样品。对于日内精密度，在三个连续测试中对样品溶液进行六次重复分析；对于日间精密度，通过6天的运算得到结果。如表3所示，日内和日间的变异分别小于5.63％和7.29％，表明该方法具有较好的精密度。
对提取前加入50μg·mL-1磷脂标准的中华鳖样品进行了回收实验，与同浓度的无实际样品提取物的样品进行了回收率的比较，结果表明，样品中磷脂含量为50μmol·mL-1时，样品的回收率为100％。PC14：0/14：0，PE15：0/15：0，PI16：0/16：0的相对回收率在86.4％-93.6％之间，相对标准偏差小于5.89％，表明该方法具有良好的回收率。
表3、三种不同磷脂标准的HILIC-MS/MS方法得到的精确度和回收率
实验2：采用本发明建立的检测方法对18只中华鳖样本(每种中华鳖的6个平行样本) 进行检测，三种品系中华鳖样本分别为浙新花鳖(ZXH)，清溪乌鳖(QXW)和浙乌二号(ZWE)，并对结果进行数理统计分析。图4的上图显示了中华鳖样本(D1和D2)的前两个主要成分，分别解释了50.8累积百分比(cum％)值和49.2cum％的数据集总方差。这些中华鳖样本被很好地聚类成三个具有统计意义的组(ST-ZXH，ST-QXW和ST-ZWE)，并分布在图中的不同位置。为了揭示影响这三个簇间分离的最有影响的磷脂分子物种，通过构造加载图，计算了确定原始变量权重的系数。图4的下图显示了D1和D2中变量的负载情况。大多数已鉴定的磷脂分子物种聚集在中心零线附近，而其他对差异有显著影响的离子远离蓝色圈。例如，在加载值为0.71的D1中，m/z816是主要贡献者，而在加载值分别为0.46、0.42和0.51的 D2中，m/z790、818和866是主要特征值。这些离子可作为鉴别中华鳖品系的潜在标记。
每种种类的鳖都分别有六个样品，一共对这十八中样品进行检测，根据得到的每种样品的数据得到该图4，发现同一种种类的样品数据可以很好的聚集在一起，而且三个圈(代表三种类型鳖)互相不重叠，说明该方法能很好的区别不同种类的鳖。
将完善的基于HILIC的脂质组学方法应用于六个随机收集的盲样品。所提出的潜在标记物m/z790,816,818和866的磷脂离子用于甲鱼株的分化。暂时将4个样品鉴定为ZWE，因为它们具有相对高的m/z816丰度和低水平的m/z790和818。另外两个盲样品由于其低水平的 m/z816和866而被归类为QXW。为了验证和确认，将结果导入PCA图中，表明四个ZWE 样品和两个QXW样品均聚集良好。说明基于高效液相色谱和质谱联用的脂质组学方法在三种中华鳖快速鉴定中具有很大的优势，能够为有效鉴别不同种类中华鳖并鉴定其是否掺假提供相关依据和参考，从而保障消费者的食品安全。
验证实验、将事先已知为清溪乌鳖、浙乌二号和浙新花鳖、黄河鳖、江西鳖，按照实施例1所述方法进行检测(每个种类的中华鳖分别设置3个组别)，所得结果分别如表4所述：
表4
对比试验1、将实施1中的流动相A为由“先配乙酸浓度为53±5mM的乙酸乙腈溶液，再调pH至4.0～4.5”改成“乙腈”，其余等同于实施例1。将完全同验证实验所用的鳖，按照此对比试验1所述方法进行检测。所得结果与验证实验的对比如下表5所述。
对比试验2、将实施1中的流动相A中的“乙腈”改为“甲醇”；其余等同于实施例1。将完全同验证实验所用的鳖，按照此对比试验2所述方法进行检测。所得结果与验证实验的对比如下表5所述。
表5、关于m/z816的磷脂离子丰度(％)
对比试验3、将PC中其他离子的相对含量与作为潜在标记离子的m/z790、m/z816、m/z818 的相对含量进行对比。如表6所示，我们可以发现除该三种标记离子之外的其他离子在三个品种的中华鳖之间差别不大，因此无法作为潜在标记物，进一步的确定了m/z790、m/z816、 m/z818可用于对清溪乌鳖、浙乌二号、浙新花鳖的鉴别。
表6
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.有效鉴别不同种类中华鳖的分析检测方法，其特征在于包括以下步骤：
