CN111771725A - 一种优化的生姜脱毒苗再生扩繁方法及其产业化流程的开发 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种优化的生姜脱毒苗的再生扩繁方法及其产业化流程的开发，其特征在于：确定了最佳的外植体类型、消毒方法、细胞分类素、诱导培养基配方、炼苗条件以及培养条件。优化后的生姜脱毒苗从外植体到TC0生根苗需要3.5‑4.5个月，之后每继代一次需要1.5个月左右，全过程染菌率低于5%，TC0出芽率最高可达800%，后面每次继代分化效率最高可达300%，生根率可达100%，组培苗移栽成活率达到80%以上，生根苗田间扩繁2‑3代即可作为姜种应用于产业化，本方法脱毒苗扩繁效率高、状态好、周期短。

Description

一种优化的生姜脱毒苗再生扩繁方法及其产业化流程的开发
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种生姜脱毒苗的扩繁及其产业化流程的方法。
背景技术
生姜是姜科植物的根茎，属多年生草本植物，宜生长在温和、遮阴、潮湿的环境中，因品种不同而具有白色、米色、茶色、黄色和金黄色等多种颜色，性温、味辛，具有很高的营养价值和药用价值。生姜作为食材和药材，由来已久，中医认为，生姜为药中佳品，具有解表散寒、消炎抗菌的功效，可用于治疗伤风感冒、胃寒呕吐等症状；同时，生姜在抗氧化、抗衰老和抗肿瘤有一定的作用，能在一定程度上抑制癌细胞的生长；此外，生姜具有驱寒活血、降血脂的作用，民间常用生姜泡酒，利用其祛风寒、通经络的作用来缓解关节炎等疾病的痛楚。
中国是世界上生姜栽培面积最大且生产总量最多的国家，作为常见的调味植物，生姜在我国的种植面积十分广泛，其中，南方主要以广东、浙江、湖南、安徽、和四川等地种植为主，北方则主要以山东省种植面积最大，2018年中国生姜种植面积达30万公顷。中国又是全球生姜第一出口大国，生姜出口主要以未磨姜为主，其中美国、日本、巴基斯坦、荷兰等国是我国生姜主要出口国，2018 年中国生姜(未磨的姜)出口数量达48万吨。由此可见生姜在我国是一种重要的经济作物。
由于生姜不开花或少开花，无法进行有性繁殖，只能通过地下茎块进行无性繁殖。经过多世代的无性繁殖，病毒容易积累，造成生姜的种性退化、抗逆性下降等不良影响，从而导致减产、品质下降等不可挽回的经济损失。常见的病害包括姜瘟病、姜腐霉根腐病、姜枯萎病、姜斑点病、姜炭疽病、姜细菌性叶枯病、姜细菌性软腐病等。为了防止这些病害，大量的农药喷施灌根，不仅带来了成本的增加，还会带来农药残留、环境污染等问题。因此如何让生姜脱毒，将为生姜产业的综合发展带来重要的意义。
生姜的组织培养利用植物的全能性，经过脱分化、再分化、不定芽伸长、生根等阶段，获得无菌组培苗。生姜组培苗不但可以实现脱毒、恢复生姜的种性，还具有不受季节、场地的限制等优良特点。但目前现有的生姜组织培养技术还具有易生菌、繁殖效率低、多次继代后长势差等不足，无法大面积的进行应用。
发明内容
本发明针对现有生姜组织培养技术的不足，从外植体的选择、外植体消毒条件、培养基激素条件、炼苗方式等几个方面进行优化，确立了一种无菌、扩繁系数高、长势正常可以多次继代、成活率高的生姜脱毒苗再生扩繁方法，并开发了一套生姜脱毒苗产业化流程。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
(1)选材：选取肥大、饱满、皮色光亮、肉质新鲜、不干不缩、不腐烂、未受冻、质地硬的姜块；
(2)催芽：将选取好的生姜块茎置于无光照室内，维持温度25-30℃，湿度40-50％，催芽25-35天，待姜芽生长至1-2cm时切下；
(3)脱毒再生及继代：将步骤(2)中得到的姜芽外植体用自来水清洗，去除最外缘表皮，于超净工作台内用75％酒精处理1min，0.1％升汞处理10min， 2.5％次氯酸钠处理10min，无菌水清洗3-5次，剥离叶原基后置于诱导培养基上，脱分化、分化、生根、成苗，培养条件为25-28℃，每天光照16h，光照强度为2500-3000Lux，培养100-130天可炼苗，培养至60-90天时可对分化芽进行重复继代，继代培养周期为40-50天。
