CN111748552A - 用于五种幼儿腹泻病系列病毒检测的试剂盒及其应用 - Google Patents

用于五种幼儿腹泻病系列病毒检测的试剂盒及其应用 Download PDF

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CN111748552A CN202010542570.9A CN202010542570A CN111748552A CN 111748552 A CN111748552 A CN 111748552A CN 202010542570 A CN202010542570 A CN 202010542570A CN 111748552 A CN111748552 A CN 111748552A
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金宁一
李体远
李昌
杜寿文
田明尧
任琴
张星艳
王宇航
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Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences
Shenzhen Peoples Hospital
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Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences
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Abstract

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种用于建立同时检测幼儿腹泻系列病毒，如诺如病毒GⅠ型和GⅠ/GⅡ型(NV GI、NV GI/GⅡ)、人星状病毒(HAstV)、轮状病毒A组(RV)和肠道腺病毒(EAdV)的极速检测试剂盒及其应用。本发明具备很高的灵敏度和特异性，其建立的方法与其他荧光定量PCR相比，可在半小时内获得结果，可达到临床快速检测，有望实现真正的POCT，具有很好的应用前景。

Description

用于五种幼儿腹泻病系列病毒检测的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别涉及用于五种幼儿腹泻病系列病毒检测的试剂盒及其应用。
背景技术
婴幼儿腹泻病是世界范围内影响婴幼儿健康的常见病和多发病。病毒性腹泻是导致全球婴幼儿急性重症腹泻的重要原因，此病也是发展中国家婴幼儿死亡的主要疾病。引起婴幼儿腹泻的病毒主要包括诺如病毒、人星状病毒、轮状病毒和肠道腺病毒等。
诺如病毒，又称诺瓦克病毒(Norwalk Viruses，NV)是人类杯状病毒科(HumanCalicivirus，HuCV)中诺如病毒(Norovirus，NV)属的原型代表株。它是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。NV为单股正链RNA病毒，颗粒直径约为26～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称。电镜下缺乏显著的形态学特征，负染色电镜照片显示，NV是具有典型的羽状外缘，表面有凹痕的小圆状结构病毒。从急性胃肠炎病人的粪便中分离得到，不能在细胞或组织中培养，也没有合适的动物模型。NV感染性腹泻是由诺如病毒属病毒引起的腹泻，其在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。美国每年在所有的非细菌性腹泻暴发中，60-90％是由NV引起。荷兰、英国、日本、澳大利亚等发达国家也都有类似结果。在中国5岁以下腹泻儿童中，NV检出率为15％左右，血清抗体水平调查表明中国人群中NV的感染亦十分普遍。NV感染性腹泻具有发病急、传播速度快、涉及范围广等特点，是引起非细菌性腹泻暴发的主要病因。NV感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。
人星状病毒(Human Astrovirus，HAstV)属于星状病毒科哺乳动物星状病毒属，是一种单正链RNA病毒，于1975年从腹泻婴儿粪便中分离得到，球形，直径28-35nm，无包膜，电镜下表面结构呈星形，有5～6个角。该病毒呈世界性分布，粪-口传播，是引起婴幼儿、老年人及免疫功能低下者急性病毒性肠炎的重要病原之一，其致病性已日益受到重视，人类感染腺病毒主要症状是严重腹泻，伴随发热、恶心、呕吐。本病为自愈性疾病，大部分患者在出现症状2-3天时，症状会逐渐减轻，但也有极少数症状加重，造成脱水。
轮状病毒(Rotavirus，RV)是一种双链核糖核酸病毒，属于呼肠孤病毒科，是引起婴幼儿腹泻的主要病原体之一。全世界每年因轮状病毒感染导致的婴幼儿死亡的人数大约为900000人，其中大多数发生在发展中国家。在我国，0～2岁以内的婴幼儿人数约为4000万人(含新生儿)，每年大约有1000万婴幼儿患轮状病毒感染性胃肠炎，占婴幼儿人数的1/4，是引起婴幼儿严重腹泻的最主要病原。轮状病毒总共有七种，以英文字母编号为A、B、C、D、E、F与G。其中，A种是最为常见的一种，而人类轮状病毒感染超过90％的案例也都是该种造成的。其感染途径为粪-口途径，主要感染小肠上皮细胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻。临床表现为急性胃肠炎，呈渗透性腹泻病，病程一般为6-7天，发热持续1-2天，呕吐2～3天，腹泻5天，严重出现脱水症状。
肠道腺病毒(Enteric adenovirus，EAdV)是一种双链直线DNA病毒，长约36kb，外层为蛋白外壳，核衣壳20面体立体对称。EAdV是引起婴幼儿腹泻的又一重要病原体，主要经粪-口途径传播，亦可通过呼吸道传播，主要感染两岁以下儿童。EAdV感染性腹泻呈全球性分布，全年呈散发、无显著季节性。印度以2、3月份为相对高峰期，但总体无明显趋势。此外，国内外EAdV腹泻发病无性别差异。其感染的临床症状主要表现为腹泻、呕吐、发热，部分患儿有腹痛、呼吸道症状等，潜伏期3-10天，病程约5-9天。常见呕吐1-2天后见水样性腹泻，每日数次至数十次，持续1-2周，平均5-9天，少数可延长至3-4周，近半数患者在发病初期伴有2-3天低热，部分患者同时伴有鼻炎、咽炎、气管炎等上呼吸道感染。
