CN112251463A

CN112251463A - 一种cd73人源化小鼠模型的构建方法

Info

Publication number: CN112251463A
Application number: CN202011062364.4A
Authority: CN
Inventors: 琚存祥; 王韬; 杨笑柳; 于薇薇
Original assignee: Guangdong Yaokang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Yaokang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-09-30
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2021-01-22
Anticipated expiration: 2040-09-30
Also published as: CN112251463B

Abstract

本发明公开了一种CD73人源化小鼠模型的构建方法，通过优化该模型制备中所使用的打靶载体、sgRNA以及验证步骤，高效成功的获得了CD73人源化动物模型。本发明的模型在CD73靶向药物与其他免疫检查点或者小分子药物联合用药的筛选应用中具有显著优势。

Description

一种CD73人源化小鼠模型的构建方法

技术领域

本发明涉及动物基因工程技术领域，具体为一种CD73人源化小鼠模型的构建方法。

背景技术

PD1、PDL1和CTLA4等在内的第一代免疫检查点抑制剂，已成为肿瘤免疫治疗的主力军。尽管这些免疫检查点在肿瘤免疫治疗中取得不小成功，但是只有小部分病人对单一免疫检查点表现出持久的响应，甚至有部分病人对目前已上市的检查点抑制剂并不响应。对于如何克服实体肿瘤治疗的耐药性，其中很重要的方面就是对肿瘤微环境的调控，调控微环境中免疫抑制作用可显著提高肿瘤免疫治疗效果。

CD73是胞外-5’-核苷酸酶，通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定于质膜的一种糖蛋白。CD73广泛分布在人体组织细胞表面。CD73分子在多种肿瘤组织中呈现高表达，不仅参与嘌呤核苷酸的代谢和补救合成途径，而且作为一种重要的免疫信号负调控分子，通过催化免疫抑制性介质腺苷(ADO)的形成，参与肿瘤的免疫逃逸。靶向CD73可能具有良好的抗肿瘤作用，而抗CD73与某些免疫分子调节剂联合所显示的增效作用也已成为近期研究热点。因此抗CD73靶向治疗有望成为一种新型联合免疫疗法。

人类疾病的发病机制研究，筛选有效的治疗药物，均需要进行大量临床前试验。由于直接利用人细胞及组织进行临床前相关研究受到伦理方面的限制，动物模型就成为人类生物学研究的替代选择。小鼠因体积小，易维持与操作，繁殖周期短,与人在基因组和生理学等特征方面相似，并且已经有相应成熟的基因修饰技术，使其成为广泛应用的哺乳动物模式生物***。但由于小鼠生理特征与人存在较多差异，利用动物模型得到的实验结果有时不能适用到人体上。然而利用基因修饰或细胞与组织移植的方法，将人类基因或细胞组织“放置”在小鼠模型上所制备的人源化小鼠模型，极大程度上模拟人类基因或细胞组织的相关活动，大大提高了这类小鼠模型作为模拟某些人类疾病的有效性。这就是我们通常所说的人源化小鼠模型，即带有人类功能性基因、人类细胞或组织的小鼠模型。

CD73人源化小鼠是指利用基因修饰的方法，在免疫***健全的小鼠上，将鼠源的CD73基因替换为人源的基因，构建能与抗人源CD73单抗相互作用小鼠模型，为临床前抗人源CD73单抗筛选提供更实惠且易取的动物评价体系。我们构建了针对mouse CD73基因的gRNA和携带human CD73基因片段的载体，利用CRISPR/Cas9技术和胚胎注射技术，使用人源CD73基因替换鼠源CD73。同时，我们对于CRISPR/Cas9技术中用到的各个原件包括gRNA等进行了充分的优化和调整，保证采用该技术制备人源化CD73基因动物模型的成功率和准确率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CD73人源化小鼠模型的构建方法，该模型具备在CD73靶向药物与其他免疫检查点或者小分子药物联合用药的高效筛选应用的优点，解决了人类疾病的发病机制研究，筛选有效的治疗药物，均需要进行大量临床前试验,且由于直接利用人细胞及组织进行临床前相关研究会受到伦理方面的限制的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

