CN111808200B

CN111808200B - Cd19和cd22双靶点嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN111808200B
Application number: CN202010687675.3A
Authority: CN
Inventors: 秦乐; 汤朝阳; 邓殷建; 魏志辉; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: Guangdong Zhaotai Invivo Biomedicine Co ltd
Current assignee: Guangdong Zhaotai Invivo Biomedicine Co ltd
Priority date: 2020-07-16
Filing date: 2020-07-16
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2040-07-16
Also published as: WO2022011846A1; CN111808200A

Abstract

本发明提供了CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；所述抗原结合结构域包括抗CD19单链抗体的轻链可变区、抗CD19单链抗体的重链可变区、抗CD22单链抗体的轻链可变区和抗CD22单链抗体的重链可变区。本发明的抗CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体对CD19阳性和/或CD22阳性细胞具有靶向活性，表达抗CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体的T细胞对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、CD22抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有杀伤作用，有利于避免免疫逃逸现象，降低了疾病复发的可能性。

Description

CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)由肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区以及胞内信号转导区组成。通常，CAR分子包含的抗体单链片段可变区(single chain fragment variable，scFv)对肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)具有特异性结合作用，其通过铰链和跨膜区与信号传导分子的胞质结构域偶联。

近年来，随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。目前，CAR-T细胞疗法已经广泛应用于治疗B细胞恶性肿瘤，靶向CD19的CAR-T细胞是CAR-T疗法治疗B细胞恶性肿瘤的先驱，为治疗B细胞恶性肿瘤提供了有效方案。然而，医学诊断表明，某些血液肿瘤中的肿瘤细胞并不表达CD19分子，而表达CD22分子，仅利用靶向CD19分子的CAR-T细胞治疗效果不佳，一段时间后部分患者出现了肿瘤复发现象。

因此，有必要开发双靶向CD19和CD22分子的嵌合抗原受体，提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的靶向和清除作用。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体可以同时靶向CD19和CD22分子，在治疗血液恶性疾病方面具有广阔的前景。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；

所述抗原结合结构域包括抗CD19单链抗体的轻链可变区、抗CD19单链抗体的重链可变区、抗CD22单链抗体的轻链可变区和抗CD22单链抗体的重链可变区。

本发明中，与单靶点嵌合抗原受体相比，抗CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体对CD19阳性和/或CD22阳性细胞具有更强的靶向活性，对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、CD22抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有高效的靶向作用，有利于避免免疫逃逸现象。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD19单链抗体的轻链可变区、抗CD19单链抗体的重链可变区、抗CD22单链抗体的轻链可变区和抗CD22单链抗体的重链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD19单链抗体的轻链可变区、抗CD19单链抗体的重链可变区、抗CD22单链抗体的重链可变区和抗CD22单链抗体的轻链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD19单链抗体的轻链可变区、抗CD22单链抗体的轻链可变区、抗CD19单链抗体的重链可变区和抗CD22单链抗体的重链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD19单链抗体的轻链可变区、抗CD22单链抗体的轻链可变区、抗CD22单链抗体的重链可变区和抗CD19单链抗体的重链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD19单链抗体的轻链可变区、抗CD22单链抗体的重链可变区、抗CD19单链抗体的重链可变区和抗CD22单链抗体的轻链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD19单链抗体的轻链可变区、抗CD22单链抗体的重链可变区、抗CD22单链抗体的轻链可变区和抗CD19单链抗体的重链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD19单链抗体的重链可变区、抗CD19单链抗体的轻链可变区、抗CD22单链抗体的轻链可变区和抗CD22单链抗体的重链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD19单链抗体的重链可变区、抗CD19单链抗体的轻链可变区、抗CD22单链抗体的重链可变区和抗CD22单链抗体的轻链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD19单链抗体的重链可变区、抗CD22单链抗体的轻链可变区、抗CD19单链抗体的轻链可变区和抗CD22单链抗体的重链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD19单链抗体的重链可变区、抗CD22单链抗体的轻链可变区、抗CD22单链抗体的重链可变区和抗CD19单链抗体的轻链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD19单链抗体的重链可变区、抗CD22单链抗体的重链可变区、抗CD19单链抗体的轻链可变区和抗CD22单链抗体的轻链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD19单链抗体的重链可变区、抗CD22单链抗体的重链可变区、抗CD22单链抗体的轻链可变区和抗CD19单链抗体的轻链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD22单链抗体的轻链可变区、抗CD19单链抗体的轻链可变区、抗CD19单链抗体的重链可变区和抗CD22单链抗体的重链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD22单链抗体的轻链可变区、抗CD19单链抗体的轻链可变区、抗CD22单链抗体的重链可变区和抗CD19单链抗体的重链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD22单链抗体的轻链可变区、抗CD19单链抗体的重链可变区、抗CD19单链抗体的轻链可变区和抗CD22单链抗体的重链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD22单链抗体的轻链可变区、抗CD19单链抗体的重链可变区、抗CD22单链抗体的重链可变区和抗CD19单链抗体的轻链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD22单链抗体的轻链可变区、抗CD22单链抗体的重链可变区、抗CD19单链抗体的轻链可变区和抗CD19单链抗体的重链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD22单链抗体的轻链可变区、抗CD22单链抗体的重链可变区、抗CD19单链抗体的重链可变区和抗CD19单链抗体的轻链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD22单链抗体的重链可变区、抗CD19单链抗体的轻链可变区、抗CD19单链抗体的重链可变区和抗CD22单链抗体的轻链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD22单链抗体的重链可变区、抗CD19单链抗体的轻链可变区、抗CD22单链抗体的轻链可变区和抗CD19单链抗体的重链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD22单链抗体的重链可变区、抗CD19单链抗体的重链可变区、抗CD19单链抗体的轻链可变区和抗CD22单链抗体的轻链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD22单链抗体的重链可变区、抗CD19单链抗体的重链可变区、抗CD22单链抗体的轻链可变区和抗CD19单链抗体的轻链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD22单链抗体的重链可变区、抗CD22单链抗体的轻链可变区、抗CD19单链抗体的轻链可变区和抗CD19单链抗体的重链可变区。

