CN111743920A - 一种酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物制品的技术领域，更具体地，本发明涉及一种酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉、制备方法及其应用，所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉，冻干粉酪酸梭状芽孢杆菌的芽孢率大于90％，冻干粉中活菌数为2.0×1010cfu/g～3.0×1010cfu/g。本发明提供的酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的抗冻性较强，冻干粉中活菌数大于2.0×1010cfu/g，芽孢率大于90％，延长了酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的保藏时间，有利于后期产品的加工、储藏及运输。

Description

一种酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物制品的技术领域，更具体地，本发明涉及一种酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉、制备方法及其应用。
背景技术
近年来，益生菌在功能性乳制品、保健食品、微生态制剂及医疗等领域得到广泛应用，具体是指一类对宿主有功能性健康益处的活性微生物，具有调节人体免疫功能、改善肠道菌群微生态平衡、降低血脂胆固醇、促进营养物质消化与吸收等优点。常见的益生菌有乳酸菌、双歧杆菌、酪酸梭状芽孢杆菌及酵母菌等。酪酸梭状芽孢杆菌作为机体肠道中最重要的生理性细菌，与人体的生长、新陈代谢密切相关，在人体健康和疾病方面起着重要的作用。
酪酸梭状芽孢杆菌又名丁酸梭状芽孢杆菌和宫内菌，是健康儿童和成人肠道内的共生菌。酪酸梭状芽孢杆菌专性厌氧，有着促进有益菌和抑制有害菌的作用。酪酸梭状芽孢杆菌微生态制剂对腹泻、肠炎、结直肠癌和新生儿黄疸等疾病有着很强的防治作用。口服酪酸梭状芽孢杆菌活菌片、酪酸梭状芽孢杆菌胶囊等片剂和散剂的生产已经通过了国家食品药品监督管理局的GMP认证。
酪酸梭状芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌、专性厌氧、形态为杆状；形成芽孢后抗逆性较强，在生产、保藏和运输过程中可保持其活性。研究表明，酪酸梭状芽孢杆菌制剂若形成的芽孢率较低，在贮存过程中活菌数量下降很快，4℃条件下冷藏也只能保藏5～7d，因此制备高活性酪酸梭状芽孢杆菌菌粉至关重要，有利于后期产品的加工、储藏及运输，但在制备菌粉的过程中，需要经过冻干这一过程，若酪酸梭状芽孢杆菌的芽孢率较低，在冻干过程会有大量活菌死去。然而目前如何提高酪酸梭状芽孢杆菌芽孢率和冻干粉的活菌数一直是一个问题。
发明内容
针对现有技术中存在的一些问题，本发明第一个方面提供了一种酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉，冻干粉酪酸梭状芽孢杆菌的芽孢率大于90％，冻干粉中活菌数为2.0×1010cfu/g～3.0×1010cfu/g。
作为本发明的一种优选地技术方案，所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的制备原料包括酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥和保护剂，其重量比为(1～0.2)：(0.1～1)；所述酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥中含有酪酸梭状芽孢杆菌。
作为本发明的一种优选地技术方案，所述保护剂选自脱脂奶粉、海藻糖、蔗糖、麦芽糖、β-环糊精、甘露醇、甘油中一种或多种。
作为本发明的一种优选地技术方案，所述保护剂包括脱脂奶粉和海藻糖，重量比为(0.8～10)：1。
作为本发明的一种优选地技术方案，培养酪酸梭状芽孢杆菌的液体发酵培养基成分包括碳源、氮源、无机盐、维生素B1和蒸馏水；所述碳源选自葡萄糖、可溶性淀粉、玉米浆粉、大豆浆粉、蔗糖中一种或多种；所述氮源选自胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸粉、酪蛋白胨、牛肉浸膏、L-半胱氨酸、谷氨酸、丙氨酸、消化血清粉、硫酸铵、豆饼粉、尿素、氯化铵中一种或多种；所述无机盐选自醋酸钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钙、碳酸氢钠中一种或多种。
作为本发明的一种优选地技术方案，所述液体发酵培养基成分中所述碳源包括：25～35g可溶性淀粉、5～15g葡萄糖；所述氮源包括5～20g胰蛋白胨、5～25g大豆蛋白胨、10～20g酵母浸粉、5～20g酪蛋白胨、10～20g牛肉浸膏、1～2g L-半胱氨酸、0.1～1g谷氨酸、0.1～1g丙氨酸、10～15g消化血清粉；所述无机盐包括5～15g醋酸钠、1～5g磷酸氢二钾、1～5g磷酸二氢钾、10～20g碳酸钙。
作为本发明的一种优选地技术方案，所述液体发酵培养基成分还包括0.5～1.5g硫酸镁、0.5～1.5g硫酸锰。
本发明第二个方面提供了一种所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的制备方法，其包括下面步骤：
(1)菌种培养：培养酪酸梭状芽孢杆菌至稳定期，芽孢率大于90％且芽孢脱落率大于10％，获得酪酸梭状芽孢杆菌发酵液；
(2)收集菌体：将酪酸梭状芽孢杆菌发酵液沉淀，获得酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥；
(3)添加保护剂：将酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥和保护剂混合得到混合物；
