CN111714706A - 可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架、血管支架的制备方法及活性人工血管 - Google Patents

可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架、血管支架的制备方法及活性人工血管 Download PDF

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Abstract

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架，其特征在于，包括添加了活性因子的管状聚合物纤维支架；所述活性因子包括IGF‑1、VEGF、PDGF、bFGF生长因子中至少一种，和/或IGF‑1、VEGF、PDGF、bFGF生长因子相应的多肽中至少一种，和/或RGD短肽、NO供体分子中至少一种；所述管状聚合物纤维支架采用可降解聚合物材料。本发明的有益效果在于：经过活性和功能修饰的血管支架，在体外组织工程构建细胞外基质人工血管过程中，可显著提高细胞的增殖速率和分泌细胞外基质的速率，大大缩短体外细胞培养之间；此外，也显著提高了血管材料的组织再生活性，满足临床治疗的需求。

Description

可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架、血管支 架的制备方法及活性人工血管
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架、血管支架的制备方法及活性人工血管。
背景技术
血管性疾病是全球致死率最高的疾病，该疾病的发生常由于血管狭窄或阻塞导致的血流减少和营养物质缺乏，从而使组织或器官受损，通常表现为冠心病、脑血管病、外周动脉疾病。据世界卫生组织预测，到2030年全世界每年死于心血管相关疾病的人数会增加到2330万。血管移植手术仍是治疗这类疾病的常规手段，使用患者自体血管(如大隐静脉，两侧胸廓内动脉、桡动脉等)仍然是目前血管移植手术的黄金标准。但是由于患者患有复杂心血管病变或自体血管已被采集，能够采集的自体血管长度、口径不匹配等问题，很难找到符合移植要求的健康血管，因此只能选择人工血管代替。
目前，聚苯二甲酸乙二醇酯
Figure BDA0002482904260000011
膨体聚四氟乙烯(Gore-
Figure BDA0002482904260000012
)和聚氨酯等材料制备的大口径(内径>6mm)人工血管移植后长期通畅率较高，已广泛应用于临床。但对于小口径人工血管(内径<6mm)，临床上尚无理想的产品可以用于心脏冠脉搭桥、脑血管替换以及膝盖以下外周血管替换。因此，开发新型可生物降解活性小口径人工血管日益受到全世界科学家的重视。
人们先后使用聚己内酯(PCL)、聚己内酯-丙交酯(PLCL)、可降解聚氨基甲酸酯(PU)、聚癸二酸甘油酯(PGS)、聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸酯(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚对二氧环己酮(PDS)、聚乙二醇(PEO)、明胶、胶原等可降解材料制备小口径人工血管。但是单纯使用以上材料制备的小口径人工血管缺乏生物活性，血管再生缓慢，远期通畅性不理想。
研究发现，小口径人工血管通畅性低的主要原因是血管内腔缺少具有生理功能的血管内皮覆盖，因此，长期以来研究者试图通过体外种植内皮细胞来构建内皮化的组织工程血管，然而这些努力一直没有成功。原因是体外构建内皮化的条件和体内环境相差很大，形成的内皮单层缺少天然的组织微环境，特别是缺少平滑肌的支持。因此，这种内皮化组织工程血管的内皮功能较弱，而且在植入血液循环***以后，极易发生内皮脱落，导致植入的血管发生血栓形成和再狭窄。
最近一些年研究人员改变了研究策略，采用传统的组织工程手段，在血管支架上种植细胞，在体外流动生物反应器内培养约8周，使血管支架充分细胞化，细胞分泌大量细胞外基质，使支架产生足够的力学强度和具备活性的细胞外基质，最后将细胞脱除，获得活性人工血管，在美国已经完成了III期临床实验。
然而，这些组织工程化技术都是使用简单的聚合物血管支架，未进行任何功能修饰或添加药物，除了力学刺激，未对细胞的增殖和分泌进行任何干预，因此，在体外生物反应器的培养过程需要8周以上。过程越长，成本越高，细菌污染的几率越大。
此外，多数研究采用成体的血管平滑肌细胞和成纤维细胞，成体细胞传代生长和分泌细胞外基质的能力有限，特别是经过几周时间的体外扩增，细胞的生长和活力更显著降低。
