CN111763263A - 一种艰难梭菌抗原及多克隆抗体的制备方法和检测试剂盒 - Google Patents

一种艰难梭菌抗原及多克隆抗体的制备方法和检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种艰难梭菌抗原及多克隆抗体的制备方法和检测试剂盒，涉及免疫检测技术领域。本发明利用独属于艰难梭菌的抗原表位TcdB1和TcdB2作为抗原决定簇，利用单个抗原表位连接钥孔血蓝蛋白后免疫实验兔，得到高纯度、高效价及高特异性的多克隆抗体。本发明基于所述多克隆抗体提供了一种双抗体夹心ELISA试剂盒用于检测艰难梭菌，所建立的检测方法更为科学、严谨；同时满足ELISA试剂对灵敏度、特异性、重复性等重要参数的要求。

Description

一种艰难梭菌抗原及多克隆抗体的制备方法和检测试剂盒
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种艰难梭菌抗原及多克隆抗体的制备方法和检测试剂盒。
背景技术
艰难梭菌(Clostridium diffcile，CD)为革兰阳性粗大杆菌，有鞭毛，有芽孢的专性厌氧菌，分离培养较为困难。艰难梭菌感染大多数为无症状携带者，临床上艰难梭菌感染(Clostridium diffcile infection，CDI)，可引起轻度腹泻至血样腹泻，严重感染患者可导致假膜性结肠炎、中毒性巨结肠、肠坏死，甚至危及生命。艰难梭菌主要产生两种毒素：肠毒素(TcdA)和细胞毒素(TcdB)。肠毒素能趋化中性粒细胞浸润回肠肠壁，释放细胞因子，导致肠道大量失水和出血性坏死。细胞毒素能解聚肌动蛋白，损坏细胞骨架，导致局部肠壁细胞坏死，有直接损伤肠壁作用。近些年发现了TcdB也具有肠毒素的功能，可单独致病。
艰难梭菌的实验室检测是临床诊断CDI的重要依据，但目前国内缺乏标准的艰难梭菌毒素的检测方案，且相关研究较少，使艰难梭菌临床资料匮乏。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种艰难梭菌抗原及多克隆抗体的制备方法和检测试剂盒，从而建立一套完整的艰难梭菌的检测方法，更为科学、严谨，具有检测灵敏度高、特异性行和重复性好等优点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种艰难梭菌抗原，所述抗原包括将抗原表位TcdB1和TcdB2分别与载体蛋白钥孔血蓝蛋白KLH连接形成的抗原；所述TcdB1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述TcdB2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，在所述连接前，还包括分别在所述TcdB1和TcdB2的氨基酸序列的N端添加1个半胱氨酸修饰。
本发明还提供了一种艰难梭菌的多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：每隔两周对新西兰兔进行一次免疫，在第5次免疫2周后，从血液中分离纯化蛋白，得多克隆抗体Anti-TcdB1或Anti-TcdB2；
第一次免疫时，利用所述抗原分别单独与弗氏完全佐剂等体积混匀，乳化后得首次免疫抗原，利用所述的首次免疫抗原免疫兔；
第二次至第四次免疫时，利用所述抗原分别单独与弗氏不完全佐剂等体积混匀，乳化后得第二免疫抗原，利用所述第二免疫抗原免疫所述兔；
第五次免疫时，利用所述抗原免疫所述兔。
优选的，在第一次免疫时，在兔腋下、颈部和背部共5处分别注射所述第一免疫抗原0.1mg；
在第二次至第四次免疫时，在第一次免疫的相同位置分别注射所述第二免疫抗原0.1mg；
在第五次免疫时，经耳缘静脉注射所述抗原0.1mg。
优选的，在每次免疫后1周还包括采集血清，用间接ELISA方法测定血清抗体效价并进行Western-blot验证抗体的特异性。
优选的，所述分离纯化，包括将心脏血经4000r/min分离血清，用0.45μm滤器过滤后通过proteinA亲和层析柱分离纯化。
本发明还提供了一种人艰难梭菌TcdB双抗体夹心ELISA试剂盒，所述试剂盒包括以下成分：96孔板、PBS缓冲液、PBST缓冲液、包被液、封闭液、抗体稀释液显色液、终止液和抗体，所述抗体包括一抗和二抗，所述一抗为利用上述制备方法制备得到的Anti-TcdB1，所述二抗为HRP标记的利用上述制备方法制备得到的Anti-TcdB2。
