TWI523946B - 位置特異性整合 - Google Patents

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Description

位置特異性整合
本發明關於穩定且高產量之位置特異性整合(SSI)宿主細胞(例如自中國倉鼠卵巢(CHO)衍生之宿主細胞)、彼等之製造方法及使用方法。
研發中之生物性生物製藥候選物增加的數目已激起對於研發用來發展細胞株之強大且快速之高產出量技術的需求，因為使用習知方法產生商用細胞株是費時、勞動密集及重複的過程。在建構及選擇抗體製造細胞株期間，取得具有大範圍之表現、生長和穩定性變化形廓的細胞株。這些變化可能因哺乳動物基因組之固有塑性而出現。其亦可能衍生自隨機基因調控網絡或起因於轉基因之隨機基因組整合(此主要是由於“花斑型位置效應(position variegation effect)”)之重組蛋白製造量的變化。
由於這些變化及低頻率(一萬分之一)之基因組整合，在庫中篩選出許多這些罕見事件之轉染株時需要資源密集及費時的工作，以分離出商業上兼容之製造細胞株 (例如結合生長良好、高生產力及製造穩定性，具有所需之產物變化形廓)。此情況可經由使用高度嚴格之選擇系統(諸如GS(麩醯胺合成酶)基因表現系統)來富集高產量細胞株而獲得改善。例如，在最近的一項研究中，>30%之製造175mAb(單株抗體)GS-CHOK1SV(GS基因表現系統TM，Lonza公司)細胞株的隨機選擇小組在搖瓶饋料批式過程中製造>=1克/升mAb。CHOK1SV內源性地表現GS酶，因此，陽性轉染株可使用不含麩醯胺之培養基及甲硫胺酸亞碸亞胺(methionine sulfoximine)(MSX)選擇作用來取得。儘管有這類有效之選擇系統，嚴格且費工之篩選方法仍然有需要。因此，製造細胞株之建構為艱苦而漫長之過程。這些細胞不僅需要選擇正增長及生產力特性，亦需要經過選殖，且基本上需要在製造過程持續時間製造具正確品質之產物。此外，對具有經濟效益之過程而言，所產生之細胞株需要在經過許多細胞世代後仍表現出一致的生產力。提供具有正增長特性之高產量細胞株，以每次最低之篩選活性表現出一種所欲之新蛋白質(例如新單株抗體)是令人渴望的。
本發明之根本技術問題是要克服上述缺點，尤其是提供(較佳地，以簡單而有效的方式)具有高穩定性及正增長和生產力特性之高產量細胞株，尤其是能在長時間培養和製造期間提供一致之生產力的細胞株。
本發明藉由提供根據申請專利範圍獨立項之教示內容來解決其根本之技術問題。
尤其是，本發明藉由提供包含內源性Fer1L4基因之位置特異性整合(SSI)宿主細胞來解決其技術問題，其中一外源性核苷酸序列被整合在該Fer1L4基因中。於一些實施例中，該外源性核苷酸序列包含至少一個編碼所欲序列之基因。於一些實施例中，該外源性核苷酸序列包含至少兩個重組靶的位置。於一些實施例中，該重組靶的位置係位在至少一個編碼所欲序列之基因的二側。於其他實施例中，該重組靶的位置係與該至少一個編碼所欲序列之基因相鄰，但非位在其二側。於一些實施例中，該編碼所欲序列之基因包含至少一個選擇標記基因。
於一較佳之實施例中，本發明預見該被整合在內源性Fer1L4基因中之外源性核苷酸序列為位在該至少一個編碼所欲序列之基因(較佳為該至少一個選擇標記基因)二側的兩個重組靶的位置，此意味一個第一重組靶的位置係位在該至少一個編碼所欲序列之基因(較佳為該至少一個選擇標記基因)的5’上游，且一個第二重組靶的位置係位在3’下游。
較佳地，該編碼所欲序列之基因可為編碼所欲蛋白質(例如抗體、抗原、酶、可檢測之蛋白質(例如螢光蛋白，諸如綠色螢光蛋白)、激素、生長因子、受體、融合蛋白，或具選擇功能之蛋白質)的核苷酸序列。該核苷酸序列可功能上連接至少一個調控元件，諸如啟動子。較佳 地，該編碼所欲序列之基因為選擇標記基因。
於一較佳之實施例中，本發明關於根據本發明之SSI宿主細胞，其中該重組靶的位置為FRT(FLP識別靶的)位置。於本發明之一較佳實施例中，該FRT位置為野生型FRT位置，即，F位置。
於本發明之另一較佳實施例中，該FRT位置為突變型FRT位置，較佳為F5位置，較佳地，諸如Schlacke and Bode(1994)Biochemistry 33：12746-12752中所揭露者。
於本發明之一特佳實施例中，該編碼所欲序列之基因(例如，該選擇標記基因)之5’端為野生型FRT位置，而3’端為突變型FRT位置。
在本發明的背景下，術語“位於該至少一個編碼所欲序列之基因二側的重組靶的位置”意指該重組靶的位置係位於該編碼所欲序列之基因的5’和3’端，即，意指一個靶的位置係位在該編碼所欲序列之基因的5’端，而另一靶的位置係位在3’端。該重組靶的位置可直接鄰接該編碼所欲序列之基因或與該基因相隔規定之距離。
側翼序列(flanking sequence)，尤其是該側翼之重組靶的位置係位在正向或反向位置上，較佳為兩者均位在正向或均位在反向位置上。
於本發明之進一步的較佳實施例中，該重組靶的位置為lox位置。
如果該重組靶的位置為FRT位置，宿主細胞需要有 FLP(FLP重組酶)之存在及表現以實現交叉或重組事件。如果該重組靶的位置為lox位置，宿主細胞需要有Cre重組酶的存在及表現。
FLP或Cre重組酶的存在及表現均可藉由，例如將編碼FLP或Cre重組酶之外源性核苷酸序列引入宿主細胞中來達成，該宿主細胞為可令該核苷酸序列在其中表現之宿主細胞。
因此，本發明提供在預先定義之“熱點(hot-spot)”(即，Fer1L4基因)處納入支持正增長、生產力和穩定性之組合的外源性核苷酸序列，例如至少兩個重組靶的位置，尤其是FRT位置和/或至少一個編碼所欲序列之基因的宿主細胞(較佳為宿主細胞株)。例如，於一些實施例中，編碼所欲序列之基因在本文所提供之SSI宿主細胞中的表現可維持穩定至少70、100、150、200或300個世代。若經過一段時間後表現減少的水準少於30%，或保持在相同的水準或水準增加則表現為“穩定”。於一些實施例中，若經過一段時間後容積生產力減少之水準少於30%，或保持在相同的水準或水準增加則表現為“穩定”。於一些實施例中，本文所提供之SSI宿主細胞製造至少1.5克/升、2克/升、3克/升、4克/升或5克/升之編碼所欲序列之基因的表現產物。於一些實施例中，本文所提供之SSI細胞(尤其是細胞株)極為穩定，以致於其可被保持在培養中，而不需進行任何選擇，因此本細胞株有可能更容易被監管機構接受。在經濟方面，由於本發明之細胞株具有 高度可預測之性能，因而在發展過程的不同階段中需要篩選的細胞株較少，本發明因此能夠快速且資源有效地發展細胞株。因此，與標準過程相比較，可發展更多用於指定靶的之生物製藥候選物(例如單株抗體(mAb)候選物)，或更多用於複數靶的之候選物。最終，這可能引導向患者利益，因為縮短所欲蛋白(較佳為治療性mAbs)用於臨床的時間。
在本發明的背景下，術語“熱點”意指一個位置，也就是在宿主細胞之基因組中提供穩定且高度表現活性(較佳為轉錄活性)地製造產物(即，編碼所欲序列之基因的蛋白質)的位置，尤其是提供強勁且穩定地製造由編碼所欲序列之基因編碼的蛋白質，較佳地，其中該編碼所欲序列之基因在轉染入宿主細胞後被整合在該位置處。
在本發明的背景下，術語“位置”係指核苷酸序列，尤其是規定之核苷酸伸展，即，規定之核苷酸序列長度，較佳地，為較大之核苷酸伸展的一部分之規定的核苷酸伸展。於一些實施例中，位置(例如為“熱點”之位置)為基因組之一部分。於一些實施例中，位置係被引入基因組中，例如重組靶的位置。“重組靶的位置”為一種核苷酸伸展，其加上重組酶對靶向重組以及規定這類重組之定位而言是必要的且使其成為可能。
在本發明的背景下，術語“宿主細胞”(以下亦稱為“受體細胞”)係指攜帶外源性核苷酸序列(較佳為被穩定地整合在細胞之基因組中)的細胞。
在本發明的背景下，“細胞”較佳為哺乳動物細胞，尤其是囓齒動物細胞，較佳為小鼠細胞、倉鼠細胞，較佳為中國倉鼠細胞，較佳為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，較佳為CHOK1細胞，較佳為CHOK1SV細胞。較佳地，該細胞為人類細胞。較佳地，該細胞為非人類細胞。
在本發明的背景下，較佳地，術語“細胞”係指細胞株之細胞。較佳地，術語“細胞株”係指已建立之永生化細胞株。
於一實施例中，術語“細胞”亦指初代細胞。
在本發明的背景下，術語“位置特異性整合(SSI)宿主細胞”係指包含外源性核苷酸序列的宿主細胞。於一些實施例中，該外源性核苷酸序列包括重組靶的位置，其能夠位置特異性整合外源性核苷酸序列，從而能夠預先決定所需之核苷酸序列定位及定向整合在宿主細胞之基因組中的所需處。因此，於一些實施例中，位置特異性整合宿主細胞能夠靶向整合編碼所欲序列之基因。更佳地，位置特異性整合宿主細胞能夠藉由重組介導之卡匣交換(RMCE)靶向整合編碼所欲序列之基因。較佳地，這類過程僅引入一個編碼序列之基因功能複本，較佳地，僅在預定之位點引入編碼所欲序列之基因的一個複本。較佳地，此過程並不將載體序列(例如原核載體序列)共同引入宿主細胞中。
在進一步之較佳實施例中係將兩個編碼所欲序列之基因的功能複本引入SSI宿主細胞中。
在本發明的背景下，術語“選擇標記基因”係指核苷酸序列，尤其是編碼序列之基因，也就是指編碼蛋白質之核苷酸序列，以下亦稱為受至少一個調控元件(尤其是啟動子)調控和功能控制之區域，其中該編碼蛋白質之區域編碼能夠用來選擇表現該蛋白質之宿主細胞的蛋白質。
在本發明的背景下，術語“FRT”意指FLP識別靶的。FRT為34個鹼基對長之核苷酸序列，其使可容許在體內之受控條件下操縱有機體DNA的定點重組技術成為可能。FRT與FLP重組酶(FLP)結合，FLP重組酶隨後裂解該序列並允許整合在兩個FRT位置之間的核苷酸序列重組。在RMCE方面，需要兩個由兩個側翼重組酶靶的序列介導之交叉事件；一個在欲交換之卡匣的5’端且一個在3’端。交叉可能會出現在兩個完全相同的FRT位置之間。使用FRT位置亦需要有FLP重組酶的表現和存在。整個系統(本文中亦稱為“FRT/FLP”)係揭露於Seibler and Bode，Biochemistry 36(1997)，第1740至1747頁及Seibler et al.,Biochemistry 37(1998)，第6229至6234頁中。
