CN102277737A

CN102277737A - 聚己内酯/天然高分子复合多孔支架的制备方法及应用

Info

Publication number: CN102277737A
Application number: CN 201110107051
Authority: CN
Inventors: 陈义旺; 周志华; 聂华荣; 汪泱; 周魏华; 李璠
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2011-04-27
Filing date: 2011-04-27
Publication date: 2011-12-14

Abstract

聚己内酯/天然高分子复合多孔支架的制备方法及用途，方法：包括聚己内酯电纺纳米纤维膜的制备；（1）将聚己内酯电纺纳米纤维膜置于碱溶液中反应，去离子水浸泡冲洗；（2）将（1）所获得的纤维膜放入DMTMM或DMTMM的天然聚合物溶液中反应，去离子水浸泡冲洗，然后浸泡在天然聚合物中室温反应，去离子水浸泡冲洗；（3）将天然高分子材料的混合溶液，均匀涂覆流延在（2）所得纤维膜上，冷冻干燥，抽出溶剂；（4）将（3）所获得的双层支架浸泡到交联中室温反应后，去离子水浸泡冲洗，冷冻干燥。本发明制备的多孔支架稳定、孔径适宜，具有良好生物相容性，降解速率快，可用于皮肤及临床的组织器官缺损修复、重建或创伤敷料。

Description

聚己内酯/天然高分子复合多孔支架的制备方法及应用

技术领域

本发明属于医用多孔支架材料领域，涉及医用多孔支架的制备方法及应用。

背景技术

随着纳米纤维制备技术的不断发展，由静电喷射法制得的纳米无纺布是以无规定向的纳米纤维构成的几何空间，具有模仿生物体内的纳米级胶原质组成的细胞外基质结构、比表面积大，是一种良好的支架材料。其制备过程简单，纤维网质轻柔软，便于手术操作；植入体内时可降低其与身体本身组织的硬度不匹配性，极少量的聚合物会降低植入材料的副反应；而其极大的比表面积和表面积体积比，高空隙率及纤维表面的微孔结构赋予材料很强的吸附力以及良好的过滤性、阻隔性、黏合性和保温性等，并有利于营养物质的传送。目前多家研究机构和医院都在对这方面进行研究，电纺纳米纤维有望在组织工程支架、防粘连膜、创面修复材料、人造血管等生物医学领域得到广泛应用。

在组织工程应用中，电纺纳米纤维支架与细胞外基质在形态结构上具有更高的相似性，其特有的高比表面积和孔隙率有利于细胞的粘附和增殖。电纺纳米纤维是层层随机沉积在收集装置上的，因此其孔径分布较宽(几微米到几百微米)，但大多数孔的尺寸在25～100 m之间，这个范围适合于大多数细胞的植入和生长。而且纤维的随机取向使纤维间的结合较弱，当细胞进入孔内后可以推动它周围的纤维，适当的调节孔径以扩展空间，从而提高了细胞在三维支架中的渗透能力。目前，电纺制备聚合物纳米支架材料方法较多，如单一组分静电纺丝法，共混或复合静电纺丝法等。Han 等人用醋酸纤维素作为材料研究了膀胱体系中细胞外基质的结构。他们发现细胞外基质的拓扑形态会在细胞分化中占据重要的角色，通过电纺丝技术调整支架结构，初步实了现对细胞生长的控制。比较而言，由于单一材料静电纺制得的纳米纤维存在缺乏表面特异性，力学性能差，降解速率难以调控等缺点。目前，多组分电纺纳米纤维支架材料的研究越来越引起关注。

胶原蛋白、丝素蛋白及明胶等天然高分子具有良好的生物相容性，利用这些材料与合成高分子混纺或同轴共电纺制备复合纳米纤维，可用于组织工程支架的构建。Zhang等通过静电纺明胶(Gt)与PCL，制备了Gt／PCL复合纤维膜。实验表明该复合纤维比单纯PCL或Gt纺丝纤维的机械性及亲水性更好。体外研究发现BMSC在该支架表面黏附和生长良好，l周后细胞迁移至支架内部l- 14 nm处。该Gt／PCL复合纤维适用于骨组织工程研究。Min等将甲壳素、PLGA分别溶解在甲酸、HFIP溶液中制得纺丝液，使用双喷嘴装置制备PLGA／甲壳素复合纳米纤维，甲壳素纳米粒子能很均匀的分布在PLGA纤维中且和PLGA纤维结合牢固。Vaz等利用PLA、PCL性能的不同，采用静电纺丝法分层构建PLA(外层)／PCL(内层组织工程血管支架，结果改善了血管支架的性能，使血管具有良好的柔韧性，能够支持小鼠成纤维细胞的粘附、生长和增殖。Zhang等利用同轴电纺技术制备了芯层为聚己内酯(PCL)、壳层为胶原的核／壳结构纳米纤维支架，在支架上种植人成纤维细胞。培养至第6天时发现，同轴电纺支架上细胞密度远远高于仅涂覆胶原的PCL支架。