优选的，利用所述试剂盒检测人艰难梭菌前，包括对所述96孔板进行预处理，所述预处理包括：利用所述包被液将Anti-TcdB1稀释至0.5μg/ml，100μl/孔加至96孔板，37℃包被2小时后，转4℃包被8～12h；包被后用所述PBST缓冲液洗板三次；向包被后的板内每孔加入300μl封闭液，置于37℃封闭2小时后，转移至4℃继续封闭8～12h；封闭后用所述PBST缓冲液洗板三次，干燥。
优选的，所述包被液包括摩尔浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH值为9.6。
优选的，所述抗体稀释液为含BSA的PBST缓冲液，所述BSA和PBST的质量体积比为0.2g：100mL。
本发明提供了一种艰难梭菌抗原，利用独属于艰难梭菌的抗原表位TcdB1和TcdB2作为抗原决定簇，利用单个抗原表位连接钥孔血蓝蛋白后免疫实验兔，得到高纯度、高效价及高特异性的多克隆抗体，该方法相较于单克隆抗体的制备方法具有更快捷、经济且方便等优点。制备的抗体在理论上具备了单克隆抗体的高特异性同时又具备多克隆抗体的高亲和性，且可用于沉淀、凝集等试验，亦可用于检测变性蛋白。制备流程相较于单克隆抗体更加经济与简便，还具有更加稳定、方便保存的优点。
本发明基于所述多克隆抗体还提供了一种双抗体夹心ELISA试剂盒用于检测艰难梭菌，所建立的检测方法更为科学、严谨；同时满足ELISA试剂对灵敏度、特异性、重复性等重要参数的要求。
本发明实施例中对所述抗原表位及构建得到的多克隆抗体进行验证，结果发现，在第四次免疫后，Anti-TcdB1和Anti-TcdB2的抗体效价分别大于1:128000和1:512000，第五次免疫后一周血清抗体效价分别大于1:256000和1:1024000。分别以Anti-TcdB1和Anti-TcdB2为一抗进行Western-blot，抗体与产毒艰难梭菌培养后上清反应条带位于170KDa，而作为阴性对照的非产毒艰难梭菌无此反应条带，证明制备的两种抗体均具有较高的特异性。基于所述多克隆抗体构建得到的双抗体夹心法ELISA检测艰难梭菌时，最低检测限为15.6ng/ml；按已建立的ELISA双抗体夹心法对产毒艰难梭菌、PBS、金黄色葡萄菌和肺炎链球菌等临床常见菌进行检测，产毒艰难梭菌A450值为0.413，判断为阳性；其余均小于阴性临界值0.1776，判断为阴性，未见交叉反应，表明该检测方法特异性强；掉建立的双抗体夹心ELISA法进行批内和批间重复性验证，其中批内阳性检测变异系数为3.62～5.58％，阴性检测变异系数为5.65～8.04％；批间阳性检测变异系数为5.19～7.00％，阴性检测变异系数为6.39～8.21％。批内和批间重复性良好，建立的双抗体夹心ELISA法具有一定的稳定性；按已建立的ELISA检测方法每周进行一次检测，用酶标仪读取OD450值，经过6个周期的检测，阳性结果虽有所降低，但结果判断仍为阳性；阴性结果保持稳定；说明该检测试剂盒稳定性较好。将终浓度为50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml和250ng/ml的CDB3重组蛋白，按已建立的ELISA检测方法进行检测，回收率在91.17～105.33％之间，每个浓度的变异系数为2.35～5.44％，说明建立的ELISA检测方法准确性较高。
附图说明
图1为Anti-TcdB1和Anti-TcdB2的效价；
图2为Anti-TcdB1(左)和Anti-TcdB2(右)的WB试验结果，其中M：蛋白标准分子量，1:TcdB1抗体与产毒菌的反应条带，2:非产毒菌阴性对照3:TcdB2抗体与产毒菌反应条带，4:非产毒菌阴性对照；
图3为灵敏度及线性回归结果；
图4为特异性实验结果；
图5为重复性实验结果；
图6为稳定性结果；
图7为TcdB1与TcdB2在TcdB蛋白的空间位置。
具体实施方式