提供一种CD73人源化小鼠模型的构建方法，其特征在于，将人CD73编码氨基酸序列***鼠CD73基因5’UTR后面，末端加入一段终止序列3×ployA，使得小鼠CD73蛋白无法表达，人源CD73蛋白受小鼠CD73基因的启动子及5’UTR调控，包括以下步骤：(1)构建表达人源化CD73的表达载体用于人源化CD73基因的***，具体采用SLIC方式将多个片段连接在一起构建打靶载体；(2)确定用于模型制备的sgRNA序列；(3)将表达人源化CD73的表达载体和sgRNA连同Cas9蛋白注射到受精卵，移植至假孕小鼠，其中人源化CD73基因的序列如SEQ IDNO：2所示。

优选地，选择将人源序列插在鼠源5’UTR之后，针对目的片段选取脱靶率最低的sgRNA，其序列如SEQ ID NO：3所示。

优选地，所述打靶片段载体制备步骤如下：

1)通过NOTI+SPEI酶切pl253-DTA质粒获得线性化的pl253-DTA线性化；

2)使用C57BL/6基因组PCR扩增CD73-5arm、CD73-3arm，获得huCD73-CDS片段，获得3xployA片段，回收备用；

3)将CD73-5arm、CD73-3arm、线性化的pl253-DTA、huCD73-CDS和3xployA进行SLIC连接，使用PCR鉴定载体完整性；

4)终载体构建成功后，使用PACI/AGEI酶切回收3839bp的条带，完成测序，用于注射。

优选地，扩增CD73-5arm、CD73-3arm、huCD73-CDS及3xployA序列的引物如下：

优选地，所述方法还包括对假孕生的仔鼠进行基因型鉴定，筛选成功***正确人源片段的阳性鼠F0小鼠，F0与B6背景鼠配繁获得F1，对F1代鼠尾进行基因鉴定。

优选地，其中鉴定基因型所使用的引物如下：

优选地，所述方法还包括对CD73蛋白表达的检测、免疫***验证和/或CD73抑制剂抗肿瘤药效验证。

优选地，其中免疫***验证步骤为：选取小鼠的主要免疫器官胸腺或脾脏，剪取B6-hCD73纯合小鼠和C57BL/6背景鼠胸腺或脾脏，将组织研磨消化成单个细胞，用鼠源T\B\NK表面抗体对组织细胞胞外蛋白进行染色，用PBS清洗细胞后，进行流式细胞检测T(CD4+、CD8+)、B、NK细胞数量。

优选地，其中CD73抑制剂抗肿瘤药效验证步骤为：将B6背景PD1与PDL1双人源化小鼠与hCD73人源化小鼠配繁获得B6-hPD1/hPDL1/hCD73三人源化小鼠，采用B6-hPD1/hPDL1/hCD73人源化鼠进行药效评价；选取6-7wB6-hPD1/hPDL1/hCD73纯合小鼠，皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38-hPDL1(Tg)-mPDL1(KO)-hCD73(Tg)-mCD73(KO)，该细胞系为CD73人源化与PDL1人源化同时鼠源PDL1和CD73均敲除的肿瘤细胞，待肿瘤体积约100±50^mm3后随即分为4组，分别为对照组、PDL1单药组、PDL1与CD73-1抗体联用组以及PDL1与CD73-2抗体联用组；给药频次为每周2次，连续给药3周，给药终点，将小鼠处死。

优选地，其中CD73蛋白通过流式检测方法检测：

(1)取材：眼眶采集小鼠外周血100ul至1.5mL EP管，轻轻拨动，避免发生凝血，将血液转移到10mL离心管中，每管加入1mL 1×RBC，混匀，室温避光裂红10min，8℃400g，离心5min，去上清，如需要，可2次裂红，用FACS buffer洗涤1次，冰上放置，备用；