在本發明的背景下，Fer1L4基因為Fer1L4野生型基因、其所有異型體(isoform)及其所有同系物，尤其只要是與野生型Fer1L4基因(較佳為野生型Fer1L4基因全長，較佳為野生型倉鼠Fer1L4基因，較佳為其具有來自NCBI登錄編號NW_003613833或JH000254.1之坐標1176191至1781992，較佳為野生型CHO Fer1L4基因或 其縮短型)具有至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98、至少99或至少99.5%之序列同源性的同系物。
最佳地，存在於本發明之SSI宿主細胞中的野生型Fer1L4基因特徵為，首先，位於5’端之側翼序列的5’端整合位置係位在外顯子39和40之間，其次，位於3’端之側翼序列的3’端整合位置係位在外顯子28和29之間。因此，於一較佳之實施例中，該外源性序列之整合涉及部分之內源性Fer1L4基因，較佳地，該區域橫跨且包括外顯子28至40。於一些實施例中，至少一部分之Fer1L4基因在SSI宿主細胞中被刪除。
本發明中，“同系物”或“同源序列”為核苷酸序列，其與具體指定之比較性序列具有上述之序列同源性(例如與野生型CHO Fer1L4基因或其部分同源，例如與SEQ ID No：7、8或9同源)。
在本發明的背景下，術語“序列同源性”係指根據序列比對(其最大限度地提高比對之核苷酸之間的相似性)測量之兩種序列的同一性或相似性的程度，且其為完全相同之核苷酸數目、全部核苷酸數目及序列比對中間隙之存在和長度的函數。可用於使用標準參數測定序列相似性之算法和電腦程式有多種。較佳地，序列同源性係使用用於核酸序列之BLASTn程式測量，此程式可透過國家生物信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)取得，且描述於，例如Altschul et al.(1990),J Mol.Biol.215：403-410；Gish and States(1993),Nature Genet.3：266-272；Madden et al.(1996),Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul et al.(1997),Nucleic Acids Res.25：33 89-3402)；Zhang et al.(2000),J.Comput.Biol.7(I-2)：203-14中。較佳地，兩種核苷酸序列之序列同源性為根據下列用於BLASTn算法之參數的積分：字的大小=11；間隙開口懲罰=-5；間隙延伸懲罰=-2；匹配獎勵=1；及錯配懲罰=-3。
因此，Fer1L4基因可能為CHO Fer1L4基因本身，或亦可能為，例如人類Fer1L4基因，例如Dysferlin(Fer1L1)、Otoferlin(Fer1L2)、Myoferlin(Fer1L3)、Fer1L4、Fer1L5或Fer1L6。
較佳地，本Fer1L4基因亦可能為秀麗隱桿線蟲(C.elegans)Fer1基因(NCBI基因ID：172659，WormBase：WBGene00001414)或ferlin族中之任何其他成員，該ferlin族在哺乳動物細胞中有六名成員。Fer1ins促進血管融合，具體地說，膜融合事件。秀麗隱桿線蟲Fer1對於蠕蟲中細胞器融合到質膜及正常繁殖是必須的(Achanzar,W.E.,and Ward,S.,J.Cell Sci.110(1997),1073-108；Washington,N.L.,and Ward,S.,J.Cell Sci.119(2006),2552-2562)。
除了C端錨外，哺乳動物ferlin族成員亦包含多個(6或7)C2結構域(Sutton RB et al.Cell 80(1995),929-38；Shao et al.Science 273(1996),248-251)。因此，編碼C2結構域之基因在下文中亦被認為與本發明之 野生型Fer1L4基因同源。
在本發明之背景下，術語“外源性基因”或“外源性核苷酸序列”係指被引入宿主細胞中(例如藉由習知之基因工程方法，較佳地，藉由轉化、電穿孔或轉染)之核苷酸序列，而該核苷酸序列在該引入前並不存在於該宿主細胞中。這類序列亦被稱為“基因轉殖的”。
術語“內源性基因”或“內源性核苷酸序列”係指源自且存在於宿主細胞中之核苷酸序列，因此不是從該宿主細胞外部引入該宿主細胞中。
較佳地，本文所使用之術語“核苷酸序列”或“多核苷酸”係指核酸，較佳為DNA或RNA。
於本發明之較佳實施例中，二側鄰接至少兩個重組靶的位置之編碼所欲序列之基因為選擇標記基因或編碼抗體(例如單株抗體、抗體衍生物、融合蛋白、酶或生物活性蛋白質，例如生長因子或肽激素、G-CSF、GM-CSF、EPO、TPO、介白素、干擾素，等，尤其是藥學或營養功能性蛋白質)之基因編碼序列。較佳地，編碼所欲序列之基因對宿主細胞而言為外源性。
於進一步之較佳實施例中，編碼所欲序列之基因亦可為基因之結構或功能定義部分，例如抗體片段，諸如其重鏈或輕鏈或功能性蛋白質之一部分。於一些實施例中，編碼所欲序列之基因可編碼包含多肽之結構或功能定義部分的表現產物，例如離散結構域、結構域組或域之一部分，諸如抗體之重鏈或輕鏈，或抗體或之恆定區。
於一較佳之實施例中，本發明關於根據本發明之SSI宿主細胞，其中該選擇標記為GS選擇標記、潮黴素(hygromycin)選擇標記、嘌呤黴素(puromycin)選擇標記或胸腺嘧啶激酶選擇標記。
在本發明之背景下，由GS標記基因編碼之GS選擇標記係在GS標記系統中操作。因此，生長培養基中不含麩醯胺時，麩醯胺合成酶(GS)活性對培養中之哺乳動物細胞的生存是必要的。一些哺乳動物細胞株(諸如小鼠骨髓瘤細胞株)不表現足以在不添加麩醯胺下存活之足夠GS。使用這些細胞株，經轉染之GS標記基因經由允許在不含麩醯胺的培養基中生長可作為選擇性標記。其他細胞株(諸如中國倉鼠卵巢細胞株)表現足夠之GS，以在沒有外源性麩醯胺下存活。在這些情況中，可使用GS抑制劑甲硫胺酸亞碸亞胺(MSX)來抑制內源性GS活性，如此僅有具額外之GS活性的轉染株可以存活。
於一較佳之實施例中，本發明關於根據本發明之SSI宿主細胞，其中該宿主細胞為CHO宿主細胞或CHOK1SV(Porter,AJ et al.Biotechnol Prog.26(2010),1455-1464)宿主細胞。
於一較佳之實施例中，本發明亦關於SSI宿主細胞，其中該外源性序列係被整合在從位置1750049(5’整合位置)橫跨至1760965(3’整合位置)之所在處上(見第7圖)。較佳地，該側翼序列係位於支架坐標1750049至1750870(5’端，SEQ ID No.9，822bp)及1758964至 1760965(3’末端，SEQ ID No.7和8，2000bp)(見第7圖)。
於一較佳之實施例中，本發明關於本發明之SSI宿主細胞，其中該位在被整合之外源性核苷酸序列(即，該至少一個編碼所欲序列之基因，其本身之5’和3’端之二側各鄰接一個重組靶的位置)二側的Fer1L4基因之核苷酸序列係選自下列群組：SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9及其同源序列。
於本發明之一較佳實施例中，該與SEQ ID No.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9之序列同源的側翼序列與野生型Fer1L4基因之這些區域具有至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98、至少99或至少99.5%，較佳地，其全部長度之序列同源性。
因此，於一特佳之實施例中，本發明之SSI宿主細胞的特徵為存有外源性核苷酸序列(即，該至少一個編碼所欲序列之基因)，該外源性核苷酸序列本身之5’和3’端二側各鄰接一個重組靶的位置，且其中SEQ ID No.7或SEQ ID No.8之核苷酸序列，或其同源序列至少有一係位於該被整合在宿主細胞之基因組中的外源性核苷酸序列之3’端。
因此，於一特佳之實施例中，本發明之SSI宿主細胞的特徵為存有外源性核苷酸序列(即，該至少一個編碼所欲序列之基因)，該外源性核苷酸序列本身之5’和3’端 二側各鄰接一個重組靶的位置，且其中至少有一如SEQ ID No.9中指定之核苷酸序列或其同源序列係位於被整合在宿主細胞之基因組中的外源性核苷酸序列之5’端。
較佳地，該SSI宿主細胞包含外源性核苷酸序列(即，至少一個編碼所欲序列之基因)，該外源性核苷酸序列本身之5’和3’端二側各鄰接一個重組靶的位置，其3’端側翼鄰接SEQ ID No.7、8之核苷酸序列或其同源序列中至少一者，且其5’端側翼鄰接SEQ ID No.9中所指定之核苷酸序列或其同源序列。
於一特佳之實施例中，該指定之SEQ ID No.7、8、9之5’和/或3’端側翼序列或其同源序列係位在相鄰位置上，而無任何***序列在5’端或3’端，或在被整合在Fer1L4基因中之重組靶的位置的5’和3’端。
於本發明之另一較佳實施例中係提供經分離之核苷酸分子(較佳為多核苷酸)，其包含Fer1L4基因之一部分，例如包含至少一選自下列群組之核苷酸序列：如SEQ ID No.7、8、9中所指定之核苷酸序列及其同源序列。
特佳者為經分離之核苷酸分子，較佳為多核苷酸，其包含至少一選自下列群組之核苷酸序列：如SEQ ID No.7、8、9中指定之核苷酸序列及其同源序列。