(4)真空冷冻干燥：将混合物于25～37℃平衡20～60min，-40℃预冻6～12h，然后在3～8Pa下冷冻干燥16～28h，即得。
作为本发明的一种优选地技术方案，所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的制备方法，其包括下面步骤：
(1)菌种活化：在无菌室中，将低温保存的酪酸梭状芽孢杆菌菌种溶解在20～30mL无菌生理盐水中，振荡3～5min后于75～85℃水浴振荡10～20min，振荡频率为110～130r/min，得到菌种混合液；
(2)扩大培养：将菌种混合液依次在一级种子培养基、二级菌种液体培养基、三级菌种液体培养基中培养，得到三级酪酸梭状芽孢杆菌培养液；
(3)发酵培养：将三级酪酸梭状芽孢杆菌培养液于液体发酵培养基中培养至酪酸梭状芽孢杆菌至稳定期，芽孢率大于90％且芽孢脱落率大于10％，获得酪酸梭状芽孢杆菌发酵液；
(4)收集菌体：在离心机上于4℃、4500～5500rpm转速条件下离心酪酸梭状芽孢杆菌发酵液，离心时间为15～25min，弃上清，获得酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥；
(5)添加保护剂：将酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥和保护剂混合得到混合物；
(6)真空冷冻干燥：将混合物于25～37℃平衡20～60min，-40℃预冻6～12h，然后在3～8Pa下冷冻干燥16～28h，即得。
本发明第三个方面提供了一种酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉在保健食品、医疗生物制剂中的应用。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
本发明提供的酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的抗冻性较强，冻干粉中活菌数大于2.0×1010cfu/g，芽孢率大于90％，延长了酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的保藏时间，有利于后期产品的加工、储藏及运输。
具体实施方式
以下通过具体实施方式说明本发明，但不局限于以下给出的具体实施例。
本发明第一个方面提供了一种酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉，冻干粉酪酸梭状芽孢杆菌的芽孢率大于90％，冻干粉中活菌数为2.0×1010cfu/g～3.0×1010cfu/g。
在一种实施方式中，所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的制备原料包括酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥和保护剂，其重量比为(1～0.2)：(0.1～1)；所述酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥中含有酪酸梭状芽孢杆菌。
优选地，所述酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥和保护剂的重量比为3：1。
在一种实施方式中，所述保护剂选自脱脂奶粉、海藻糖、蔗糖、麦芽糖、β-环糊精、甘露醇、甘油中一种或多种。
优选地，所述保护剂包括脱脂奶粉和海藻糖；进一步优选地，所述脱脂奶粉和海藻糖的重量比为(0.8～10)：1；更优选地，所述脱脂奶粉和海藻糖的重量比为5：1。
所述保护剂的pH为7。
本申请人发现对其他菌体的保护剂并不适用于酪酸梭状芽孢杆菌，此外，本申请人意外地发现当保护剂包括脱脂奶粉和海藻糖，且其重量比为(0.8～10)：1时，所得冻干粉的单位质量的活菌数增加，本申请人认为可能的原因是脱脂奶粉能在该菌体表面形成保护层，对细胞加以保护且固定了冻干的酶类，减少了真空冷冻干燥对细胞壁的损坏而引发的胞内物质的泄漏，且脱脂奶粉在真空冷冻干燥时使菌体细胞被覆盖的面积增加，减少了菌体表面暴露于外界的面积，从而起到了保护的作用。而海藻糖含有较多的羟基，能够与酪酸梭状芽孢杆菌表面的自由基结合，避免了其菌体暴露在环境中，同时通过水合作用结合更多的羟基，降低了游离水的含量，延缓了冰晶核的生长，并使所形成的冰晶更小，降低了对菌体的破坏作用，从而起到保护作用。此外海藻糖含有的环状结构较多，能够与脱脂奶粉中的蛋白质形成稳定而密集的氢键，增强了其稳定性，使得脱脂奶粉和海藻糖能够相互促进，更加充分地发挥作用。
在一种实施方式中，培养酪酸梭状芽孢杆菌的液体发酵培养基成分包括碳源、氮源、无机盐、维生素B1和蒸馏水；所述碳源选自葡萄糖、可溶性淀粉、玉米浆粉、大豆浆粉、蔗糖中一种或多种；所述氮源选自胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸粉、酪蛋白胨、牛肉浸膏、L-半胱氨酸、谷氨酸、丙氨酸、消化血清粉、硫酸铵、豆饼粉、尿素、氯化铵中一种或多种；所述无机盐选自醋酸钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钙、碳酸氢钠中一种或多种。
可溶性淀粉是一种白色或类白色粉末，无臭无味，不溶于冷水，在热水中则可成为透明溶液，冷却后不结冰，一般用大米、玉米、小米、土豆的淀粉都可制成可溶性淀粉。
在一种实施方式中，所述液体发酵培养基成分中所述碳源包括：25～35g可溶性淀粉、5～15g葡萄糖；所述氮源包括5～20g胰蛋白胨、5～25g大豆蛋白胨、10～20g酵母浸粉、5～20g酪蛋白胨、10～20g牛肉浸膏、1～2g L-半胱氨酸、0.1～1g谷氨酸、0.1～1g丙氨酸、10～15g消化血清粉；所述无机盐包括5～15g醋酸钠、1～5g磷酸氢二钾、1～5g磷酸二氢钾、10～20g碳酸钙。