在创口包覆材料应用中，因电纺纤维轻薄柔软且布满纳米孔隙，能与创面充分弥合，一方面减轻外界环境对创面组织的刺激，保护创口体液不致于在空气中蒸发散失，同时保证创面能接触到新鲜的氧气，利于细胞的生长修复，另一方面，在气溶胶微粒捕捉机制的作用下，电纺丝纳米纤维可以滤去空气中的几乎所有的细菌和微尘，避免伤口出现感染。经过处理的创口，往往愈合良好，不留疤痕。而且治疗过程也并不复杂，只需在电场中将纳米纤维直接喷洒到创面，即可形成稳定而有效的保护层了。韩国Rho[等人将I型胶原溶解在HFIP(六氟异丙醇)中，在质量分数为8％时，纺丝形成由平均直径为460nm的纤维构成的细胞支架，利用戊二醛饱和水溶液蒸汽化学交联12h提高强力后，用层粘连蛋白、I型胶原处理，研究角化细胞的培养性能。结果表明经细胞外基质蛋白处理的胶原纤维支架促进人表皮细胞(NHEK)、口腔细胞(NHOK)的粘附和增殖，并沿纤维取向生长。在鼠伤口包覆实验中，组织观察发现棉纱布包覆的伤口一周后出现纤维蛋白组织碎片，并观察到多形核白细胞和成纤维细胞的增殖。而胶原纳米纤维覆盖的伤口在一周后未发现组织碎片，成纤维细胞增殖明显并出现初生毛细血管。

血管内膜增生导致的管腔再狭窄乃至阻塞，是困扰血管外科的一大难题。Venugopal用PCL形成纳米纤维支架后，表面经胶原蛋白处理，培养冠状动脉平滑肌细胞(SMCs)，发现细胞保持表型并沿纤维取向生长，能够进入支架并形成平滑肌组织，初步研究表明可用作血管移植，Xu用PLA/PCL以75/25比例共聚后形成的纳米纤维培养SMCs发现具有相同的特征。

神经轴突在体内的不可再生性，使神经修复成为难题，神经组织工程(NTE)的发展为神经修复提供了可能。Yang通过选择合适工艺形成由纳米、微米级纤维并以有序、无序排列形成的四种支架，首次培养神经干细胞(NSC)，探索其在神经修复中的应用。激光扫描共聚焦显微镜观察发现，神经细胞和轴突沿纤维取向伸展和生长，与微米级纤维支架相比，细胞在纳米级纤维上的分化率更高，在平行纤维上有助于轴突生长，表明静电纺纳米纤维支架在神经修复中具有重要的应用价值。

细胞外基质中含有胶原、弹性蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、蛋白多糖和粘多糖等，因此静电纺丝构建组织构成支架时应首选该类天然生物材料，但受到其在静电纺丝中的难以加工性，及其材料力学强度的不稳定性的限制。对于电纺工艺而言，人工合成聚合物电纺纤维的优势是材料具有较强的可塑性及良好的机械性能，能在一定程度上满足组织支架所需要的机械支撑的要求。常用的人工合成聚合物材料包括聚乳酸(poly—lactide-co-glycolide，PLA)、聚羟基乙酸(polyglycolic acid，PGA)、聚己内酯(poly(caprolactone)，PCL)、聚氧化乙烯(PEO)以及聚乳酸一羟基乙酸共聚物(PLGA)等。由于综合性能较好、价格较为低廉，PCL的电纺纤维研究较为广泛。但相对于天然生物材料，其组织相容性和细胞亲和性尚不能满足组织工程和其它生物医用领域飞速发展的需要。因此，设计与合成新型的生物材料，尤其是针对不同组织与器官的具体要求而进行专门设计，是聚合物组织工程材料发展的重要方向之一。