於本發明之另一較佳實施例中係提供載體(較佳為表現載體)，其包含本發明之經分離的核苷酸分子，尤其是SEQ ID No.7、8、9或其同系物以及包含該載體或該核苷酸分子之經轉染的宿主細胞。
本文中憑經驗藉由核酸構建體(其包含表現高水準之報告子蛋白的細胞株之表現卡匣)之整合位置的上游和下游序列來鑑定該定義Fer1L4基因位點之核酸序列，即，Fer1L4基因之核酸序列，即，Fer1L4核苷酸序列，尤其是選自下列群組之核苷酸序列：如SEQ ID No.7、8、9中指定之核苷酸序列及其同源序列。本發明之這些核酸序列提供具有新功能之序列，該新功能與增強和穩定之核酸(例如包含編碼所欲序列之基因的外源性核酸)表現有關，這些序列顯示出與先前描述之順式作用元件(諸如啟動子、增强子、基因位點控制區域、支架連接區域或核基質連接區域)的運作方式不同。
本核苷酸序列未顯示出具有任何開放閱讀框(ORF)，這使得它們不太可能編碼反式活化蛋白(transactivator protein)。轉染實驗證明本序列顯示一些順式作用元件之特徵。在瞬時轉染分析中並未檢測到本序列之活性；本序列亦顯示出與使用這些方法檢測到之啟動子和增強子元件不同。
本發明亦關於Fer1L4核苷酸序列(尤其是選自下列群組之核苷酸序列：如SEQ ID No.7、8、9中指定之核苷酸序列及其同源序列)在載體(尤其是表現載體，尤其是包含至少一個編碼所欲序列之基因的非RMCE表現載體)中之用途，尤其是用於製造細胞株(較佳為在隨機過程中)，尤其是用於製造顯示出增強之表現的細胞株，尤其是用於製造高生產者細胞株，較佳為以較高之頻率製造且 較佳地，其提供較高之生產力穩定性。較佳地，這類用途預見以前述鑑定之Fer1L4核苷酸序列轉染細胞，較佳為以含有該核苷酸序列之載體轉染，並由此取得經穩定轉染之細胞株。
因此，本發明亦關於製造細胞或細胞株(較佳為具有高生產力穩定性之高生產者細胞或細胞株)的方法，其中係將Fer1L4核苷酸序列(尤其是選自下列群組之核苷酸序列：如SEQ ID No.7、8、9中指定之核苷酸序列及其同源序列)轉染入細胞或細胞株中，較佳地，該核苷酸序列被整合在載體(較佳為表現載體，較佳為非RMCE表現載體)中，並選擇和取得經穩定轉染之細胞或細胞株。存有如本文鑑定之Fer1L4基因位點或其部分之序列可對所欲基因提供順式作用效果，從而增加彼等之表現，無論其被整合在何基因組中。在隨機過程中以此方式產生之細胞株預計將顯示出較高之生產力穩定性。
較佳地，本發明關於Fer1L4核苷酸序列在用於製造具穩定且高轉錄活性之細胞株或細胞的表現載體中之用途。
較佳地，本發明關於上述鑑定之用途，其中該Fer1L4核苷酸序列係選自下列群組：如SEQ ID No.7、8、9中指定之核苷酸序列及其同源序列。
較佳地，本發明關於用於製造編碼所欲序列之基因之產物的方法，其包含將根據用於製造細胞或細胞株之本發明方法製造的宿主細胞培養在合適之培養基中，並從其中 回收產物。
於一較佳之實施例中，本發明關於根據本發明之SSI宿主細胞，其中該外源性核苷酸序列包括至少一個位在至少一個編碼所欲序列之基因二側的野生型FRT位置，較佳地，至少兩個野生型FRT位置，或至少一個位在至少一個編碼所欲序列之基因二側的突變型FRT位置，較佳地，至少兩個突變型FRT位置。最佳地，該外源性核苷酸序列為位於至少一個編碼所欲序列之基因二側的一個野生型FRT位置及一個突變型FRT位置。特佳地，編碼所欲序列之基因(較佳為選擇標記基因)係位在野生型FRT位置(較佳地，位於該編碼所欲序列之基因(較佳為選擇標記基因)的5’端)與突變型FRT位置(較佳地，位於該編碼所欲序列之基因(較佳為選擇標記基因)的3’端)之間。較佳地，這確保由重組介導之卡匣交換總是發生在同一方向。
於一較佳之實施例中，本發明關於用於製造根據本發明之SSI宿主細胞的方法，其包含下列步驟：a)以包含第一交換卡匣之第一載體轉染細胞(較佳地，其包含內源性Fer1L4基因)，該卡匣包含至少兩個位於至少一個編碼所欲序列之第一基因(較佳地，其編碼mAb)重組靶的位置(尤其是FRT位置)，接著，b)選擇包含該至少兩個重組靶的位置(尤其是位於至少一個被整合在內源性Fer1L4基因中之編碼所欲序列之第一基因二側的FRT位置)並顯示出高生產力且穩定地製造該編碼所欲序列之第 一基因之產物的經轉染之細胞，接著，c)以包含第二交換卡匣之第二載體轉染該在步驟b)中取得之細胞，該卡匣包含至少兩個匹配之重組靶的位置(尤其是FRT位置)，該重組靶的位置係位於至少一個編碼所欲序列之第二基因(即，選擇標記基因)二側，接著，d)使由定點重組介導之卡匣交換生效，接著，e)選擇表現該編碼所欲序列之第二基因(較佳地，選擇標記基因)之經轉染的細胞，從而取得根據本發明之SSI宿主細胞，該SSI宿主細胞包含被穩定地整合在其基因組中之第二交換卡匣(見，例如第4圖)。
較佳地，該編碼所欲序列之第一和第二基因的二端之一側翼鄰接第一重組靶的位置，而其另一端側翼鄰接與第一重組靶的位置不同的第二重組靶的位置。
因此，本發明提供用於製造根據本發明之SSI宿主細胞的方法，該方法使用由重組酶介導之卡匣交換且在其過程中，包含側翼鄰接重組靶的位置之編碼所欲序列的第一基因(較佳地，編碼mAb)之第一交換卡匣係經由載體被轉染入宿主細胞中，被整合在宿主細胞的基因組中，尤其是其“熱點”，且在選擇“熱點”轉染株後，將第二交換卡匣(例如為環形交換質粒之一部分且由至少一個側翼鄰接匹配之重組靶的位置之編碼所欲序列之基因，尤其是編碼所欲序列之第二基因，較佳地，選擇標記基因所組成)轉染入宿主細胞中，並容許重組，藉此以編碼所欲序列之第二基因交換編碼所欲序列之第一基因(參見，例如第4 圖)。有利的是，僅有一個編碼所欲序列之基因的複本被***預定之基因位點且沒有載體序列，尤其是該交換質粒之質粒序列被整合入宿主基因組中。
用於製造SSI宿主細胞之本發明方法是有利的，只要在步驟a)和b)中可使用至少一個編碼所欲序列的第一基因(例如編碼抗體，例如mAb的基因)或其部分且為工業用途之基因(例如生物製藥相關蛋白質)鑑定出顯示出能高而穩定地製造編碼所欲序列之基因產物之“熱點”，且在步驟c)、d)和e)中該被用來鑑定所欲之“熱點”的編碼所欲序列之第一基因完全被所謂的無效(null)卡匣交換，尤其是被包含至少一個編碼所欲序列之第二基因(即，一個選擇標記基因)的第二交換卡匣完全交換。以此方式可創建不含預先存在之用於鑑定該“熱點”之編碼所欲序列的第一基因之序列的SSI宿主細胞，其可容許另一由重組酶介導之卡匣交換以將另一編碼所欲序列之基因(即取代編碼所欲序列之第二基因的編碼所欲序列之第三基因，較佳地，選擇標記基因)放置在該“熱點”上。因此，目前取得之SSI宿主細胞可用來使另一由重組酶介導之卡匣交換生效，以將編碼所欲序列之第三基因置入宿主細胞基因組中被鑑定出之“熱點”中。
在本發明的背景下，術語“匹配之重組靶的位置”意指該交換卡匣之重組靶的位置的第一位置與另一交換卡匣之第一重組靶的位置完全相同，而該首先提及之交換卡匣的第二重組靶的位置與另一交換卡匣之第二重組靶的位置完 全相同，從而使該重組靶的位置之間的核苷酸序列可以交換。較佳地，兩個交換卡匣之第一重組靶的位置與兩個交換卡匣之第二重組靶的位置不同。
於一較佳實施例中，本發明關於用於製造編碼所欲序列之基因的產物之方法，其包含下列步驟：i)以包含至少一個第三交換卡匣之載體轉染根據本發明之SSI宿主細胞，該第三交換卡匣包含至少兩個匹配之重組靶的位置，此兩個重組靶的位置位於至少一個編碼所欲序列及至少一個選擇標記之第三基因的二側，ii)使由定點重組介導之卡匣交換生效，從而取得包含該編碼所欲序列之第三基因的SSI宿主細胞，iii)令在步驟ii)中取得之SSI宿主細胞表現該編碼所欲序列之第三基因，及iv)回收該編碼所欲序列之第三基因的產物。
本發明之一種主要優點為提供固有之製造穩定性，此穩定性從步驟b)中產生之SSI宿主細胞(其在鑑定之“熱點”中包含編碼所欲序列的第一基因，即，Fer1L4基因)傳承到包含編碼所欲序列的第三基因之SSI宿主細胞。此種穩定性與選擇無關且允許歸結出該在步驟a)和b)中鑑定之“熱點”為與“熱點”或基因組其他地方之序列相關的特性。於根據隨機載體整合之細胞株構建中，這是非常罕見之事件且找到這類位置之前需耗費巨大的努力。因此，本發明允許排除用於選擇合適之細胞株之延長的穩定性研究，使整體發展週期縮短及資源減少。此外，本發明容許在由重組介導之卡匣交換後不經選擇地培養細胞，這意味 著該製造過程可能更為監管機構接受。有利的是，本“Fer1L4熱點”係使用mAb，較佳為不使用螢光標記來定義和鑑定。
本發明提供製造SSI宿主細胞之方法，在該SSI宿主細胞中係藉由靶向整合(targeted integration)將外源性核苷酸序列引入細胞中之內源性Fer1L4基因中。用於將核苷酸序列引導進入基因組中之所欲指定位置的各式方法中之任一種均可以採用，包括同源重組及由核酸酶介導之方法，例如使用由細小病毒介導之同源重組、使用鋅指核酸酶、類轉錄活化因子效應子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease)或經遺傳工程處理之大範圍核酸酶(meganuclease)(見，例如Russell and Hirata,Nat.Med.18(4)：325-30,1998；美國專利出版物第20120070890號；美國專利出版物第6,528,313號；美國專利出版物第20090258363號)。藉由這類方法引入之外源性核苷酸序列可包括本文所描述之任何特性。例如，內源性核苷酸序列可包括至少一個編碼所欲序列之基因和/或至少兩個重組靶的位置。於一些實施例中，該編碼所欲序列之基因包含至少一個選擇標記基因。