目前对于幼儿病毒感染性腹泻的临床诊断，多以临床症状及流行病学资料作为依据，而确诊需用电子显微镜技术、抗原检测、病毒分离培养、血清学检测及病毒核酸的分子生物学检测等实验室诊断。在这些方法中，基于荧光定量的病毒核酸检测最为常用。而传统的荧光定量PCR方法尚存在试剂价格高，检测时间长、无法达到真正的即时检验(point-of-care testing,POCT)，不能实现便携、可移动及现场快检的要求。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种用于五种幼儿腹泻病系列病毒检测的试剂盒及其应用，具体提供一种快速、高效、高通量和高灵敏度检测NV G Ⅰ/G Ⅱ、NV G Ⅰ、HastV、RV以及EAdV的方法以及检测试剂盒。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了引物探针组合，包括如下组合中的一种或两者以上：
组合一：
(1)、上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和
(2)、下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；和
(3)、第一荧光探针具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；和
(4)、第二荧光探针具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；或
(5)、如(1)、(2)、(3)或(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)、(2)、(3)或(4)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(6)、与(1)、(2)、(3)或(4)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；
组合二：
(7)、上游引物具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；和
(8)、下游引物具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；和
(9)、荧光探针具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；或
(10)、如(7)、(8)或(9)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(7)、(8)或(9)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(11)、与(7)、(8)或(9)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；
组合三：
(12)、上游引物具有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；和
(13)、下游引物具有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；和
(14)、荧光探针具有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；或
(15)、如(12)、(13)或(14)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(12)、(13)或(14)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(16)、与(12)、(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；
组合四：
(17)、上游引物具有如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；和
(18)、下游引物具有如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；和
(19)、荧光探针具有如SEQ ID No.13所示的核苷酸序列；或
(20)、如(17)、(18)或(19)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(17)、(18)或(19)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(21)、与(17)、(18)或(19)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；
组合五：
(22)、上游引物具有如SEQ ID No.14所示的核苷酸序列；和
(23)、下游引物具有如SEQ ID No.15所示的核苷酸序列；和
(24)、荧光探针具有如SEQ ID No.16所示的核苷酸序列；或
(25)、如(22)、(23)或(24)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(22)、(23)或(24)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(26)、与(22)、(23)或(24)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。
具体的，本发明提供的引物探针组合为：
诺如病毒G1：
正向引物：gCTggATgCgCTTCCATgA(如SEQ ID No.1所示)
反向引物：TCCTTAgACgCCATCATCATTTAC(如SEQ ID No.2所示)
荧光探针1：FAM-TgCgATCTCCTgTCCACAATCCgAg-BHQ1(如SEQ ID No.3所示)
荧光探针2：FAM-TgCgATCTCCTgTCCACAAACCAAg-BHQ1(如SEQ ID No.4所示)