优选地，所述液体发酵培养基成分中所述碳源包括：30g可溶性淀粉、10g葡萄糖；所述氮源包括15g胰蛋白胨、20g大豆蛋白胨、15g酵母浸粉、15g酪蛋白胨、15g牛肉浸膏、1.5g L-半胱氨酸、0.5g谷氨酸、0.6g丙氨酸、13g消化血清粉；所述无机盐包括10g醋酸钠、3g磷酸氢二钾、4g磷酸二氢钾、15g碳酸钙。
在一种实施方式中，所述维生素B1的重量为0.01～0.1g；优选地，所述维生素B1的重量为0.05g。
在一种实施方式中，所述蒸馏水的体积为1000mL。
本申请人意外地发现当液体发酵培养基成分包括碳源、氮源、无机盐和维生素B1，且碳源包括：25～35g可溶性淀粉、5～15g葡萄糖；所述氮源包括5～20g胰蛋白胨、5～25g大豆蛋白胨、10～20g酵母浸粉、5～20g酪蛋白胨、10～20g牛肉浸膏、1～2g L-半胱氨酸、0.1～1g谷氨酸、0.1～1g丙氨酸、10～15g消化血清粉；所述无机盐包括5～15g醋酸钠、1～5g磷酸氢二钾、1～5g磷酸二氢钾、10～20g碳酸钙时，得到的冻干粉中活菌数较多，本申请人猜测可能的原因是在该条件下，其营养物质能够促进具体的生长，且不会导致菌体大量繁殖后期出现自溶的现象。此外，可溶性淀粉属于高分子化合物，能够促进葡萄糖与菌体细胞膜活性成分的分子形成稳定化学结构替代水的结合位置，同时可溶性淀粉和葡萄糖使得发酵液中的形态良好，不会导致发酵液体粘稠而降低发酵液中溶氧度的情况，有利于菌体的生长，可以提高菌体的抗逆性。
此外，本申请人意外地发现当碳源的含量过高，活菌数下降，本申请人认为可能的原因是碳源含量过高可能会使培养基中渗透压过高而抑制菌体的生长，甚至引发菌体的死亡。
在一种实施方式中，所述液体发酵培养基成分还包括0.5～1.5g硫酸镁、0.5～1.5g硫酸锰。
优选地，所述液体发酵培养基成分还包括1g硫酸镁、1g硫酸锰。
本申请人意外地发现当无机盐中存在磷酸氢二钾、磷酸二氢钾时虽然能够提高冻干粉活菌数，但是芽孢率却不高，然而本申请人意外地发现当液体发酵培养基成分还包括硫酸镁、硫酸锰，且硫酸镁的重量为0.5～1.5g，硫酸锰的重量为0.5～1.5g时，在保证冻干粉活菌数的前提下可以显著提高芽孢率，本申请人认为可能的原因是该重量下的硫酸锰和硫酸镁能够作为菌体中酶的辅助因子，可以显著影响菌体芽孢的形成，同时碳源中可溶性淀粉和葡萄糖能够促进硫酸镁和硫酸锰对菌体酶活性的激活，提高其抗逆能力，从而提高芽孢率。
此外，本申请人意外地发现当硫酸镁和硫酸锰超过这个量，则会抑制菌体芽孢的生成。本发明第二个方面提供了一种所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的制备方法，其包括下面步骤：
(1)菌种培养：培养酪酸梭状芽孢杆菌至稳定期，芽孢率大于90％且芽孢脱落率大于10％，获得酪酸梭状芽孢杆菌发酵液；
(2)收集菌体：将酪酸梭状芽孢杆菌发酵液沉淀，获得酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥；
(3)添加保护剂：将酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥和保护剂混合得到混合物；
(4)真空冷冻干燥：将混合物于25～37℃平衡20～60min，-40℃预冻6～12h，然后在3～8Pa下冷冻干燥16～28h，即得。
在一种优选地实施方式中，所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的制备方法，其包括下面步骤：
(1)菌种活化：在无菌室中，将低温保存的酪酸梭状芽孢杆菌菌种溶解在20～30mL无菌生理盐水中，振荡3～5min后于75～85℃水浴振荡10～20min，振荡频率为110～130r/min，得到菌种混合液；
(2)扩大培养：将菌种混合液依次在一级种子培养基、二级菌种液体培养基、三级菌种液体培养基中培养，得到三级酪酸梭状芽孢杆菌培养液；
(3)发酵培养：将三级酪酸梭状芽孢杆菌培养液于液体发酵培养基中培养至酪酸梭状芽孢杆菌至稳定期，芽孢率大于90％且芽孢脱落率大于10％，获得酪酸梭状芽孢杆菌发酵液；
(4)收集菌体：在离心机上于4℃、4500～5500rpm转速条件下离心酪酸梭状芽孢杆菌发酵液，离心时间为15～25min，弃上清，获得酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥；
(5)添加保护剂：将酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥和保护剂混合得到混合物；
(6)真空冷冻干燥：将混合物于25～37℃平衡20～60min，-40℃预冻6～12h，然后在3～8Pa下冷冻干燥16～28h，即得。
步骤(1)
在一种实施方式中，所述步骤(1)包括：菌种活化：在无菌室中，将低温保存的酪酸梭状芽孢杆菌菌种溶解在20～30mL无菌生理盐水中，在涡旋振荡器上振荡3～5min后于75～85℃水浴振荡10～20min，振荡频率为110～130r/min，得到菌种混合液。
优选地，所述步骤(1)包括：在无菌室中，将低温保存的酪酸梭状芽孢杆菌菌种溶解在25mL无菌生理盐水中，在涡旋振荡器上振荡4min后于80℃水浴振荡15min，振荡频率为120r/min，得到菌种混合液。
步骤(2)
在一种实施方式中，所述步骤(2)包括：扩大培养：将菌种混合液按照体积比为2～6％的接种量接种于一级种子培养基中，在35～38℃条件下厌氧培养8～15h，pH至4.90～5.50终止培养，得到一级菌种液体培养物；将一级菌种液体培养物按体积比为2～6％的接种量接种于二级菌种液体培养基中，在35～38℃条件下厌氧培养10～16h，pH在5.5以下终止培养，得到二级菌种液体培养物；将二级菌种液体培养物在75～85℃水浴活化15～20min，按体积比为2～6％的接种量接种于液体三级菌种液体培养基中，35～38℃厌氧培养6～10h，pH至4.90～5.50终止培养，得到三级酪酸梭状芽孢杆菌培养液。