於進一步之實施例中，本發明關於製造SSI宿主細胞之方法，該方法包含將外源性核苷酸序列引入細胞中之內源性Fer1L4基因。較佳地，該外源性核苷酸序列係藉由Fer1L4基因與多核苷酸之間的同源重組被引入，其中該多核苷酸包含a)與Fer1L4基因之第一部分同源的第一核 苷酸序列，b)該外源性核苷酸序列，及c)與Fer1L4基因之第二部分同源的第二核苷酸序列。較佳地，於此進一步之實施例中係使用病毒載體(例如介導同源重組之與腺相關病毒載體)或外源性核酸酶(例如鋅指核酸酶、類轉錄活化因子效應子核酸酶或經遺傳工程處理之大範圍核酸酶)來協助引入該外源性核苷酸序列。特佳地，使用腺相關病毒載體。於特佳之實施例中，該外源性核苷酸序列二側鄰接重組靶的位置，較佳為loxP位置。
於觀點A中，本發明亦關於包含以下步驟之用於製造SSI宿主細胞之方法：a)提供包含內源性Fer1L4基因之細胞，其中一內源性核苷酸序列被整合在該Fer1L4基因中，且其中該內源性核苷酸序列包含至少兩個位在至少一個編碼所欲序列之第一基因二側的重組靶的位置；接著，b)以包含第一交換卡匣之載體轉染步驟a)中所提供之細胞，該卡匣包含至少兩個匹配之重組靶的位置，此兩個重組靶的位置位於至少一個編碼所欲序列之第二基因(即，選擇標記基因)的二側，接著，c)使由定點重組介導之卡匣交換生效，及接著，d)選擇表現出編碼所欲序列之第二基因(較佳地，選擇標記基因)的經轉染之細胞，從而取得包含第一交換卡匣之SSI宿主細胞，其中該第一交換卡匣被穩定地整合在該SSI宿主細胞之基因組中。
本發明亦關於包含以下步驟之用於製造SSI宿主細胞之方法：a)提供包含內源性Fer1L4基因之細胞，其中係 將一外源性核苷酸序列整合在該Fer1L4基因中，且其中該外源性核苷酸序列包含至少兩個位於至少一個編碼所欲序列之第一基因二側的重組靶的位置；接著，b)以包含第一交換卡匣之載體轉染步驟a)中所提供之細胞，該卡匣包含至少兩個匹配之重組靶的位置，此兩個重組靶的位置位於至少一個編碼所欲序列之第二基因(即，選擇標記基因)的二側，接著c)使由定點重組介導之卡匣交換生效，及接著，d)選擇表現出編碼所欲序列之第二基因(較佳地，該選擇標記基因)的經轉染之細胞，從而取得包含被穩定地整合在該SSI宿主細胞基因組中之第一交換卡匣的SSI宿主細胞。
本發明亦關於進一步包含下列步驟之上述鑑定的觀點A之方法：i)以包含至少一個第二交換卡匣之載體轉染該SSI宿主細胞，該卡匣包含至少兩個匹配之重組靶的位置，此兩個重組靶的位置位於至少一個編碼所欲序列及至少一個選擇標記之第三基因的二側，ii)使由定點重組介導之卡匣交換生效，從而取得包含該編碼所欲序列之第三基因的SSI宿主細胞，iii)令在步驟ii)中取得之SSI宿主細胞表現該編碼所欲序列之第三基因，及iv)回收該編碼所欲序列之第三基因的產物。
本發明亦提供包含內源性Fer1L4基因(較佳為CHO Fer1L4基因)之細胞(較佳為CHO細胞)於製造穩定且具高轉錄活性之細胞株的用途。
在更詳細地描述本發明之前，須理解的是，本發明不 限於所描述之特定實施例，因為這類實施例可能，當然地，會發生變化。亦須理解的是，本文所使用之術語僅用於描述特定之實施例，而不欲限制本發明的範圍，因為本發明的範圍將僅受限於所附之申請專利範圍。
除非另有定義，本文所使用之所有技術和科學術語之含義與本發明所屬之技藝中之一般技術人士所通常理解者相同的。雖然可以使用與本文所描述者類似或同等之任何方法和材料來實施或測試本發明，一些可能及較佳之方法和材料現在說明於本文中。本文所提及之所有出版物均以引用方式被納入本文中以揭露和描述與引用之出版物有關的方法和/或材料。可理解的是，在有矛盾之範圍內，本揭露內容取代所納入之出版物的任何揭露內容。
必須指出的是，除非上下文另外清楚地規定，本文及所附之申請專利範圍中所使用之單數型“一(a、an)”及“該”包括複數對象。因此，例如，對“一個細胞”之引用包括數個這類細胞，且對“該載體”之引用包括一或多個載體及熟習本技藝之人士已知之其同等物，等之引用。
本文所討論之出版物僅提供其在本申請案提交日之前的揭露內容。本文中之任何內容均不能被解釋為承認本發明無權憑藉先前之發明享有早於這類出版物之權利。此外，提供之出版日期可能與實際的出版日期有所不同，這可能需要被獨立確認。
進一步之較佳實施例為從屬申請專利範圍之標的物。
SEQ ID No.1至3代表本發明所使用之載體的核苷酸 序列，SEQ ID No.4至6代表本發明所使用之引子，SEQ ID No.7和8代表Fer1L4 CHO基因之3’端序列，SEQ ID No.9代表Fer1L4 CHO基因之5’端序列，且SEQ ID No.10和11代表本發明所使用之其他引子。
本發明將藉由實例及附圖進行進一步之描述。
第1圖顯示用於鑑定CHOK1SV中之“熱點”的載體pRY17(SEQ ID No.1)。LC1及HC1為嵌合單株IgG4抗體cB72.3之輕鏈和重鏈。hCMV係指hCMV-MIE早期基因啟動子，其中“Int”表示其第一內含子，內含子A及編碼5’UTR之側翼外顯子分別以“Ex1”和“Ex2”表示。野生型和F5突變型FRT位置分別被標示為F和F5。多聚腺苷酸化、SV40早期啟動子及β-內醯胺酶序列分別以pA，SV40及bla表示。GS代表麩醯胺合成酶cDNA且Hyg(-ATG)代表缺乏起始甲硫胺酸密碼子和啟動子之潮黴素磷酸轉移酶基因。
第2圖顯示用於創建SSI宿主細胞10E9之“中間”載體，pRY37(SEQ ID No.2)。此載體包含位在含有胸腺嘧啶激酶(TK)和嘌呤黴素乙醯轉移酶(PAC)基因之轉錄單位二側之突變型FRT(F5)及野生型FRT位置(F)。每一轉錄單位中之轉錄作用係由SV40早期啟動 子(SV40E)驅動。將載體pRY37與編碼FLP重組酶之載體pOG44(Invitrogen公司)共同轉染入11A7細胞中。在含有嘌呤黴素之培養基的存在下選擇細胞株，並進一步在包埋在11A7基因組中之pRY37 FRT序列與pRY17之相等序列之間篩選RMCE(見第3圖)。在篩選和選殖之後，分離出細胞株10E9(“SSI宿主細胞”)，其中該cB72.3mAb轉錄單位已與TK和PAC交換。
第3圖顯示用於在SSI宿主細胞10E9中創建mAb製造細胞株的靶向載體(targeting vector)。此載體，pRY21(SEQ ID No.3)含有二側鄰接突變型(F5)和野生型FRT位置之包含Myo mAb基因的轉錄單位(HC2和LC2)。該野生型FRT位置之5’端已添加框內起始甲硫胺酸密碼子(ATG+F)且此上游為SV40早期啟動子(SV)。HC2和LC2基因之轉錄作用係由hCMV主要即刻早期基因1之啟動子(hCMV-MIE)及其第一內含子，內含子A(Int A)及編碼5’UTR之側翼外顯子(分別以“Ex1”和“Ex2”表示)驅動。β-內醯胺酶基因係以bla表示。
第4圖顯示從11A7細胞株產生SSI宿主細胞10E9之過程。此示意圖顯示在細胞株11A7中含有二側鄰接突變型F5和野生型FRT位置之mAb cB72.3轉錄單位(HC1和LC1)的經線性基因組整合之pRY17的單一複本。轉染前，以Pvu I從β-內醯胺酶基因(bla)中間切開載體pRY17，於是該線性載體二側鄰接該基因之5’(bla L)和 3’(bla R)部分。將載體pRY37與編碼FLP重組酶之質粒共同轉染入細胞株11A7中，而重組(以交叉記號指示)發生在導致具有胸腺嘧啶激酶(TK)之mAb轉錄單位和嘌呤黴素乙醯轉移酶(PAC)轉錄單位(其各由SV40早期啟動子(SV)驅動)之RMCE的類似位置之間。
第5圖顯示出從SSI宿主，10E9產生mAb製造細胞株的過程。靶向載體，pRY21(第3圖，SEQ ID No.3)含有用於第二(Myo)mAb之轉錄單位(HC2及LC2)，該轉錄單位上游側翼鄰接突變型FLP位置(F5)且下游側翼鄰接本身為野生型FRT位置上游之SV40早期啟動子(SV)，該野生型FRT位置在框內連接甲硫胺酸起始密碼子(ATG-F))。在FIp重組酶及靶向載體pRY21之存在下，胸腺嘧啶激酶(TK)及嘌呤黴素乙醯轉移酶(PAC)基因和相關的啟動子藉由RMCE被新Myo mAb抗體轉錄單位所取代。因此，創建該野生型FRT位置和潮黴素基因之功能性融合基因(ATG-F-Lnk-Hyg)。因此，可在潮黴素和更昔洛韋之存在下選擇其中已發生特異性RMCE的細胞。
第6圖顯示出SSI池之抗體表現和從隨機過程或經FLP輔助之定點整合(SSI)衍生之選殖細胞株之抗體表現的比較。使用與第1階段中用於產生細胞株11A7之過程完全相同的過程來產生隨機整合選殖株。在如方法部分中具體指明之不同的轉染和選擇條件下產生SSI池(SSI 第1輪)和選殖細胞株(SSI第2輪和SSI第3輪)。在SSI第3輪、4輪方面，採用不同的選擇條件；200微克/毫升，無MSX(●)、200微克/毫升潮黴素，加MSX(◆)、400微克/毫升潮黴素，無MSX(▲)或400微克/毫升潮黴素，加MSX(▼)。將從所有過程產生之選殖細胞株在搖瓶中擴大。在7天終端批次搖瓶中評估選殖細胞株之生產力(見方法)。
第7圖顯示在支架1492aka.JH000254.1(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JH000254)之負股上的Fer1L4基因之外顯子結構。5’和3’整合位置之所在已指明(分別為1750049和1760965)。
第8圖顯示使用BWA而對映到pRY17-GA-Q之10E9測序讀值(reads)的映像。透過檢查該映像，發現多個對映在HC片段(其具有從完整之HC的5’端刪除之214bp)之5’端的不成對測序讀值(黑色箭頭)。
第9圖顯示在SSI宿主細胞10E9之Fer1L4基因中的停機坪(landing pad)之結構。(A)停機坪之WGRS覆蓋係以疊加在“單複本”模型之上方顯示，而下方顯示出更詳細之圖式。(B)南方點墨數據提示可能有兩個停機坪複本。以Bmg1或Pml1限制酶分解來自10E9細胞之基因組DNA並藉由南方點墨分析。將南方點墨與TK探針雜交，透露出跨越停機坪之兩個複本(顯示出對映'兩個複本'模型)的兩個片段。該'兩個複本'模式與WGRS數據相一致。