诺如病毒G2：
正向引物：GGATGAGATTCTCAGAYCTSAGCAC(如SEQ ID No.5所示)
反向引物：TCGACGCCATCTTCATTCAC(如SEQ ID No.6所示)
荧光探针：FAM-AGATTGCGATCGCCCTCCCA-BHQ1(如SEQ ID No.7所示)
人星状病毒：
正向引物：ggACTgCWAAgCAgCTTCgT(如SEQ ID No.8所示)
反向引物：gCCATCRCACTTCTTTggTC(如SEQ ID No.9所示)
荧光探针：FAM-TCACAgAAgAgCAACTCCATCgCATTTg-BHQ1(如SEQ ID No.10所示)
人轮状病毒A组：
正向引物：AgTggTTgATgCTCAAgATggA(如SEQ ID No.11所示)
反向引物：TCATTgTAATCATATTgAATACCCA(如SEQ ID No.12所示)
荧光探针：FAM-CAgCAACAACTgCAgCTTCAAAAgAAgWgT-BHQ1(如SEQ ID No.13所示)
肠道腺病毒：
正向引物：TgTTYgAAgTTTTCgACgTYgT(如SEQ ID No.14所示)
反向引物：SAggTAgACggCCTCgATgA(如SEQ ID No.15所示)，其中，S为C或G；
荧光探针：FAM-CgCATCCACCAgCCSCACC(如SEQ ID No.16所示)。
在本发明的一些具体实施方案中，所述取代、缺失或添加一个或多个中的多个为2个、3个、4个、5个或6个。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的引物探针组合在制备病毒检测的试剂和/或试剂盒中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒为引起婴幼儿腹泻的病毒。
在本发明的一些具体实施方案中，所述引起婴幼儿腹泻的病毒为诺如病毒、人星状病毒、轮状病毒和肠道腺病毒中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述幼儿腹泻病系列病毒为诺如病毒(NV G Ⅰ/G Ⅱ、NV G Ⅰ)、人星状病毒(HAstV)、轮状病毒A组(RV)以及肠道腺病毒(EAdV)中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒检测的扩增程序为：
Figure BDA0002539412410000061
本发明还提供了病毒检测的试剂盒，包括所述的引物探针组合以及常用的助剂。
在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒为引起婴幼儿腹泻的病毒。
在本发明的一些具体实施方案中，所述引起婴幼儿腹泻的病毒为诺如病毒、人星状病毒、轮状病毒和肠道腺病毒中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述幼儿腹泻病系列病毒为诺如病毒(NV G Ⅰ/G Ⅱ、NV G Ⅰ)、人星状病毒(HAstV)、轮状病毒A组(RV)以及肠道腺病毒(EAdV)中的一种或多种。
本发明提供的试剂盒具备很高的灵敏度和特异性，其建立的方法与其他荧光定量PCR相比，可在半小时内获得结果，可达到临床快速检测，有望实现真正的POCT，具有很好的应用前景。本发明提供的检测方法选用美康基因提供的不同病毒的检测试剂盒，利用其生产的基于微流控芯片技术和具有独特快速反应体系及创新性温控模块研制的极速荧光定量PCR仪，通过选择不同组合、优化反应条件、规范实验流程、建立质控标准，建立可同时检测五种幼儿腹泻病系列病毒的快速检测技术平台。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明实施例2中NV G Ⅰ的特异性检测结果；
图2示本发明实施例2中NV G Ⅰ/G Ⅱ的特异性检测结果；
图3示本发明实施例2中HAstV的特异性检测结果；
图4示本发明实施例2中RV的特异性检测结果；
图5示本发明实施例2中EAdV型的特异性检测结果；
图6示本发明实施例3中NV G Ⅰ、NV G Ⅰ/G Ⅱ、HAstV、RV以及EAdV的灵敏性检测结果。
具体实施方式
本发明公开了一种用于五种幼儿腹泻病系列病毒检测的试剂盒及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明还提供了NV G Ⅰ、NV G Ⅰ/G Ⅱ、HAstV、RV以及EAdV的极速检测方法，包括如下步骤：
核酸提取(配合Hs480加热离心机使用)
1)取样品50μl加入5μl FastLyse L4，震荡混匀；
2)将混匀后的样本置于HS480加热离心一体机中95℃加热2min，5000rpm离心2min，上清可直接作为模板用于RT-PCR扩增；
3)阳性对照与阴性对照与待测样本同步进行处理。
二、PCR试剂配制
1)配制PCR反应液：预先混合极速PCR buffer1(68μl)与极速PCR酶系(17μl)(比实际反应管数多2个，避免加样过程中发生损耗，混合时避免产生气泡)；
2)各取5μl上述混合液分装至PCR反应管(15管)中，分别加入2μl相应的引物探针，编号并充分混匀；(注意：使用前确保极速PCR buffer 1和引物探针混合液充分溶解)。
三、加样
1)取已处理好的样品RNA、阳性对照、阴性对照各3μl分别加入到相应的PCR反应管中；
2)取8μl终混合液垂直加入PCR扩增芯片中，盖上芯片盖，移至扩增检测区。建议芯片加样顺序如下：
表1
01 NV G Ⅰ(PC) 09 HAstV(待检样品RNA)
02 NV G Ⅰ(NC) 10 RV(PC)
03 NV G Ⅰ(待检样品RNA) 11 RV(NC)
04 NV G Ⅰ/G Ⅱ(PC) 12 RV(待检样品RNA)
05 NV G Ⅰ/G Ⅱ(NC) 13 EAdV(PC)
06 NV G Ⅰ/G Ⅱ(待检样品RNA) 14 EAdV(NC)
07 HAstV(PC) 15 EAdV(待检样品RNA)
08 HAstV(NC) 16 水
四、PCR扩增检测
1)将PCR扩增芯片***Mokobio UltraFast LabChip Real-time PCR V280中进行扩增检测。
2)循环参数设定：
表2