1)、取待测中华鳖的肌肉组织0.2g，碾磨均匀后加入1.2±0.1mL二氯甲烷-甲醇混合提取溶液，于30±5℃振荡均匀，得提取液；
所述二氯甲烷-甲醇混合提取溶液中，二氯甲烷：甲醇＝1.9～2.1：1的体积比；
2)、将提取液进行超声辅助提取后，加入0.8±0.1mL的超纯水，然后冷冻离心；
3)、在步骤2)冷冻离心所得的首次水相中加入2±0.2mL二氯甲烷进行二次提取，获得位于上层的二次水相和位于下层的二次有机相层；
4)、步骤2)冷冻离心所得的首次有机相以及步骤3)二次提取获得的二次有机相进行合并，得萃取液；
将萃取液放置在氮吹仪下吹干，用1mL的乙腈定容，过0.22μm有机滤膜，作为待测液；
5)、将待测液通过液相色谱质谱法进行分析检测，利用m/z790,816,818和866的磷脂离子作为潜在标记物用于中华鳖种类鉴别。
2.根据权利要求1所述的有效鉴别不同种类中华鳖的分析检测方法，其特征在于所述步骤5)中，
液相色谱为：液相色谱柱为YMC Triart diol液相色谱柱，4.6*250mm，3μm；色谱柱温度为40℃，流速为0.2mL·min-1，进样量为2mL；
流动相A为：先配乙酸浓度为53±5mM的乙酸乙腈溶液，再调pH至4.0～4.5；
流动相B为：在60±5mmol乙酸铵和53±5mmol乙酸中加入纯水定容至1L，并调pH至3.0±0.2；
梯度洗脱为：0-3分钟，流动相A保持在95％；3-13分钟，流动相A由95％均匀降至70％；13-18分钟，流动相A均匀下降至50％；梯度洗脱中，每个时间段内，余量为流动相B，上述％为体积％。
3.根据权利要求2所述的有效鉴别不同种类中华鳖的分析检测方法，其特征在于所述步骤5)中，
质谱测定方式：使用针泵注射器以200μL·min-1的流速，进样量为2μL将步骤4)所得的待测液注入大气压离子化学源中，以负离子的方式进行电离；
质谱条件为：在负离子模式下将离子喷雾电压设置在4500V，离子源温度保持在500℃；离子源气体，包括干燥气体(GS1)、雾化器气体(GS2)和气帘气分别设置为50psi、60psi和25psi；质谱测量范围为m/z450-950，扫描速率为每个光谱1s；
使用Analyst1.5.1软件进行仪器控制和数据采集、处理和分析。
4.根据权利要求3所述的有效鉴别不同种类中华鳖的分析检测方法，其特征在于所述步骤5)中，
当m/z816的磷脂离子丰度的相对范围在15％-21％，而且m/z790的磷脂离子丰度的相对范围在2％-4％，m/z818的磷脂离子丰度的相对范围在10％-12％时，待测中华鳖为浙乌二号；
当m/z816的磷脂离子丰度的相对范围在6％-10％时，待测中华鳖为清溪乌鳖；
当m/z816的磷脂离子丰度的相对范围在11％-14％时，待测中华鳖为浙新花鳖。
5.根据权利要求1～4任一所述的有效鉴别不同种类中华鳖的分析检测方法，其特征在于所述步骤4)中：于4±1℃的环境温度下，将萃取液用氮气流吹干，然后再用1mL的乙腈定容，过0.22μm有机滤膜，作为待测液。
6.根据权利要求1～4任一所述的有效鉴别不同种类中华鳖的分析检测方法，其特征在于：
所述步骤2)中：将提取液于提取温度为50℃，53KHz的条件下超声辅助提取30±5分钟后，加入0.8±0.1mL的超纯水，于-20±2℃下冷冻离心15±2分钟。
7.根据权利要求1～4任一所述的有效鉴别不同种类中华鳖的分析检测方法，其特征在于所述步骤3)中：在步骤2)离心所得的首次水相中加入2±0.2mL二氯甲烷进行二次提取，获得位于上层的二次水相和位于下层的二次有机相层；以二次水相替代步骤2)离心所得的首次水相重复上述二次提取1～2次；
步骤2)离心所得的首次有机相以及步骤3)所有的提取获得的二次有机相进行合并，得萃取液。
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