CN108398565A - 用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡与制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测犬C‑反应蛋白的免疫荧光层析检测卡与制备方法;旨在提供一种灵敏度高,检测结果可靠的用于检测犬C‑反应蛋白的免疫荧光层析检测卡;其技术要点包括底板,在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫,所述结合垫上设有荧光微球标记的CRP单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY,所述的硝酸纤维膜设有一条包被鸡IgY的质控C线,以及一条包被CRP单克隆抗体的检测T线;属于动物疫病检测领域。
Description
技术领域
本发明公开了一种免疫荧光层析检测卡,具体地说,是一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡,本发明还公开了该免疫荧光层析检测卡的制备方法。
背景技术
C反应蛋白(CRP)是机体非免疫***的组成成分,在多种哺乳动物疾病的急性期有重要的诊断警示作用。CRP在肝脏的合成反应主要由IL-1、IL-6和TNF-α等炎症因子所调节。CRP浓度受年龄、性别和体重的影响不大。在人类临床医学诊断中,CRP作为炎性或非炎性疾病的诊断标志物进行检测已超过30年。在兽医临床上,犬CRP的检测在临床应用中也比较广泛,包括急性感染性疾病的诊断和鉴别诊断、手术后感染的监测、抗生素疗效的观察、病程监测及预后判断等。犬CRP对疾病敏感度高,能在疾病早期快速升髙,及时反映病情;而且CRP的浓度不受到抗生素及免疫抑制剂的影响,在治疗中可以准确地对疾病的发展进行监测,在临床诊疗中具有很高的价值。因此作为炎症标记物,CRP在兽医临床上的作用日趋显著,检测犬CRP对临床诊断、疗效及预后观察等具有重要价值。
CRP是由肝脏合成的一种能与肺炎链球菌C多糖反应形成复合物的急性时相反应蛋白。它由5个相同的亚基单位以非共价方式联接,与人CRP不同,犬CRP的5个亚基中有两个被糖基化。研究表明,各种抗其他物种CRP蛋白的抗血清,都不能和急性期犬血清或者分离的犬CRP发生交叉反应,说明其他物种CRP和犬CRP没有共同的抗原性,这种现象也说明犬CRP的快速检测方法不能依赖于人的商品化CRP快速检测试纸条。目前,临床中快速检测犬CRP的方法多是依赖于临床检测仪器,这在普通宠物医院并不具备。而且,对于动物疫病诊断行业,很多情况下,对于疾病的诊断需要在野外进行,这对于现行犬CRP检测方法是没有办法完成的。时间分辨荧光免疫层析技术采用稀土元素(如Eu3+等)克服了荧光微球灵敏度较差的缺点。与放射性免疫分析相比,时间分辨荧光免疫层析技术无放射性污染,具有灵敏度高、抗基质干扰性好,稳定性强等优点。
中国专利ZL201710468614.6公开了一种犬C反应蛋白胶体金免疫层析试纸条,由样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫、底板依次组成,所述结合物释放垫上包被有鼠抗犬C反应蛋白单克隆抗体-胶体金标记物,所述反应膜上包括检测区和质控区,所述检测区包被有鸡抗犬C反应蛋白多克隆抗体,所述质控区包被有羊抗鼠抗抗体。该方法选用了胶体金作为示踪物,免疫标记物依靠静电吸附,存在灵敏度较低、难以定量、重复性和稳定性较差等缺陷,无法完全满足临床的检测需求。
中国专利ZL201710468621.6公开了一种犬C反应蛋白荧光检测试纸条,由样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫、底板依次组成,所述结合物释放垫上包被有鼠抗犬C反应蛋白单克隆抗体-荧光微球标记物,所述反应膜上包括检测区和质控区,所述检测区包被有鸡抗犬C反应蛋白多克隆抗体,所述质控区包被有羊抗鼠抗抗体;但是该方法存在下述缺点:检测线包被抗体为多克隆抗体,可能会影响到检测的特异性;另外反应膜检测区和质控区发生免疫反应时,共用一种标记物:鼠抗犬C反应蛋白单克隆抗体-荧光微球标记物,当样本中C反应蛋白变化是,C线荧光值将相应变化,从而可能影响C值和T/C值的稳定性,从而严重影响定量的准确性。
发明内容
针对上述问题,本发明的目的是提供一种灵敏度高,检测结果重现性的用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡。
本发明的第二个目的是提供上述检测试剂卡的制备方法。
为此,本申请提供的第一个技术方案是这样的:
一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡,包括底板,在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫,所述结合垫上设有荧光微球标记的CRP单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY,所述的硝酸纤维膜设有一条包被鸡IgY的质控C线,以及一条包被CRP单克隆抗体的检测T线。
进一步的,上述的用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡,还包括样品稀释液瓶。
进一步的,上述的用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡,所述的样品稀释液瓶中含的样品稀释液为含1%S9和0.1%Triton X-100的的0.1M的pH7.8 Tris-盐酸缓冲液。
本发明的第二个技术方案是提供上述检测试剂卡的制备方法。
一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法,在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫,
A)所述的样品垫的制备方法为:
1)配制样品垫处理液:含1%牛血清白蛋白、2%聚乙二醇4000和0.5%Triton X-100的pH9.0 0.1M的甘氨酸缓冲液;
2)将步骤1)中制备的缓冲液5.0μl/cm的浓度喷涂于玻璃纤维上;
B)所述的结合垫的制备方法为:
1)将用荧光微球标记CRP单克隆抗体和用荧光微球标记的羊抗鸡IgY按照体积比20:1混合均匀,超声2s,间歇5s,重复3次;
2)按3.5μl/cm、0.02MPa喷至剪裁后的结合垫上;
C)所述的反应膜的制备方法为:
1)用含3%蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将鸡IgY稀释到1mg/mL,即为C质控线工作液;
2)用含3%蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将CRP单克隆抗体稀释到1mg/mL,即为T检测线工作液;
3)取底板粘贴硝酸纤维膜;
4)在硝酸纤维膜上划T线和C线,划线浓度均为1μL/cm;
5)完成后将片材放置在37℃干燥箱中干燥过夜。
进一步的,上述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法,荧光微球标记CRP单克隆抗体的制备方法为:
1)稀释荧光微球:取一离心管,加入1mL标记缓冲液0.1M MES缓冲液,加入荧光微球1mg,涡旋混匀;
2)微球的活化:在上述离心管中加入20μl-50μl标记活化剂A和20μl-50μl标记活化剂B,旋转培养器上反应30min;
3)活化淬灭:将活化后的荧光微球20000g离心30min,弃上清,留取沉淀,加入5000μl淬灭剂,超声2s;
4)抗体的标记:在超声重悬后的荧光微球中加入20-200μg CRP单克隆抗体,涡旋混匀,置于旋转培养器上反应30min;
5)封闭:加入2mL标记封闭液,超声2s,间歇5s,重复3次,超声完成后置于旋转培养器上反应30min;
6)纯化:完成上述反应后,19000g离心30min,吸去上清,留取沉淀,加入2mL标记荧光微球稀释液,超声,工作2S,间歇5S,重复3次。
进一步的,上述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法,荧光微球标记的羊抗鸡IgY的制备方法为:
1)稀释微球:取一离心管,加入1mL的标记缓冲液标记缓冲液0.1M MES缓冲液,取荧光微球1.0mg,涡旋混匀;
2)微球的活化:在上述离心管中加入20μl-50μl标记活化剂A和20μl-50μl标记活化剂B,旋转培养器上反应30min;
3)活化淬灭:将活化后的荧光微球19000g离心30min,弃上清,留取沉淀,加入2mL淬灭剂,90W超声,工作2s,间歇5s,重复1次;
4)抗体的标记:在超声重悬后的荧光微球中加入1000μg羊抗鸡IgY,涡旋混匀,置于旋转培养器上反应30min;
5)封闭:加入500μl标记封闭液,封闭30min;
6)纯化:完成上述反应后,19000g离心30min,吸去上清,留取沉淀,加入2mL标记荧光微球稀释液,90W超声,工作2s,间歇5s,重复3次。
进一步的,上述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法,所述的微球为含有稀土铕元素的荧光错配物的聚苯乙烯微球;密度:1.05g/cm3;折射率:1.59@589nm,25℃;直径300nm;功能基团:羧基;外观:白色。