基于上述现有技术中存在的问题，亟需一种活性修饰的血管支架，向支架添加生物活性物质或固定功能分子，在体外培养细胞过程中刺激和增强细胞的增殖和分泌细胞外基质的能力，显著缩短体外培养的时间。更进一步的，向血管支架添加某些血管相关生长因子或多肽，在培养血管平滑肌和内皮细胞的过程中，有助于维持血管细胞的表型和功能，并促进血管组织的重构，最后经过脱除细胞处理后，获得的细胞外基质活性人工血管具备仿生的组织结构和活性组分。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架、血管支架的制备方法及活性人工血管，使得到的产品能够满足血管搭桥等重要血管治疗的需要，大大改善心肌梗死、头颈血管病变和下肢动脉严重闭塞的治疗效果。
本发明公开了一种可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架，包括添加了活性因子的管状聚合物纤维支架；所述活性因子包括IGF-1、VEGF、PDGF、bFGF生长因子中至少一种，和/或IGF-1、VEGF、PDGF、bFGF生长因子相应的多肽中至少一种，和/或RGD短肽、NO供体分子中至少一种；所述管状聚合物纤维支架采用可降解聚合物材料。
进一步地，所述管状聚合物纤维支架为侧壁多孔的结构。
进一步地，所述可降解聚合物材料采用聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)、聚氨基甲酸酯(PU)、聚癸二酸甘油酯(PGS)、聚对二氧六环己酮(PDS)、聚乙醇酸(PGA)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚乙二醇(PEO)、明胶、胶原中一种或几种的任意比例混合物。
优选地，所述管状聚合物纤维支架，内径为2-10mm，壁厚为200-1000μm，长度为5-40cm。
进一步地，所述管状聚合物纤维支架为单层或双层结构。
优选地，所述管状聚合物纤维支架采用双层结构时，内层为周向排列的熔融纺丝纤维，纤维直径10-60μm，有助于血管平滑肌细胞的仿生排列和中膜组织再生；外层为无序排列的静电纺丝纤维，纤维直径1-10μm。此双层结构有助于保持血管支架的拉伸强度并防止渗漏。
本发明还公开了一种可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架的制备方法，包括以下步骤：
制备管状聚合物支架，所述管状聚合物纤维支架的制备方法包括：熔融纺丝、3D打印、静电纺丝、编织、浇铸中的至少一种；
添加活性因子，所述活性因子的添加方式包括：在聚合物溶液中添加、在支架表面吸附、自组装或化学键接枝固定。
添加的活性因子可改善人工血管的活性，有利于实现血管移植后的重构和再生。
本发明还公开了一种活性人工血管，利用如下方法制备：
首先接种平滑肌细胞，尽量使细胞均匀分布在整个血管支架的纤维空隙内，培养1-6天后，使接种的平滑肌细胞完全贴附和伸展；
此后在管腔内表面接种内皮细胞，静置培养2-3天后，置于流动培养生物反应器，与循环管路连接，逐渐加大液体流速、剪切力和压力至与生理水平相当的条件，持续培养1-8周，即获得所述活性人工血管。
进一步地，所述血管内皮细胞与所述平滑肌细胞的来源为人源iPS，通过诱导分化制备血管内皮细胞和平滑肌细胞。iPS的制备及其向血管内皮细胞、平滑肌细胞定向诱导分化遵循商品试剂盒的使用说明。
进一步地，所述活性人工血管的制备方法还包括如下步骤：对接种内皮细胞并培养后的活性人工血管进行温和的脱细胞处理，确保细胞的彻底脱除，同时最大程度保留活性的细胞外基质，并且不破坏内部的聚合物纤维原始结构。
进一步地，所述脱细胞处理的方法包括：SDS法或液氮冻融法。
优选地，SDS法的操作步骤如下：将组织工程血管浸泡于1％SDS溶液中，置于摇床上，室温缓慢振荡12h，之后用无菌的生理盐水冲洗除去SDS，随后将其置于无菌的DNase和RNase混合溶液中，其中酶液体系为40ml，其缓冲液由0.2mol/L MgCl2，0.2mol/L CaCl2和0.1mol/L pH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成；DNase的浓度是50U/ml，RNase的浓度为1U/ml，于摇床上室温振荡24h，随后用无菌的生理盐水冲洗残留的DNase和RNase，最后将得到的材料置于无菌PBS中，4℃保存备用。
进一步地，所述的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架可直接用做病人自体心脏搭桥、头颈血管搭桥手术的材料；也可制备成活性人工血管后再用于病人自体心脏搭桥、头颈血管搭桥等手术的材料。
