CN104388328B - 降解5环和6环多环芳烃的菌株及其获取方法、应用 - Google Patents

降解5环和6环多环芳烃的菌株及其获取方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明实施例提供了一种降解5环和6环多环芳烃的菌株、及其获取方法、应用，涉及环境污染物生物处理技术领域，可以高效地降解5环和6环多环芳烃。所述菌株名称为鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)ZH‑L8；形态特征为：固体培养基上生长呈圆形乳白色菌落，边缘光滑；显微镜下观察为杆状；细胞呈革兰氏阳性杆状，侧面平行，两端钝圆；菌落圆形，边缘光滑，菌落与培养基紧贴，白色、不透明；生理生化特性为：细菌在20‑45℃范围内生长良好、在pH 5.7、6.8下生长良好；耐盐浓度为5％；甲基红阳性；接触酶阳性；v‑p阴性，v‑p液最终pH＜6；精氨酸利用阳性；硝酸盐利用阳性；D‑葡萄糖产酸、乳糖产酸、蔗糖产酸阳性；淀粉水解阳性等。

Description

降解5环和6环多环芳烃的菌株及其获取方法、应用
技术领域
本发明涉及环境污染物生物处理技术领域，尤其涉及一种降解5环和6环多环芳烃的菌株及其获取方法、应用。
背景技术
多环芳烃(PAHs)是一类广泛分布并稳定存在于自然环境中的含2个或2个以上苯环的有毒有机污染物。由于其具有“三致(致癌、致畸、致突变)效应，还会产生光致毒效应，且其在土壤中具有隐弊性大、潜伏期长、涉及面广、治理困难等特点，尤其是高环PAHs，不仅化学结构复杂、电子云密度高、很难被氧化，而且水溶性差、热稳定性强、固水分配系数高、生物可利用性低，带来的环境污染问题日益突出，从而倍受环境科学家的关注，对人类健康和生态环境具有很大的潜在危害。美国环保局在20世纪80年代初就将16种PAHs列为环境中优先监测污染物，我国也将PAHs列入环境优先检测的污染物黑名单中。多环芳烃已造成许多重点工矿企业内部和周边土壤的严重污染，在一些重工业污染区，每千克土壤中PAHs含量可达上万微克。在农业污灌区同样存在污染问题，研究表明，沈抚灌区土壤表层16种优先控制PAHs的平均含量达2.22mg/kg，亚表层为0.75mg/kg；无论表层还是亚表层，多环芳烃均以4环和5环为主，其在总PAHs中所占比例均在34％以上。
为了保护生态***和人体健康，有必要对PAHs污染土壤进行修复。可采用的修复方法包括物理法(如土壤蒸汽浸提、热脱附)、化学法(如化学氧化、土壤淋洗)、以及生物法(如微生物修复、植物修复)。生物修复是指利用特定的生物吸收、转化、清除或降解环境污染物，从而修复被污染环境或消除环境中污染物，实现环境净化。相对于物理修复和化学修复还具有诸多优点，如费用低、效果好、不产生二次污染等，是一类低耗、高效和环境安全的环境生物技术，具有良好发展潜力。因此，对多环芳烃污染的生物修复进行研究是非常具有实际意义的。
微生物修复技术能有效的去除污染土壤中的低环PAHs，但可降解高环PAHs的优势菌株很少，尤其五环以上则更少。迄今为止，学者们已经分离出许多可以降解多环芳烃的微生物，其中细菌占主要地位。已经富集分离并鉴定的降解高环PAHs的细菌主要包括：鞘氨醇菌属(Sphingomonas sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)和分枝杆菌属(Mycobacteriumsp.)。其中，大多数降解菌能以四环PAHs为唯一碳源和能源生长，且可参与更高环PAHs的共代谢降解过程。以往降解芳烃的细菌大多都是针对低分子量的多环芳烃，对5环和6环多环芳烃的降解效果不甚理想，尤其针对以煤矿区PAHs污染的土壤为介质的降解菌筛选工作尚未见有报道。因此，以河北唐山煤矿区PAHs污染的土壤为研究介质，筛选5环和6环多环芳烃的高效降解菌，对于土壤PAHs污染的微生物修复具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的实施例提供一种降解5环和6环多环芳烃的菌株、及其获取方法、应用，可以高效地降解5环和6环多环芳烃。
