CN111796096A - 一种新型冠状病毒IgGIgM抗体联合检测试剂制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种新型冠状病毒IgGIgM抗体联合检测试剂制备方法,具体涉及生物技术领域,用磷酸盐缓冲液将鼠抗人IgM单克隆抗体稀释到包被浓度为2.0至5.0mg/ml;将鼠抗人IgG单克隆抗体稀释到包被浓度为1.0至3.0mg/ml;将鼠抗新型冠状病毒N抗原抗体稀释成包被浓度为1.0至5.0mg/ml;包被液划到硝酸纤维素膜上;进行干燥并储存备用;将标记浓度为30至50μg/ml的重组新型冠状病毒N抗原与胶体金进行偶联制得胶体金标记的复合物,以转速为10000转/分钟离心20分钟,弃上清;然后加入胶体金结合物稀释液至原体积的80%,然后用稀释液按50μl/cm2浸泡涂抹玻璃纤维素膜制成金标垫;装配成反应板,装卡后,装入铝箔袋内制成检测试剂。本发明可提高检出的灵敏度与特异性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种新型冠状病毒IgGIgM抗体联合检测试剂制备方法。
背景技术
冠状病毒(Coronavirus)是一类广泛存在于人类、动物和鸟类的RNA病毒,其能导致呼吸道、胃肠、肝部以及神经等部位的疾病。目前已知6种冠状病毒感染人,其中四个(229E、OC43、NL63和HKU1)普遍存在,并感染少量免疫力低下人群,造成普通感冒的症状;另外两个至重症急性呼吸综合征病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS至CoV)和中东呼吸道综合征病毒(Middle east respiratory syndromecoronavirus,MERS至CoV)来源于动物,但曾在部分地区发生广泛的感染,导致死亡及大量的经济损失。
新冠病毒核酸检测在中国《新冠肺炎诊疗方案》第一版到第七版,一直是公认的最准确的确证检测方法学。但该技术对实验场所人员要求高、操作繁琐、耗时长,检测人员感染风险高,结果受标本质量、病毒感染部位及表达量等因素影响较大,核酸单项检测并不能满足排查诊断的要求。作为机体免疫***抵抗病毒的重要效应分子,血清特异性抗体是诊断感染的另一关键证据。抗体检测的操作简单便捷,对实验环境及人员要求不甚苛刻,仅需采集血液标本,很大程度上降低医护人员在标本采集和检测过程中被感染的风险,是快速筛查和核酸辅助诊断的重要手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型冠状病毒IgGIgM抗体联合检测试剂制备方法,用人源化的鼠抗人IgM单克隆抗体和人源化的鼠抗人IgG单克隆抗体划检测线T1/T2,采用捕获法原理直接捕获检测样本中的全部IgM和IgG抗体,可以有效的避免和减少样本中其他IgG、IgM等抗体的产生的非特异性干扰,提高检出的灵敏度与特异性。
本发明提供了如下的技术方案:
一种新型冠状病毒IgGIgM抗体联合检测试剂制备方法,具体步骤如下:
S1、用磷酸盐缓冲液将鼠抗人IgM单克隆抗体稀释到包被浓度为2.0至5.0mg/ml;
将鼠抗人IgG单克隆抗体稀释到包被浓度为1.0至3.0mg/ml;
将鼠抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原抗体稀释成包被浓度为1.0至5.0mg/ml;
用金标划线机将三种包被液划到硝酸纤维素膜上,分别标记T1、T2和C;
然后干燥后即获得划线硝酸纤维素膜,进行干燥并储存备用;
S2、将标记浓度为30至50μg/ml的重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原与胶体金进行偶联制得胶体金标记的复合物,以转速为10000转/分钟离心20分钟,弃上清;
然后加入胶体金结合物稀释液至原体积的80%,然后用稀释液按50μl/cm2浸泡涂抹玻璃纤维素膜制成金标垫,进行干燥并储存备用;
S3、将划线硝酸纤维素膜、金标垫、吸水纸、样品垫装配成反应板,再用切条机切成3至4mm的试纸条,装卡后,装入铝箔袋内制成检测试剂。
优选的,S1至S3步骤中,硝酸纤维素膜、金标垫和抗原垫的制备中干燥条件为37℃干燥3小时。
优选地,S1步骤中,用人源化的鼠抗人IgM单克隆抗体和人源化的鼠抗人IgG单克隆抗体划检测线T1/T2。
优选地,所述检测线T1以包被浓度为2.0mg/ml的人源化鼠抗人IgM单克隆抗体划线;
所述检测线T2以包被浓度为1.4mg/ml的人源化鼠抗人IgG单克隆抗体划线;
所述质控线以包被浓度为1.2mg/ml的鼠抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原抗体划线;