本发明的有益效果：
1、以往在单纯的聚合物血管支架上种植血管细胞，这些聚合物支架包括PLGA、PGA、PU、PCL等，即使是明胶、胶原类的天然高分子，均不能为血管细胞提供最适宜的组织微环境，不利于血管细胞的增殖、分泌、组织再生和重构。然而，本发明构建的血管支架组装了各种生长因子、血管活性物质，包括IGF-1、PDGF、bFGF、RGD等，不仅可以显著改善材料对血管细胞的相容性，尤其是显著促进细胞增殖和分泌细胞外基质，可大大缩短在体外生物反应器中的培养时间，在较短的时间内，获得类似天然血管的细胞外基质结构，节约生产成本，并减少培养过程中的染菌风险。此外，添加的血管活性物质还有助于维持血管细胞的表型和功能，诱导产生大量促血管再生的活性物质，保留在细胞外基质中，大大改善人工血管的组织再生活性。
2、通过组织工程手段在血管支架中接种血管细胞，经过流动生物反应器构建的组织工程血管具有内皮细胞(内膜)和平滑肌细胞(中膜)的组织结构，在脱除细胞以后保留类似天然血管的细胞外基质，植入体内后有利于实现血管快速再生。
3、以往构建组织工程血管时使用的内皮细胞和平滑肌细胞分别来自人脐静脉和动脉，是成体细胞，在体外传代和生长的能力有限。但是，iPS具有无限增殖能力和多向分化潜能，可诱导分化成血管内皮细胞和平滑肌细胞，其增殖能力、细胞活力大大优于成体血管细胞，分泌的细胞外基质中血管活性物质也会高于成体细胞制备的人工血管。由人源干细胞构建的组织工程血管，具有更好的相容性和安全性。人源干细胞不存在动物来源的风险。在植入体内后，含有细胞外基质的活性人工血管可快速吸引细胞的迁入、增殖和分化，快速再生血管内皮和平滑肌。而普通的纯聚合物材料人工血管缺乏这些活性。
4、脱除细胞后得到的活性人工血管保留了内皮细胞和平滑肌细胞的胞外基质，显著改善了初始血管支架的活性，移植到体内以后，血管再生和血管功能将显著优于单纯聚合物材料的人工血管。
5、血管支架分成两层结构，内层为周向排列的熔融纺丝纤维，孔径较大，有助于血管平滑肌细胞的增殖、仿生排列和中膜组织再生；外层为无序排列的静电纺丝纤维，孔径较小，有助于保持血管支架的拉伸强度和防止渗漏。
附图说明
图1所述Nap-FFG-IGF-1分子结构图；
图2所述Nap-FFGRGD分子结构图；
图3所述Nap-FFGGG-NO分子结构图；
图4人脐静脉内皮细胞在实施例3、对比组3-1、对比组3-2材料表面的黏附与增殖测试结果图；
图5人脐静脉内皮细胞在实施例4、对比组4-1材料表面不同时间的铺展情况、黏附与增殖测试结果图；
图6实施例5材料NO释放检测结果图；
图7实施例6材料(PCL/CS-NO)与PCL的红外谱图；
图8实施例8VEGF-HGFI修饰PCL电纺血管表征图；
图9实施例8VEGF-HGFI修饰对内皮细胞增殖及功能的影响测试图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术实施例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明采用的技术实施例如下：
实施例1
一种IGF-1多肽自组装修饰的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的PCL血管支架，其制备方法包括以下步骤：
1、支架加工：
(1)采用熔融纺丝法制备支架内层，具体操作步骤如下：称取5.0g，分子量为80000的PCL，置于热熔器包裹的封闭的不锈钢注射器中，于100℃下加热1h；将直径2mm的不锈钢管(接收棒)与旋转电机相连，注射器针头与接收棒的距离为5mm，PCL熔体的流速为0.5mL/h，接收棒的旋转速度为300r/min，接收器平移速度为10mm/s，纺丝时间为5min，制备出的纤维角度为50°，纤维直径为60μm，壁厚度为300μm的内层纤维；
(2)采用静电纺丝法制备支架外层，具体操作步骤如下：称取3g分子量为80000的PCL，加入到12mL体积比为5：1的氯仿与无水甲醇的混合溶剂中，室温搅拌溶解过夜，制得浓度分数为25％(m/v)的PCL溶液；将静电纺丝装置置于通风橱内，将上面制备的纺丝支架连同接收棒安装在转动装置上，将PCL溶液吸入注射器中，将注射器安装在注射泵上，注射器针头与接收棒距离10cm，使用高压直流电源在21G金属针头上加12kV电压。设定注射泵推进速度为8mL/h，接收棒转速为100rpm，纺丝时间为4min。这样操作后，在熔融纺丝支架外形成一层静电纺丝纤维层，纤维直径5μm，厚度100μm。得到的双层PCL血管支架：内径为2mm，总壁厚为400μm。