在本发明中，为克服其表面亲水性差，降解速率慢等缺陷，以碱水解的方法在其表面引入羧基，并接枝上带有氨基的天然高分子，再利用纤维膜表面天然高分子链上的极性基，在PCL纤维膜上引入天然高分子的大孔海绵层。其中，PCL纤维膜提供材料的力学支撑及大孔结构，而海绵层可有效地调节支架中孔径尺寸，利于细胞的长入，中间接枝的天然高分子层则起到生物粘合剂的作用可将两不相容材料稳定地贴合起来，更利于提高材料的稳定性，最后天然高分子海绵层的引入可有效地提高PCL纤维支架的降解速率。所制备的聚己内酯电纺纳米纤维膜/天然高分子海绵的双层支架材料不仅具有良好的稳定性，且贯穿的多孔、大孔结构也促进了组织细胞的迁入、生长。该复合膜材料有望在组织工程支架、防粘连膜、创面修复材料、人造血管等生物医学领域得到广泛应用。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种聚己内酯电纺纳米纤维/天然聚合物大孔海绵的双层不对称支架的制备方法。

本发明的目的之二是提供一种在疏水性聚己内酯电纺纳米纤维膜表面引入多孔亲水性聚合物层，以提供适用于细胞生长、繁殖的多孔支架，从而提高细胞在其表面的粘附、增殖及分化，使用该方法对材料表面的生物相容性有很大的促进作用。

本发明的目的之三是提供一种在聚己内酯电纺纳米纤维膜表面引入可生物降解的天然高分子，以提供促进PCL基材降解的方法，从而为PCL在生物体内的安全应用提供可行性。

本发明的目的之四是提供可用于创伤部位皮肤与临床急需的修复组织器官缺损和重建的支架。

本发明是通过以下方法来实现的：以聚己内酯为基质材料，通过静电纺丝的方法得到PCL纳米支架，以碱水解的方法在其表面引入羧基，并接枝上明胶等天然大分子，再利用纤维膜表面天然聚合物分子链上的极性基，在PCL纤维膜上进一步引入亲水性天然聚合物大孔海绵层，即得多孔复合支架，该支架可用于创伤处的暂时性敷料，组织工程皮肤支架及临床急需的组织器官缺损修复和重建。

所述的制备过程主要包括聚己内酯电纺纳米纤维膜的制备、聚己内酯电纺纳米纤维膜进行表面改性（碱水解、天然高分子的键入）、天然高分子海绵层的引入等几个过程。

具体地说，本发明的技术方案包括聚己内酯电纺纳米纤维膜的制备，其特征是：

（1）聚己内酯电纺纳米纤维膜进行表面碱处理：配置浓度为0.05～0.2M的碱溶液，将聚己内酯电纺纳米纤维膜置于该溶液中，于0-10℃反应20～60分钟后，用去离子水浸泡冲洗。

（2）天然大分子的键入：将（1）所获得的聚己内酯电纺纳米纤维膜放入浓度为20 mM～200 mM的4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)溶液中，于室温反应8～14小时后，用大量的去离子水浸泡冲洗，然后浸泡在浓度为1wt%～10wt%的天然聚合物中，于室温反应6-12小时后，用去离子水浸泡冲洗。

或者将（1）所获得的聚己内酯电纺纳米纤维膜放入浓度为20 mM～200 mM的4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)的天然聚合物溶液中，其中天然聚合物浓度为0.1wt%～2.0wt%，于室温反应6～12小时后，用大量的去离子水浸泡冲洗。

（3）海绵层的引入：配置浓度为1wt%～10wt%的天然高分子材料的混合溶液，均匀涂覆流延在（2）所得纤维膜上，并使用冷冻干燥器将溶剂抽出。

（4）海绵层的交联：将（3）所获得的双层支架浸泡到交联剂4-（4,6-二甲氧基三嗪）-4-甲基吗啉盐酸盐（DMTMM）、碳二亚胺（EDC）或EDC与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的混合物中，交联剂的浓度为50mM～200mM，于室温反应6～12小时后，用大量的去离子水浸泡冲洗，并将纤维支架再次置于冷冻干燥机中，抽干吸收的水分，即得所需的多孔支架材料。

本发明所述的天然聚合物是指分子链中除氨基及羟基等外还含有羧基的聚合物。

本发明所述的碱溶液，所选用的碱为氢氧化钠、氢氧化钾等。

本发明所述的天然高分子材料的分子量为5～100万的含极性基团聚合物，选自：透明质酸、海藻酸钠、胶原、肝素、聚赖氨酸、壳聚糖、核酸、多聚氨基酸、纤维素蛋白、血清纤维结合蛋白、多肽或上述高分子衍生物，或者其中的两种以上的共混物。