第10圖顯示10E9(SSI宿主細胞)與RMCE細胞株(表現所欲之基因)之整合位置的示意圖。基因組所在處係以在無定所CHO-K1支架1492支架(登錄編號JH000254.1，與NW_003613833.1完全相同)上之垂直虛線及核苷酸坐標指示。Fer1L4基因以箭頭說明，而基因組片段以一條實線表示。中斷的虛線代表非常大的距離。5’和3’側翼序列分別藉由白色和黑色指針表示。
第11圖顯示對映之全基因組重測序讀值在經整合之載體的一個複本模型上的覆蓋圖。灰度圖表的高度等於在未經過平滑處理之每個基點的覆蓋度(在每個RMCE生成細胞株方面的顯示，1-4)。所有細胞株中之側翼區的覆蓋大約相同。然而，圖形上方之兩個高生產者的覆蓋度為底部兩個低生產者之覆蓋度的約1.4至2.3倍。wFRT特性係用星號表示，而mFRT特性係以黑色圓圈描繪。(其他特性之指示如下：有214bp缺失之HC為創建SSI宿主10E9後留存在熱點之剩餘cB72.3；BlaR為β-內醯胺酶基因之5’部分；Myo-LC和Myo-HC為抗肌肉生成抑制素(myostatin)mAb HC(重鏈)和LC(輕鏈)編碼序列，其居於RMCE後熱點；Hyg=潮黴素；BlaL為β-內醯胺酶基因之3’部分，而GS-cDNA為麩醯胺合成酶編碼序列型載體pRY17)。
第12圖顯示對映之RNA-seq測序讀值在經整合之載體之Myo LC和HC區上的覆蓋圖(在經RMCE產生之細胞株1-4方面)。該圖表之高度等於未經平滑處理之每個 基點的覆蓋度。
實例1： A)材料和方法 1.載體構建
所有載體序列均經完全測序合成。在基因合成前將嘌呤黴素乙醯基轉移酶(PAC)、潮黴素磷酸轉移酶(Hyg)及mAb基因全部進行基因優化且使其適應於灰倉鼠(Cricetulus griseus)之密碼子偏性。大部分pRY17(第1圖)係衍生自pCB72.3-GA-HC-LC(Kalwy et al.(2006),Mol Biotechnol.34.，第151至156頁)。存在於所有載體中之野生型FRT(F)之序列和突變F5 FRT(F5)重組序列均提供在Schlake和Bode中(Schlake and Bode,1994,Biochemistry 33：12746-12751)。模板序列(在具有或不具有基因優化之基因合成前依下述來源取得：F重組序列和連接子在載體pRY17中之框內融合物係自載體pFRT/lacZeo(Invitrogen公司)(第1圖)取得。甲硫胺酸起始密碼子與F重組序列在pRY21中之框內融合物係自pcDNAT5/FRT(Invitrogen公司)(第3圖)取得。在所有載體中，所使用之SV40早期啟動子(除了該衍生自pCB72.3-GA-HC-LC之與GS轉錄單位聯結者外)係從上述Invitrogen公司載體取得。pRY37中之胸腺嘧啶激酶(TK)和PAC基因序列係分別衍生自pWSTK6(gb： EU530625)和pPUR(Clontech公司，gb：U07648)。
2. 分批及饋料批式搖瓶分析
在分批搖瓶分析方面，將細胞以3×105存活細胞/毫升接種在125毫升搖瓶中之30毫升CD CHO中(該CD CHO中係輔以各種選擇作用劑(如稍後介紹者))並在37℃，140rpm下，培養在潮濕之5% CO2(在空氣中)(體積/體積)迴轉式震盪培養箱(orbital shaking incubator)中。在培養第7天收穫條件培養基並藉由蛋白A HPLC測定在條件培養基中之抗體濃度。
在饋料批式搖瓶分析方面，將細胞以3×105細胞/毫升接種在500毫升搖瓶中，每一搖瓶中含有100毫升之專利培養基，並將細胞在37℃，140rpm下，培養在潮濕之5% CO2(在空氣中)(體積/體積)迴轉式震盪培養箱中。從培養第3天開始由胺基酸和微量元素混合物組成的專利餵料餵予細胞。使用Vi-CELLTM自動化細胞存活力分析儀每日測定存活力及存活細胞濃度。在培養第6天開始藉由蛋白A HPLC測定在培養基中之抗體濃度直至在第14天收穫該抗體。
3.穩定性分析
每3至4天將細胞在125毫升搖瓶中之輔以不同選擇作用劑(如稍後介紹者)的30毫升CD CHO中交替進行繼代培養。在不同世代編號(1代相當於1次群體倍 增)，依上述設立倍增饋料批式搖瓶。依上述收集細胞濃度、存活力及mAb濃度測量值。若在70個世代的範圍內，細胞株之生產力變化>30%，則其被認為不穩定。
4. 用於單細胞選殖之流式細胞儀
在配備FACSDiva v6.0軟體，具有在488nm處發射之空冷式雷射的FACS Aria II細胞分選儀上進行單細胞選殖。FSC對SSC之散點圖中排除死亡細胞，且FSC寬度對面積之散點圖中排除雙峰。活細胞之分選閘門為該兩種散點圖之組合。
5. 產生SSI宿主細胞
使用FreeStyleTM MAX CHO系統(Invitrogen公司)，以無效(null)載體，pRY37(其包含編碼所欲序列之第二基因，即，該選擇標記基因)轉染母pRY17表現細胞株。為此，在為了RMCE之再轉染前24小時先將選定之經pRY17轉染的細胞株(11A7)以5×105個細胞/毫升之濃度接種在125毫升搖瓶中之FreeStyleTM CHO表現培養基中。轉染當天，根據製造商之操作指南，使用在125毫升搖瓶中之FreeStyleTM MAX作用劑，以33.75微克之pOG44質粒(Invitrogen公司，gb：X52327)和3.75微克之pRY37(9：1)共同轉染濃度為1×106細胞/毫升之約3×107個細胞。轉染後，將細胞平皿接種在含有專利限定化學成分培養基(其中係輔以25μM MSX及7微克/毫 升嘌呤黴素)之48孔板中。平皿接種後三週，在使用蛋白質A生物傳感器之ForteBio上對來自各個含有活細胞之孔中的培養基進行抗體製造之篩選。將來自不具有可檢測之抗體之細胞株的培養基置入含有輔以25μM MSX及1微克/毫升嘌呤黴素之CD CHO培養基的125毫升搖瓶中。
6. 產生衍生自10E9宿主之細胞株
將RMCE實驗分為3個不同'輪'，且此處及稍後在下文之結果部分中均有提及(輪之定義在第6圖中)。
在第1和2輪中，使用FreeStyleTM MAX CHO系統(Invitrogen公司)，以SSI靶向載體，pRY21轉染SSI宿主細胞10E9。為此，在為了RMCE之再轉染前24小時先將10E9 SSI宿主細胞以5×105個細胞/毫升之濃度接種在含有輔以25μM MSX及1微克/毫升嘌呤黴素之FreeStyleTM CHO表現培養基(Invitrogen公司)的125毫升搖瓶中。轉染當天，根據製造商之操作指南，使用在125毫升搖瓶中之FreeStyleTM MAX作用劑，以33.75微克之pOG44質粒(Invitrogen公司，gb：X52327)和3.75微克之pRY21(9：1)共同轉染濃度為1×106細胞/毫升之約3×107個細胞。轉染後，回收在含有30毫升輔以25μM MSX之FreeStyleTM CHO表現培養基(Invitrogen公司)的125毫升搖瓶中之細胞。RMCE後48小時，將來自第一輪之轉染株平皿接種在含有專利限定化學成分培養基 (其中係輔以25μM MSX、400微克/毫升嘌呤黴素(陽性選擇)及3μM更昔洛韋(ganciclovir)(陰性選擇))之48孔板中。四週後，在使用蛋白質A生物傳感器之ForteBio Octect上測定來自含有可視集中點之孔的培養基中之mAb濃度。將分泌mAb入培養基之細胞擴充並維持在含有輔以200微克/毫升潮黴素及25μM MSX之CD CHO培養基的搖瓶中。在分批搖瓶分析中進一步評估這些細胞池之抗體生產力(依稍早之描述)。在穩定性分析方面，從繼代培養移出MSX以適於第6圖中具體指出之條件。
在搖瓶中恢復48小時後，將第2輪之轉染株以5×105個細胞/毫升之濃度接種在含有輔以400微克/毫升潮黴素(陽性選擇)之CD CHO培養基的125毫升搖瓶中。接著，5天後添加3μM更昔洛韋以作為陰性選擇。將細胞每3-4天在相同搖瓶中之相同培養基中連續傳代3週。使用FACS AriaII將存活之細胞經單細胞選殖方式選殖入含有專利限定化學成分培養基(其中係輔以400微克/毫升嘌呤黴及3μM更昔洛韋)之96孔板中。三週後，在使用蛋白質A生物傳感器之ForteBio Octect上測定來自含有可視之細胞生長之孔的培養基中的mAb濃度。將分泌mAb入培養基之選殖株擴充並維持在含有輔以200微克/毫升潮黴素及25μM MSX之CD CHO培養基的搖瓶中。在分批搖瓶分析(依稍早之描述)中進一步評估這些選殖株之抗體生產力。在穩定性分析方面，從繼代培養移出MSX 以適於第6圖中具體指定之條件。
在第3輪轉染方面，在900μF，300V下，藉由電穿孔以45微克pOG44質粒(Invitrogen公司，gb：X52327)和5微克pRY21共同轉染1×107 10E9 SSI宿主細胞。轉染後，將細胞接種在含有20毫升專利限定化學成分培養基之T-75燒瓶中。48小時後，將200或400微克/毫升之潮黴素加入培養基中，6天後再加入3μM更昔洛韋。在一些情況中(如第6圖之圖例中的說明)，將25μM MSX隨潮黴素選擇一起加入。在所有測試之轉染條件方面，將細胞在這些條件下進行選擇3週。在此期間，每隔3-4天以含有陽性及陰性選擇藥物之新鮮培養基更換在T-75燒瓶中之條件培養基。一旦存活率達到>=90%時，使用FACS AriaII將細胞經單細胞選殖方式選殖入含有稍早描述之專相同利限定化學成分培養基的96孔板中，該培養基中係輔以200或400微克/毫升潮黴素，加有或不加有25μM MSX(如第6圖之圖例中的說明)。在使用蛋白質A生物傳感器之ForteBio Octect上測定從含有生長中之可視細胞的孔收集的條件培養基中之抗體濃度。將選定之選殖細胞株擴充並在含有輔以200微克/毫升潮黴素及25μM MSX之CD CHO培養基的125毫升搖瓶中進行繼代培養。在分批搖瓶分析中進一步評估這些選殖株之抗體生產力(依稍早之描述)。在穩定性分析方面，從繼代培養移出潮黴素及MSX以適於第6圖之圖例中具體指出之條件。