(2)封闭：根据实验需要，将100uL(约10⁶个)细胞分到不同的流式管中，加Fcblock(CD16/32抗体)每管加1ul CD16/32抗体(1:100稀释)混匀，冰上孵育5min；

(3)抗体孵育：根据样品管数目配置抗体混合液(hPD-1，mPD-1，hCD73，mCD73，CD3抗体)，按照抗体最佳用量添加，每个样加50uL抗体混合液，涡旋混匀；单染管每管加0.5ul抗体，涡旋混匀；冰上避光孵育1h；

(4)清洗：FACS buffer洗涤，加入FACS buffer，上机检测，上样前5min添加Sytoxblue(终浓度1:10000稀释)，区分死活细胞。

优选地，免疫细胞通过流式检测的方法如下：

取材：剪取B6-hCD73纯合小鼠和C57BL/6背景鼠脾脏称重，置于C型管；

消化：脾脏使用酶消化液，37℃，消化30min。将消化完成的脾脏细胞加300ul 0.1M的EDTA终止消化，取1mL用滤膜过滤，除去未消化完全的组织块，每管加2mLFACS buffer中和EDTA；8℃,400g,离心5min,去上清，脾脏每管加3ml 1×RBC混匀，室温避光裂解红细胞5min，8℃,400g,离心5min,去上清，加1mLFACS buffer重悬，过滤；8℃,400g,离心5min,去上清，加FACS buffer重悬，调整细胞浓度1×10⁷个/mL，分到流式管中100uL，准备孵育抗体；

(1)封闭：根据实验需要，将100uL(约10⁶个)细胞分到不同的流式管中，加Fcblock(CD16/32抗体)每管加1ul CD16/32抗体(1:100稀释)混匀，冰上孵育5min；

(2)抗体孵育：根据样品管数目配置抗体混合液：CD19，CD4，CD8，CD335，CD3抗体，按照抗体最佳用量添加，每个样加50uL抗体混合液，涡旋混匀，单染管每管加0.5ul抗体，涡旋混匀，冰上避光孵育1h；

(3)清洗：FACS buffer洗涤，加入FACS buffer，上机检测，上样前5min添加Sytoxblue(终浓度1:10000稀释)，区分死活细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、将小鼠CD73蛋白人源化，获得成功表达人源CD73的小鼠模型。

2、可将人源CD73的小鼠模型与PD1/PDL1小鼠配繁获得三靶点人源化小鼠模型，该模型可同时表达人源PD1、PDL1与CD73蛋白，实现PD1与PDL1通路完美识别，是用于免疫检查点疗法评价的优质模型该模型。该不仅可供于PD1、PDL1、CD73抗体单药评价，同时可用于CD73抗体联合PDL1抗体抗肿瘤药效评价，对临床前药效评价有着深远的指导意义，且建立的B6-hPD1/hPDL1/hCD73人源化小鼠模型填补了市场在该三靶点小鼠模型的空白，同时提供了CD73抑制剂评价平台。从经济角度与社会角度均带来显著效益。

3、本发明提供了优化的制备稳定表达人源化CD73动物模型的具体操作方法，该方法中优化了打靶策略、表达人源化CD73的载体上的元件构成、敲除鼠源CD73的最佳sgRNA、以及鉴定筛选所使用的引物和酶切方案，结合后续蛋白表达检测、免疫***验证、抑制剂评价等，确保了制备目的动物模型的高效性。

附图说明

图1为本发明的打靶策略图。

图2为PCR扩增鉴定载体的结果。

图3为F1代鉴定策略。

图4为F1代鉴定结果图1。

图5为F1代鉴定结果图2.