Figure BDA0002539412410000081
Figure BDA0002539412410000091
3)仪器检测通道选择：荧光信号选择FAM通道，内标荧光信号选择Cy5通道。
本发明建立的方法与其他荧光定量PCR相比，可在半小时内获得结果，可达到临床快速检测，有望实现真正的POCT，若推向临床，具有很好的应用前景。
本发明提供的用于五种呼吸道病毒检测的试剂盒及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
以下实施例均按照常规实验条件中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1重复性检测
以稀释10倍的各病毒阳性对照作为待检样品进行重复性检测，共重复检测3次。
一、核酸提取(配合Hs480加热离心机使用)
1)取样品50μl加入5μl FastLyse L4，震荡混匀；
2)将混匀后的样本置于HS480加热离心一体机中95℃加热2min，5000rpm离心2min；
3)离心结束后，取上清即为样品RNA，编号；
4)阳性对照、阴性对照与待测样本同步进行处理。
二、PCR试剂配制
1)配制PCR反应液：预先混合极速PCR buffer1(68μl)与极速PCR酶系(17μl)(比实际反应管数多2个，避免加样过程中发生损耗，混合时避免产生气泡)；
2)各取5μl上述混合液分装至PCR反应管(15管)中，分别加入2μl相应的引物探针，编号并充分混匀；(注意：使用前确保极速PCR buffer 1和引物探针混合液充分溶解)。
三、加样
1)取已处理好的样品RNA、阳性对照、阴性对照(阳性对照为含各病毒目的基因片段的质粒菌或假病毒，阴性对照为细胞培养液)各3μl分别加入到相应的PCR反应管中；
2)取8μl终混合液垂直加入PCR扩增芯片中，盖上芯片盖，移至扩增检测区。建议芯片加样顺序如下：
表3
01 NV G Ⅰ(PC) 09 HAstV(待检样品RNA)
02 NV G Ⅰ(NC) 10 RV(PC)
03 NV G Ⅰ(待检样品RNA) 11 RV(NC)
04 NV G Ⅰ/G Ⅱ(PC) 12 RV(待检样品RNA)
05 NV G Ⅰ/G Ⅱ(NC) 13 EAdV(PC)
06 NV G Ⅰ/G Ⅱ(待检样品RNA) 14 EAdV(NC)
07 HAstV(PC) 15 EAdV(待检样品RNA)
08 HAstV(NC) 16 水
四、PCR扩增检测
1)将PCR扩增芯片***Mokobio UltraFast LabChip Real-time PCR V280中进行扩增检测。
2)循环参数设定：
表4
Figure BDA0002539412410000101
3)仪器检测通道选择：荧光信号选择FAM通道，内标荧光信号选择Cy5通道。
五、结果
表5重复性检测数据统计结果
Figure BDA0002539412410000102
Figure BDA0002539412410000111
共重复检测了3次，结果Ct值变异系数(CV)≤5％，重复性较好。
实施例2特异性检测
分别以各病毒阳性对照作为待检样品进行特异性检测，检测方法同实施例1。
结果：各病毒阳性对照样品仅在对应的探针下呈阳性，其余均呈阴性，特异性较好，结果如图1-图5所示。
实施例3敏感性检测
将试剂盒中的各病毒阳性对照(浓度均为1×105copies/ml)梯度稀释至1×104copies/ml、1×103copies/ml、1×102copies/ml和1×101copies/ml，制备好后以此作为待测样品用对应的试剂盒进行敏感性检测。
具体实施步骤同实施例1
结果：NV G Ⅰ、NV G Ⅰ/G Ⅱ、HAstV、RV以及EAdV的检测限均不高于1×101copies/ml，结果如图6所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 申请人
<120> 用于五种幼儿腹泻病系列病毒检测的试剂盒及其应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctggatgcg cttccatga 19
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccttagacg ccatcatcat ttac 24
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcgatctcc tgtccacaat ccgag 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcgatctcc tgtccacaaa ccaag 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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tcgacgccat cttcattcac 20
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gccatcrcac ttctttggtc 20
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcacagaaga gcaactccat cgcatttg 28
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agtggttgat gctcaagatg ga 22
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcattgtaat catattgaat accca 25
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cagcaacaac tgcagcttca aaagaagwgt 30
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgttygaagt tttcgacgty gt 22
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
saggtagacg gcctcgatga 20