所述胶体金标记的重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原的标记浓度为30μg/ml。
优选地,所述胶体金的制备方法为,在100ml双蒸水中加入1%氯金酸溶液1.0ml煮沸,在搅拌条件下加入1.6ml的1%柠檬酸三钠溶液,继续煮沸5分钟,冷却至室温备用。
优选地,所述胶体金标记重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原的pH为9.0~9.4;重组新型冠状病毒(SARS至CoV至2)N抗原浓度为30μg/ml;
胶体金标记重组新型冠状病毒(SARS至CoV至2)N抗原稀释比例为1:0.8;
金标垫的制备条件为稀释后的胶体金结合物按50μl/cm2浸泡涂抹。
本发明的有益效果:
(1)本发明用人源化的鼠抗人IgM单克隆抗体和人源化的鼠抗人IgG单克隆抗体划检测线T1/T2,采用捕获法原理直接捕获检测样本中的全部IgM和IgG抗体,可以有效的避免和减少样本中其他IgG、IgM等抗体的产生的非特异性干扰,提高检出的灵敏度与特异性。
(2)本发明样品垫为聚酯纤维膜,可过滤一定量的全血。在检测中只需10ul的末梢全血即可进行检测,操作简单方便,增加了产品的适用性;
(3)本发明具有快速、简便、准确和灵敏度高的特点,整个操作时间仅需15分钟就可判读结果,不需要辅助仪器,可直接肉眼观察结果,适用范围广,可单份检测,易于普及,对于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的检测和控制效果明显。
具体实施方式
胶体金颗粒的选择:根据煮沸条件下氯金酸与柠檬酸三钠发生氧化还原反应制备胶体金。通过调节氯金酸和柠檬酸三钠的加入比例来改变和控制胶体金的颗粒大小。
在100ml双蒸水中加入1%氯金酸溶液1ml煮沸,在搅拌条件下加入不同量的1%柠檬酸三钠溶液,继续煮沸5分钟以制备不同大小的胶体金颗粒,自然冷却待用。用不同大小的胶体金标记重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原,以企业内部质控品为研究材料进行检测,结果详见表1,表2。
表1-1%柠檬酸三钠用量的选择实验——胶体金颗粒大小的选择(1)
表2-内部质控品检测结果——胶体金颗粒大小的选择(2)
结果分析:表1、表2可以看出,2号胶体金溶液颜色紫红、透亮,无混浊及漂浮物,标记后的胶体金重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原其敏感性、特异性最好,故选择制备胶体金的工艺条件为:在100ml双蒸水中加入1%氯金酸溶液1.0ml煮沸,在搅拌条件下加入1.6ml的1%柠檬酸三钠溶液,继续煮沸5分钟,自然冷却待用。
胶体金标记重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原工艺的优化;胶体金由于静电作用形成带负电的疏水胶溶液,胶体金在弱碱环境下带负电荷,可与重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原的正电荷基团形成牢固的结合,形成稳定的重组新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)N抗原金标记物。
胶体金标记最适PH值的选择:取若干个1.5ml离心管,分别加入1.0ml胶体金,用5.0mol/L的HCl和0.1mol/L的K2CO3将pH分别调整为3,4,5,6,7,8,9,10。每管加入50μg的重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原,混匀,室温放置10分钟。每管加入100μl 10%NaCl溶液,混匀,室温放置2小时,观察胶体金颜色变化,记录胶体金颜色保持不变的最低pH(X)。调整pH为X-0.8、X-0.4、X、X+0.4、X+0.8,重复以上步骤,胶体金颜色保持不变的最低pH值即为标记的最适pH值。结果详见表3、表4。
表3.胶体金标记最适PH值的选择(1)
表4.胶体金标记最适PH值的选择(2)
结果分析:从表3、表4可以看出,当pH值为9.0~10.0时,金标记重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原的稳定性好,故选定胶体金标记的最适pH值为9.0,即加入 0.1mol/L的K2CO3 29μl/ml。
重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原最适标记量的选择