图6为流式蛋白检测结果。

图7为免疫***验证结果图。

图8为各组小鼠体重变化图。

图9为各组小鼠肿瘤变化曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 CD73人源化小鼠模型的构建

CD73人源化小鼠模型的构建方法按照以下步骤完成：

1、确定人源片段替换区域及***的人源序列：使用CRISPR Cas9的方式将人类CD73编码基因替换鼠的Cd73编码基因，从而构建可以表达人源CD73的小鼠模型。选取的人源CD73基因编码的氨基酸序列(Aa：1-574)为下列序列SEQ ID NO：1所示；将人CD73编码氨基酸序列***鼠CD73基因5’UTR后面，末端加入一段终止序列3×ployA，使得小鼠CD73蛋白无法表达，策略图如下。人源CD73蛋白受小鼠CD73基因的启动子及5’UTR调控，使人源CD73蛋白表达在鼠源序列调控维持与原鼠CD73蛋白表达空间及表达量的相似性，从而不破坏小鼠机体原有稳定性。打靶策略图如图1所示。

人源CD73氨基酸序列SEQ ID NO：1：

MCPRAARAPATLLLALGAVLWPAAGAWELTILHTNDVHSRLEQTSEDSSKCVNASRCMGGVARLFTKVQQIRRAEPNVLLLDAGDQYQGTIWFTVYKGAEVAHFMNALRYDAMALGNHEFDNGVEGLIEPLLKEAKFPILSANIKAKGPLASQISGLYLPYKVLPVGDEVVGIVGYTSKETPFLSNPGTNLVFEDEITALQPEVDKLKTLNVNKIIALGHSGFEMDKLIAQKVRGVDVVVGGHSNTFLYTGNPPSKEVPAGKYPFIVTSDDGRKVPVVQAYAFGKYLGYLKIEFDERGNVISSHGNPILLNSSIPEDPSIKADINKWRIKLDNYSTQELGKTIVYLDGSSQSCRFRECNMGNLICDAMINNNLRHTDEMFWNHVSMCILNGGGIRSPIDERNNGTITWENLAAVLPFGGTFDLVQLKGSTLKKAFEHSVHRYGQSTGEFLQVGGIHVVYDLSRKPGDRVVKLDVLCTKCRVPSYDPLKMDEVYKVILPNFLANGGDGFQMIKDELLRHDSGDQDINVVSTYISKMKVIYPAVEGRIKFSTGSHCHGSFSLIFLSLWAVIFVLYQ

选用人源基因序列如SEQ ID NO：2所示：

atgtgtccccgagccgcgcgggcgcccgcgacgctactcctcgccctgggcgcggtgctgtggcctgcggctggcgcctgggagcttacgattttgcacaccaacgacgtgcacagccggctggagcagaccagcgaggactccagcaagtgcgtcaacgccagccgctgcatgggtggcgtggctcggctcttcaccaaggttcagcagatccgccgcgccgaacccaacgtgctgctgctggacgccggcgaccagtaccagggcactatctggttcaccgtgtacaagggcgccgaggtggcgcacttcatgaacgccctgcgctacgatgccatggcactgggaaatcatgaatttgataatggtgtggaaggactgatcgagccactcctcaaagaggccaaatttccaattctgagtgcaaacattaaagcaaaggggccactagcatctcaaatatcaggactttatttgccatataaagttcttcctgttggtgatgaagttgtgggaatcgttggatacacttccaaagaaaccccttttctctcaaatccagggacaaatttagtgtttgaagatgaaatcactgcattacaacctgaagtagataagttaaaaactctaaatgtgaacaaaattattgcactgggacattcgggttttgaaatggataaactcatcgctcagaaagtgaggggtgtggacgtcgtggtgggaggacactccaacacatttctttacacaggcaatccaccttccaaagaggtgcctgctgggaagtacccattcatagtcacttctgatgatgggcggaaggttcctgtagtccaggcctatgcttttggcaaatacctaggctatctgaagatcgagtttgatgaaagaggaaacgtcatctcttcccatggaaatcccattcttctaaacagcagcattcctgaagatccaagcataaaagcagacattaacaaatggaggataaaattggataattattctacccaggaattagggaaaacaattgtctatctggatggctcctctcaatcatgccgctttagagaatgcaacatgggcaacctgatttgtgatgcaatgattaacaacaacctgagacacacggatgaaatgttctggaaccacgtatccatgtgcattttaaatggaggtggtatccggtcgcccattgatgaacgcaacaatggcacaattacctgggagaacctggctgctgtattgccctttggaggcacatttgacctagtccagttaaaaggttccaccctgaagaaggcctttgagcatagcgtgcaccgctacggccagtccactggagagttcctgcaggtgggcggaatccatgtggtgtatgatctttcccgaaaacctggagacagagtagtcaaattagatgttctttgcaccaagtgtcgagtgcccagttatgaccctctcaaaatggacgaggtatataaggtgatcctcccaaacttcctggccaatggtggagatgggttccagatgataaaagatgaattattaagacatgactctggtgaccaagatatcaacgtggtttctacatatatctccaaaatgaaagtaatttatccagcagttgaaggtcggatcaagttttccacaggaagtcactgccatggaagcttttctttaatatttctttcactttgggcagtgatctttgttttataccaatag