优选地，所述步骤(2)包括：扩大培养：将菌种混合液按照体积比为4％的接种量接种于一级种子培养基中，在37℃条件下厌氧培养12h，pH至4.90～5.50终止培养，得到一级菌种液体培养物；将一级菌种液体培养物按体积比为4％的接种量接种于二级菌种液体培养基中，在37℃条件下厌氧培养14h，pH在5.5以下终止培养，得到二级菌种液体培养物；将二级菌种液体培养物在80℃水浴活化18min，按体积比为4％的接种量接种于液体三级菌种液体培养基中，37℃厌氧培养8h，pH至4.90～5.50终止培养，得到三级酪酸梭状芽孢杆菌培养液。
在一种实施方式中，所述一级种子培养基的成分包括：8～12g胰蛋白胨、15～25g大豆蛋白胨、5～15g酵母浸粉、15～25g牛肉浸膏、8～12g葡萄糖、1～5g氯化钠、4～8g磷酸氢二钠、1～5g磷酸二氢钾、0.1～1g硫酸镁、0.1～0.6g L-半胱氨酸、1～6g可溶性淀粉、1000mL蒸馏水。
优选地，所述一级种子培养基的成分包括：10g胰蛋白胨、20g大豆蛋白胨、10g酵母浸粉、20g牛肉浸膏、10g葡萄糖、3g氯化钠、5g磷酸氢二钠、3g磷酸二氢钾、0.4g硫酸镁、0.35g L-半胱氨酸、3.5g可溶性淀粉、1000mL蒸馏水。
在一种实施方式中，所述二级菌种液体培养基的成分包括：10～20g胰蛋白胨、5～12g大豆蛋白胨、10～20g酵母浸粉、12～20g酪蛋白胨、8～16g醋酸钠、12～20g牛肉浸膏、1～5g磷酸氢二钾、1～5g磷酸二氢钾、12～20g碳酸钙、18～35g可溶性淀粉、1～3g L-半胱氨酸、0.01～0.1g维生素B1、0.2～0.6g谷氨酸、0.2～0.8g丙氨酸、10～15g消化血清粉、1000mL蒸馏水。
优选地，所述二级菌种液体培养基的成分包括：15g胰蛋白胨、10g大豆蛋白胨、15g酵母浸粉、15g酪蛋白胨、10g醋酸钠、15g牛肉浸膏、3g磷酸氢二钾、4g磷酸二氢钾、15g碳酸钙、30g可溶性淀粉、1.5g L-半胱氨酸、0.05g维生素B1、0.5g谷氨酸、0.6g丙氨酸、13g消化血清粉、1000mL蒸馏水。
在一种实施方式中，所述液体三级菌种液体培养基的成分包括：8～12g胰蛋白胨、18～22g大豆蛋白胨、8～15g酵母浸粉、18～22g牛肉浸膏、8～15g葡萄糖、1～5g氯化钠、2～6g磷酸氢二钠、1～5g磷酸二氢钾、0.1～0.8g硫酸镁、0.2～0.6g L-半胱氨酸、2～6g可溶性淀粉、1000mL蒸馏水。
优选地，所述液体三级菌种液体培养基的成分包括：10g胰蛋白胨、20g大豆蛋白胨、10g酵母浸粉、20g牛肉浸膏、10g葡萄糖、3g氯化钠、5g磷酸氢二钠、3g磷酸二氢钾、0.4g硫酸镁、0.35g L-半胱氨酸、3.5g可溶性淀粉、1000mL蒸馏水。
步骤(3)
在一种实施方式中，所述步骤(3)包括：发酵培养：将三级酪酸梭状芽孢杆菌培养按照体积比为2～6％的接种量接种于液体发酵培养基中，接种温度为35～38℃，搅拌5～10min，在35～38℃培养20～25h，培养过程中自3h起每间隔1h搅拌5min，pH每小时自动检测，当镜检芽胞饱满、健壮、芽胞率大于90％，芽胞脱落率大于10％，pH在5.30以下，视为终点，获得酪酸梭状芽孢杆菌发酵液。
优选地，所述步骤(3)包括：发酵培养：将三级酪酸梭状芽孢杆菌培养按照体积比为4％的接种量接种于液体发酵培养基中，接种温度为37℃，搅拌8min，在37℃培养23h，培养过程中自3h起每间隔1h搅拌5min，pH每小时自动检测，当镜检芽胞饱满、健壮、芽胞率大于90％，芽胞脱落率大于10％，pH在5.30以下，视为终点，获得酪酸梭状芽孢杆菌发酵液。
本发明所述未作三级酪酸梭状芽孢杆菌培养的液体发酵培养基的pH7.0～7.5。
本发明所述培养基均经过灭菌处理。
步骤(4)
在一种实施方式中，所述步骤(4)包括：收集菌体：在离心机上于4℃、5000rpm转速条件下离心酪酸梭状芽孢杆菌发酵液，离心时间为20min，弃上清，获得酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥。
步骤(5)
在一种实施方式中，所述步骤(5)包括：添加保护剂：将酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥和保护剂混合得到混合物。
步骤(6)
在一种实施方式中，所述步骤(6)包括；真空冷冻干燥：将混合物于30℃平衡40min，-40℃预冻8h，然后在6Pa下冷冻干燥20h，即得。
本发明第三个方面提供了一种酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉在保健食品、医疗生物制剂中的应用。
本发明冻干粉中的活菌数和芽孢率的测试方法如说明书中性能评估中所示。
实施例
在下文中，通过实施例对本发明进行更详细地描述，但应理解，这些实施例仅仅是示例的而非限制性的。如果没有其它说明，下面实施例所用原料都是市售的。
实施例1
本发明的实施例1提供了一种酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉，其制备原料包括酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥和保护剂，其重量比为2：1。
所述保护剂为脱脂奶粉和海藻糖，重量比为3：1。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的制备方法，具体为下面步骤：
(1)菌种活化：在无菌室中，将低温保存的酪酸梭状芽孢杆菌菌种溶解在25mL无菌生理盐水中，在涡旋振荡器上振荡4min后于80℃水浴振荡15min，振荡频率为120r/min，得到菌种混合液；