7.數據分析
使用Renard等人所描述之方法(Renard et al.1988,Biotechnology Letters 10：91-96)計算生長曲線下面積之時間積分(活細胞濃度之時間積分(IVC)；106細胞天/毫升)。
其中Xv0=第一樣本之活細胞濃度(106/毫升)，Xv1=第二樣本之活細胞濃度(106/毫升)，t0=第一樣本之經過時間(天)，t1=第一樣本之經過時間(天)。
8. DNA步移
根據製造商之操作指南，使用Seegene DNA Walking SpeedUpTM套組II來提供3’基因組側翼序列數據。使用β內醯胺(bla)基因特異性引子，其特異於GS-CHOK1SV細胞株11A7中之經線性整合之pRY17載體圖式的3’臂中之bla(bla R，第3圖)、TSP1fwd(SEQ ID No.4)、TSP2fwd(SEQ ID No.5)及TSP3fwd(Seq ID No.6)。
9. 10E9宿主細胞之基因組測序
將10E9基因組DNA片段化並根據製造商之操作指南，使用TrueSeq DNA樣本製備套組製備適合用於HiSeq 平台測序之成雙末端文庫(paired-end library)。產生之文庫係在預期之300bp至500bp大小範圍內。使用Agilent 2100生物分析儀進行之所產生之文庫的QC分析指出該文庫具有可接受之品質，含有用於後續樣本處理之預期片段大小和產量。根據製造商之操作指南，在cBot系統中使用所產生之文庫來產生集群。在Hi-Seq 2000上使用2×100鹼基對成雙末端測序法決定含有擴增之集群的流動細胞之序列。使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)(Li H.and Durbin R.2009 25：1754-1760)將測序讀值)對映到CHO-K1毗連序列群(contig)(Xu X et al.2011,Nature Biotechnol.29：735-742)。
B)結果 第I階段：產生母mAb表現細胞株
第I階段之目標為產生高產量表現之mAb的GS-CHOK1SV細胞株，其顯現出良好之生長特性，具有穩定之生產力，僅含有單一整合基因位點及在此基因位點之載體整合體的最低可能數。設計一種編碼嵌合mAb，cB72.3(Whittle et al.1987,Protein Eng 1：499-505)之改良的Lonza GS '雙基因載體'，pRY17(第1圖)。在pRY17中，該48bp野生型F及突變型F5重組序列位在該mAb之HC和LC轉錄單位的二側。F5和F重組序列雖然功能上相等，其顯示出最小交叉重組活性，因此可允許由FLP重組酶催化之有效且定向的RMCE(Schlake and Bode, 1994,Biochemistry 33：12746-12751)。衍生自pRY17轉染之初始GS-CHOK1SV細胞株不會有效地轉錄或轉譯該潮黴素抗性基因，因為此雜交基因之尾上游沒有起動子甲硫胺酸密碼子或啟動子。
重要的是，載體衍生之GS基因被置於交換卡匣外面，如此其可在RMCE後被保留在所產生之細胞株的基因組中。藉由如此做可避免任何衍生細胞株中的任何潛在之麩醯胺代謝擾動；在內源性和載體衍生之麩醯胺合成酶二者的表現下，在不含麩醯胺的培養基及50μM甲硫胺酸亞碸亞胺(MSX)中選擇母GS-CHOK1SV細胞株。不含啟動子及轉譯起始甲硫胺酸缺失(-ATG)之潮黴素B磷酸轉移酶基因被置於編碼連接子(Lnk)之序列與F重組序列之間(第1圖)。在本研究之二個階段中所使用之用於RMCE的載體含有表現潮黴素抗性所須有之SV40早期啟動子和起始甲硫胺酸(ATG)。全功能潮黴素抗性基因僅在基因組中之野生型F重組序列發生重組時創建(第1圖)。
藉由習知之細胞株發展程序將含有FRT重組序列之pRY17載體引入CHOK1SV細胞中，接著在該過程之關鍵階段進行加强篩選，以確保我們分離出具有最佳之生長和生產力組合的細胞株。此外，衍生自所選擇之細胞株的cB72.3蛋白必須顯示出與衍生自先前之GS-CHOK1SV細胞株之製品相似的產物品質特徵(Birch and Racher,2006,Adv Drug Deliv Rev 58：671-685)。來自候選細胞株之 HC和LC基因複本數較佳為接近每一種一個。為此，進行三次獨立的電穿孔，各使用50微克線性化pRY17及1×107 CHOK1SV細胞。在含有50μM MSX之培養基中選擇來自全部三次電穿孔之轉染株，並在轉染後3週篩選~1500個存活細胞池以用於製造抗體。最後，藉由7天分批搖瓶共評估79個選殖株並測定全部79個選殖株之cB72.3mAb濃度。除非另有說明，將所有RMCE衍生之細胞株保持在含有25μM MSX之培養基中。從評估之79個選殖株中選擇38個選殖株以供在饋料批式搖瓶培養中作進一步分析。基於生產力及生長特性選出前6名表現最佳之選殖株(表1)以用於決定遺傳特徵(見方法)。
為了研究CKOK1SV基因組中之pRY17的整合位置，從6個選殖株製備中期染色體，並以經DIG標示之pRY17(數據未示出)探測。選殖株1G11、6B5、8F10、14D11及11A7均顯示出在個別染色體之端粒區僅有一個整合位點。另一方面，選殖株18C11似乎具有兩個不同的 整合位置，因此未被選中作進一步研究。為了確定在每個細胞株中的基因複本數，從生長活躍之細胞製備經超音波處理之基因組DNA。在qPCR分析方面，包含GAPDH以作為內源性對照組，將pRY17'摻入'宿主細胞DNA中以作為陽性對照組。計算每個細胞中HC和LC之基因複本數以作為平均複本對平均GAPDH複本之比值。如表2中所示，在5個分析之選殖株中，11A7具有最低之HC和LC基因複本數。基因組DNA之南方點墨(Southern blot)分析透露在所有5個選殖株中均可檢測到HC和LC二者且這些帶之強度反映經qPCR測定之基因複本數(數據未顯示)。
在5個選出之進入本穩定性研究的選殖株(表3)中，11A7在7個月(220個世代)內保持類似之生產力，而其他選殖株顯示出在研究前3個月之間(80個世代)逐漸喪失生產力。加總在一起，11A7不僅具有生長良好和生產力變化形廓的最佳組合之一，亦在以單一整合位置具有最少之基因複本數。重要的是，就生產力來說， 11A7為這6個中最穩定的選殖株。最重要的是，產物品質在220個世代後仍然相仿。11A7被選擇作為RMCE第一輪之母選殖株：第II階段。
第II階段-產生SSI宿主細胞
雖然設計能將11A7中之原始mAb轉錄單位與新mAb轉錄單位交換之靶向載體是完全可能的，較佳地，該原始mAb轉錄單位被完全從基因組中切除。為此，設計不編碼mAb基因之額外無效(null)靶向載體，pRY37(第2圖)。取而代之的，該載體編碼陽性和陰性選擇標記，分別為嘌呤黴素乙醯基轉移酶(PAC)及胸腺嘧啶激酶(TK)，且其二側鄰接與pRY17同向之F和F5重組序列(第1圖)。RMCE後，這些標記預計可取代在原始11A7基因組中之相同基因位點中的原始cB72.3mAb。選擇經歷RMCE之具pRY37的細胞株時需要PAC。TK將前藥更昔洛韋轉換成毒性，磷酸化之核苷酸類似物(Wood and Crumpacker，1996，New England Journal of Medicine 335，第721至729頁)。這對稍後在第III階段中應用陰性選擇非常重要：更昔洛韋選擇經由殺死那些未經歷正統RMCE之細胞來豐富已經歷正統RMCE之細胞的RMCE池。
在mAb表現呈陰性之存活細胞株池中選擇一個細胞株，136-A4來藉由南方點墨分析(數據未顯示出)進一步決定其特徵。其證實136-A4基因組中存有TK。限制酶圖諎製圖(restriction mapping)指出“熱點”中僅存有兩個pRY37複本，此藉由隨後之子代選殖株10E9之基因組測序獲得確認。複本數大幅低於在11A7中發現之pRY17(表2)。為了取得同源SSI宿主，我們使用FACS Aria II進行136-A4之單細胞選殖，並取得26種選殖衍生物之生長變化形廓。從這些中選出具有最佳生長變化形廓之兩種選殖衍生物，10E9和8C8來藉由北方點墨分析進一步決定其特徵。來自這些子代選殖株之RNA的北方點墨分析確認不存有cB72.3 HC和LC mRNA(數據未顯示)。總結，這些結果顯示出10E9為適合用於第III階段測試之RMCE的候選宿主細胞株。
第III階段-以Myo mAb靶向載體進行RMCE
為了證明新SSI宿主細胞株10E9之用途，設計靶向載體，pRY21(第3圖)。此載體含有用於Myo mAb之HC和LC基因，其二側鄰接與pRY17(第I階段)和pRY37(第II階段)載體內所發現者同方向之F和F5重組序列。其亦包含在框內融合至F重組序列(ATG+F)之在甲硫胺酸起始密碼子上游的SV40早期啟動子(SV40E)。當合理RMCE發生時，ATG+F與無啟動子及轉譯起始甲硫胺酸缺失(-ATG)之潮黴素B磷酸轉移酶基因被放置在框內。以pRY21和pOG44共同轉染10E9細胞三輪。在前兩輪中，以FreestyleTMMAX CHO系統轉染細胞，而在第3輪中係藉由電穿孔進行細胞轉染。此外，以更昔洛韋和潮黴素共同選擇第1輪之細胞來作為細胞池；接著，先使用400微克/毫升潮黴素，再使用更昔洛韋選擇第2輪之細胞來作為細胞池，然後，接著使用FACS Aria II進行單細胞選殖；接著，先使用200或400 微克/毫升潮黴素，再使用更昔洛韋來依序選擇第3輪之細胞來作為細胞池，然後，接著使用FACS Aria II進行單細胞選殖(第6圖)。在第3輪中，在兩種測試條件下，培養基中不含MSX。