为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：
一种降解5环和6环多环芳烃的菌株，所述菌株名称为鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)ZH-L8；
所述鲍氏不动杆菌ZH-L8形态特征为：固体培养基上生长呈圆形乳白色菌落，边缘光滑；显微镜下观察为杆状；细胞呈革兰氏阳性杆状，侧面平行，两端钝圆；菌落圆形，边缘光滑，菌落与培养基紧贴，白色、不透明；
生理生化特性为：细菌在20-45℃范围内生长良好、在pH 5.7、6.8下生长良好；耐盐浓度为5％；甲基红阳性；接触酶阳性；v-p阴性，v-p液最终pH＜6；精氨酸利用阳性；硝酸盐利用阳性；D-葡萄糖产酸、乳糖产酸、蔗糖产酸阳性；淀粉水解阳性；硝酸盐还原阳性；卵黄卵磷脂酶阳性；酪氨酸水解阳性；柠檬酸盐利用阳性；D-甘露醇产酸、明胶液化阴性、苯丙氨酸脱氢酶皆阴性；不产吲哚；兼性厌氧。
一种上述的菌株的获取方法，包括以下步骤：
(1)从唐山煤矿区周围的草地，按照梅花型取样方法取0-10cm表层混合样1份，取样完成后，在24小时内迅速进行下述步骤筛选出所述菌株；
(2)富集：取1g所述混合样，采用无机盐液体培养基获得富集菌液，取1mL富集菌液接种到LB培养基中进行培养；
其中，所述无机盐液体培养基包括：MgSO4.7H2O 0.2g、CaCl2.2H2O 0.02g、FeSO4.7H2O 0.01g、KH2PO4 0.4g、Na2HPO4 0.6g、MnSO4.H2O 0.02g NH4NO3 1.0g、蒸馏水1L；所述LB培养基：酵母浸提膏0.5g胰蛋白胨1g、氯化钠1g、琼脂1.5-2g、pH7.4-7.6、蒸馏水100ml；
(3)筛选与纯化：将上述在LB培养基中培养后的富集菌液经含PAHs的无机盐培养基进行筛选，并经多次转接纯化后，获得多株纯菌；
(4)驯化：将已筛选出的所有纯菌接种到表层含120ug PAHs的无机盐固体培养基中进行冲击，30℃下培养7d后观察菌落生长状况，得到目标降解菌株；所述无机盐固体培养基包括：MgSO4.7H2O 0.2g、CaCl2.2H2O 0.02g、FeSO4.7H2O 0.01g、KH2PO4 0.4g、Na2HPO40.6g、MnSO4.H2O 0.02g NH4NO3 1.0g、琼脂15～20g、蒸馏水1L；
将所述目标降解菌株分别接种到含茚并芘、苯并[a]芘、二苯并[a，h]蒽、茚幷苝(Bghip)单体12ug、24ug、48ug的无机盐固体培养基中进行逐级驯化，30℃下恒温培养7d后，生长良好，将驯化后的菌株用甘油冷冻保存；
(5)降解：将目标降解菌株接种至含茚并芘、苯并[a]芘、二苯并[a，h]蒽、茚并花(Bghip)单体的无机盐液体培养基中验证其降解能力，最后得到一株能够降解5环和6环PAHs单体的高效降解菌株，将其命名为：ZH-L8。
一种上述的菌株的应用，包括：所述菌株用于降解5环和6环的多环芳烃。
上述技术方案提供的菌株，及其获取方法、应用，通过采样、富集、筛选与纯化、驯化、降解，获得菌株，可以高效降解5环和6环多环芳烃，进而有效修复多环芳烃污染场地。
菌株：ZH-L8
拉丁文名：Acinetobacter baumannii(鲍氏不动杆菌)
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所
保藏日期：2014年08月11日
保藏编号：CGMCC NO.9498
附图说明
图1为本发明实施例提供的一种菌株在固体培养基上的形态示意图；