取若干个1.5ml离心管,分别加入1ml胶体金,用0.1mol/L的K2CO3将pH分别调整为9.0。每管依次分别按5μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μ g加入重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原,混匀,室温放置10分钟。每管加入100 μl 10%NaCl溶液,混匀,室温放置2小时,观察胶体金颜色变化,记录胶体金颜色保持不变的最低重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原加入量,胶体金颜色保持不变的最低重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原加入量即为标记的重组新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)N抗原最适标记量。结果详见表5。
表5-重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原最适标记量的选择
结果分析:从表5可以看出,当加入的重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原浓度为30~40μg/ml时,金标记重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原不变色,故选定重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原最适标记量为30μg/ml。
3检测线T2包被浓度和胶体金标记重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原稀释比例的选择;按照上述确定好的金标记工艺标记重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原,将其体积浓缩至原体积的1/10,再以不同的稀释比例稀释浓缩液,用稀释液按50μl/cm2 涂金标垫,干燥备用;以不同检测线T2包被浓度按1.2μl/cm的包被量包被硝酸纤维素膜(NC膜)检测线。将金标垫和划线NC膜配对,检测内部质控血清,实验方案如表 6,实验结果如表7、表8。
表6-试验设计方案
表7为10份阳性内部质控品和最低检出限质控品检测结果
表8为10份阴性内部质控品检测结果
结果分析:通过表7、表8结果可以看出D2组合的灵敏度高,特异性好,故将检测线的包被浓度定为1.4mg/ml,按1.2μl/cm的包被量包被NC膜检测线;将胶体金标记重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原稀释比例定为1:0.8,即胶体金结合物稀释液加入至原体积的80%,原体积以胶体金体积计算。金标垫的制备条件为稀释后的胶体金结合物按50μl/cm2浸泡涂抹。
检测线T1包被浓度的选择:将人源化鼠抗IgM抗体配成不同浓度,与制备好的其他组分配套使用,用内部质控品进行检测,结果详见表9。
表9为检测线T1不同包被浓度检测结果
结果分析:通过表9结果可以看出当T1的包被浓度为2.0mg/ml时,灵敏度高,特异性好,故将检测线T1的包被浓度定为2.0mg/ml。
质控线包被浓度的选择:将鼠抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原抗体配成不同浓度,与制备好的其他组分配套使用,用内部质控品进行检测,结果详见表10。
表10为质控线检测结果
结果分析:从表10可以看出,当C线抗体浓度≥1.2mg/ml时,反应到达最大值,所以选择最适质控线生物素浓度为1.2mg/ml。
综上所述,NC膜最终包被条件为:
包被量为1.2μl/cm;
检测线T1包被浓度:鼠抗人IgM单克隆抗体为2.0mg/ml;
检测线T2包被浓度:鼠抗人IgG单克隆抗体为1.4mg/ml;
质控线包被浓度:生物素为1.2mg/ml。
划线NC膜和金标垫干燥条件的选择:适宜的干燥条件,不仅影响试剂盒的灵敏度,而且关系到试剂盒的稳定性。结果表明,在干燥环境为37℃条件下,干燥3小时制备的试纸条,其敏感性,稳定性均较好,故选择37℃条件下干燥3小时为划线NC膜和金标垫生产的干燥条件。
本发明将人源化鼠抗人IgM单克隆抗体、人源化鼠抗人IgG单克隆抗体、鼠抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原抗体分别以条带状固定在NC膜上,金标记的重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原吸附在金标垫上,当含有新型冠状病毒IgG/IgM抗体的待测样品加到试纸条的样品垫上后,通过毛细作用向前移动,溶解金标垫上胶体金标记的重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原后相互反应,再移动至固定在NC膜的人源化鼠抗人IgM单克隆抗体(T1)、人源化鼠抗人IgG单克隆抗体(T2)区域反应形成金标记免疫复合物而被截留,聚集在检测带上。