优选地，所述抗原结合结构域包括依次串联的抗CD22单链抗体的重链可变区、抗CD22单链抗体的轻链可变区、抗CD19单链抗体的重链可变区和抗CD19单链抗体的轻链可变区。

优选地，所述抗CD19单链抗体的轻链可变区包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1：

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPPRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSAYTFGQGTKLEIK。

优选地，所述抗CD19单链抗体的重链可变区包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:2：

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRHGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNQYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLDLQMNSLRVEDTAVYYCARRSITWYGGFDIWGQGTMVTVSSAQTTAPSVYPLAP。

优选地，所述抗CD22单链抗体的轻链可变区包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:3：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIK。

优选地，所述抗CD22单链抗体的重链可变区包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:4：

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSS。

优选地，所述抗CD19单链抗体的轻链可变区、抗CD19单链抗体的重链可变区、抗CD22单链抗体的轻链可变区和抗CD22单链抗体的重链可变区之间通过连接肽连接。

优选地，所述连接肽包括SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:5：GSGGGGSGGGGSGGGGS；

SEQ ID NO:6：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；

SEQ ID NO:7：GSTSGSGKPGSGEGSTKG。

优选地，所述跨膜结构域包括CD28和/或CD8α。

优选地，所述信号转导结构域包括CD3ζ、4-1BB、CD28、TLR1、TLR2、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽。

优选地，所述信号肽包括GM-CSF信号肽。

优选地，所述GM-CSF信号肽包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:8：MLLLVTSLLLCELPHPAFLL。

优选地，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、抗CD19单链抗体的轻链可变区、第一连接肽、抗CD19单链抗体的重链可变区、第二连接肽、抗CD22单链抗体的重链可变区、第三连接肽、抗CD22单链抗体的轻链可变区、CD28和CD3ζ串联组成。

第二方面，本发明提供了一种编码基因，所述编码基因编码第一方面所述的嵌合抗原受体。

优选地，所述编码基因包括抗CD19单链抗体的轻链可变区编码序列、抗CD19单链抗体的重链可变区编码序列、抗CD22单链抗体的重链可变区编码序列和抗CD22单链抗体的轻链可变区编码序列。