进一步的,上述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法,所述的标记封闭液为含3%牛血清白蛋白的0.04M pH 8.0乙醇胺溶液;所述的标记荧光微球稀释液为含1%牛血清白蛋白、0.5%牛丙种球蛋白、3%蔗糖的pH9.0 0.1M的甘氨酸缓冲液;所述的淬灭剂为含0.25%甲醇的0.1M的MES缓冲液。
进一步的,上述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法,所述的标记活化剂A为含50mg/mLNHS的0.05MES缓冲液;所述标记活化剂B为含50mg/mLEDC的0.05M MES缓冲液。
与现有技术相比,本发明提供的技术方案具有如下优点:
1、本发明提供的技术方案操作步骤简单,对样品预处理方法进行优化,只需要采集犬血清,稀释后加入到检测卡的加样孔中即可检测,检测速度快,10分钟出结果,结果即可定性观察又可定量测定,大大降低检测成本,减少工作量。
2、本发明提供的技术方案,通过对样品垫处理液和标记荧光微球稀释液的优化,相比传统工艺,灵敏度明显高,最低检测限(LOD)可达到0.86mg/L(原工艺1.56mg/L),线性更好,剂量-反应曲线的决定系数由0.9874提升到0.9989。
3、本发明提供的技术方案对结合垫、硝酸纤维膜制备过程严格考究、优化,进一步提高了检测卡的精密度。
4、本发明采用样品垫处理液处理后的荧光微球释放更充分,重复性好,低中高三个水平质控变异系数均低于10%(7.21%、6.24%和4.26%);另外缓冲液中加入生物防腐剂Proclin 300,可以有效保持检测试剂的稳定性,并且防止减少了常规催化剂对检测结果的影响,确保检测结果的精确度,并保护检测者不受常规防腐剂例如叠氮钠等的危害。
附图说明
图1是本发明提供的检测试纸卡结构示意图;
图2是本发明提供的检测试纸条结构示意图;
图3是本发明提供的另一种检测试纸卡结构示意图;
图4是本发明提供的检测卡判定结果为阳性时示意图;
图5是本发明提供的检测卡判定结果为阴性示意图;
图6是本发明本发明提供的检测卡判定结果为无效时一种示意图;
图7是本发明本发明提供的检测卡判定结果为无效时另一种示意图;
图8是本申请提供的病毒抗原浓度检测的标准曲线图。
图9是对比例提供的病毒抗原浓度检测的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式,对本发明的权利要求作进一步的详细说明。
实施例1
本发明提供的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡,参阅图1至图2,包括壳体7,所述的壳体7内设有用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡,所述用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡包括卡底板1,在底板1上依次衔接有样品垫2、结合垫3、硝酸纤维膜4和吸水垫5,所述结合垫3上设有荧光微球标记的CRP单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY;所述的硝酸纤维膜4设有一条包被鸡IgY的质控C线,以及一条包被CRP单克隆抗体的检测T线。所述的壳体7上设有与样品垫2相适配的加样孔72,与结合垫3相适配的观察窗口71,所述的壳体7上表面还设有防滑条,方便试剂卡的取出与放入。
实施例2
本申请提供的另一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡,参阅图1至图3,包括盒体9,所述的体9内设有样品稀释液瓶6,吸管8以及检测卡,所述检测卡位于壳体7内,所述用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡包括底板1,在底板1上依次衔接有样品垫2、结合垫3、硝酸纤维膜4和吸水垫5,所述结合垫3上设有荧光微球标记的CRP单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY。所述的硝酸纤维膜4设有一条包被鸡IgY的质控C线,以及一条包被CRP单克隆抗体的检测T线。所述的壳体7上设有与样品垫2相适配的加样孔72,与结合垫3相适配的观察窗口71,所述的壳体7上表面还设有防滑条,方便试剂卡的取出与放入。
更为具体的说,所述的样品稀释液瓶中样品稀释液为含1%S9、1%SDS、0.1%Triton X-100的0.1M pH7.8的Tris-盐酸缓冲液。
实施例3
实施例1或者2中提供的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法是在温度(18~26)℃、湿度≤30%的环境下进行装配,在底板1上依次衔接有硝酸纤维膜4、吸水垫5、结合垫3和样品垫2;将粘贴好的大板切成4.0MM宽的试纸条,装入塑料卡壳内,即CDV检测卡;将每一检测卡置于铝膜袋中,加入干燥剂1包,热合封口备用。