2、IGF-1多肽自组装修饰：
将化学修饰的IGF-1多肽Nap-FFG-IGF-1(分子结构如附图1所示)溶解在磷酸盐氯化钠缓冲溶液(PBS)中，浓度0.1％(w/v)，pH＝7.4。将上述制备的双层PCL血管支架浸泡到多肽溶液中，室温放置过夜。
即可得到IGF-1多肽自组装修饰的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的PCL血管支架。
由于PCL是疏水材料，需要进行较长时间的孵育，确保多肽溶液渗透到全部支架中，在纤维表面形成均一的自组装涂层。
多肽涂层的鉴定和分析采用荧光免疫染色、水接触角、XPS、SEM或TEM进行验证。
活性人工血管的制备：
将所述的血管支架按照如下步骤进行加工：
(1)iPS细胞制备：
取人皮肤成纤维细胞重编程制备iPSCs。将携带有重编程因子的质粒与5×105人皮肤成纤维细胞混合，通过电转***将带有重编程因子的质粒转导入细胞中。讲电转后的细胞接种至铺有Matrigel的细胞培养板中。使用细胞重编程培养基(北京赛贝生物科技有限公司)培养细胞约30天，待出现典型iPSCs克隆样细胞团后，挑取单克隆并接种，即获得iPSCs细胞。
(2)iPS向平滑肌细胞诱导分化：
当iPSCs密度达到80％左右时，在37℃条件下，用分散酶消化细胞15分钟，获得拟胚体(EBs)，将EBs种植在低粘附力且含有mTeSR培养基的六孔板中培养。第二天将培养基更换为比例为1:3的mTeSR培养基和拟胚体(EBs)分化培养基。第三天将培养基替换为EBs分化培养基，连续培养3天。第5天时，将EBs转移至明胶(Gelatin)包被的六孔板中，再用EB分化培养基培养5天，每天更换新的EBs培养基。培养5天后，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，将其接种于Matrigel凝胶包被的T75瓶上，用平滑肌细胞生长培养基培养基(SmGM-2)培养7天，每隔一天换新鲜培养基，最终可获得iPSCs诱导分化的血管平滑肌细胞(iPSC-SMCs)。
(3)iPS向内皮细胞诱导分化：
第0-1天，使用添加4-8μM的GSK3I的CDM3分化培养基对细胞密度达到95％以上的人多能干细胞进行诱导分化；第2天，使用添加40-60ng/mL bFGF的CDM3分化培养基对上一步诱导培养后的细胞进一步诱导分化；第3-5天，使用添加40-60ng/mL VEGF和20-30ng/mLBMP4的CDM3分化培养基对上一步诱导培养后的细胞进一步诱导分化；第6天对上一步诱导培养后的细胞进行消化，随后采用内皮细胞培养基继续培养3-4天，即可获得iPSCs诱导分化的内皮细胞(iPSC-ECs)。
(4)平滑肌细胞种植与培养：
取平滑肌细胞悬液，从一端注入血管支架内腔，静置5分钟后，将血管支架放在滤纸上均匀地来回滚动以吸干培养基，重复以上操作6次，血管两端各进行3次，以保证种植均匀。种植完成后将种有细胞的血管放入六孔板中静置10分钟，随后加入10毫升培养基。在37℃，5％CO2的培养箱中静置培养24小时，每隔4小时旋转90°，以使平滑肌细胞粘附于血管支架上。使用
Figure BDA0002482904260000071
TEB 500生物反应器对人工血管进行流动培养。培养环境设置为37℃，5％CO2，流动培养过程中通过蠕动泵控制培养基流速，缓慢调节流速至额定速率。
(5)内皮细胞种植与培养：
取下上述步骤中培养的人工血管支架，用100μg/mL纤连蛋白溶液浸泡血管内腔，取内皮细胞悬液，从一端注入血管支架内腔，静置5分钟后，将血管支架放在滤纸上均匀地来回滚动以吸去多余培养基，重复以上操作6次，血管两端各进行3次，以保证种植均匀。种植完成后将种有细胞的血管放入六孔板中静置10min，随后加入10毫升培养基。在37℃，5％CO2的培养箱中静置培养24h，每隔4h旋转90°，以使内皮细胞粘附于血管支架上。再将人工血管接入到细胞流动培养生物反应器(
Figure BDA0002482904260000081
TEB 500)中，培养环境设置为37℃，5％CO2，流动培养过程中通过蠕动泵控制培养基流速，缓慢调节流速至额定速率。
即可得到活性人工血管。
本实施例所述的，所述活性人工血管还可以进一步进行脱细胞处理，得到具有仿生细胞外基质结构的活性人工血管。
包括如下步骤：