优选地，所述编码基因还包括连接肽编码序列。

优选地，所述编码基因还包括GM-CSF信号肽编码序列、CD28编码序列和CD3ζ编码序列。

优选地，所述抗CD19单链抗体的轻链可变区编码序列包括SEQ ID NO:9所示的核酸序列；

SEQ ID NO:9：

gacatccagatgacccagagccccagcaccctgagcgccagcgtgggcgaccgcgtgaccatcacctgccgcgccagccagagcatcagcagctggctggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacaaggccagcagcctggagagcggcgtgcccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgagttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgacgacttcgccacctactactgccagcagtacaacagcgcctacaccttcggccagggcaccaagctggagatcaag。

优选地，所述抗CD19单链抗体的重链可变区编码序列包括SEQ ID NO:10所示的核酸序列；

SEQ ID NO:10：

caggtgcagctggtggagagcggcggcggcgtggtgcagcccggccgcagcctgcgcctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagccgccacggcatgcactgggtgcgccaggcccccggcaagggcctggagtgggtggccgtgatctggtacgacggcagcaaccagtactacgtggacagcgtgaagggccgcttcaccatcagccgcgacaacagcaagaacaccctggacctgcagatgaacagcctgcgcgtggaggacaccgccgtgtactactgcgcccgccgcagcatcacctggtacggcggcttcgacatctggggccagggcaccatggtgaccgtgagcagcgcccagaccaccgcccccagcgtgtaccccctggccccc。

优选地，所述抗CD22单链抗体的重链可变区编码序列包括SEQ ID NO:11所示的核酸序列；

SEQ ID NO:11：

caggtgcagctgcagcagtctggccctggcctcgtgaagcctagccagaccctgagcctgacctgtgccatcagcggcgatagcgtgtccagcaatagcgccgcctggaactggatcagacagagccctagcagaggcctggaatggctgggccggacctactaccggtccaagtggtacaacgactacgccgtgtccgtgaagtcccggatcaccatcaaccccgacaccagcaagaaccagttctccctgcagctgaacagcgtgacccccgaggataccgccgtgtactactgcgccagagaagtgaccggcgacctggaagatgccttcgacatctggggccagggcacaatggtcaccgtgtctagc。

优选地，所述抗CD22单链抗体的轻链可变区编码序列包括SEQ ID NO:12所示的核酸序列；

SEQ ID NO:12：

gacatccagatgacacagagccccagctccctgagcgccagcgtgggagacagagtgaccatcacctgtcgggccagccagaccatctggtcctacctgaactggtatcagcagcggcctggcaaggcccccaacctgctgatctatgccgccagctcactgcagagcggcgtgcccagcagattttccggcagaggcagcggcaccgacttcaccctgacaatcagttccctgcaggccgaggacttcgccacctactactgccagcagagctacagcatcccccagaccttcggccaggggaccaagctggaaatcaaa。

优选地，所述连接肽编码序列包括SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示的核酸序列；

SEQ ID NO:13：

ggatccggtggcggtggcagcggcggtggtggttccggaggcggcggttct；

SEQ ID NO:14：

ggtggaggcggcagtggcggaggtgggagcggagggggcggttccggtggcgggggatct；

SEQ ID NO:15：

ggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggc。

优选地，所述GM-CSF信号肽编码序列包括SEQ ID NO:16所示的核酸序列；

SEQ ID NO:16：

atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctg。

第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括第二方面所述的编码基因。

优选地，所述表达载体为含有第二方面所述的编码基因的病毒载体。

优选地，所述表达载体为含有第二方面所述的编码基因的慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种。

第四方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒为转染有第三方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞。

第五方面，本发明提供了一种CAR-T细胞，所述CAR-T细胞表达第一方面所述的嵌合抗原受体。

本发明中，表达抗CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体的T细胞对CD19阳性和/或CD22阳性细胞具有高效的靶向活性和杀伤效力，对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、CD22抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有杀伤作用，有利于避免免疫逃逸现象，降低了疾病复发的可能性。

优选地，所述CAR-T细胞的基因组中整合有第二方面所述的编码基因。

优选地，所述CAR-T细胞包括第三方面所述的表达载体和/或第四方面所述的重组慢病毒。

第六方面，本发明提供了一种第五方面所述的CAR-T细胞的制备方法，所述方法包括将第一方面所述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞的步骤。