(2)扩大培养：将菌种混合液按照体积比为4％的接种量接种于一级种子培养基中，在37℃条件下厌氧培养12h，pH至4.90～5.50终止培养，得到一级菌种液体培养物；将一级菌种液体培养物按体积比为4％的接种量接种于二级菌种液体培养基中，在37℃条件下厌氧培养14h，pH在5.5以下终止培养，得到二级菌种液体培养物；将二级菌种液体培养物在80℃水浴活化18min，按体积比为4％接种于液体三级菌种液体培养基中，37℃厌氧培养8h，pH至4.90～5.50终止培养，得到三级酪酸梭状芽孢杆菌培养液；
(3)发酵培养：将三级酪酸梭状芽孢杆菌培养按照体积比为4％的接种量接种于液体发酵培养基中，接种温度为37℃，搅拌8min，在37℃培养23h，培养过程中自3h起每间隔1h搅拌5min，pH每小时自动检测，当镜检芽胞饱满、健壮、芽胞率大于90％，芽胞脱落率大于10％，pH在5.30以下，视为终点，获得酪酸梭状芽孢杆菌发酵液；
(4)收集菌体：在离心机上于4℃、5000rpm转速条件下离心酪酸梭状芽孢杆菌发酵液，离心时间为20min，弃上清，获得酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥；
(5)添加保护剂：将酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥和保护剂混合得到混合物；
(6)真空冷冻干燥：将混合物于30℃平衡40min，-40℃预冻8h，然后在6Pa下冷冻干燥20h，即得。
所述一级种子培养基的成分为：8g胰蛋白胨、15g大豆蛋白胨、5g酵母浸粉、15g牛肉浸膏、8g葡萄糖、1g氯化钠、4g磷酸氢二钠、1g磷酸二氢钾、0.1g硫酸镁、0.1g L-半胱氨酸、1g可溶性淀粉、1000mL蒸馏水。
所述二级菌种液体培养基的成分为：10g胰蛋白胨、5g大豆蛋白胨、10g酵母浸粉、12g酪蛋白胨、8g醋酸钠、12g牛肉浸膏、1g磷酸氢二钾、1g磷酸二氢钾、12g碳酸钙、18g可溶性淀粉、1g L-半胱氨酸、0.01g维生素B1、0.2g谷氨酸、0.2g丙氨酸、10g消化血清粉、1000mL蒸馏水。
所述液体三级菌种液体培养基的成分为：8g胰蛋白胨、18g大豆蛋白胨、8g酵母浸粉、18g牛肉浸膏、8g葡萄糖、1g氯化钠、2g磷酸氢二钠、1g磷酸二氢钾、0.1g硫酸镁、0.2g L-半胱氨酸、2g可溶性淀粉，1000mL蒸馏水。
所述液体发酵培养基成分为：25g可溶性淀粉、5g葡萄糖、5g胰蛋白胨、5g大豆蛋白胨、10g酵母浸粉、5g酪蛋白胨、10g牛肉浸膏、1g L-半胱氨酸、0.1g谷氨酸、0.1g丙氨酸、10g消化血清粉、5g醋酸钠、1g磷酸氢二钾、1g磷酸二氢钾、10g碳酸钙、0.5g硫酸镁、0.5g硫酸锰、0.01g维生素B1、1000mL水。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉应用在保健食品、医疗生物制剂中。
实施例2
本发明的实施例2提供了一种酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉，其制备原料包括酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥和保护剂，其重量比为4：1。
所述保护剂为脱脂奶粉和海藻糖，重量比为8：1。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的制备方法，具体为下面步骤：
(1)菌种活化：在无菌室中，将低温保存的酪酸梭状芽孢杆菌菌种溶解在25mL无菌生理盐水中，在涡旋振荡器上振荡4min后于80℃水浴振荡15min，振荡频率为120r/min，得到菌种混合液；
(2)扩大培养：将菌种混合液按照体积比为4％的接种量接种于一级种子培养基中，在37℃条件下厌氧培养12h，pH至4.90～5.50终止培养，得到一级菌种液体培养物；将一级菌种液体培养物按体积比为4％的接种量接种于二级菌种液体培养基中，在37℃条件下厌氧培养14h，pH在5.5以下终止培养，得到二级菌种液体培养物；将二级菌种液体培养物在80℃水浴活化18min，按体积比为4％接种于液体三级菌种液体培养基中，37℃厌氧培养8h，pH至4.90～5.50终止培养，得到三级酪酸梭状芽孢杆菌培养液；
(3)发酵培养：将三级酪酸梭状芽孢杆菌培养按照体积比为4％的接种量接种于液体发酵培养基中，接种温度为37℃，搅拌8min，在37℃培养23h，培养过程中自3h起每间隔1h搅拌5min，pH每小时自动检测，当镜检芽胞饱满、健壮、芽胞率大于90％，芽胞脱落率大于10％，pH在5.30以下，视为终点，获得酪酸梭状芽孢杆菌发酵液；
(4)收集菌体：在离心机上于4℃、5000rpm转速条件下离心酪酸梭状芽孢杆菌发酵液，离心时间为20min，弃上清，获得酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥；
(5)添加保护剂：将酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥和保护剂混合得到混合物；
(6)真空冷冻干燥：将混合物于30℃平衡40min，-40℃预冻8h，然后在6Pa下冷冻干燥20h，即得。
所述一级种子培养基的成分为：12g胰蛋白胨、25g大豆蛋白胨、15g酵母浸粉、25g牛肉浸膏、12g葡萄糖、5g氯化钠、8g磷酸氢二钠、5g磷酸二氢钾、1g硫酸镁、0.6g L-半胱氨酸、6g可溶性淀粉、1000mL蒸馏水。
所述二级菌种液体培养基的成分为：20g胰蛋白胨、12g大豆蛋白胨、20g酵母浸粉、20g酪蛋白胨、16g醋酸钠、20g牛肉浸膏、5g磷酸氢二钾、5g磷酸二氢钾、20g碳酸钙、35g可溶性淀粉、3g L-半胱氨酸、0.1g维生素B1、0.6g谷氨酸、0.8g丙氨酸、15g消化血清粉、1000mL蒸馏水。