通过可目测的胶体金标记物检测人全血、血清或血浆中的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)IgG、IgM抗体。用人源化的鼠抗人IgM单克隆抗体和人源化的鼠抗人IgG单克隆抗体划检测线T1/T2,采用捕获法原理直接捕获检测样本中的全部IgM和IgG抗体,可以有效的避免和减少样本中其他IgG、IgM等抗体的产生的非特异性干扰,提高检出的灵敏度与特异性。样品垫为聚酯纤维膜,可过滤一定量的全血。在检测中只需10ul的末梢全血即可进行检测,操作简单方便,增加了产品的适用性;具有快速、简便、准确和灵敏度高的特点,整个操作时间仅需15分钟就可判读结果,不需要辅助仪器,可直接肉眼观察结果,适用范围广,可单份检测,易于普及,对于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的检测和控制效果明显。
以上仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种新型冠状病毒IgGIgM抗体联合检测试剂制备方法,其特征在于,具体步骤如下:
S1、用磷酸盐缓冲液将鼠抗人IgM单克隆抗体稀释到包被浓度为2.0至5.0mg/ml;
将鼠抗人IgG单克隆抗体稀释到包被浓度为1.0至3.0mg/ml;
将鼠抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原抗体稀释成包被浓度为1.0至5.0mg/ml;
用金标划线机将三种包被液划到硝酸纤维素膜上,分别标记T1、T2和C;
然后干燥后即获得划线硝酸纤维素膜,进行干燥并储存备用;
S2、将标记浓度为30至50μg/ml的重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原与胶体金进行偶联制得胶体金标记的复合物,以转速为10000转/分钟离心20分钟,弃上清;
然后加入胶体金结合物稀释液至原体积的80%,然后用稀释液按50μl/cm2浸泡涂抹玻璃纤维素膜制成金标垫,进行干燥并储存备用;
S3、将划线硝酸纤维素膜、金标垫、吸水纸、样品垫装配成反应板,再用切条机切成3至4mm的试纸条,装卡后,装入铝箔袋内制成检测试剂。
2.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒IgGIgM抗体联合检测试剂制备方法,其特征在于:S1至S3步骤中,硝酸纤维素膜、金标垫和抗原垫的制备中干燥条件为37℃干燥3小时。
3.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒IgGIgM抗体联合检测试剂制备方法,其特征在于:S1步骤中,用人源化的鼠抗人IgM单克隆抗体和人源化的鼠抗人IgG单克隆抗体划检测线T1/T2。
4.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒IgGIgM抗体联合检测试剂制备方法,其特征在于:所述检测线T1以包被浓度为2.0mg/ml的人源化鼠抗人IgM单克隆抗体划线;
所述检测线T2以包被浓度为1.4mg/ml的人源化鼠抗人IgG单克隆抗体划线;
所述质控线以包被浓度为1.2mg/ml的鼠抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原抗体划线;
所述胶体金标记的重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原的标记浓度为30μg/ml。
5.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒IgGIgM抗体联合检测试剂制备方法,其特征在于:所述胶体金的制备方法为,在100ml双蒸水中加入1%氯金酸溶液1.0ml煮沸,在搅拌条件下加入1.6ml的1%柠檬酸三钠溶液,继续煮沸5分钟,冷却至室温备用。
6.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒IgGIgM抗体联合检测试剂制备方法,其特征在于:所述胶体金标记重组新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N抗原的pH为9.0~9.4;重组新型冠状病毒(SARS至CoV至2)N抗原浓度为30μg/ml;
胶体金标记重组新型冠状病毒(SARS至CoV至2)N抗原稀释比例为1:0.8;
金标垫的制备条件为稀释后的胶体金结合物按50μl/cm2浸泡涂抹。
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