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgcatccacc agccscacc 19

Claims (9)

1.引物探针组合，其特征在于，包括如下组合中的一种或两者以上：
组合一：
(1)、上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和
(2)、下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；和
(3)、第一荧光探针具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；和
(4)、第二荧光探针具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；或
(5)、如(1)、(2)、(3)或(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)、(2)、(3)或(4)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(6)、与(1)、(2)、(3)或(4)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；
组合二：
(7)、上游引物具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；和
(8)、下游引物具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；和
(9)、荧光探针具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；或
(10)、如(7)、(8)或(9)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(7)、(8)或(9)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(11)、与(7)、(8)或(9)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；
组合三：
(12)、上游引物具有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；和
(13)、下游引物具有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；和
(14)、荧光探针具有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；或
(15)、如(12)、(13)或(14)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(12)、(13)或(14)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(16)、与(12)、(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；
组合四：
(17)、上游引物具有如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；和
(18)、下游引物具有如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；和
(19)、荧光探针具有如SEQ ID No.13所示的核苷酸序列；或
(20)、如(17)、(18)或(19)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(17)、(18)或(19)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(21)、与(17)、(18)或(19)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；
组合五：
(22)、上游引物具有如SEQ ID No.14所示的核苷酸序列；和
(23)、下游引物具有如SEQ ID No.15所示的核苷酸序列；和
(24)、荧光探针具有如SEQ ID No.16所示的核苷酸序列；或
(25)、如(22)、(23)或(24)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(22)、(23)或(24)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(26)、与(22)、(23)或(24)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述取代、缺失或添加一个或多个中的多个为2个、3个、4个、5个或6个。
3.如权利要求1或2所述的引物探针组合在制备病毒检测的试剂和/或试剂盒中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病毒为引起婴幼儿腹泻的病毒。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述引起婴幼儿腹泻的病毒为诺如病毒、人星状病毒、轮状病毒和肠道腺病毒中的一种或多种。
6.如权利要求3至5任一项所述的应用，其特征在于，所述病毒检测的扩增程序为：
Figure FDA0002539412400000031
7.病毒检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的引物探针组合以及常用的助剂。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述病毒为引起婴幼儿腹泻的病毒。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述引起婴幼儿腹泻的病毒为诺如病毒、人星状病毒、轮状病毒和肠道腺病毒中的一种或多种。
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