所述液体三级菌种液体培养基的成分为：12g胰蛋白胨、22g大豆蛋白胨、15g酵母浸粉、22g牛肉浸膏、15g葡萄糖、5g氯化钠、6g磷酸氢二钠、5g磷酸二氢钾、0.8g硫酸镁、0.6gL-半胱氨酸、6g可溶性淀粉，1000mL蒸馏水。
所述液体发酵培养基成分为：35g可溶性淀粉、15g葡萄糖、20g胰蛋白胨、25g大豆蛋白胨、20g酵母浸粉、20g酪蛋白胨、20g牛肉浸膏、2g L-半胱氨酸、1g谷氨酸、1g丙氨酸、15g消化血清粉、15g醋酸钠、5g磷酸氢二钾、5g磷酸二氢钾、20g碳酸钙、1.5g硫酸镁、1.5g硫酸锰、0.1g维生素B1、1000mL水。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉应用在保健食品、医疗生物制剂中。
实施例3
本发明的实施例3提供了一种酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉，其制备原料包括酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥和保护剂，其重量比为3：1。
所述保护剂为脱脂奶粉和海藻糖，重量比为5：1。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的制备方法，具体为下面步骤：
(1)菌种活化：在无菌室中，将低温保存的酪酸梭状芽孢杆菌菌种溶解在25mL无菌生理盐水中，在涡旋振荡器上振荡4min后于80℃水浴振荡15min，振荡频率为120r/min，得到菌种混合液；
(2)扩大培养：将菌种混合液按照体积比为4％的接种量接种于一级种子培养基中，在37℃条件下厌氧培养12h，pH至4.90～5.50终止培养，得到一级菌种液体培养物；将一级菌种液体培养物按体积比为4％的接种量接种于二级菌种液体培养基中，在37℃条件下厌氧培养14h，pH在5.5以下终止培养，得到二级菌种液体培养物；将二级菌种液体培养物在80℃水浴活化18min，按体积比为4％接种于液体三级菌种液体培养基中，37℃厌氧培养8h，pH至4.90～5.50终止培养，得到三级酪酸梭状芽孢杆菌培养液；
(3)发酵培养：将三级酪酸梭状芽孢杆菌培养按照体积比为4％的接种量接种于液体发酵培养基中，接种温度为37℃，搅拌8min，在37℃培养23h，培养过程中自3h起每间隔1h搅拌5min，pH每小时自动检测，当镜检芽胞饱满、健壮、芽胞率大于90％，芽胞脱落率大于10％，pH在5.30以下，视为终点，获得酪酸梭状芽孢杆菌发酵液；
(4)收集菌体：在离心机上于4℃、5000rpm转速条件下离心酪酸梭状芽孢杆菌发酵液，离心时间为20min，弃上清，获得酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥；
(5)添加保护剂：将酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥和保护剂混合得到混合物；
(6)真空冷冻干燥：将混合物于30℃平衡40min，-40℃预冻8h，然后在6Pa下冷冻干燥20h，即得。
所述一级种子培养基的成分为：10g胰蛋白胨、20g大豆蛋白胨、10g酵母浸粉、20g牛肉浸膏、10g葡萄糖、3g氯化钠、5g磷酸氢二钠、3g磷酸二氢钾、0.4g硫酸镁、0.35g L-半胱氨酸、3.5g可溶性淀粉、1000mL蒸馏水。
所述二级菌种液体培养基的成分为：15g胰蛋白胨、10g大豆蛋白胨、15g酵母浸粉、15g酪蛋白胨、10g醋酸钠、15g牛肉浸膏、3g磷酸氢二钾、4g磷酸二氢钾、15g碳酸钙、30g可溶性淀粉、1.5g L-半胱氨酸、0.05g维生素B1、0.5g谷氨酸、0.6g丙氨酸、13g消化血清粉、1000mL蒸馏水。
所述液体三级菌种液体培养基的成分为：10g胰蛋白胨、20g大豆蛋白胨、10g酵母浸粉、20g牛肉浸膏、10g葡萄糖、3g氯化钠、5g磷酸氢二钠、3g磷酸二氢钾、0.4g硫酸镁、0.35g L-半胱氨酸、3.5g可溶性淀粉，1000mL蒸馏水。
所述液体发酵培养基成分为：30g可溶性淀粉、10g葡萄糖、15g胰蛋白胨、20g大豆蛋白胨、15g酵母浸粉、15g酪蛋白胨、15g牛肉浸膏、1.5g L-半胱氨酸、0.5g谷氨酸、0.6g丙氨酸、13g消化血清粉、10g醋酸钠、3g磷酸氢二钾、4g磷酸二氢钾、15g碳酸钙、0.05g维生素B1的、1000mL水。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉应用在保健食品、医疗生物制剂中。
实施例4
本发明的实施例4提供了一种酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉，其具体实施方式同实施例3。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的制备方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述液体发酵培养基成分无可溶性淀粉。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉应用在保健食品、医疗生物制剂中。
实施例5
本发明的实施例5提供了一种酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉，其具体实施方式同实施例3。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的制备方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述液体发酵培养基成分中可溶性淀粉替换为大豆浆粉。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉应用在保健食品、医疗生物制剂中。
实施例6