本发明提供了一种艰难梭菌抗原，所述抗原包括将抗原表位TcdB1和TcdB2分别与载体蛋白钥孔血蓝蛋白KLH连接形成的抗原；所述TcdB1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述TcdB2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明所述抗原表位TcdB1(SEQ ID NO.1：DGSKYYFDEDTAE)和TcdB2(SEQ IDNO.2：HQNTLDENFEGESIN)的筛选过程优选包括：从NCBI RefSeq dataset获取TcdB的氨基酸序列CAJ67492.1，使用ABCpred，Bepipred和DNAstar数据库软件对其序列进行分析，对各个肽段的亲水性、可变性及表面暴露可能性等进行分析，选择12～20个氨基酸的长度作为目的抗原决定簇，分别命名为TcdB1和TcdB2，通过NCBI数据库protein Blast工具对两条多肽的同源性进行分析，确定其只来源于艰难梭菌TcdB，并通过SWISS-modle建立毒素B蛋白的3D结构，观察抗原表位的暴露情况。本发明优选将合成的裸肽同时对氨基酸序列的N端添加1个半胱氨酸修饰后，与载体蛋白钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)通过羧基基团用戊二醛法连接，合成抗原KLH-TcdB1和KLH-TcdB2。
本发明还提供了一种艰难梭菌的多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：每隔两周对新西兰兔进行一次免疫，在第5次免疫2周后，从血液中分离纯化蛋白，得多克隆抗体Anti-TcdB1或Anti-TcdB2；
第一次免疫时，利用所述抗原分别单独与弗氏完全佐剂等体积混匀，乳化后得首次免疫抗原，利用所述的首次免疫抗原免疫兔；
第二次至第四次免疫时，利用所述抗原分别单独与弗氏不完全佐剂等体积混匀，乳化后得第二免疫抗原，利用所述第二免疫抗原免疫所述兔；
第五次免疫时，利用所述抗原免疫所述兔。
本发明在所述免疫前，优选还包括对新西兰兔耳缘静脉采血，作为阴性血清。
本发明在进行第一次免疫时，优选在兔左腋下、右腋下、颈部和背部两点共5处分别注射所述第一免疫抗原0.1mg；在第二次至第四次免疫时，优选在第一次免疫的相同位置分别注射所述第二免疫抗原0.1mg；在第五次免疫时，优选经耳缘静脉注射权利要求1或2所述抗原0.1mg。
本发明在每次免疫后1周优选还包括采集血清，然后用间接ELISA方法测定血清抗体效价并进行Western-blot验证抗体的特异性。
本发明在第5次免疫2周后，从血液中分离纯化蛋白，所述血液优选为心脏血；所述分离纯化，优选包括将心脏血经4000r/min分离血清，用0.45μm滤器过滤后通过proteinA亲和层析柱分离纯化。本发明在得到所述多克隆抗体Anti-TcdB1和Anti-TcdB2后，优选还包括透析复性除盐，用BCA试剂盒定量蛋白含量，-80℃保存。
本发明还提供了一种人艰难梭菌TcdB双抗体夹心ELISA试剂盒，所述试剂盒包括以下成分：96孔板、PBS缓冲液、PBST缓冲液、包被液、封闭液、抗体稀释液显色液、终止液和抗体，所述抗体包括一抗和二抗，所述一抗为Anti-TcdB1，所述二抗为HRP标记的Anti-TcdB2。
在本发明中，利用所述试剂盒检测人艰难梭菌前，优选包括对所述96孔板进行预处理，所述预处理包括：利用所述包被液将Anti-TcdB1稀释至0.5μg/ml，100μl/孔加至96孔板，37℃包被2小时后，转4℃包被8～12h；包被后用所述PBST缓冲液洗板三次；向包被后的板内每孔加入300μl封闭液，置于37℃封闭2小时后，转移至4℃继续封闭8～12h；封闭后用所述PBST缓冲液洗板三次，干燥。本发明所述包被液中优选包括摩尔浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH值为9.6。本发明所述抗体稀释液优选为含BSA的PBST缓冲液，所述BSA和PBST的质量体积比优选为0.2g：100mL。
在本发明中，所述试剂盒中各成分的来源并没有特殊限定，自行配置时优选包括：
PBS缓冲液：用超纯水将PBS磷酸盐干粉溶解，定容至2L，即为pH7.2～7.4的PBS缓冲液；
PBST：在1000ml的PBS溶液中加入500μl的Tween-20，即为终浓度为0.5％的PBST；
包被液：秤取Na2CO31.59g和NaHCO32.93g，溶解至超纯水中，调节pH至9.6，即配置成了0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，4℃密封保存；