2、确定用于模型制备的sgRNA序列：根据替换片段确定sgRNA大概区域，S2中为确保小鼠序列不表达，选择将人源序列插在鼠源5‘UTR之后，使用sgRNA测评软件，针对目的片段选取脱靶率最低，且sgRNA转录制备方法：以Primer Star或Primer Star Max体系，sgRNA-F、sgRNA-R为引物，测序正确的puc57-sgRNA质粒(1：30稀释)为模板进行PCR，PCR产物进行纯化，制备sgRNA转录制备模板。使用T7-ShortScript体外转录试剂盒(AM1354)进行sgRNA的转录；所使用的sgRNA序列如下，该sgRNA的打靶效率高至88％。

3、载体及移植产物构建：采用SLIC方式将多个片段连接在一起构建打靶片段载体，所需片段包括pl253-DTA骨架、huCD73-CDS、3*stop、CD73-5arm、CD73-3arm，打靶片段载体制备步骤如下：

(1)通过NOTI+SPEI酶切pl253-DTA质粒获得线性化的pl253-DTA线性化。

(2)使用C57BL/6基因组PCR扩增CD73-5arm(sgRNA5’端同源臂)，CD73-3arm(sgRNA3’端同源臂)，获得3xployA序列，序列合成huCD73-CDS片段同时通过PCR扩增方式获得所需剂量的片段，电泳跑胶并使用试剂盒胶回收备用。扩增CD73-5arm、CD73-3arm、huCD73-CDS及3xployA序列的引物如下表1所示。

表1扩增CD73-5arm、CD73-3arm、huCD73-CDS及3xployA序列的引物

(3)将CD73-5arm，CD73-3arm，pl253-DTA(线性化)，huCD73-CDS和3xployA进行SLIC连接，使用PCR鉴定载体完整性。使用表2所示引物对载体进行扩增。

表2 PCR扩增鉴定载体所使用的引物

鉴定结果如图2所示。

(4)终载体构建成功后，使用PACI/AGEI酶切(6451bp,3839bp)回收3839bp的条带，测序正确载体，线性化处理后用于注射。测序方案如表4所示。

表4载体测序方案

4、移植注射获得阳性鼠：将移植产物、目的sgRNA、cas9蛋白注射到受精卵，移植至假孕小鼠，对假孕生的仔鼠进行基因型鉴定，筛选成功***正确人源片段的阳性鼠F0小鼠，F0与B6背景鼠配繁获得F1，对F1代鼠尾进行基因鉴定，鉴定策略见图3，引物如表5所示。参见图3的3个PCR反应，其中野生型：①②PCR反应未获得阳性条带；③PCR反应可以获得单一的206bp条带；杂合子：①②PCR反应可以获得阳性条带；③PCR反应可以获得单一的206bp条带；纯合子：①②PCR反应可以获得阳性条带；③PCR反应未获得单一的206bp条带。F1代小鼠PCR实验结果见图4及图5，图4-5中，阴性对照为B6基因组DNA；N为空白对照,无模板的对照；TRANS 2K PLUS II条带8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。可见F1阳性小鼠鼠尾DNA可PCR扩增出相应条带，5端条带显示2135bp，3端条带2074bp。PCR阳性产物进行二代测序，测序引物如表7所示，测序正确小鼠为阳性小鼠。阳性小鼠编号如下：7#、12#、13#，F1大量扩繁后进行互配，获得CD73人源化纯和小鼠，简称B6-hCD73。