(4)驯化炼苗：将步骤(3)得到的生姜组培苗从培养基中取出清洗后，置于1/4MS培养液炼苗中1周(保鲜膜覆盖保湿)，培养条件为25-28℃，每天光照16h，光照强度为2500-3000Lux，揭去保鲜膜3天后移栽至营养土中(营养土/基质为2:1)中即可。
其中，作为优化的，对姜芽外植体形态进行探索，确定矮胖为提高出芽率的最佳形态。
作为优化的，对姜芽外植体消毒方式进行探索，确定75％酒精处理1min， 0.1％升汞处理10min，2.5％次氯酸钠处理10min，无菌水清洗3-5次为保证出芽率并降低染菌率最佳消毒条件。
作为优化的，对诱导培养基细胞***素种类进行探索，确定6-BA为最佳细胞***素。
作为优化的，对6-BA及NAA配比进行探索，确定6-BA:NAA＝4:1为分化效率最高的浓度配比方式。
作为优化的，对诱导培养基配方进行探索，确定每升MS基础培养基含 2mg6-BA，0.5mgNAA，8g琼脂的配方为最佳方式。
作为优化的，对培养条件进行探索，确定温度26℃，每天光照16小时为最佳培养条件。
作为优化的，对组培苗的炼苗条件进行探索，确定从培养瓶中取出后，维持在1/4MS培养液中覆膜盖1周，揭膜3天后移栽至营养土中为提高成活率的炼苗方式。
作为优化的，生根苗移栽至大田扩繁2-3代后作为姜种应用于产业化。
本发明的有益效果是：
1、确定了组织培养中外植体的形态，消毒条件，控制分化、继代生长、生根等的培养基成分、浓度，炼苗的最佳方式以及确定了最佳的产业化流程；
2、优化后的生姜脱毒苗从外植体到TC0生根苗需要3.5-4.5个月，之后每继代一次需要1.5个月左右，全过程染菌率低于5％，TC0出芽率最高可达800％，后面每次继代分化效率最高可达300％，生根率可达100％，组培苗移栽成活率达到80％以上，生根苗田间扩繁2-3代即可作为姜种应用于产业化，本方法脱毒苗扩繁效率高、状态好、周期短。
附图说明
图1是姜种剥离后不同状态的生姜外植体图
图2是不同状态生姜外植体经过诱导培养发芽图
图3是TC0代生姜在不同诱导培养基条件下诱导发芽图
图4是TC1代生姜在不同诱导培养基条件下诱导发芽图
图5是生姜脱毒苗扩繁及产业化流程图
具体实施方法
实施例1、生姜外植体的选择
选取肥大、饱满、皮色光亮、肉质新鲜、不干不缩、不腐烂、未受冻、质地硬的姜块，在28℃、45％湿度条件下催芽30天左右，待姜芽生长至1～2cm的嫩芽时切下备用。
生姜外植体的形态不同直接影响出芽率的高低及长势强弱，传统方法对外植体无严格挑选，会造成后代生姜脱毒苗出芽率及长势参差不齐。本研究对生姜外植体的选择进行了探索。具体方法如下：
(1)选取上述培养的生姜芽，用75％酒精处理1min，0.1％升汞处理10min，无菌水清洗3-5次，剥离叶原基，获得不同状态的姜芽外植体各20个(如图1 所示)；
(2)将上述不同状态的外植体分别置于诱导培养基(MS基础培养基，TDZ 2.0mg/L，NAA0.5mg/L，8g琼脂)上，培养条件为26℃光照16h；
(3)统计出芽率，结果显示相对于A状态外植体(矮弱)和B状态外植体 (瘦长)，C状态外植体(矮胖)出芽率最高且芽状态最好(如图2、表1所示)。
表1不同状态外植体出芽率统计
外植体状态 出芽率
A 15％(3/20)
B 80％(16/20)
C 100％(20/20)
实施例2、生姜外植体消毒条件优化
生姜外植体会携带多种细菌、真菌，消毒不彻底会降低生姜外植体整体的出芽率，影响后代生长。传统的方法中，使用消毒剂量少会造成污染率高，消毒剂量高会造成出芽率低。本研究使用了不同的消毒剂组合，优化了不同的消毒条件，确定了污染率低且出芽率高的消毒方法。
(1)剥取姜芽后用自来水清洗，然后去除最外缘表皮，于超净工作台内进行消毒处理；
(2)不同消毒条件如下：
消毒方式一：75％酒精处理1min，升汞0.1％处理10min，无菌水清洗3-5 次；
消毒方式二：75％酒精处理1min，升汞0.1％处理10min，2.5％次氯酸钠处理10min，无菌水清洗3-5次；
消毒方式三：75％酒精处理1min，2.5％次氯酸钠处理10min，无菌水清洗3-5 次；