第七方面，本发明提供了一种第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的编码基因、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的重组慢病毒或第五方面所述的CAR-T细胞在制备疾病治疗药物中的应用。

优选地，所述疾病包括血液肿瘤。

优选地，所述疾病包括CD19阳性和/或CD22阳性疾病。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明构建的抗CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体与单靶点嵌合抗原受体相比，对CD19阳性和/或CD22阳性细胞具有更强的靶向活性，对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、CD22抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有高效的靶向作用，有利于避免免疫逃逸现象；

(2)本发明表达抗CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体的T细胞对CD19阳性和/或CD22阳性细胞具有高效的靶向活性和杀伤效力，对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、CD22抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有杀伤作用，有利于避免免疫逃逸现象，降低了疾病复发的可能性。

附图说明

图1为含有靶向CD19和CD22双靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体图谱；

图2A为WT和2228zT2的流式结果图，图2B为1928zT2、31A2和11H8.22.28.zGFP的流式结果图；

图3为WT、2228zT2和11H8.22.28.zGFP对肿瘤细胞K52-CD22-GL在不同E:T比下的杀伤效率；

图4为WT、31A2、1928zT2和11H8.22.28.zGFP对肿瘤细胞K52-CD19-GL在不同E:T比下的杀伤效率。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1CAR分子载体的构建

本实施例首先基因合成抗CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体的编码基因，并在编码基因的C端和N端分别添加限制性内切酶Pme1酶切位点及其保护碱基和限制性内切酶Spe1酶切位点及其保护碱基；

利用限制性内切酶Pme1和Spe1对编码基因进行双酶切，琼脂凝胶电泳回收获得含有粘性末端的酶切产物，连接入同样经Pme1和Spe1双酶切的线性化pWPXLd-eGFP质粒(含粘性末端)中，连接反应在T4 DNA聚合酶(Invitrogent公司)的参与下进行，得到含有靶向CD19和CD22双靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体，图谱如图1所示。

本实施例同时构建抗原结合结构域分别为抗CD19 scFv的CAR(antiCD19scFv-CD28-CD3ζ)和抗CD22 scFv的CAR(antiCD22 scFv-CD28-CD3ζ)，并构建相应的慢病毒载体。

实施例2慢病毒包装

为了将CAR分子导入T细胞，采用293T细胞制备重组慢病毒，当293T细胞铺100mm培养皿板底达80～90％时，进行慢病毒包装：

病毒包装前2h，更换培养基为含1％胎牛血清的DMEM，加入量为6mL/100mm培养皿；

配制如表1所示的质粒混合液，pWPXLd-表达质粒包括含有靶向CD19和CD22双靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体、含有靶向CD19单靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体、含有靶向CD22单靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体，pWPXLd-eGFP质粒为不含有CAR编码基因的空载体；

表1

将36μg PEI加至另一500μL opti-MEM培养基内，混匀，室温静置5min；

将pWPXLd-表达质粒或pWPXLd-eGFP质粒与PEI混合，吹打混匀，室温静置25～30min；

将上述混合液逐滴加至培养在100mm培养皿中的293T细胞上；

培养6h后，更换培养基为含1％胎牛血清的DMEM，加入量为7mL/100mm培养皿；

包装后24h、48h和72h，收取病毒上清，同时向293T细胞补加培养基，加入量为7mL/100mm培养皿；

1000g离心10min，0.45μm滤器过滤，得到表达CAR的重组慢病毒或空白对照eGFP慢病毒，4℃保存待用。

实施例3T细胞激活和慢病毒转染

采用Ficoll密度梯度离心试剂盒(GE公司)从全血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，去除红细胞后，再利用MACS Pan-T磁珠分选出T细胞；

分选出来的T细胞采用培养基(AIM-V培养基+5％FBS+青霉素100U/mL+链霉素0.1mg/mL)稀释至细胞浓度为2.5×10⁶个/mL待用；

采用CD2/CD3/CD28 T细胞激活扩增试剂盒(美天旎公司)激活T细胞，即包被磁珠与T细胞以1:2比例混合，T细胞最终密度为5×10⁶个/mL/cm²，混合后，置于37℃、5％CO₂培养箱培养刺激48h；