本发明所述的碱溶液所用的碱选自如：氢氧化钠、氢氧化钾等。

本发明所述的聚己内酯电纺纳米纤维膜支架材料用于皮肤及临床急需的组织器官缺损修复、重建或创伤敷料。

聚己内酯电纺纳米纤维膜的制备可以采用现有技术制备，也可以采用以下方法制备：将Mw=8×10⁴的PCL溶解在体积比为1/1的甲醇/氯仿混合溶剂或体积比为3/2的DMF/氯仿中；配成浓度为8wt%～18 wt%的电纺溶液，将该溶液装入静电纺丝设备的给料装置中，设置溶液的供料速率为20 ul/min，接受距离为8 cm，静电压为 15 kV，即可获得可生物降解的超细电放纳米纤维膜。

经对纯PCL电纺纳米纤维膜、PCL接枝明胶的电纺纳米纤维膜和交联明胶的PCL电纺纳米纤维膜进行扫描，其扫描光谱显示，所有XPS谱均有两个独立的峰，分别为C1s（键能，285 eV）和O1s的（键能，532 eV）。此外，在PCL接枝明胶的电纺纳米纤维膜和明胶与PCL交联的电纺纳米纤维膜上出现了一个新的谱峰N1s（键能，400 eV），这表明明胶已经成功的引入到了电纺纳米纤维膜表面（见附图7所示）。

经对明胶、纯的PCL电纺纳米纤维膜表面、PCL接枝明胶的电纺纳米纤维膜表面和交联明胶的PCL电纺纳米纤维膜表面进行红外光谱分析，其红外光谱显示，明胶的红外光谱显示在3400-3500 cm^-1处有一个强峰，这是由于重叠的N-H和O-H的伸缩振动形成的；并且C-H的伸缩在3068 cm^-1 处也有一个强峰，N-H变形的吸收峰分别在1600–1650 cm^-1、1500–1550 cm^-1 。对PCL电纺纳米纤维膜而言，C=O的伸缩振动在1700–1760 cm^-1处，这个峰也出现在PCL接枝明胶的电纺纳米纤维膜和交联明胶的PCL电纺纳米纤维膜上。在接枝明胶后，在1600–1650 cm^-1和1500–1550 cm^-1处出现N-H变形振动峰，而且在PCL接枝明胶的电纺纳米纤维膜和交联明胶的PCL电纺纳米纤维膜上重叠的N-H变形振动出现在3400–3500 cm^-1。这些结果表明，明胶成功的引入到了PCL的电纺纳米纤维膜表面（见附图8所示）。

由水滴的接触角测量来表征膜的润湿性。结果显示通过相应的化学修饰的PCL的电纺纳米纤维膜表面润湿性改变了，而未修改的PCL支架呈疏水性。接枝明胶后的PCL膜呈现亲水性。由于明胶是一个含有许多极性基团的亲水大分子，所以显示测量接枝明胶的PCL电纺纳米纤维膜的接触角图像显示接枝明胶的PCL膜的静态接触角几乎从原来的140°减少为0°，进而证明了将明胶接枝到PCL膜表面可以改善PCL膜的润湿性（见附图9所示）。

对力学性能的研究显示，纯PCL电纺纳米纤维膜和水解的PCL膜的杨氏模量是66-77.3 MPa和62.3-75.4 MPa。杨氏模量结果表明，PCL的膜在碱处理后无明显变化，因此，改性后的PCL电纺纳米纤维膜的力学性能可满足其作为植入设备的机械性能要求（见附图3所示）。

在共培养实验中使用的所有细胞都表现出典型的ADMSCs特征。图11为分别在纯PCL电纺纳米纤维膜和交联明胶的PCL电纺纳米纤维膜上培养1、3和7天后的脂肪间充质干细胞的荧光微图像。从图11a和图11b中可以看出在纯PCL电纺纳米纤维膜和交联明胶的PCL电纺纳米纤维膜上所有细胞的粘附和生长都非常好。这表明，纯PCL电纺纳米纤维膜和明胶交联的PCL的电纺纳米纤维膜对细胞是没有毒性的。

图11d-f显示出在细胞培养液中培养不同天数的情况下，ADMSCs在明胶交联的PCL的电纺纳米纤维膜上可以快速增殖和很好的粘附。并发现细胞的生长、细胞增殖和细胞分化在交联明胶的PCL电纺纳米纤维膜上比纯PCL电纺纳米纤维膜的要好。这一结果表明，ADMSCs在明胶交联的PCL电纺纳米纤维膜上生长更好。从图11中可以发现细胞聚集量随着明胶的加入而增加，这意味着明胶可以改善细胞在材料表面的粘附性能。