将上述制得的活性人工血管浸泡于1％SDS溶液中，置于摇床上，室温缓慢振荡12小时，之后用无菌的生理盐水冲洗去除SDS，随后将其置于无菌的DNase和RNase混合溶液中(酶液体系为40ml，其缓冲液由0.2mol/L MgCl2，0.2mol/L CaCl2和0.1mol/L pH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成；DNase的浓度是50U/ml，RNase的浓度为1U/ml)，于摇床上室温振荡24小时，随后用无菌的生理盐水冲洗残留的DNase和RNase，最后将得到的材料置于无菌PBS中，4℃保存备用。
如此得到的活性人工血管具有良好的血管再生活性，可满足临床治疗的需要。
实施例2
一种缓释IGF-1多肽的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的PCL/胶原复合血管支架，其制备方法包括以下步骤：
首先采用静电纺丝技术制备PCL/胶原复合血管支架。将PCL溶于氯仿和甲醇(体积比5：1)混合溶剂，浓度为10％(w/v)。I型胶原溶于六氟异丙醇，浓度8％(w/v)。IGF-1多肽溶于去离子水，浓度2mg/mL。将IGF-1多肽溶液加入胶原溶液，体积比例为4：1，混合均匀。
分别将PCL溶液和胶原/IGF-1溶液装入两个10-mL注射器，针头为21-G。两个注射器分别安装到两个注射泵上，转动的接收棒为直径2-6mm的不锈钢管。两个注射器针头与接收棒的距离均为15cm。
PCL溶液连接的电压是15kV，注射泵推进速度是2mL/h。胶原溶液连接的电压是12kV，注射泵推进速度是0.6mL/h。
即可得到缓释IGF-1多肽的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的PCL/胶原复合血管支架。
如此制备的血管支架携带IGF-1多肽，在细胞培养和体内植入时，随着胶原的分解，IGF-1逐渐释放，促进细胞增殖和血管再生。
活性人工血管的制备：
与实施例1方法相同。
实施例3
一种VEGF生长因子修饰的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的PCL/明胶复合血管支架，其制备方法包括以下步骤：
首先采用静电纺丝技术制备PCL/明胶复合血管支架。将PCL溶于氯仿和甲醇(体积比5：1)混合溶剂，浓度为25％(w/v)。然后制备明胶溶液，将明胶溶于六氟异丙醇，浓度为6％(w/v)。将两种溶液分别加入两个10mL注射器内，使用21G针头，分别安装到两个注射泵上，连接PCL和明胶两个注射器的高压电源分别是，PCL11kV，明胶17kV。两个注射器针头与接收棒的距离分别是，PCL 25cm，明胶15cm。两种材料同时纺丝，制备PCL/明胶复合血管支架。在真空干燥器内使支架材料中的溶剂彻底挥发并充分干燥。
按照以下步骤先固定肝素和VEGF：在50％乙醇水溶液中加入连接试剂EDC和肝素，使二者的浓度分别为30mM和0.5mg/mL，然后，将血管支架浸泡到该溶液中，置于零度冰水浴中，反应12h。然后用蒸馏水洗涤三次。在室温下放置至干燥。配制VEGF生长因子的PBS溶液，浓度为1μg/mL，将血管支架浸入VEGF溶液，4℃孵育过夜，最后用PBS洗涤。
即可得到VEGF生长因子修饰的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的PCL/明胶复合血管支架。
活性人工血管的制备：
与实施例1方法相同。
为了进一步说明本实施例的有益效果，特设置如下实验：
取与实施例3所述的血管支架相同尺寸的PCL材质的人造血管支架作为对比组3-1；
取与实施例3所述的血管支架相同尺寸的肝素修饰的PCL材质(HP-PCL)的人造血管支架作为对比组3-2；
分别测试人脐静脉内皮细胞在对比组3-1、对比组3-2、实施例3所述的VEGF生长因子与肝素共修饰的PCL支架(VEGF-HP-PCL)表面的黏附与增殖情况。
实验结果如附图4所示：
a)PI标记的内皮细胞在对比组3-1上黏附1h后的激光共聚焦图像；
b)PI标记的内皮细胞在对比组3-2上黏附1h后的激光共聚焦图像；
c)PI标记的内皮细胞在实施例3上黏附1h后的激光共聚焦图像；
d)黏附细胞在三种材料上的平均每视野计数统计；
e)内皮细胞在不同材料上的增殖情况。**p<0.01(vs PCL)；每组n＝3，标尺为250μm。
由附图4可知，相对于对比组3-1与对比组3-2，实施例3显著提高了人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在材料表面的黏附和增殖性。材料表面修饰的VEGF能够与内皮细胞上的VEGF受体结合，诱导内皮细胞的快速黏附，此外，VEGF从材料上的缓慢释放也有助于内皮细胞的增殖。
实施例4