封闭液：5g脱脂牛奶加入100ml PBST，充分溶解；
抗体稀释液：0.2g BSA加入100ml PBST，充分溶解。
本发明还提供了一种人艰难梭菌TcdB的ELISA检测方法，具体包括以下步骤：(一)检测：取出经预处理的96孔板，100μl/孔加入产毒型艰难梭菌培养液，阴性对照加PBS缓冲液，空白孔不加任何样品，37℃恒温箱反应60min；
(二)洗涤：用1×PBST洗板三次，备用；
(三)二抗：取出HRP标记的Anti-TcdB2(HRP-Anti-TcdB2)，用抗体稀释液稀释20000倍，100μl/孔加入后，放于37℃恒温箱反应30min；
(四)洗涤：用1×PBST洗板五次，备用。
(五)显色：50μl/孔加入新鲜配置的TMB工作液，室温避光显色5min，再50μl/孔快速加入终止液，终止反应。用酶标仪测定450nm的OD值。
(六)结果判读：OD450值超过0.1872为阳性，低于0.1776为阴性，介于0.1776～0.1872之间的为可疑值。
本发明将重组TcdB(通过在PET30a质粒中***TcdB的基因，利用原核生物表达出来的TcdB蛋白)以PBS倍比稀释后，进行双抗体夹心法ELISA，以重组TcdB的浓度的对数值为横坐标，以A450值为纵坐标，绘制曲线，得出曲线方程y＝0.0248ln(x)+0.1826，R2＝0.9903，当TcdB抗原稀释至15.6ng/ml时，ELISA结果判定为阳性。因此该方法的最低检测限为15.6ng/ml。
下面结合实施例对本发明提供的艰难梭菌抗原及多克隆抗体的制备方法和检测试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、筛选抗原表位和制备多克隆抗体
从NCBI RefSeq dataset获取TcdB的氨基酸序列CAJ67492.1，使用ABCpred，Bepipred和DNAstar数据库软件对其序列进行分析，对各个肽段的亲水性、可变性及表面暴露可能性等进行分析，其中将ABCpred预测结果评分大于0.9的肽段筛选出来；Bepipred预测结果中单个氨基酸评分大于0.6的肽段也筛选出来，DNAstar利用对蛋白质的二级结构进行预测，该方法认为转角和无规则蜷曲结构适合作为抗原表位，亲水性、柔韧性和表面可及性也是不可缺少的积极影响因素。将以上三组数据综合分析，选择在三组预测结果均出现的肽段作为候选序列，选择其中两条肽段作为目的抗原决定簇，分别命名为TcdB1和TcdB2，通过NCBI数据库protein Blast工具对两条多肽的同源性进行分析，确定其只来源于艰难梭菌TcdB，并通过SWISS-modle建立毒素B蛋白的3D结构(图7)，观察抗原表位的暴露情况。合成裸肽并同时对氨基酸序列的N端添加1个半胱氨酸修饰后，与载体蛋白钥孔血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin，KLH)连接，分别合成裸肽TcdB1、TcdB2和KLH-TcdB1、KLH-TcdB2复合蛋白。
免疫前，取新西兰大白兔2只，免疫前耳缘静脉采血，作为阴性血清。将TcdB抗原(KLH-TcdB1、KLH-TcdB2)分别单独与弗氏完全佐剂1:1等体积混匀，乳化后于兔左腋下、右腋下、颈部、背部两点共5处分别注射抗原0.1mg。两周后将抗原与同体积的弗氏不完全佐剂等体积混合，免疫剂量及部位同上。重复第2次免疫2次，在第5次免疫时经耳缘静脉注射抗原0.1mg。在每次免疫后1周采集血清，用间接ELISA方法测定血清抗体效价并进行Western-blot实验验证抗体的特异性。
第5次免疫2周后心脏采血，4000r/min分离血清，用0.45um滤器过滤后通过protein A亲和层析柱分离纯化，纯化蛋白命名Anti-TcdB1和Anti-TcdB2，透析复性除盐，用BCA试剂盒定量蛋白含量，-80℃保存。
在第四次免疫后，抗体效价如如图1所示，其中A表示Anti-TcdB1和Anti-TcdB2的效价分别大于1:128000和1:512000；B表示第五次免疫后一周血清抗体效价，Anti-TcdB1和Anti-TcdB2分别大于1:256000和1:1024000。