具体制备方法如下:
1.1结合垫的制备
1.1.1 CRP单克隆抗体的标记
1)选择微球:微球为含有稀土铕元素的荧光错配物的聚苯乙烯微球;密度:1.05g/cm3;折射率:1.59@589nm,25℃;直径300nm;功能基团:羧基;外观:白色。
2)稀释荧光微球:取一离心管,加入1mL 0.1M的MES标记缓冲液(2-(N-***啉)乙磺酸,加入荧光微球1mg,涡旋混匀。
3)微球的活化:在上述离心管中加入(20-50)μl(优选30μl)10mg/mL标记活化剂A[10mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的0.05M的MES缓冲液(2-(N-***啉)乙磺酸)],涡旋混匀后加入(20-50)μl(优选30μl)50mg/mL标记活化剂B[10mg/mL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的0.05M MES缓冲液(2-(N-***啉)乙磺酸)],旋转培养器上反应30min;
4)活化淬灭:将活化后的荧光微球20000g离心30min,弃上清,留取沉淀,加入2mL淬灭剂(含0.25%甲醇的0.1M的MES缓冲液),超声2s;
5)抗体的标记:在超声重悬后的荧光微球中加入20μg CRP单克隆抗体,涡旋混匀,置于旋转培养器上反应30min;
6)封闭:加入200.0μl标记封闭液[含3%牛血清白蛋白(BSA)的0.04M pH 8.0乙醇胺溶液],超声2s,间歇5s,重复3次,超声完成后置于旋转培养器上反应30min;
7)纯化:完成上述反应后,19000g离心30min,吸去上清,留取沉淀,加入600.0μl标记荧光微球稀释液[含1%牛血清白蛋白(BSA)、0.5%牛丙种球蛋白、3%蔗糖的pH9.0 0.1M的甘氨酸缓冲液],超声,工作2S,间歇5S,重复3次。
1.1.2质控C线抗体的标记
1)稀释微球:取一离心管,加入1mL的标记缓冲液,取荧光微球0.5mg,涡旋混匀;
2)微球的活化:在上述离心管中加入20μl-50μl(优选30μl)标记活化剂A[含10mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的0.05M的MES缓冲液(2-(N-***啉)乙磺酸)]和20μl-50μl(优选30μl)标记活化剂B[含10mg/mL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的0.05M MES缓冲液(2-(N-***啉)乙磺酸)],旋转培养器上反应30min;
3)活化淬灭:将活化后的荧光微球19000g离心30min,弃上清,留取沉淀,加入1mL淬灭剂(含0.25%甲醇的0.1M的MES缓冲液),90W超声,工作2s,间歇5s,重复1次;
4)抗体的标记:在超声重悬后的荧光微球中加入0.25mg羊抗鸡IgY,涡旋混匀,置于旋转培养器上反应30min;
5)封闭:加入标记封闭液[含3%牛血清白蛋白(BSA)的0.04M pH 8.0乙醇胺溶液],封闭30min;
6)纯化:完成上述反应后,19000g离心30min,吸去上清,留取沉淀,加入1mL标记荧光微球稀释液[含1%牛血清白蛋白(BSA)、0.5%牛丙种球蛋白、3%蔗糖的pH9.0 0.1M的甘氨酸缓冲液],90W超声,工作2s,间歇5s,重复3次。
1.1.3喷膜
1)将璃纤维裁切为(10±1)mm×(300±10)mm大小为结合垫;
2)将标记后的T、C线抗体按20:1(V:V)混合均匀,90W超声,工作2s,间歇5s,重复3次;
3)按5.0μl/cm、0.02MPa喷至剪裁后的结合垫上;
4)喷完后,37℃干燥箱中干燥过夜(16~18)h。
1.2反应膜的制备
1)用含3%蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)将鸡IgY稀释到1mg/mL,即为C线工作液。
2)用含3%蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)将另一株CRP单克隆抗体稀释到1mg/mL,即为T线工作液。
3)取PVC底板,粘贴硝酸纤维膜。
4)在硝酸纤维膜上划T线和C线,划线浓度均为1μL/cm。
5)完成后将片材放置在37℃干燥箱中干燥过夜(16~18)h。
1.3样品垫制备
1)配制样品垫处理液:含1%牛血清白蛋白(BSA)、2%聚乙二醇4000和0.5%Triton X-100的pH9.0 0.1M的甘氨酸缓冲液;
2)以5.0μl/cm的浓度将缓冲液喷涂于玻璃纤维上。
对比试验