体外降解实验：将(50×20×0.09 mm)的PCL纳米纤维膜放入到20 mL PH等于7.4的PBS缓冲溶液中，在温度为37°C的恒温振荡仪中振荡。每一周时间称量一次，直到完全降解为止。利用质量损失(%) = (原始质量-降解后的质量)/原始质量′100%公式计算降解速率（见附图12所示）。

体内降解实验：在老鼠体内左右边分别植入PCL原膜和接枝明胶改性后的PCL纤维膜，在老鼠体内分别植入一周、两周、三周和四周时间。经过移植一周后，发现PCL原膜没什么变化，但接枝明胶改性后的PCL纤维膜的机械强度基本丧失，两周后改性后的PCL纤维膜的出现缺损，四周后PCL原膜变化不大，但接枝明胶改性后的PCL纤维膜的可完全降解。

本发明的优点是：在聚己内酯电纺纳米纤维膜表面涂覆天然高分子溶液前，先进行碱处理并接枝含有极性基的天然高分子，不仅改善了聚己内酯电纺纳米纤维膜表面的亲水性，从而有利于明胶溶液的铺展；而且天然高分子本身的基团还有利于物理键合天然高分子海绵层；另外，PCL纤维膜可提供材料的力学支撑及大孔结构，而天然高分子海绵层可有效地调节支架中孔径尺寸，利于细胞的长入，中间键入的天然高分子化合物则起到生物粘合剂的作用可将两不相容材料稳定地贴合起来，更利于提高材料的稳定性，最后天然高分子的引入可有效地提高PCL纤维支架的降解速率，调控不同组分，能在一定程度上调控材料的降解周期。所制备的具有良好生物相容性，稳定、孔径适宜的聚己内酯纳米纤维/天然高分子海绵复合的多孔材料可用于创伤部位修复的临时性敷料，或有利于组织工程皮肤及临床急需的组织器官缺损修复和重建。

附图说明

图1为本发明的聚己内酯电纺纳米纤维。

图2为本发明的聚己内酯电纺纳米纤维膜表面静态接触角。

图3为本发明的聚己内酯电纺纳米纤维膜表面的明胶静态接触角。

图4为本发明的聚己内酯电纺纳米纤维膜改性前后的力学性能。

图5为本发明的聚己内酯电纺纳米纤维膜表面的明胶基海绵层的形貌。

图6为本发明的聚己内酯电纺纳米纤维膜表面涂覆明胶断面形貌。

图7为纯PCL电纺纳米纤维膜、PCL接枝明胶的电纺纳米纤维膜和交联明胶的PCL电纺纳米纤维膜的扫描光谱。其中（a）为纯PCL电纺纳米纤维膜，（b）为PCL接枝明胶的电纺纳米纤维膜，（c）为交联明胶的PCL电纺纳米纤维膜。

图8为明胶、纯的PCL电纺纳米纤维膜表面、PCL接枝明胶的电纺纳米纤维膜表面和交联明胶的PCL电纺纳米纤维膜表面的红外光谱。其中(a)为明胶，(b)为纯PCL电纺纳米纤维膜，(c)为PCL接枝明胶的电纺纳米纤维膜，（d）交联明胶的PCL电纺纳米纤维膜。

图9为PCL基膜的润湿性评估。

图10为脂肪间充质干细胞在纯PCL的电纺纳米纤维膜和交联明胶的PCL电纺纳米纤维膜上分别培养细胞1，3和7天后的荧光显微图像。其中(a)为纯PCL的电纺纳米纤维膜，1天；(b)为纯PCL的电纺纳米纤维膜，3天；(c)为纯PCL的电纺纳米纤维膜，7天；(d)为明胶交联PCL的电纺纳米纤维膜，1天；(e)为明胶交联PCL的电纺纳米纤维膜，3天；(f)为明胶交联PCL的电纺纳米纤维膜，7天。

图11为体外降解曲线图。

具体实施方式

本发明将通过以下实例作进一步说明。

实施例 1。

本实施例选择NaOH处理改性聚己内酯电纺纳米纤维膜，键入明胶、涂覆明胶溶液，交联剂选择EDC/NHS的混合物进行交联，具体步骤如下：

第一步，聚己内酯电纺纳米纤维膜的制备：将PCL溶解在体积比为1/1的甲醇/氯仿混合溶剂中，配成浓度为12 wt%的电纺溶液，将该溶液装入静电纺丝设备的给料装置中，设置溶液的供料速率为20 l/min，接受距离为8 cm，静电压为15 kV，即可获得可生物降解的超细电纺纳米纤维膜（附图1）。