T细胞激活48h后，去磁珠，300g离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬T细胞，分别加入表达CAR的重组慢病毒或空白对照eGFP慢病毒(MOI＝10)，并加入8μg/mL polybrene和300IU/mL IL-2，置于37℃、5％CO₂培养箱培养；

24h后，300g离心5min，去上清，用含300IU/mL IL-2的新鲜培养基重悬T细胞，即得CAR-T细胞；

将CAR-T细胞密度维持在1×10⁶个/mL左右，每2～3天进行一次半量换液，两周后，CAR-T细胞数扩增了100倍。

本实施例构建的CAR-T细胞分别为11H8.22.28.zGFP(表达抗CD19和CD22双靶点CAR)、31A2(表达抗人源CD19单靶点CAR)、1928zT2(表达抗鼠源CD19单靶点CAR)、2228zT2(表达抗鼠源CD22单靶点CAR)，同时设置WT对照组(转染空白对照eGFP慢病毒)。

慢病毒转染条件如表1所示。

表1

实施例4T细胞对CAR分子的表达

由于表达CAR分子的慢病毒载体上携带有eGFP基因，可以通过eGFP指示T细胞上CAR分子的表达，本实施例采用流式细胞仪ACEANovocyte，检测T细胞上的eGFP。

如图2A和图2B为实验组和不同对照组的流式结果图，可以看出，慢病毒对WT细胞的转染效率为0.72％，对2228zT2的转染效率为3.71％，对1928zT2的转染效率为18.5％，对31A2的转染效率为7.77％，对11H8.22.28.zGFP的转染效率为9.79％。

实施例5体外检测CAR-T细胞对肿瘤细胞K52-CD22-GL的杀伤功能

将实施例3制备的WT、2228zT2和11H8.22.28.zGFP分别与1×10⁴个肿瘤细胞K52-CD22-GL按E:T为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8、1:16的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％CO₂培养箱共培养18h；

18h后，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较WT、2228zT2和11H8.22.28.zGFP对K52-CD22-GL的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：

100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)

结果如图3所示，11H8.22.28.zGFP对K52-CD22-GL的体外杀伤效率显著高于WT和2228zT2，在E:T很小的情况下，即肿瘤靶细胞远大于效应T细胞，11H8.22.28.zGFP也能表现出很强的肿瘤杀伤活性。

实施例6体外检测CAR-T细胞对肿瘤细胞K52-CD19-GL的杀伤功能

将实施例3制备的WT、31A2、1928zT2和11H8.22.28.zGFP分别与1×10⁴个肿瘤细胞K52-CD19-GL按E:T为8:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％CO₂培养箱共培养18h；

18h后，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较WT、31A2、1928zT2和11H8.22.28.zGFP对K52-CD19-GL的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：

结果如图4所示，1928zT2和11H8.22.28.zGFP对K52-CD19-GL的体外杀伤效率显著高于WT和31A2。

综上所述，本发明构建的抗CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体对CD19阳性和/或CD22阳性细胞具有靶向活性，表达抗CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体的T细胞对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、CD22抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有杀伤作用，有利于避免免疫逃逸现象，降低了疾病复发的可能性。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东昭泰体内生物医药科技有限公司

<120> CD19和CD22双靶点嵌合抗原受体及其应用

<130> 20200714

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Ala Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 2

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg His

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asp

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ser Ile Thr Trp Tyr Gly Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ser Val

115 120 125

Tyr Pro Leu Ala Pro

130

<210> 3

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 4

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala

50 55 60

Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn

65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 7

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu

20

<210> 9

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gacatccaga tgacccagag ccccagcacc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60

atcacctgcc gcgccagcca gagcatcagc agctggctgg cctggtacca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacaag gccagcagcc tggagagcgg cgtgcccccc 180

cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgag ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gacgacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacagcg cctacacctt cggccagggc 300

accaagctgg agatcaag 318

<210> 10

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggccgcag cctgcgcctg 60

agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc cgccacggca tgcactgggt gcgccaggcc 120