一种RGD短肽自组装修饰的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的PCL血管支架，其制备方法包括以下步骤：
对RGD短肽进行化学修饰，得到可自组装成胶的分子Nap-FFGRGD(分子结构如附图2所示)。Nap-FFGRGD可自组装成为凝胶，也可在材料表面自组装形成涂层，从而将RGD固定到材料表面，提高材料表面对细胞的亲和性，并促进细胞增殖。
将Nap-FFGRGD溶解在PBS中，浓度0.2mg/mL，pH＝7.4。血管支架加工过程同实施例1，将双层PCL血管支架浸泡到Nap-FFGRGD溶液中，37℃放置过夜，随后用PBS缓冲液冲洗PCL支架3次。Nap-FFGRGD在纤维表面形成均一的自组装涂层。
即可得到RGD短肽自组装修饰的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的PCL血管支架。
活性人工血管的制备：
与实施例1方法相同。
为了进一步说明本实施例的有益效果，特设置如下实验：
取与实施例4所述的血管支架相同尺寸的PCL材质的人造血管支架作为对比组4-1；
利用鬼笔环肽分别对对比组4-1、实施例4的细胞骨架进行染色，观察人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在支架表面的铺展情况。
实验结果如附图5所示：
a)内皮细胞在对比组4-1上黏附2h后的铺展状态；
b)内皮细胞在实施例4上黏附2h后的铺展状态；
c)内皮细胞在对比组4-1上黏附4h后的铺展状态；
d)内皮细胞在实施例4上黏附4h后的铺展状态；
e)内皮细胞在不同材料上的黏附情况；
e)内皮细胞在不同材料上的增殖情况。
由附图5可知，在培养2h后，相比与HUVEC在PCL表面多数呈现球形，尚未铺展的状态，在经过Nap-FFGRGD修饰后的材料表面，细胞呈现片状且铺展面积更大；培养4h后，PCL-RGD表面绝大多数细胞呈现成熟内皮细胞的形态，即伸长的纺锤形，而PCL组细胞的铺展程度远低于RGD修饰组。此外，Nap-FFGRGD修饰还有效提高了HUVEC在支架表面的增殖情况。
以上结果表明RGD的修饰为HUVEC的生长提供了更加理想的微环境，有效促进了HUVEC在PCL支架表面的黏附和生长。
实施例5
一种NO供体分子自组装修饰的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的PCL血管支架，其制备方法包括以下步骤：
通过多肽合成反应和反相高效液相色谱纯化，制备得到可自组装成胶的NO供体分子Nap-FFGGG-NO(分子结构如附图3所示)。将Nap-FFGGG-NO溶于PBS(pH＝7.4)，制备浓度为0.1wt％的溶液。PCL血管支架的加工过程同实施例1。将PCL血管支架浸入Nap-FFGGG-NO溶液，室温静置2h。
Nap-FFGGG-NO在PCL纤维表面形成亚微米厚度的水凝胶涂层，湿态条件可稳定一个月。通常将Nap-FFGGG-NO涂层修饰的血管支架冷冻干燥后，干态保存。
即可得到NO供体分子自组装修饰的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的PCL血管支架。
Nap-FFGGG-NO表面修饰不仅将疏水的PCL纤维表面改变为亲水表面，提高了细胞的亲和性，同时控制释放的NO还可以促进血管再生。
为了证明本实施例反应过程中形成了NO供体分子Nap-FFGGG-NO并且能够释放NO，特设计了如下实验：
实施例5所述的血支架材料催化NO释放后，分为两组：
a、不加入NO探针DAF-FM；b、加入NO探针DAF-FM。
分别采集材料表面的宏观光学照片及其对应荧光图像。
结果如附图6所示，NO探针DAF-FM在与NO结合后，形成能够产生绿色荧光的苯并***结构(Benzotriazole)。在荧光显微镜下可以观察到，在催化NO释放后的PCL材料表面具有显著的绿色荧光(图6b)。
活性人工血管的制备：
与实施例1方法相同。
实施例6
一种负载NO供体分子的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的PCL血管支架，其制备方法包括以下步骤：
PCL血管支架的加工过程同实施例1。为了提高PCL静电纺丝支架的亲水性，首先对其进行水解处理。将PCL电纺支架置于50％乙醇溶液中进行漂洗，同时将附着在电纺支架上的铝箔去除。之后将清洗干净的PCL电纺支架浸没于pH＝12的NaOH水溶液中，37℃下水解处理48h。之后用去离子水清洗PCL电纺支架3次，每次1h，以去除残留的NaOH。将洗净的PCL电纺支架置于真空干燥箱，室温干燥2天。将水解处理后的PCL电纺支架裁成直径为1cm的圆形。之后利用滴落涂布法，将50μL浓度为20mg/mL的CS-NO水溶液均匀涂布于电纺支架表面。室温干燥两天后，在电纺支架表面形成CS-NO涂层。