從在第1輪中之不同池取得之生產力數據類似，這提示每個池之細胞株成員可能具有類似之生產力。來自池之生產力範圍較來自隨機整合過程之選殖或非選殖細胞株窄得多(第6圖)。當比較在不同選擇條件下從第2和第3輪分離出之選殖細胞株時，其顯示出與選自具有MSX之組相比較，最高產量之選殖細胞株存在於選自不含MSX之組中。在生長在不含MSX中的細胞株中，以選擇性培養基中之不同濃度的潮黴素取得之生產力似乎有所差異，此差異在培養基中存有MSX時並不明顯。
首先，在第一階段中分離出一種可保持穩定達220個世代之非常穩定的GS-CHOK1V細胞株，11A7。此穩定性特徵可在第三階段中藉由RMCE產生之衍生細胞株中傳承。因此，在一個延伸之穩定性研究中，在兩種不同的條件下評估來自第三階段之第1輪中的三個細胞池(表4)。
不論條件，所有3種測試之細胞池均符合穩定細胞株的標準。進一步在相同類型之穩定性研究中測試全部共12個選殖細胞株(第2和第3輪各6個)(分別在表5和表6中)。結果發現，所有12個選殖細胞株均保留選擇之穩定特質。有趣的是，6個來自第3輪之選殖細胞株(表4)即使没有任何選擇作用劑存在時仍保持穩定。這對製造生物製藥有著深遠的影響。
位於“熱點”二側之基因組序列之表徵 3’側翼序列
使用衍生自從bla R(第3圖)之Seegene DNA步移的500bp 3’側翼序列(SEQ ID No.7)進行blast搜尋CHO-K1基因組測序計劃的毗連序列群(其可在NCBI數據庫中公開取得)(Xu X et al.2011,Nature Biotechnol.29：735-742)。在負股之1760466-1760965上找到位於無定所基因組支架，支架1492(登錄編號JH000254.1，與NW_003613833.1完全相同)上之獨特區域。根據10E9測序讀值對支架1492之高覆蓋映像(數據未顯示)將500bp序列(SEQ ID No.7)延長成2000bp(SEQ ID No.8)。
使用藉由Seegene DNA步移(見方法)鑑定之3’側翼序列進行blast搜尋CHO-K1基因組測序計劃的毗連序列群(其可在NCBI數據庫中公開取得)(Xu X et al.2011,Nature Biotechnol.29：735-742)。使用此數據及自10E9 SSI宿主細胞株取得之Illumina HiSeq基因組序列數據可找出位於無定所基因組支架，支架1492(登錄編號JH000254.1，與NW_003613833.1完全相同)上之獨特區域。這被發現係位於負股上之支架1492中之預測的Fer1L4(fer-1狀4)基因(NCBI基因ID：100755848)內(支架1492核苷酸編號1,746,191至1,781,992；共有35,802個核苷酸)。5’端側翼序列似乎係位於外顯子39和40之間，而3’側翼序列似乎係位於外顯子28和29之 間(見第7圖)。
5’側翼序列
使用Burrows-Wheeler定位儀(BWA)將來自10E9基因組DNA之Illumina測序讀值對映到pRY17(SEQ ID No.1)。透過檢查該映像，結果發現多個不成對之測序讀值(第8圖中之黑色箭頭)對映到cB72.3 HC之3’部分的5’端。此分析提示至少有一個cB72.3 HC之片段(從5’端缺失214bp)保持在10E9“熱點”中。北方點墨分析(數據未顯示)顯示出10E9細胞中没有cB72.3 LC或HC mRNA，這提示該cB72.3中之經截斷之HC為非功能性。然後，使用相等之配對測序讀值進行blast搜尋CHO-K1基因組測序計劃的毗連序列群(Xu X et al.2011,Nature Biotechnol.29：735-742)。其全部均比對在無定所基因組支架，支架1492(登錄編號JH000254.1，與NW_003613833.1完全相同)上之相同位置(1750048-1750183)。這允許5’側翼序列延長到最長之822bp(SEQ ID No.9)。
實例2： A)材料和方法 1. 南方點墨
在37℃下，以限制性核酸內切酶分解從每個選殖株之第2和4代分離出並使用5-10微克來自QIAGEN公司 之Blood &Cell Culture DNA Maxi套組(Qiagen公司)純化的基因組DNA 15小時。以等體積之酚：氯仿：異戊醇混合物，pH值8.0(1：1體積/體積)萃取經分解之DNA兩次，再以單獨之氯仿萃取並經乙醇沉澱，接著在0.7%(重量/體積)瓊脂糖凝膠上，在0.5xTBE(50×TBE：Lonza)或1×TAE(40mM Tris，pH值7.7，2.5mM EDTA)緩衝液中電泳。基本上根據製造商之操作指南(Appligene，Pharmacia)，使用真空抽濾裝置將凝膠轉移到Hybond-N膜(Amersham)上。將Hybond-N膜經UV固定，在含有從50×儲存液製備之5×Denhardt氏溶液(Sigma公司)、6×SSC(1×SSC：0.15M氯化鈉，15mM檸檬酸鈉)及10%(重量/體積)SDS的雜交緩衝液或單獨之Rapid-hyb緩衝液(GE healthcare)中預雜交。
在PCR反應中使用以下之引子組產生TK探針：TK-正向：5’-AGATCACCATGGGCATGCCTTAC-3’(SEQ ID No.10)；TK-反向：5’AACACGTTGTACAGGTCGCCGTT-3’(SEQ ID No.11)；使用載體pRY37作為用於產生探針之PCR的模板且該循環條件為：15奈克模板/50微升反應物；Taq DNA聚合酶(Roche公司)；94℃下2分鐘，30個循環之94℃下30秒，55℃下1分鐘及72℃下30秒，最後在72℃下延長7分鐘。使用Megaprime套組，以[γ-32P]dCTP (111TBq/毫莫耳，Perkin Elmer公司)標示25奈克之PCR產物並在缺口轉譯柱(Amersham)上純化。在65℃下，在相同之預雜交緩衝液中進行雜交2-20小時。雜交後，清洗膜，達到最終嚴格性為0.1×SSC、0.1%(重量/體積)SDS，65℃。使點墨暴露於儲存螢光屏(Bio-Rad公司)；使用個人分子成像儀(PMI)系統(Bio-Rad公司)為暴露之屏幕造像。
2.對映和序列比對
FASTQ格式之雙末端(paired-end)測序讀值為用於對映到基因組模板的輸入數據。編入載體序列和CHOK1SV裝配之索引以作為欲對映之模板。使用用於非常快速之局部比對，具預設參數(-D 5-R 1-N 0-L 25-i S，1,2.00)之Bowtie2，將雙末端測序讀值與模板進行序列比對(Langmead B,& Salzberg SL,2012,Nature methods,9(4),357-9)。當<原始覆蓋>*500M/<測序讀值之數目>時，將覆蓋正常化，以在不同的樣本之間比較。
3. 鑑定整合位置
使用Illumina Hi-SEQ 2000在平均覆蓋度40X下為10E9 SSI宿主菌株之2×100雙末端測序讀值測序。將序列之測序讀值對映到載體pRY17(此為第一個整合入CHOK1SV基因組之載體)。覆蓋整合位置之測序讀值被稱為嵌合測序讀值，因為它們含有同時對映於CHOK1SV 基因組且亦對映於經整合之載體序列的序列。因為對映係藉由局部序列比對進行，該嵌合測序讀值所具有之特徵與帶有突出尾端之載體序列(其可對映到基因組序列)部分匹配。除了該嵌合測序讀值外，還有其他測序讀值，其中雙末端測序讀值之一端完全對映載體序列且另一端對映到基因組序列。這些測序讀值對被稱為不一致測序讀值對。 收集突出尾端序列及來自不一致測序讀值對之未對映的測序讀值並用於對CHOK1SV基因組裝配進行搜尋(此係使用blast搜尋)，以根據序列相似性鑑定整合位置之側翼序列。
4.停機坪(landing pad)
停機坪(被引入熱點之外源性序列，其包含用於藉由RMCE整合所欲基因之表現卡匣的重組位置)之結構係基於10E9細胞株之南方點墨分析及全基因組再測序(WGRS)分析數據(第9圖)。使用與用於對映整合位置之相同算法來將自10E9衍生之測序讀值對映至該載體序列。嵌合測序讀值亦可在複製、缺失或***位置處觀察到。根據密切調查出現嵌合測序讀值之位置來校正假定之停機坪序列。
5. 量化RNA-seq分析
使用衍生自全基因組再測序之停機坪的`單複本'模型(見上文)構建用於對映測序讀值之模板。使用預設參 數，藉由BWA將RNA-seq測序讀值對映於模板。藉由下列公式將LC和HC上之測序讀值計數對RPKM測量值，測序讀值/每千鹼基轉錄體/每百萬對映之測序讀值標準化：
使用bedtools，依下列指令bedtools cover-age-abam<bam file>-b<intervals in bed>取得每一間隔之與外顯子重疊的測序讀值數目(Quinlan AR and Hall IM,2010,Bioinformat-ics.26,6,pp.841-842)。
B)結果 10E9 SSI宿主細胞中之停機坪的結構
從預期之RMCE事件(在使用無效(null)靶向載體pRY37從11A7創建細胞株10E9之期間發生)推斷在Fer1L4熱點內之停機坪的結構模型(第4圖)。此模式被稱為'單複本'模型且與來自細胞株10E9之WGRS數據一致(第9A圖)。然而，南方點墨數據提示該模型實際上應該包含兩個複本(第9B圖)。此'兩個複本'模型在數據的基礎上細修並用來協助解釋在10E9宿主中藉由RMCE衍生之mAb製造細胞株。該'兩個複本'模型使我們能夠解釋為什麼可以藉由RMCE，使用靶向載體pRY21將抗體轉錄單位之一或兩個複本併入停機坪中。
RMCE衍生之細胞株中的側翼序列