分别以Anti-TcdB1和Anti-TcdB2为一抗进行Western-blot结果如图2所示，抗体与产毒艰难梭菌培养后上清反应条带位于170KDa，而作为阴性对照的非产毒艰难梭菌无此反应条带，证明制备的2种抗体均具有较高的特异性。
2、试剂配置
PBS：用超纯水将PBS磷酸盐干粉溶解，定容至2L，即为pH7.2-7.4的PBS。
PBST：在1000ml的PBS溶液中加入500μl的Tween-20，即为终浓度为0.5％的PBST。
包被液：秤取Na2CO31.59g和NaHCO32.93g，溶解至超纯水中，调节pH至9.6，即配置成了0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，4℃密封保存。
封闭液：5g脱脂牛奶加入100ml PBST，充分溶解。
抗体稀释液：0.2g BSA加入100ml PBST，充分溶解。
3、人艰难梭菌TcdB双抗体夹心ELISA试剂盒的制备
包被：用ELISA包被液将Anti-TcdB1稀释至0.5μg/ml，100μl/孔加至96孔板，37℃包被2小时后，转4℃过夜包被。
洗涤：用1×PBST洗板三次，备用。
封闭：用300μl/孔加入封闭液，置于37℃封闭2小时后，转移至4℃继续过夜封闭。
洗涤：用1×PBST洗板三次，干燥后放入含干燥机的密封袋。
4、检测
检测：打开密封袋，取出96孔板，100μl/孔加入细菌培养上清液，阴性对照加PBS缓冲液，空白孔不加任何样品，37℃恒温箱反应60min.
洗涤：用1×PBST洗板三次，备用。
二抗：取出HRP-Anti-TcdB2，用抗体稀释液稀释20000倍，100μl/孔加入后，放于37℃恒温箱反应30min。
洗涤：用1×PBST洗板五次，备用。
显色：50μl/孔加入新鲜配置的TMB工作液，室温避光显色5min，再50μl/孔快速加入终止液，终止反应。用酶标仪测定OD450值。
结果判读：OD450值超过0.1872为阳性，低于0.1776为阴性，介于0.1776～0.1872之间的为可疑值。
因艰难梭菌培养液中含大量非毒素B蛋白，难以定量毒素B蛋白，故选择用重组毒素B蛋白来做敏感性实验，将重组TcdB以PBS倍比稀释后，进行双抗体夹心法ELISA，以重组TcdB的浓度的对数值为横坐标，以A450值为纵坐标，绘制曲线，得出如图3所示的曲线方程y＝0.0248ln(x)+0.1826，R2＝0.9903，当TcdB抗原稀释至15.6ng/ml时，ELISA结果判定为阳性。因此该方法的最低检测限为15.6ng/ml。
按已建立的ELISA双抗体夹心法对产毒艰难梭菌、PBS、金黄色葡萄菌和肺炎链球菌等临床常见菌进行检测，结果见图4，产毒艰难梭菌A450值为0.413，判断为阳性；其余均小于阴性临界值0.1776，判断为阴性，未见交叉反应，表明该检测方法特异性强。
建立的双抗体夹心ELISA法进行批内和批间重复性验证，结果如图5所示，其中批内阳性检测变异系数为3.62～5.58％，阴性检测变异系数为5.65～8.04％；批间阳性检测变异系数为5.19～7.00％，阴性检测变异系数为6.39～8.21％。批内和批间重复性良好，建立的双抗体夹心ELISA法具有一定的稳定性。
按已建立的ELISA检测方法每周进行一次检测，用酶标仪读取OD450值。结果如图6所示，经过6个周期的检测，阳性结果虽有所降低，但结果判断仍为阳性；阴性结果保持稳定。说明该检测试剂盒稳定性较好。
将终浓度为50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml和250ng/ml的CDB3重组蛋白，按已建立的ELISA检测方法进行检测。按照公式(回收率％＝检测浓度/实际浓度×100％)计算回收率，结果如表1所示，回收率在91.17～105.33％之间，每个浓度的变异系数为2.35～5.44％，说明本发明所建立的ELISA检测方法准确性较高。
表1回收实验结果
Figure BDA0002576647480000101
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 宁夏医科大学
<120> 一种艰难梭菌抗原及多克隆抗体的制备方法和检测试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> Clostridium difficile
<400> 1