第二步，聚己内酯电纺纳米纤维膜表面碱处理改性：将聚己内酯电纺纳米纤维膜置于0.075M的NaOH溶液中，于0℃反应30 min后，用大量的去离子水浸泡冲洗。

第三步，明胶大分子的键入：所碱处理过的聚己内酯电纺纳米纤维膜放入浓度为100 mM的4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)溶液中，于室温反应8 h后，用大量的去离子水浸泡冲洗，然后浸泡在一定浓度的0.2 wt % 的明胶溶液中，于室温反应 12 h后，用去离子水冲洗。参见附图2和图3，聚己内酯电纺纳米纤维膜表面亲水性有显著的提高，但力学性能没多大的变化（附图4）。

第四步，海绵层的引入：配制5 wt%的明胶溶液，并将其涂覆在处理过的聚己内酯电纺纳米纤维膜表面，使用冷冻干燥器将溶剂抽出（处理时间为24h）。

第五步，海绵层的交联：将冻干后的聚己内酯/胶原多孔支架投入到含50 mM的EDC/NHS (摩尔比1/1)的水溶液中，于室温反应12小时后，用大量去离子水浸泡冲洗，将洗涤后的支架再次置于冷冻干燥机中，抽干吸收的水分,即得PCL /明胶多孔结构支架（附图5和图6），将制备的多孔支架敷于皮肤创伤部位，发现具有很好的促进皮肤修复功能，并且天然高分子的降解可以促进PCL的降解。

实施例2 。

本实施例选择选择KOH处理改性聚己内酯电纺纳米纤维膜，键入水溶性壳聚糖、涂覆明胶和壳聚糖的混合溶液，选择交联剂为EDC/NHS的混合物。具体步骤如下：

第一步，聚己内酯电纺纳米纤维膜的制备：将PCL溶解在体积比为3/2的DMF/氯仿，配成浓度为18 wt%的电纺溶液，将该溶液装入静电纺丝设备的给料装置中，设置溶液的供料速率为20

l/min，接受距离为8 cm，静电压为 15 kV，即可获得可生物降解的超细电纺纳米纤维膜。

第二步，聚己内酯电纺纳米纤维膜进行表面碱处理改性：将聚己内酯电纺纳米纤维膜置于0.075M的KOH溶液中，于10℃反应30分钟后，用大量的去离子水浸泡冲洗。

第三步，壳聚糖大分子的键入：将碱处理过的聚己内酯电纺纳米纤维膜放入浓度50 mM的4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)，于室温反应12 小时后，用大量的去离子水浸泡冲洗，然后浸泡在浓度为1 wt %壳聚糖的溶液中，于室温反应 12h后，用去离子水冲洗。

第四步，海绵层的引入：配制5 wt%的明胶与壳聚糖的混合溶液（其中明胶/壳聚糖质量比为60:40），并将其涂覆在处理过的聚己内酯电纺纳米纤维膜表面，使用冷冻干燥器将溶剂抽出（处理时间为24h）。

第五步，海绵层的交联：将冻干后的多孔支架投入到含100 mM的EDC/NHS (摩尔比1/1)的水溶液中，于室温反应12 h后，用大量去离子水浸泡冲洗，将洗涤后的支架再次置于冷冻干燥机中，抽干吸收的水分,即得双层多孔结构支架，将制备的多孔支架敷于皮肤创伤部位，发现具有很好的促进皮肤修复功能，并且天然高分子的降解可以促进PCL的降解。

实施例3。

本实施例选择NaOH处理改性聚己内酯电纺纳米纤维膜，键入明胶、涂覆明胶与海藻酸钠混合溶液，脱水剂选择EDC/NHS的混合物进行交联，具体步骤如下：

第一步，聚己内酯电纺纳米纤维膜的制备：将PCL溶解在体积比为1/1的甲醇/氯仿混合溶剂中，配成浓度为15 wt%的电纺溶液，将该溶液装入静电纺丝设备的给料装置中，设置溶液的供料速率为20

第二步，聚己内酯电纺纳米纤维膜进行表面碱处理改性：将聚己内酯电纺纳米纤维膜置于0.05M的NaOH溶液中，于0℃反应1h后，用大量的去离子水浸泡冲洗。

第三步，明胶大分子的键入：将碱处理过的聚己内酯电纺纳米纤维膜放入适当浓度200 mM的4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)溶液中，于室温反应12 小时后，用大量的去离子水浸泡冲洗，然后浸泡在浓度为0.5 wt % 的明胶溶液中，于室温反应 12小时后，用去离子水冲洗。