本发明的实施例6提供了一种酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉，其具体实施方式同实施例3。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的制备方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述液体发酵培养基中可溶性淀粉为40g，葡萄糖为15g。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉应用在保健食品、医疗生物制剂中。
实施例7
本发明的实施例7提供了一种酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉，其具体实施方式同实施例3。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的制备方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述液体发酵培养基中无硫酸镁。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉应用在保健食品、医疗生物制剂中。
实施例8
本发明的实施例8提供了一种酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉，其具体实施方式同实施例3。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的制备方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述液体发酵培养基中硫酸镁替换为硫酸亚铁。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉应用在保健食品、医疗生物制剂中。
实施例9
本发明的实施例9提供了一种酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述保护剂无脱脂奶粉。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的制备方法其具体实施方式同实施例3。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉应用在保健食品、医疗生物制剂中。
实施例10
本发明的实施例10提供了一种酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述保护剂中海藻糖替换为甘油。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的制备方法其具体实施方式同实施例3。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉应用在保健食品、医疗生物制剂中。
实施例11
本发明的实施例11提供了一种酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述保护剂中海藻糖替换为蔗糖。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的制备方法其具体实施方式同实施例3。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉应用在保健食品、医疗生物制剂中。
实施例12
本发明的实施例12提供了一种酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉，其具体实施方式同实施例3。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的制备方法其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述液体发酵培养基中无葡萄糖、可溶性淀粉、硫酸镁和硫酸锰。
所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉应用在保健食品、医疗生物制剂中。
性能评估
1.冻干粉活菌数：分别将实施例1～12得到的酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉样品混匀，各取1g冻干粉使用灭菌生理盐水依次连续稀释至10-8，取100μL稀释液涂布至酪酸梭状芽孢杆菌固体培养基上，在37℃条件下进行厌氧培养24h，统计菌落数量，然后计算每克活菌数(cfu/g表示)；其中，酪酸梭状芽孢杆菌固体培养基的成分为：胰蛋白胨10.0g、大豆胨3.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉浸膏5.0g、消化血清粉13.5g、葡萄糖3.0g、磷酸二氢钾2.5g、氯化钠3.0g、L-半胱氨酸盐酸盐0.3g、硫乙醇酸钠0.3g、琼脂粉18g，蒸馏水1000mL，酪酸梭状芽孢杆菌固体培养基成分在115℃灭菌15min后使用。
2.芽孢率：实施例1～12中得到的酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉中酪酸梭状芽孢杆菌的芽孢率按照下面方法进行测试：各取1g冻干粉使用灭菌生理盐水依次连续稀释至10-8，取100μL稀释液涂布至酪酸梭状芽孢杆菌固体培养基上，在37℃条件下进行厌氧培养24h，统计菌落数量；再次各取1g冻干粉溶于灭菌生理盐水后77℃活化13min，连续稀释至10-8，取100μL稀释液涂布至酪酸梭状芽孢杆菌固体培养基上，在37℃条件下进行厌氧培养24h，统计菌落数量。77℃活化后酪酸梭状芽孢杆菌数量除以活化前酪酸梭状芽孢杆菌数量即得酪酸梭状芽孢杆菌芽孢率；其中，酪酸梭状芽孢杆菌固体培养基的成分为：胰蛋白胨10.0g、大豆胨3.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉浸膏5.0g、消化血清粉13.5g、葡萄糖3.0g、磷酸二氢钾2.5g、氯化钠3.0g、L-半胱氨酸盐酸盐0.3g、硫乙醇酸钠0.3g、琼脂粉18g，蒸馏水1000mL，酪酸梭状芽孢杆菌固体培养基成分在115℃灭菌15min后使用。