本对比例提供的检测试剂卡结构实施例1提供的检测试剂卡结构基本一致,其不同之处在于,在制备过程中将实施例3中标记荧光微球稀释液和样品垫处理液换为常规缓冲液,比如样品垫处理液为含0.5%Tween-20、0.1%牛血清白蛋白、0.5%Trtion-100的50mM pH 8.0 10mmol/L Tris-HCl缓冲液;比如标记荧光微球稀释液为含2%BSA、0.1%PEG4000、5%海藻糖、5%蔗糖、0.05%叠氮钠的pH 8.0 10mmol/L Tris-HCl缓冲液,其它参数和条件均与实施例3一致。
检测方法
为了便于使用本申请提供的检测卡,下面给出本申请提供的检测卡提供两种检测方法。
方法一:采用紫外灯照射,参阅图4至图7:用手持式紫外线灯照射观察窗口,当质控线和检测线都有量荧光出现时(图4),说明样品中CRP抗原为阳性;当只有质控线有荧光而检测线无荧光出现时(图5),说明样品中CRP抗原为阴性;质控线未出现荧光(图6、图7),则代表操作有误或检测结果无效,需重复试验。
方法二:免疫荧光检测仪检测结果:
1)收集犬血清;
2)取10μl加入含有1.0mL样品稀释液(含1%S9和0.1%Triton X-100的的0.1M的pH7.8 Tris-盐酸缓冲液的样品管中,充分混匀;
3)取出检测卡,打开干式免疫荧光检测仪;
4)吸取稀释后的样本75μl,加入到检测卡的加样孔中,将检测卡放入到仪器的卡槽中,开始计时;
5)10min后,点击仪器上的“测试”按键,仪器将开始测试;
6)荧光强度与样品中的CRP浓度成正比,通过内置标准曲线进行曲线拟合和浓度的计算,剂量反应曲线Log(Y)=0.59476Log(X)–0.5267,R=0.9994(R2=0.9989),参阅图3。
免疫荧光检测仪检测结果:
1、线性范围
1.1.1将CRP校准品用阴性血清分别稀释到0mg/L、2.5mg/L、7.5mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L和800mg/L;
1.1.2将以上各浓度样本分别取75μL,加入至制备好的犬CRP检测试剂中,每浓度重复测试2次;
1.1.3反应10min后,将试纸放入干式免疫荧光分析仪中,读取T/C值,通过内置标准曲线进行曲线拟合和浓度的计算。
1.1.4测试结果显示:试剂在检测2.5~300mg/L的CRP线性拟合关系较好,r>0.9900,当CRP浓度增加到400mg/L时,线性拟合r值小于0.9900,T/C增长减缓,CRP在400~500mg/L时T/C值平缓,CRP达到600mg/L时,T/C值反而降低。因此本检测的最大检测范围可以达到300mg/L。
2、最低检出限
将阴性血清,重复测试20次,计算T/C均值,将其代入剂量-反应曲线中,得出本方法的最低检出限为0.86mg/L。具体见表1和图8;
表1
用同样方法检测对比对比试验制备的检测卡,其检测具体见表2和图9
表2
3、精密度
将CRP校准品用阴性血清稀释至10mg/L、30mg/L、100mg/L,用本方法检测卡每浓度重复测试10次,计算测试浓度的变异系数。结果表3所示,由此可以看出,本试剂盒检测的变异系数均小于10%(三个浓度分别为7.21%、6.24%和4.26%),因此本检测方法具有较高的精密度。
表3
浓度 | CV | |
质控Ⅰ | 10mg/L | 7.21% |
质控Ⅱ | 30mg/L | 6.24% |
质控Ⅲ | 100mg/L | 4.26% |
为了更好的说明本发明的有益效果,下面给出采用本发明提供的检测试剂与其他方法(胶体金法、荧光层析法)等在检测犬C-反应蛋白时的检测性能比较,见表4。
表4
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡,包括底板(1),在底板(1)上依次衔接有样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维膜(4)和吸水垫(5),其特征在于,所述结合垫(3)上设有荧光微球标记的CRP单克隆抗体(31)和荧光微球标记的羊抗鸡IgY(32),所述的硝酸纤维膜(4)设有一条包被鸡IgY的质控C线,以及一条包被CRP单克隆抗体的检测T线。
2.根据权利要求1所述的用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡,其特征在于,还包括样品稀释液瓶(6)。
3.根据权利要求2所述的用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡,其特征在于,所述的样品稀释液瓶(6)中含的样品稀释液含1%S9和0.1% Triton X-100的的0.1M的pH7.8 Tris-盐酸缓冲液。