第四步，海绵层的引入：配制5 wt%的明胶与海藻酸钠的混合溶液（其中胶原/海藻酸钠质量比为50:50），并将其涂覆在处理过的聚己内酯电纺纳米纤维膜表面，使用冷冻干燥器将溶剂抽出（处理时间为24h）。

第五步，海绵层的交联：将冻干后的双层多孔支架投入到含200 mM的EDC/NHS (摩尔比1/1)的水溶液中，于室温反应12 h后，用大量去离子水浸泡冲洗，将洗涤后的支架再次置于冷冻干燥机中，抽干吸收的水分，即得不对称多孔结构支架，将其敷于皮肤创伤部位，发现具有很好的促进皮肤修复功能，并且天然高分子的降解可以促进PCL的降解。

实施例4。

本实施例选择NaOH处理改性聚己内酯电纺纳米纤维膜，键入明胶，然后涂覆明胶与透明质酸混合溶液，脱水剂选择EDC/NHS的混合物进行交联，具体步骤如下：

第一步，聚己内酯电纺纳米纤维膜的制备：将PCL溶解在体积比为1/1的甲醇/氯仿混合溶剂中，配成浓度为8 wt%的电纺溶液，将该溶液装入静电纺丝设备的给料装置中，设置溶液的供料速率为20

第二步，聚己内酯电纺纳米纤维膜进行表面碱处理改性：将聚己内酯电纺纳米纤维膜置于0.1M的NaOH溶液中，于0℃反应30 min后，用大量的去离子水浸泡冲洗。

第三步，明胶大分子的键入：将碱处理过的聚己内酯电纺纳米纤维膜放入适当浓度20 mM的4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)溶液中，于室温反应12 h后，用大量的去离子水浸泡冲洗，然后浸泡在浓度为0.8 wt % 的明胶溶液中，于室温反应 12小时后，用去离子水冲洗。

第四步，海绵层的引入：配制5 wt%的明胶与透明质酸的混合溶液（其中胶原/透明质酸质量比为80:20），将其涂覆在处理过的聚己内酯电纺纳米纤维膜表面，使用冷冻干燥器将溶剂抽出（处理时间为24h）。

第五步，海绵层的交联：将冻干后的多孔支架投入到含200 mM的EDC/NHS (摩尔比1/1)的水溶液中，于室温反应12 h后，用大量去离子水浸泡冲洗，将洗涤后的支架再次置于冷冻干燥机中，抽干吸收的水分,即得多孔结构支架，将其敷于皮肤创伤部位，发现具有很好的促进皮肤修复功能，并且天然高分子的降解可以促进PCL的降解。

实施例5。

本实施例选择NaOH处理改性聚己内酯电纺纳米纤维膜，键入胶原、涂覆胶原溶液，选择DMTMM进行交联，具体步骤如下：

第一步，聚己内酯电纺纳米纤维膜的制备：将PCL溶解在体积比为1/1的甲醇/氯仿混合溶剂中，配成浓度为10wt%的电纺溶液，将该溶液装入静电纺丝设备的给料装置中，设置溶液的供料速率为20

第三步，胶原大分子的键入：将碱处理过的聚己内酯电纺纳米纤维膜放入适当浓度20 mM的4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)溶液中，于室温反应12 小时后，用大量的去离子水浸泡冲洗，然后浸泡在浓度为1 wt % 的胶原弱酸溶液中，于室温反应 12 h后，用去离子水冲洗。

第四步，海绵层的引入：配制1 wt%的胶原溶液，并将其涂覆在处理过的聚己内酯电纺纳米纤维膜表面，使用冷冻干燥器将溶剂抽出（处理时间为24h）。

第五步，海绵层的交联：将冻干后的多孔支架投入到含200 mM的DMTMM的水溶液中，于室温反应12 h后，用大量去离子水浸泡冲洗，将洗涤后的支架再次置于冷冻干燥机中，抽干吸收的水分，即得多孔结构支架，将其敷于皮肤创伤部位，发现具有很好的促进皮肤修复功能，并且天然高分子的降解可以促进PCL的降解。

实施例6。

本实施例选择NaOH处理改性聚己内酯电纺纳米纤维膜，键入壳聚糖、涂覆明胶溶液，选择DMTMM进行交联，具体步骤如下：

第一步，聚己内酯电纺纳米纤维膜的制备：将PCL溶解在体积比为1/1的甲醇/氯仿混合溶剂中，配成浓度为10 wt%的电纺溶液，将该溶液装入静电纺丝设备的给料装置中，设置溶液的供料速率为20