即可得到负载NO供体分子的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的PCL血管支架。
为了证明本实施例反应过程中形成了CS-NO涂层，对本实施例所述的血管支架材料以及PCL材料进行红外检测，其结果如附图7所示：
PCL与PCL/CS-NO的红外谱图可以看出，PCL支架表面的负载CS-NO后，在1363cm-1处出现了属于氮烯醇基团的两个特征吸收峰：1363cm-1处的O-N-N-O基团的非对称拉伸特征峰和945cm-1处的N-N的平面对称拉伸特征峰，这表明CS-NO成功负载在PCL纤维上。
活性人工血管的制备：
与实施例1方法相同。
实施例7
一种IGF-1多肽和NO供体分子梯度修饰的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的PCL血管支架，其制备方法包括以下步骤：
(1)内层PCL纤维负载NO供体分子，具体操作步骤如下：将PCL溶解于体积比为5:1的氯仿与无水甲醇的混合溶剂，浓度15％(m/v)。向其中加入半乳糖基团保护的NO供体分子，浓度为0.5％(m/v)。将该PCL溶液加入10mL注射器，针头为21G，安装到注射泵上，接收棒为直径2mm的不锈钢管，注射器针头与接收棒的距离为15cm，PCL溶液的推进速度为0.5mL/h，电压为15kV，内层纺丝时间为4min，内层纤维直径约为2μm，内层厚度约50μm。
(2)外层PCL纤维负载IGF-1多肽，具体操作步骤如下：将PCL溶解于体积比为5:1的氯仿与无水甲醇的混合溶剂，浓度25％(m/v)。向其中加入IGF-1多肽，浓度30μg/ml；将该PCL溶液加入10mL注射器，针头为21G，安装到注射泵上，在前面内层纤维的基础上继续纺丝。注射器针头与接收棒距离10cm，PCL溶液推进速度为8mL/h，电压为12kV，纺丝时间为25min。外层纤维直径6-8μm，厚度400μm。
即可得到IGF-1多肽和NO供体分子梯度修饰的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的PCL血管支架。
这样得到血管支架为双层，内径纤维较细，负载NO供体分子，有利于抗凝血和促进内皮形成。外层纤维较粗，孔径较大，有利于细胞迁入，同时缓释IGF-1，可促进细胞增殖和分泌，有利于血管平滑肌的快速再生。
活性人工血管的制备：
与实施例1方法相同。
实施例8
一种VEGF融合蛋白自组装修饰的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的PCL血管支架，其制备方法包括以下步骤：
通过分子克隆技术制备融合蛋白VEGF-HGFI，其中VEGF是活性蛋白，HGFI是具有自组装能力的两亲性蛋白。配制VEGF-HGFI水溶液，浓度为200μg/mL。PCL血管支架的加工过程同实施例1。将血管支架浸入VEGF-HGFI溶液，4℃孵育12h，用PBS洗涤。
即可得到VEGF融合蛋白自组装修饰的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的PCL血管支架。
活性人工血管的制备：
与实施例1方法相同。
为了进一步说明本实施例的有益效果，特设置如下实验：
VEGF-HGFI融合蛋白的修饰对血管支架外观影响测试：
取与实施例8所述的血管支架相同尺寸的PCL材质的人造血管支架作为对比组8-1；
分别对对比组8-1(PCL)、实施例8(VEGF-HGFI-PCL)的细胞骨架的形态进行观测。
实验结果如附图8所示：
A)对比组8-1与实施例8血管支架横截面(上方图)、对比组8-1与实施例8血管支架内腔表面(下方图)；
B)对比组8-1SEM图(左图)、实施例8SEM图(右图)；
C)对比组8-1血管支架VEGF抗体染色(绿色)荧光图(左图)、实施例8血管支架VEGF抗体染色(绿色)荧光图(右图)。
由附图8可知，两亲性蛋白HGFI以及VEGF-HGFI融合蛋白的负载对血管支架纤维形貌没有显著影响，通过VEGF抗体染色可以观察到VEGF有效负载在血管支架纤维表面，且均匀分布于整个支架内。
VEGF-HGFI融合蛋白的修饰对内皮细胞增殖及功能影响测试：
取与空白玻璃片作为对比组8-2(Glass)；与涂抹了实施例8所述的VEGF-HGFI融合蛋白的玻璃片(VEGF-HGFI-Glass)进行对比。