图2为本发明实施例提供的一种菌株在显微镜下的形态示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围，下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例提供了一种降解5环和6环的多环芳烃的菌株的获取方法。所述方法包括以下步骤：
(1)采样
从唐山煤矿区周围的林地，按照梅花型取样方法取0-10cm表层混合样1份，取完后在24小时内迅速进行步骤(2)-(4)筛选出所述菌株。
这里所述的煤矿区为区内含有钢铁厂和焦化厂等工厂的煤矿区。
(2)富集
取1g所述混合样，采用无机盐液体培养基获得富集菌液，取1mL富集液接种到LB培养基中进行培养。
所述无机盐液体培养基包括：MgSO4.7H2O 0.2g、C1Cl2.2H2O 0.02g、FeSO4.7H2O0.01g、KH2PO4 0.4g、Na2HPO4 0.6g、MnSO4.H2O 0.02g NH4NO3 1.0g、蒸馏水1L。
所述LB培养基：酵母浸提膏0.5g、胰蛋白胨1g、氯化钠1g、琼脂1.5-2g、pH7.4-7.6与蒸馏水100ml。
(3)筛选与纯化：将步骤(2)中在LB培养基中培养后的富集菌液经含PAHs的无机盐固体培养基进行筛选，并经多次转接纯化后，获得多株纯菌。所述无机盐固体培养基包括：MgSO4.7H2O 0.2g、CaCl2.2H2O 0.02g、FeSO4.7H2O 0.01g、KH2PO4 0.4g、Na2HPO4 0.6g、MnSO4.H2O 0.02g NH4NO3 1.0g、琼脂15～20g、蒸馏水1L。
(4)驯化：纯菌经8种PAHs混合物进行大剂量冲击，即将已筛选出的所有纯菌接种到表层含120ug PAHs的无机盐固体培养基中进行冲击，30℃下培养7d后观察菌落生长状况，得到目标降解菌株。该菌株是经LB培养基富集筛选出来的。
将所述目标降解菌株分别接种到含茚并芘、苯并[a]芘、二苯并[a，h]蒽、茚并苝(Bghip)单体12ug、24ug、48ug的无机盐固体培养基中进行逐级驯化，30℃下恒温培养7d后，生长良好，将驯化后的菌株用甘油冷冻保存。
(5)降解：将目标降解菌株接种至含茚并芘、苯并[a]芘、二苯并[a，h]蒽、茚并苝(Bghip)单体的无机盐液体培养基中验证其降解能力，最后得到一株能够降解5环和6环PAHs单体的高效降解菌株，将其命名为：ZH-L8。
以下为菌株ZH-L8的鉴定：
1、形态特征
如图1所示，所述菌株ZH-L8在固体培养基上生长呈圆形乳白色菌落，边缘光滑。如图2所示，所述菌株ZH-L8显微镜下观察为杆状。细胞呈革兰氏阳性杆状，侧面平行，两端钝圆；菌落圆形，边缘光滑，菌落与培养基紧贴，白色、不透明。
2、生理生化特征
所述菌株ZH-L8的生理生化特征如表1所示，细菌在20-45℃范围内生长良好、在pH5.7、6.8下生长良好；耐盐浓度为5％；甲基红阳性；接触酶阳性；v-p阴性，v-p液最终pH＜6；精氨酸利用阳性；硝酸盐利用阳性；D-葡萄糖产酸、乳糖产酸、蔗糖产酸阳性；淀粉水解阳性；硝酸盐还原阳性；卵黄卵磷脂酶阳性；酪氨酸水解阳性；柠檬酸盐利用阳性；D-甘露醇产酸、明胶液化阴性、苯丙氨酸脱氢酶皆阴性；不产吲哚；兼性厌氧。
表1
3、菌株ZH-L8 16S rDNA基因的PCR扩增和序列分析
以ZH-L8 DNA为模板，用16S rDNA基因的通用引物进行PCR扩增，PCR产物进行电泳检测，将扩增片段回收、测序，用BLAST软件与GenBank中的序列进行比较，与Bacillussubtilis的16S rRNA基因序列相似性为98％。经鉴定为鲍氏不动杆菌，同源性为98％。菌株ZH-L8的16S rDNA序列长度为890bp，其DNA序列详见序列表SEQ ID NO.1。
本发明实施例还提供了上述菌株ZH-L8对5环多环芳烃类化合物单体的降解应用。
降解效率＝(培养后不接菌8种多环芳烃类的总含量-培养后接菌8种多环芳烃类的总含量)÷培养后不接菌8种多环芳烃类的总含量×100％。
无机盐液体培养基见步骤(2)中的无机盐液体培养基。
实例(1)：ZH-L8对苯并芘单体的降解