消毒方式四：75％酒精处理1min，10％聚维酮碘处理10min，无菌水清洗3-5 次；
(3)消毒处理后，分别剥离叶原基，获得C状态外植体(见图1)共80 个，平均分成4组，然后置于诱导培养基(MS基础培养基，TDZ2.0mg/L，NAA 0.5mg/L，8g琼脂)，培养条件为26℃光照16h；
(4)统计出芽率及染菌率。结果显示，消毒方式二(75％酒精处理1min，升汞0.1％处理10min，2.5％次氯酸钠处理10min，无菌水清洗3-5次)是最佳的消毒方式(如表2所示)。
表2不同消毒方式染菌率及出芽率统计
消毒方式 染菌率(％) 出芽率
消毒方式一 10％(2/20) 100％(20/20)
消毒方式二 5％(1/20) 100％(20/20)
消毒方式三 25％(5/20) 100％(20/20)
消毒方式四 20％(4/20) 100％(20/20)
实施例3、诱导培养基激素种类的选择
生姜外植体出芽率及后代分化率受激素种类及浓度影响，本研究对细胞***素的种类进行了筛选。
(1)剥取姜芽后用自来水的清洗，然后去除最外缘表皮，于超净工作台内进行消毒处理(消毒方式二)后进行剥离叶原基，获得C状态外植体(见图1) 共60个，平均分为3组；
(2)配制下列不同细胞***素的诱导培养基并对外植体进行进行诱导处理；
培养基一：MS培养基+2mg/LTDZ+0.5mg/LNAA+8g琼脂；
培养基二：MS培养基+2mg/LKT+0.5mg/LNAA+8g琼脂；
培养基三：MS培养基+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+8g琼脂；
(3)培养条件为26℃光照16h，统计出芽率及生根率，结果显示培养基三中的6-BA为最佳的细胞***素(如表3所示)。
表3不同细胞***素出芽率及生根率统计
培养基配方 出芽率 生根率
培养基一 100％(20/20) 70％(14/20)
培养基二 160％(32/20) 78％(25/32)
培养基三 300％(60/20) 100％(60/60)
实施例4、诱导培养基激素浓度及配比的优化
本研究继续对6-BA和NAA的配比进行了优化。
(1)剥取姜芽后用自来水的清洗，然后去除最外缘表皮，于超净工作台内进行消毒处理(消毒方式二)后进行剥离叶原基，获得C状态外植体(见图1)共 60个，平均分为3组；
(2)配置不同条件的培养基，具体培方如下：
培养基四：MS培养基+1.8mg/L6-BA+0.4mg/LNAA+8g琼脂；
培养基五：MS培养基+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+8g琼脂；
培养基六：MS培养基+2.2mg/L6-BA+0.6mg/LNAA+8g琼脂；
(3)利用上述培养基分别对每组C状态外植体(见图1)进行诱导及继代培养，并统计TC0及TC1代出芽率、分化效率及生根率；
(4)结果显示，诱导培养基为培养基六(MS培养基+2.2mg/L6-BA+0.6mg/L NAA+8g琼脂)的分化效率最高且长势最好(如图3、图4、表4所示)。
表4不同激素配比出芽率及生根率配比
培养基配方 TC0出芽率 TC0生根率 TC1分化率 TC1生根率
培养基四 180％(36/20) 100％(36/36) 111％(40/36) 100％(40/40)
培养基五 300％(60/20) 100％(60/60) 183％(110/60) 100％(110/110)
培养基六 800％(160/20) 100％(160/160) 300％(480/160) 100％(480/480)
实施例5、生姜脱毒组培苗炼苗条件优化
传统的方法直接将生根的生姜组培苗从培养基中取出，清洗后置于清水中培养数天后移栽。这种方法生姜组培苗成活率低，且转入土壤中培育时长势较弱。本研究对生姜组培苗的炼苗条件进行了优化。
(1)将生根的生姜组培苗从培养基中取出清洗后，每100株分成一组，分别置于清水或1/4MS培养液炼苗中1周(保鲜膜覆盖保湿)；
(2)揭去保鲜膜3天后移栽至营养土中(营养土/基质为2:1)中，培养条件为26℃光照16h；