cccggcaagg gcctggagtg ggtggccgtg atctggtacg acggcagcaa ccagtactac 180

gtggacagcg tgaagggccg cttcaccatc agccgcgaca acagcaagaa caccctggac 240

ctgcagatga acagcctgcg cgtggaggac accgccgtgt actactgcgc ccgccgcagc 300

atcacctggt acggcggctt cgacatctgg ggccagggca ccatggtgac cgtgagcagc 360

gcccagacca ccgcccccag cgtgtacccc ctggccccc 399

<210> 11

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

caggtgcagc tgcagcagtc tggccctggc ctcgtgaagc ctagccagac cctgagcctg 60

acctgtgcca tcagcggcga tagcgtgtcc agcaatagcg ccgcctggaa ctggatcaga 120

cagagcccta gcagaggcct ggaatggctg ggccggacct actaccggtc caagtggtac 180

aacgactacg ccgtgtccgt gaagtcccgg atcaccatca accccgacac cagcaagaac 240

cagttctccc tgcagctgaa cagcgtgacc cccgaggata ccgccgtgta ctactgcgcc 300

agagaagtga ccggcgacct ggaagatgcc ttcgacatct ggggccaggg cacaatggtc 360

accgtgtcta gc 372

<210> 12

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gacatccaga tgacacagag ccccagctcc ctgagcgcca gcgtgggaga cagagtgacc 60

atcacctgtc gggccagcca gaccatctgg tcctacctga actggtatca gcagcggcct 120

ggcaaggccc ccaacctgct gatctatgcc gccagctcac tgcagagcgg cgtgcccagc 180

agattttccg gcagaggcag cggcaccgac ttcaccctga caatcagttc cctgcaggcc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agctacagca tcccccagac cttcggccag 300

gggaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggatccggtg gcggtggcag cggcggtggt ggttccggag gcggcggttc t 51

<210> 14

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ggtggaggcg gcagtggcgg aggtgggagc ggagggggcg gttccggtgg cgggggatct 60

<210> 15

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggctccacct ctggatccgg caagcccgga tctggcgagg gatccaccaa gggc 54

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

Claims

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、抗CD19单链抗体的轻链可变区、第一连接肽、抗CD19单链抗体的重链可变区、第二连接肽、抗CD22单链抗体的重链可变区、第三连接肽、抗CD22单链抗体的轻链可变区、CD28和CD3ζ串联组成，

所述抗CD19单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述抗CD19单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述抗CD22单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述抗CD22单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述第一连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、所述第二连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示且所述第三连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；

所述GM-CSF信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

2.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因编码权利要求1所述的嵌合抗原受体。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因包括抗CD19单链抗体的轻链可变区编码序列、抗CD19单链抗体的重链可变区编码序列、抗CD22单链抗体的重链可变区编码序列和抗CD22单链抗体的轻链可变区编码序列；

所述编码基因还包括第一连接肽编码序列、第二连接肽编码序列和第三连接肽编码序列；

所述编码基因还包括GM-CSF信号肽编码序列、CD28编码序列和CD3ζ编码序列；

所述抗CD19单链抗体的轻链可变区编码序列如SEQ ID NO:9所示；

所述抗CD19单链抗体的重链可变区编码序列如SEQ ID NO:10所示；

所述抗CD22单链抗体的重链可变区编码序列如SEQ ID NO:11所示；

所述抗CD22单链抗体的轻链可变区编码序列如SEQ ID NO:12所示；

所述第一连接肽编码序列如SEQ ID NO:13所示、所述第二连接肽编码序列如SEQ IDNO:14所示且所述第三连接肽编码序列如SEQ ID NO:15所示；

所述GM-CSF信号肽编码序列如SEQ ID NO:16所示。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求2或3所述的编码基因。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体。

6.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒由转染有权利要求4或5所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞制备得到。

7.一种CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞表达权利要求1所述的嵌合抗原受体；

所述CAR-T细胞的基因组中整合有权利要求2或3所述的编码基因。

8.根据权利要求7所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞包括权利要求4或5所述的表达载体和/或权利要求6所述的重组慢病毒。

9.权利要求7或8所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将编码权利要求1所述的嵌合抗原受体的基因导入T细胞的步骤。

10.权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求2或3所述的编码基因、权利要求4或5所述的表达载体、权利要求6所述的重组慢病毒或权利要求7或8所述的CAR-T细胞在制备疾病治疗药物中的应用；

所述疾病为血液肿瘤。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述疾病为CD19阳性和/或CD22阳性肿瘤。