分别对对比组8-2(Glass)、实施例8(VEGF-HGFI-Glass)进行DAF-FM探针检测内皮细胞NO释放的荧光检测，实验结果如图9A。
分别对对比组8-2(Glass)、实施例8(VEGF-HGFI-Glass)进行内皮细胞摄取DiI-ac-LDL的荧光检测，实验结果如图9B。
由附图9可知，VEGF-HGFI融合蛋白的修饰能够有效促进内皮细胞的黏附和增殖，并显著提高内皮细胞NO释放能力(图9A)和对乙酰化低密度脂蛋白的摄取能力(图9B)，增强在修饰表面生长内皮细胞的功能。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架，其特征在于，包括添加了活性因子的管状聚合物纤维支架；所述活性因子包括IGF-1、VEGF、PDGF、bFGF生长因子中至少一种，和/或IGF-1、VEGF、PDGF、bFGF生长因子相应的多肽中至少一种，和/或RGD短肽、NO供体分子中至少一种；所述管状聚合物纤维支架采用可降解聚合物材料。
2.根据权利要求1所述的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架，其特征在于，所述管状聚合物纤维支架为侧壁多孔的结构。
3.根据权利要求1所述的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架，其特征在于，所述可降解聚合物材料采用聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)、聚氨基甲酸酯(PU)、聚癸二酸甘油酯(PGS)、聚对二氧六环己酮(PDS)、聚乙醇酸(PGA)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚乙二醇(PEO)、明胶、胶原中一种或几种的任意比例混合物。
4.根据权利要求1所述的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架，其特征在于，所述管状聚合物纤维支架为单层或双层结构。
5.根据权利要求4所述的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架，其特征在于，所述管状聚合物纤维支架采用双层结构时，内层为周向排列的熔融纺丝纤维，纤维直径10-60μm，有助于血管平滑肌细胞的仿生排列和中膜组织再生；外层为无序排列的静电纺丝纤维，纤维直径1-10μm。
6.一种可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备管状聚合物支架，所述管状聚合物纤维支架的制备方法包括：熔融纺丝、3D打印、静电纺丝、编织、浇铸中的至少一种；
添加活性因子，所述活性因子的添加方式包括：在聚合物溶液中添加、在支架表面吸附、自组装或化学键接枝固定。
7.一种活性人工血管，其特征在于，利用如下方法制备：
首先接种平滑肌细胞，尽量使细胞均匀分布在整个权利要求1-5任意一项所述的血管支架的纤维空隙内，培养1-6天后，使接种的平滑肌细胞完全贴附和伸展；
此后在管腔内表面接种内皮细胞，静置培养2-3天后，置于流动培养生物反应器，与循环管路连接，逐渐加大液体流速、剪切力和压力至与生理水平相当的条件，持续培养1-8周，即获得所述活性人工血管。
8.根据权利要求7所述的活性人工血管，其特征在于，所述血管内皮细胞与所述平滑肌细胞的来源为人源iPS，通过诱导分化制备血管内皮细胞和平滑肌细胞。
9.根据权利要求7所述的活性人工血管，其特征在于，制备方法还包括如下步骤：对接种内皮细胞并培养后的活性人工血管进行温和的脱细胞处理，确保细胞的彻底脱除，同时最大程度保留活性的细胞外基质，并且不破坏内部的聚合物纤维原始结构。
10.根据权利要求9所述的活性人工血管，其特征在于，所述脱细胞处理的方法包括：SDS法或液氮冻融法；SDS法的操作步骤如下：将组织工程血管浸泡于1％SDS溶液中，置于摇床上，室温缓慢振荡12h，之后用无菌的生理盐水冲洗除去SDS，随后将其置于无菌的DNase和RNase混合溶液中，其中酶液体系为40ml，其缓冲液由0.2mol/L MgCl2，0.2mol/L CaCl2和0.1mol/L pH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成；DNase的浓度是50U/ml，RNase的浓度为1U/ml，于摇床上室温振荡24h，随后用无菌的生理盐水冲洗残留的DNase和RNase，最后将得到的材料置于无菌PBS中，4℃保存备用。
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