将上述步骤(4)中多环芳烃单体驯化后保存的ZH-H2单菌落接种到LB培养基中活化48h后得到富集菌液。
接种10％富集菌液至20mL含有10mg/苯并芘的灭菌水相无机盐液体培养基中做实验组，另做不加富集菌液的对照组，在150rmp，30℃摇床中避光振荡培养7天。
培养时间结束后，取25ml色谱纯正己烷溶液加到实验组和对照组的三角瓶中，超声提取5分钟，使粘在壁上PAHs全部浸提到正己烷溶液中，再将三角瓶置于250rmp振荡器中，震荡提取40分钟后，再次超声提取5分钟后，吸取上层正己烷溶液1ml转移至2ml顶空进样瓶中，采用气普-质谱联用仪分别测定实验组和对照组溶液中多环芳烃的残留率，然后应用实验组和对照组的残留率，根据降解公式，计算降解效率。
进行三次重复实验，结果取平均值。苯并芘的降解率51％。
实例(2)：菌株ZH-L8对茚并芘单体的降解
接种10％富集菌液至20mL含有10mg/L茚并芘的灭菌水相无机盐培养基中做实验组，另做不加富集菌液的对照组，在150rmp，30℃摇床中避光振荡培养7天，提取PAHs的方法同实例(1)，分别测定实验组和对照组溶液中多环芳烃类化合物的残留率，然后应用实验组和对照组的残留率，根据降解公式，计算降解效率。
进行三次重复实验，结果取平均值。茚并芘的降解率42％。
实例(3)：菌株ZH-L8对二苯并蒽单体的降解
接种10％富集菌液至20mL含有10mg/L二苯并蒽的灭菌水相无机盐培养基中做实验组，另做不加富集菌液的对照组，在150rmp，30℃摇床中避光振荡培养7天，提取PAHs的方法同实例(1)，分别测定实验组和对照组溶液中多环芳烃类化合物的残留率，然后应用实验组和对照组的残留率，根据降解公式，计算降解效率。
进行三次重复实验，结果取平均值。二苯并蒽的降解率72％。
本发明实施例还提供了上述菌株ZH-L8对6环多环芳烃苯并(g，h，i)苝的降解应用，如下：
接种10％富集菌液至20mL含有10mg/L苯并苝的灭菌水相无机盐培养基中做实验组，另做不加富集菌液的对照组，在150rmp，30℃摇床中避光振荡培养7天，提取PAHs的方法同实例2(1)，分别测定实验组和对照组溶液中多环芳烃类化合物的残留率，然后应用实验组和对照组的残留率，根据降解公式，计算降解效率。
进行三次重复实验，结果取平均值。苯并苝的降解率63.5％。
通过以上实例，表明菌株ZH-L8对5环和6环多环芳烃具有高效的降解率。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (2)

1.一种降解5环和6环多环芳烃的菌株，其特征在于，所述菌株名称为鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)ZH-L8；所述鲍氏不动杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9498，保藏日期为2014年08月11日；
所述鲍氏不动杆菌ZH-L8形态特征为：固体培养基上生长呈圆形乳白色菌落，边缘光滑；显微镜下观察为杆状；细胞呈革兰氏阳性杆状，侧面平行，两端钝圆；菌落圆形，边缘光滑，菌落与培养基紧贴，白色、不透明；
生理生化特性为：细菌在20-45℃范围内生长良好、在pH5.7、6.8下生长良好；耐盐浓度为5％；甲基红阳性；接触酶阳性；v-p阴性，v-p液最终pH＜6；精氨酸利用阳性；硝酸盐利用阳性；D-葡萄糖产酸、乳糖产酸、蔗糖产酸阳性；淀粉水解阳性；硝酸盐还原阳性；卵黄卵磷脂酶阳性；酪氨酸水解阳性；柠檬酸盐利用阳性；D-甘露醇产酸、明胶液化阴性、苯丙氨酸脱氢酶皆阴性；不产吲哚；兼性厌氧；
所述鲍氏不动杆菌ZH-L8的16S rDNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述的菌株的应用，其特征在于，所述菌株用于降解5环和6环的多环芳烃。
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