表5基因型鉴定引物

表6基因型鉴定条件

表7基因型测序引物

5、蛋白表达检测：选取CD73表达较丰富，本实验选取外周血，检测血液中CD73蛋白的表达，CD73蛋白流式检测方法：

(1)取材：眼眶采集小鼠外周血100ul至1.5mLEP管(预先加入EDTA.2K抗凝)，轻轻拨动，避免发生凝血，将血液转移到10mL离心管中，每管加入1mL1×RBC(10×原液用蒸馏水稀释)，混匀，室温避光裂红10min，8℃，400g，离心5min，去上清，如需要，可2次裂红，用FACSbuffer洗涤1次，冰上放置，备用；

(4)清洗：FACS buffer洗涤，加入FACS buffer，上机检测，上样前5min添加Sytoxblue(终浓度1:10000稀释)，区分死活细胞；

流式检测蛋白表达检测结果如图6所示，纯和小鼠中可成功检测到人源CD73，且鼠源CD73未检测到表达。

6、免疫***验证：选取小鼠的主要免疫器官胸腺或脾脏，剪取B6-hCD73纯合小鼠和C57BL/6背景鼠胸腺或脾脏，将组织研磨消化成单个细胞，用鼠源T\B\NK表面抗体对组织细胞胞外蛋白进行染色，用PBS清洗细胞后，进行流式细胞检测T(CD4+、CD8+)、B、NK细胞数量，免疫细胞流式检测方法：

(1)取材：剪取B6-hCD73纯合小鼠和C57BL/6背景鼠脾脏称重，置于C型管；

(2)消化：脾脏使用酶消化液(PBS含Ca，Mg+2％CS+10mM HEPES+30ug DNase+1.75mg胶原酶D)，37℃，消化30min。将消化完成的脾脏细胞加300ul 0.1M的EDTA终止消化，取1mL用滤膜过滤，除去未消化完全的组织块，每管加2mL FACS buffer中和EDTA。8℃,400g,离心5min,去上清，脾脏每管加3ml 1×RBC混匀，室温避光裂解红细胞5min，8℃,400g,离心5min,去上清，加1mLFACS buffer重悬，过滤；8℃,400g,离心5min,去上清，加FACS buffer重悬，调整细胞浓度1×10⁷/mL，分到流式管中100uL，准备孵育抗体；

(3)封闭：根据实验需要，将100uL(约10⁶个)细胞分到不同的流式管中，加Fcblock(CD16/32抗体)每管加1ul CD16/32抗体(1:100稀释)混匀，冰上孵育5min。

(4)抗体孵育：根据样品管数目配置抗体混合液(CD19，CD4，CD8，CD335，CD3抗体)，按照抗体最佳用量添加，每个样加50uL抗体混合液，涡旋混匀，单染管每管加0.5ul抗体，涡旋混匀，冰上避光孵育1h；

(5)清洗：FACS buffer洗涤，加入FACS buffer，上机检测，上样前5min添加Sytoxblue(终浓度1:10000稀释)，区分死活细胞；

免疫***验证结果如图7所示，纯和小鼠中T细胞，B细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞及NK细胞相对比例与纯和小鼠相比，基本相似。表明人源化CD73小鼠中免疫***正常，小鼠建模成功。