藉由RMCE(使用靶向載體pRY21)創建四個自10E9衍生之表現抗肌肉生成抑制素(myostatin)單株抗體(Myo)的重組細胞株，並使用前述方法測定5’和3’側翼序列。在RMCE過程中，衍生細胞株中發生持續之基因組重排而產生新的3’側翼序列(第10圖)。在RMCE衍生細胞株中之5’側翼序列與10E9相同，該整合位置係位在核苷酸1750049(在無定所CHO-K1支架1492支架(登錄編號JH000254.1，與NW_003613833.1完全相同)上。然而，3’側翼序列現在不同了：雖然在10E9 SSI宿主細胞株中之3’整合位置係位在核苷酸1760965，現在發現其在所有RMCE衍生細胞株中係位在核苷酸1435427處(在上述之支架中，第10圖)。
估算在RMCE產生的細胞株中之經整合之卡匣的複本數
將來自其各基因組之測序讀值對映到其中一個複本被整合入熱點的模型中。Myo複本數係衍生自LC和HC區上之平均覆蓋度。這四個細胞株在LC區上之平均覆蓋度分別為41、34、18、27，在HC區上之平均覆蓋度分別為32、27、14、19。覆蓋數據指出對高生產者而言，可能至少有一個以上之HC和LC複本(表7)。覆蓋數據以圖形顯示在第11圖中。
基於此觀察，產生RMCE後基因位點的新模型，其中包括一個額外之Myo複本。這是藉由在緊臨第二wFRT開始之前處***另一從第一wFRT位置的開端橫跨至第二wFRT位置之開端(二者均由第11圖中之星號指示)的片段。使用此'兩個複本'模型，我們可以在將序列讀值重新對映到模型時充分說明在具有高qP之細胞株中觀察到的序列讀值。
高qP之製造Myo的細胞株中之'兩個複本'模型的進一步證據可從來自各細胞株之RNA-Seq數據取得。使用BWA(Li H.and Durbin R.2009,Bioinformatics,25：1754-60)，以預設參數運行，將來自從各Myo細胞株衍生之RNA的RNA-Seq之測序讀值對映到原始「單複本」模型(第12圖)。Myo複本數係經由計算LC和HC區之RPKM值(Mortazavi et al.(2008),Nature Methods 5,621-628)衍生。LC中之RPKM值分別為43135、40059、23204、29334且HC區中之RPKM值分別為38572、32384、17878、20751。這些數據亦確認我們從全基因組測序衍生之推薦用於高生產者的'兩個複本'模型。
<110> Lonza Biologics plc Pfizer Inc.
<120> 位置特異性整合
<130> 204381 WO
<160> 11
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<210> 1
<211> 12566
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 載體
<400> 1
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<211> 5112
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 載體
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<212> DNA
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<213> 人工序列
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<223> 引物
<400> 4
<210> 5
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<213> 中國倉鼠卵巢
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<223> 引物
<400> 11

Claims (28)

  1. 一種包含內源性Fer1L4基因之位置特異性整合(SSI)宿主細胞，其中係將一外源性核苷酸序列整合在該Fer1L4基因中。
  2. 如申請專利範圍第1項之SSI宿主細胞，其中該外源性核苷酸序列包含至少兩個重組靶的位置。
  3. 如申請專利範圍第2項之SSI宿主細胞，其中該至少兩個重組靶的位置係位在編碼所欲序列之基因的二側。
  4. 如申請專利範圍第1項之SSI宿主細胞，其中該外源性核苷酸序列包含編碼所欲序列之基因。
  5. 如申請專利範圍第3或4項之SSI宿主細胞，其中該編碼所欲序列之基因包含一或多個編碼選擇標記、可檢測之蛋白質、抗體、肽抗原、酶、激素、生長因子、受體、融合蛋白或其他生物活性蛋白質之基因。
  6. 如申請專利範圍第2項之SSI宿主細胞，其中該重組靶的位置為FRT位置或lox位置。
  7. 如申請專利範圍第5項之SSI宿主細胞，其中該選擇標記為GS選擇標記、潮黴素(hygromycin)選擇標記、嘌呤黴素(puromycin)選擇標記或胸腺嘧啶激酶選擇標記。
  8. 如申請專利範圍第1至4及6項中任一項之SSI宿主細胞，其中該宿主細胞為小鼠細胞、人類細胞或CHO宿主細胞、CHOK1宿主細胞或CHOK1SV宿主細 胞。
  9. 如申請專利範圍第1至4及6項中任一項之SSI宿主細胞，其中該位於經整合之外源性核苷酸序列二側之Fer1L4基因的核苷酸序列係選自下列群組：SEQ ID No.7、8、9及彼等之同源序列。
  10. 如申請專利範圍第1至4及6項中任一項之SSI宿主細胞，其中該外源性核苷酸序列取代一部分之Fer1L4基因。
  11. 如申請專利範圍第6項之SSI宿主細胞，其中該宿主細胞包含一個FRT位置，此FRT位置為野生型FRT位置或突變型FRT位置。
  12. 如申請專利範圍第2項之SSI宿主細胞，其中該重組靶的位置包含至少一個野生型FRT位置及至少一個突變型FRT位置。
  13. 一種用於製造SSI宿主細胞之方法，其包含下列步驟：a)提供包含內源性Fer1L4基因之細胞，其中係將一外源性核苷酸序列整合在該Fer1L4基因中，且其中該外源性核苷酸序列包含至少兩個重組靶的位置，其位在至少一個編碼所欲序列之第一基因的二側；接著b)以包含第一交換卡匣之載體轉染步驟a)中所提供之細胞，該卡匣包含至少兩個匹配之重組靶的位置，此兩個重組靶的位置位於至少一個編碼所欲序列之第二基因(亦即選擇標記基因)的二側，接著 c)使由定點重組介導之卡匣交換生效，接著d)選擇表現出編碼所欲序列之第二基因的經轉染之細胞，從而取得包含該被穩定地整合在其基因組中之第一交換卡匣的SSI宿主細胞。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法，其進一步包含i)以包含至少一個第二交換卡匣之載體轉染該SSI宿主細胞，該卡匣包含至少兩個匹配之重組靶的位置，此兩個重組靶的位置位於至少一個編碼所欲序列及至少一個選擇標記之第三基因的二側，及ii)使由定點重組介導之卡匣交換生效，從而取得包含該編碼所欲序列之第三基因的SSI宿主細胞。
  15. 一種經分離之多核苷酸分子，其由至少一個選自下列群組之核苷酸序列：如SEQ ID No：7、8、9中所給予之核苷酸序列及彼等之同源序列所組成。
  16. 一種載體，其含有如申請專利範圍第15項之多核苷酸。
  17. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第15項之核苷酸分子或如申請專利範圍第16項之載體。
  18. 如申請專利範圍第17項之宿主細胞，其中該宿主細胞包含編碼位在如申請專利範圍第15項之多核苷酸分子或如申請專利範圍第16項之載體內或與其鄰接之所欲序列的基因。
  19. 一種用於製造細胞或細胞株的方法，其包含：提供載體，該載體包含至少一個編碼所欲序列之基 因；將Fer1L4核苷酸序列整合在該載體中；將該載體穩定轉染入細胞或細胞株中；且選出並取得該載體經穩定轉染之細胞或細胞株。
  20. 如申請專利範圍第19項之方法，其中該Fer1L4核苷酸序列為選自下列群組之核苷酸序列：如SEQ ID No：7、8、9中所給予之核苷酸序列及彼等之同源序列。
  21. 如申請專利範圍第19項之方法，其中該細胞或細胞株是具有高生產力穩定性之高生產者細胞或細胞株。
  22. 一種用於製造編碼所欲序列之基因產物的方法，其包含將根據申請專利範圍第13或19項之方法製造的宿主細胞或細胞株培養在合適之培養基中，並從其中回收該產物。
  23. 一種用於製造編碼所欲序列之基因產物的方法，其包含將根據申請專利範圍第14項之方法製造的包含該編碼所欲序列之第三基因的SSI宿主細胞培養在合適之培養基中，以表現該編碼所欲序列之第三基因，並回收該編碼所欲序列之第三基因的產物。
  24. 一種用於製造SSI宿主細胞之方法，該方法包含：提供外源性核苷酸序列；提供具有內源性Fer1L4基因之細胞；及將該外源性核苷酸序列引入該細胞內之該內源性Fer1L4基因中。
  25. 如申請專利範圍第24項之方法，其中該外源性核苷酸序列係藉由Fer1L4基因與多核苷酸之間的同源重組被引入，其中該多核苷酸包含a)與Fer1L4基因之第一部分同源的第一核苷酸序列，b)該外源性核苷酸序列，及c)與Fer1L4基因之第二部分同源的第二核苷酸序列。
  26. 如申請專利範圍第24項之方法，其中係使用病毒載體或外源性核酸酶協助引入該外源性核苷酸序列。
  27. 如申請專利範圍第26項之方法，其中該病毒載體為介導同源重組之與腺相關病毒載體。
  28. 如申請專利範圍第26項之方法，其中該外源性核酸酶為鋅指核酸酶、類轉錄活化因子效應子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease)或經遺傳工程處理之大範圍核酸酶(meganuclease)。
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