表1
Figure BDA0002557793020000161
Figure BDA0002557793020000171
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims (10)

1.一种酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉，其特征在于，冻干粉中酪酸梭状芽孢杆菌的芽孢率大于90％，冻干粉中活菌数为2.0×1010cfu/g～3.0×1010cfu/g。
2.根据权利要求1所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉，其特征在于，其制备原料包括酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥和保护剂，其重量比为(1～0.2)：(0.1～1)；所述酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥中含有酪酸梭状芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉，其特征在于，所述保护剂选自脱脂奶粉、海藻糖、蔗糖、麦芽糖、β-环糊精、甘露醇、甘油中一种或多种。
4.根据权利要求3所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉，其特征在于，所述保护剂包括脱脂奶粉和海藻糖，重量比为(0.8～10)：1。
5.根据权利要求2～4任一项所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉，其特征在于，培养酪酸梭状芽孢杆菌的液体发酵培养基成分包括碳源、氮源、无机盐、维生素B1和蒸馏水；所述碳源选自葡萄糖、可溶性淀粉、玉米浆粉、大豆浆粉、蔗糖中一种或多种；所述氮源选自胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸粉、酪蛋白胨、牛肉浸膏、L-半胱氨酸、谷氨酸、丙氨酸、消化血清粉、硫酸铵、豆饼粉、尿素、氯化铵中一种或多种；所述无机盐选自醋酸钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钙、碳酸氢钠中一种或多种。
6.根据权利要求5所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉，其特征在于，所述液体发酵培养基成分中所述碳源包括：25～35g可溶性淀粉、5～15g葡萄糖；所述氮源包括5～20g胰蛋白胨、5～25g大豆蛋白胨、10～20g酵母浸粉、5～20g酪蛋白胨、10～20g牛肉浸膏、1～2g L-半胱氨酸、0.1～1g谷氨酸、0.1～1g丙氨酸、10～15g消化血清粉；所述无机盐包括5～15g醋酸钠、1～5g磷酸氢二钾、1～5g磷酸二氢钾、10～20g碳酸钙。
7.根据权利要求6所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉，其特征在于，所述液体发酵培养基成分还包括0.5～1.5g硫酸镁、0.5～1.5g硫酸锰。
8.一种根据权利要求1～7任一项所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，其包括下面步骤：
(1)菌种培养：培养酪酸梭状芽孢杆菌至稳定期，芽孢率大于90％且芽孢脱落率大于10％，获得酪酸梭状芽孢杆菌发酵液；
(2)收集菌体：将酪酸梭状芽孢杆菌发酵液沉淀，获得酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥；
(3)添加保护剂：将酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥和保护剂混合得到混合物；
(4)真空冷冻干燥：将混合物于25～37℃平衡20～60min，-40℃预冻6～12h，然后在3～8Pa下冷冻干燥16～28h，即得。
9.根据权利要求8所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，其包括下面步骤：
(1)菌种活化：在无菌室中，将低温保存的酪酸梭状芽孢杆菌菌种溶解在20～30mL无菌生理盐水中，振荡3～5min后于75～85℃水浴振荡10～20min，振荡频率为110～130r/min，得到菌种混合液；
(2)扩大培养：将菌种混合液依次在一级种子培养基、二级菌种液体培养基、三级菌种液体培养基中培养，得到三级酪酸梭状芽孢杆菌培养液；
(3)发酵培养：将三级酪酸梭状芽孢杆菌培养液于液体发酵培养基中培养至酪酸梭状芽孢杆菌至稳定期，芽孢率大于90％且芽孢脱落率大于10％，获得酪酸梭状芽孢杆菌发酵液；
(4)收集菌体：在离心机上于4℃、4500～5500rpm转速条件下离心酪酸梭状芽孢杆菌发酵液，离心时间为15～25min，弃上清，获得酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥；
(5)添加保护剂：将酪酸梭状芽孢杆菌湿菌泥和保护剂混合得到混合物；
(6)真空冷冻干燥：将混合物于25～37℃平衡20～60min，-40℃预冻6～12h，然后在3～8Pa下冷冻干燥16～28h，即得。
10.一种根据权利要求1～7任一项所述酪酸梭状芽孢杆菌冻干粉在保健食品、医疗生物制剂中的应用。
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