4.制备权利要求1所述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的方法,在底板(1)上依次衔接有样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维膜(4)和吸水垫(5),其特征在于,
A)所述的样品垫的制备方法为:
1)配制样品垫处理液:含1%牛血清白蛋白、2%聚乙二醇4000和0.5%Triton X-100的pH9.00.1M的甘氨酸缓冲液;
2)将步骤1)中制备的缓冲液5.0μl/cm的浓度喷涂于玻璃纤维上;
B)所述的结合垫(3)的制备方法为:
1)将用荧光微球标记CRP单克隆抗体和用荧光微球标记的羊抗鸡IgY按照体积比20:1混合均匀,超声2s,间歇5s,重复3次;
2)按3.5μl/cm、0.02MPa喷至剪裁后的结合垫上;
C)所述的反应膜的制备方法为:
1)用含3%蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将鸡IgY稀释到1mg/mL,即为C质控线工作液;
2)用含3%蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将CRP单克隆抗体稀释到1mg/mL,即为T检测线工作液;
3)取底板(1)粘贴硝酸纤维膜;
4)在硝酸纤维膜上划T线和C线,划线浓度均为1μL/cm;
5)完成后将片材放置在37℃干燥箱中干燥过夜。
5.根据权利要求4所述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法,其特征在于,荧光微球标记CRP单克隆抗体的制备方法为:
1)稀释荧光微球:取一离心管,加入1mL标记缓冲液0.1M MES缓冲液,加入荧光微球1mg,涡旋混匀;
2)微球的活化:在上述离心管中加入20μl-50μl标记活化剂A和20μl-50μl标记活化剂B,旋转培养器上反应30min;
3)活化淬灭:将活化后的荧光微球20000g离心30min,弃上清,留取沉淀,加入500μl淬灭剂,超声2s;
4)抗体的标记:在超声重悬后的荧光微球中加入20-200μg CRP单克隆抗体,涡旋混匀,置于旋转培养器上反应30min;
5)封闭:加入2mL标记封闭液,超声2s,间歇5s,重复3次,超声完成后置于旋转培养器上反应30min;
6)纯化:完成上述反应后,19000g离心30min,吸去上清,留取沉淀,加入2mL标记荧光微球稀释液,超声,工作2S,间歇5S,重复3次。
6.根据权利要求4所述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法,其特征在于,荧光微球标记的羊抗鸡IgY的制备方法为:
1)稀释微球:取一离心管,加入1mL的标记缓冲液标记缓冲液0.1M MES缓冲液,取荧光微球1.0mg,涡旋混匀;
2)微球的活化:在上述离心管中加入20μl-50μl标记活化剂A和20μl-50μl标记活化剂B,旋转培养器上反应30min;
3)活化淬灭:将活化后的荧光微球19000g离心30min,弃上清,留取沉淀,加入2mL淬灭剂,90W超声,工作2s,间歇5s,重复1次;
4)抗体的标记:在超声重悬后的荧光微球中加入100μg羊抗鸡IgY,涡旋混匀,置于旋转培养器上反应30min;
5)封闭:加入500μl标记封闭液,封闭30min;
6)纯化:完成上述反应后,19000g离心30min,吸去上清,留取沉淀,加入2mL标记荧光微球稀释液,90W超声,工作2s,间歇5s,重复3次。
7.根据权利要求5或者6所述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法,其特征在于,所述的微球为含有稀土铕元素的荧光错配物的聚苯乙烯微球;密度:1.05g/cm3;折射率:1.59@589nm,25℃;直径300nm;功能基团:羧基;外观:白色。
8.根据权利要求5或者6所述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法,其特征在于,所述的标记封闭液为含3%牛血清白蛋白的0.04M pH 8.0乙醇胺溶液;所述的标记荧光微球稀释液为含1%牛血清白蛋白、0.5%牛丙种球蛋白、3%蔗糖的pH9.00.1M的甘氨酸缓冲液;所述的淬灭剂为含0.25%甲醇的0.1M的MES缓冲液。
9.根据权利要求5或6所述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法,其特征在于,所述的标记活化剂A为含50mg/mLNHS的0.05MES缓冲液;所述标记活化剂B为含50mg/mLEDC的0.05M MES缓冲液。
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