第二步，聚己内酯电纺纳米纤维膜进行表面碱处理改性：将聚己内酯电纺纳米纤维膜置于0.01M的NaOH溶液中，于0℃反应1h后，用大量的去离子水浸泡冲洗。

第三步，壳聚糖大分子的键入：将碱处理过的聚己内酯电纺纳米纤维膜放入浓度50 mM的4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM), 于室温反应12 小时后，用大量的去离子水浸泡冲洗，然后浸泡在浓度为0.2 wt %壳聚糖的混合溶液中，于室温反应 12h后，用去离子水冲洗。

第四步，海绵层的引入：配制10wt%的明胶溶液，并将其涂覆在处理过的聚己内酯电纺纳米纤维膜表面，使用冷冻干燥器将溶剂抽出（处理时间为24h）。

第五步，海绵层的交联：将冻干后的多孔支架投入到含200 mM的DMTMM的水溶液中，于室温反应12 h后，用大量去离子水浸泡冲洗，将洗涤后的支架再次置于冷冻干燥机中，抽干吸收的水分, 即得多孔结构支架，将其敷于皮肤创伤部位，发现具有很好的促进皮肤修复功能，并且天然高分子的降解可以促进PCL的降解。

实施例7。

本实施例选择NaOH处理改性聚己内酯电纺纳米纤维膜，键入明胶、涂覆明胶溶液，选择DMTMM为交联剂，具体步骤如下：

第二步，聚己内酯电纺纳米纤维膜进行表面碱处理改性：将聚己内酯电纺纳米纤维膜置于0.1M的NaOH溶液中，于0℃反应10 min后，用大量的去离子水浸泡冲洗。

第三步，明胶大分子的键入：将碱处理过的聚己内酯电纺纳米纤维膜放入20 mM的4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)溶液中，于室温反应12 h后，用大量的去离子水浸泡冲洗，然后浸泡在一定浓度的1 wt % 的明胶溶液中，于室温反应 12 h后，用去离子水冲洗。

第四步，海绵层的引入：配制10 wt%的明胶溶液，并将其涂覆在处理过的聚己内酯电纺纳米纤维膜表面，使用冷冻干燥器将溶剂抽出（处理时间为24h）。

第五步，海绵层的交联：将冻干后的多孔支架投入到含200 mM的DMTMM的水溶液中，于室温反应12 h后，用大量去离子水浸泡冲洗，将洗涤后的支架再次置于冷冻干燥机中，抽干吸收的水分,即得多孔结构支架，将其敷于皮肤创伤部位，发现具有很好的促进皮肤修复功能，并且明胶可以促进PCL的降解。

Claims

1. 一种聚己内酯/天然高分子复合多孔支架的制备方法，包括聚己内酯电纺纳米纤维膜的制备，其特征是：

（1）将聚己内酯电纺纳米纤维膜置于浓度为0.05～0.2M的碱溶液中，于0-10℃反应20～60分钟后，用去离子水浸泡冲洗；

（2）将（1）所获得的聚己内酯电纺纳米纤维膜放入浓度为20 mM～200 mM的4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐溶液中，于室温反应8～14小时后，用去离子水浸泡冲洗，然后浸泡在浓度为1wt%～10wt%的天然聚合物中，于室温反应6-12小时后，用去离子水浸泡冲洗；

或者将（1）所获得的聚己内酯电纺纳米纤维膜放入浓度为20 mM～200 mM的4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐的天然聚合物溶液中，其中天然聚合物浓度为0.1wt%～2.0wt%，于室温反应6～12小时后，用大量的去离子水浸泡冲洗；

（3）配置浓度为1wt%～10wt%的天然高分子材料的混合溶液，均匀涂覆流延在（2）所得纤维膜上，并使用冷冻干燥器将溶剂抽出；

（4）将（3）所获得的双层支架浸泡到交联剂4-（4,6-二甲氧基三嗪）-4-甲基吗啉盐酸盐、碳二亚胺或碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的混合物中，交联剂的浓度为50mM～200mM，于室温反应6～12小时后，用去离子水浸泡冲洗，并将纤维支架再次置于冷冻干燥机中，抽干吸收的水分。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤（3）所述的天然高分子材料的混合溶液为透明质酸、海藻酸钠、胶原、肝素、聚赖氨酸、壳聚糖、核酸、多聚氨基酸、纤维素蛋白、血清纤维结合蛋白、多肽或上述高分子衍生物中的两种以上的共混物。

3.权利要求1所述的聚己内酯电纺纳米纤维膜支架材料用于皮肤及临床的组织器官缺损修复、重建或创伤敷料。