(3)统计成活率。在1/4MS培养液中炼苗的组培苗，存活率可达80％以上 (见表5)。
表5不同炼苗方式成活率统计
炼苗方式 平均成活率
生根苗清洗后置于清水中1周 49％(49/100)
生根苗清洗后置于1/4MS培养液中1周 82％(82/100)
实施例6、生姜脱毒苗产业化流程
本研究确定了最佳的生姜脱毒苗再生扩繁方法，确定了最佳的外植体类型为 C状态(矮胖)，最佳的消毒方法(75％酒精处理1min，升汞0.1％处理10min，2.5％次氯酸钠处理10min，无菌水清洗3-5次)，最佳的细胞分类素为6-BA，最佳的诱导培养基配方(MS培养基+2.2mg/L6-BA+0.6mg/LNAA+8g琼脂)，最佳炼苗条件(生姜生根组培苗从培养基中清洗后置于1/4MS培养液中1周)，培养条件为26℃光照16h。优化后的生姜脱毒苗流程从外植体到TC0生根苗需要 3.5-4.5个月，之后每继代一次需要1.5个月左右，全过程染菌率低于5％，TC0出芽率最高可达800％，后面每次继代分化效率最高可达300％，生根率可达100％，组培苗移栽成活率达到80％以上，生根苗田间扩繁2-3代即可作为姜种应用于产业化(此时姜种状态最佳)，本方法脱毒苗扩繁效率高、状态好、周期短(如图 5所示)。

Claims (9)

1.一种优化的生姜脱毒苗的再生扩繁方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）选材：选取肥大、饱满、皮色光亮、肉质新鲜、不干不缩、不腐烂、未受冻、质地硬的姜块；
（2）催芽：将选取好的生姜块茎置于无光照室内，维持温度25-30℃，湿度40-50%，催芽25-35天，待姜芽生长至1-2cm时切下；
（3）脱毒再生及继代：将步骤（2）中得到的姜芽外植体用自来水清洗，去除最外缘表皮，于超净工作台内用75%酒精处理1min，0.1%升汞处理10min，2.5%次氯酸钠处理10 min，无菌水清洗3-5次，剥离叶原基后置于诱导培养基上，脱分化、分化、生根、成苗,培养条件为25-28℃，每天光照16h，光照强度为2500-3000Lux，培养100-130天可炼苗,培养至60-90天时可对分化芽进行重复继代，继代培养周期为40-50天；
（4）驯化炼苗：将步骤（3）得到的生姜组培苗从培养基中取出清洗后，置于1/4 MS培养液炼苗中1周（保鲜膜覆盖保湿），培养条件为25-28℃，每天光照16h，光照强度为2500-3000Lux，揭去保鲜膜3天后移栽至营养土中（营养土/基质为2:1）中即可。
2.根据权利要求1所述的再生扩繁方法，其特征在于，所述步骤（3）中姜芽外植体为矮胖形态。
3.根据权利要求1所述的再生扩繁方法，其特征在于，所述步骤（3）中消毒条件为75%酒精处理1min，0.1%升汞处理10min，2.5%次氯酸钠处理10 min，无菌水清洗3-5次。
4.根据权利要求1所述的再生扩繁方法，其特征在于，所述步骤（3）中各阶段的诱导培养基每升配方为：MS基础培养基，2mg6-BA，0.5mgNAA，8g琼脂。
5.根据权利要求1所述的再生扩繁方法，其特征在于，所述诱导培养基细胞***素种类为6-BA。
6.根据权利要求1所述的再生扩繁方法，其特征在于，所述诱导培养基中6-BA浓度为2mg/L、NAA浓度为0.5mg/L，琼脂浓度为8g/L。
7.根据权利要求1所述的再生扩繁方法，其特征在于，所述步骤（3）培养条件为25-28℃，每天光照16h，光照强度为2500-3000Lux。
8.根据权利要求1所述的再生扩繁方法，其特征在于，所述步骤（4）中组培苗从培养瓶中取出后，前期维持在1/4 MS培养液中。
9.根据权利要求1所述的再生扩繁方法，其特征在于，组培苗移栽至大田扩繁2-3代后作为姜种应用于产业化。
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CN115769786B (zh) * 2022-11-30 2023-12-19 安徽农业大学 以交替式组织培养的方式获取铜陵白姜再生苗的方法

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