Asp Gly Ser Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu
1 5 10
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Clostridium difficile
<400> 2
His Gln Asn Thr Leu Asp Glu Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn
1 5 10 15

Claims (10)

1.一种艰难梭菌抗原，其特征在于，所述抗原包括将抗原表位TcdB1和TcdB2分别与载体蛋白钥孔血蓝蛋白KLH连接形成的抗原；所述TcdB1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述TcdB2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述抗原，其特征在于，在所述连接前，还包括分别在所述TcdB1和TcdB2的氨基酸序列的N端添加1个半胱氨酸修饰。
3.一种艰难梭菌的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：每隔两周对新西兰兔进行一次免疫，在第5次免疫2周后，从血液中分离纯化蛋白，得多克隆抗体Anti-TcdB1或Anti-TcdB2；
第一次免疫时，利用权利要求1或2所述抗原分别单独与弗氏完全佐剂等体积混匀，乳化后得首次免疫抗原，利用所述的首次免疫抗原免疫兔；
第二次至第四次免疫时，利用权利要求1或2所述抗原分别单独与弗氏不完全佐剂等体积混匀，乳化后得第二免疫抗原，利用所述第二免疫抗原免疫所述兔；
第五次免疫时，利用权利要求1或2所述抗原免疫所述兔。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，在第一次免疫时，在兔腋下、颈部和背部共5处分别注射所述第一免疫抗原0.1mg；
在第二次至第四次免疫时，在第一次免疫的相同位置分别注射所述第二免疫抗原0.1mg；
在第五次免疫时，经耳缘静脉注射权利要求1或2所述抗原0.1mg。
5.根据权利要求3或4所述制备方法，其特征在于，在每次免疫后1周还包括采集血清，用间接ELISA方法测定血清抗体效价并进行Western-blot验证抗体的特异性。
6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述分离纯化，包括将心脏血经4000r/min分离血清，用0.45μm滤器过滤后通过proteinA亲和层析柱分离纯化。
7.一种人艰难梭菌TcdB双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下成分：96孔板、PBS缓冲液、PBST缓冲液、包被液、封闭液、抗体稀释液显色液、终止液和抗体，所述抗体包括一抗和二抗，所述一抗为利用权利要求3～6任一项所述制备方法制备得到的Anti-TcdB1，所述二抗为HRP标记的利用权利要求3～6任一项所述制备方法制备得到的Anti-TcdB2。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，利用所述试剂盒检测人艰难梭菌前，包括对所述96孔板进行预处理，所述预处理包括：利用所述包被液将Anti-TcdB1稀释至0.5μg/ml，100μl/孔加至96孔板，37℃包被2小时后，转4℃包被8～12h；包被后用所述PBST缓冲液洗板三次；向包被后的板内每孔加入300μl封闭液，置于37℃封闭2小时后，转移至4℃继续封闭8～12h；封闭后用所述PBST缓冲液洗板三次，干燥。
9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，所述包被液包括摩尔浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH值为9.6。
10.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述抗体稀释液为含BSA的PBST缓冲液，所述BSA和PBST的质量体积比为0.2g：100mL。
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