7、PD1、PDL1与CD73人源化小鼠评价CD73抑制剂抗肿瘤药效验证：体外数据已验证CD73人源化小鼠可正常表达CD73蛋白，且该蛋白在小鼠体内的免疫应答显示正常，但该小鼠是否能用于评价CD73抗癌药实际疗效仍有待验证，为了适用临床现有CD73用药方案，PD1/PDL1与CD73的联用给药方案，将B6背景PD1与PDL1双人源化小鼠与hCD73人源化小鼠配繁获得B6-hPD1/hPDL1/hCD73三人源化小鼠，采用B6-hPD1/hPDL1/hCD73人源化鼠进行药效评价；

CD73抑制剂评价B6-hPD1/hPDL1/hCD73荷瘤小鼠模型：选取6-7w B6-hPD1/hPDL1/hCD73纯合小鼠，皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38-hPDL1(Tg)-mPDL1(KO)-hCD73(Tg)-mCD73(KO)，该细胞系为CD73人源化与PDL1人源化同时鼠源PDL1和CD73均敲除的肿瘤细胞，待肿瘤体积约100±50^mm3后随即分为4组，分别为对照组、PDL1单药组、PDL1与CD73-1抗体联用组以及PDL1与CD73-2抗体联用组；给药频次为每周2次，连续给药3周，给药终点，将小鼠处死。给药方案如下表所示：

结果：各组的小鼠体重变化如图8所示。各组的肿瘤生长曲线如图9所示。

结果显示：与对照组相比，anti-hPDL1抗体单独给药组有显著抑癌效果(TGI＝48.02％)，在与CD73抗体联用后抑瘤效果有提升，TGI达到63.97％和61％。结果表明B6-hPD1/hPDL1/hCD73小鼠可用于PDL1人源抗体与CD73人源抗体联合给药评价，接种PDL1与CD73人源化细胞系的B6-hPD1/hPDL1/hCD73小鼠是PD1/PDL1与CD73抑制剂联合给药的优选模型。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

序列表

<110> 广东药康生物科技有限公司

<120> 一种CD73人源化小鼠模型的构建方法

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 574

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 1

Met Cys Pro Arg Ala Ala Arg Ala Pro Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Gly Ala Val Leu Trp Pro Ala Ala Gly Ala Trp Glu Leu Thr Ile Leu

20 25 30

His Thr Asn Asp Val His Ser Arg Leu Glu Gln Thr Ser Glu Asp Ser

35 40 45

Ser Lys Cys Val Asn Ala Ser Arg Cys Met Gly Gly Val Ala Arg Leu

50 55 60

Phe Thr Lys Val Gln Gln Ile Arg Arg Ala Glu Pro Asn Val Leu Leu

65 70 75 80

Leu Asp Ala Gly Asp Gln Tyr Gln Gly Thr Ile Trp Phe Thr Val Tyr

85 90 95

Lys Gly Ala Glu Val Ala His Phe Met Asn Ala Leu Arg Tyr Asp Ala

100 105 110

Met Ala Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Asn Gly Val Glu Gly Leu Ile

115 120 125

Glu Pro Leu Leu Lys Glu Ala Lys Phe Pro Ile Leu Ser Ala Asn Ile

130 135 140

Lys Ala Lys Gly Pro Leu Ala Ser Gln Ile Ser Gly Leu Tyr Leu Pro

145 150 155 160

Tyr Lys Val Leu Pro Val Gly Asp Glu Val Val Gly Ile Val Gly Tyr

165 170 175

Thr Ser Lys Glu Thr Pro Phe Leu Ser Asn Pro Gly Thr Asn Leu Val

180 185 190

Phe Glu Asp Glu Ile Thr Ala Leu Gln Pro Glu Val Asp Lys Leu Lys

195 200 205

Thr Leu Asn Val Asn Lys Ile Ile Ala Leu Gly His Ser Gly Phe Glu

210 215 220

Met Asp Lys Leu Ile Ala Gln Lys Val Arg Gly Val Asp Val Val Val

225 230 235 240

Gly Gly His Ser Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Pro Ser Lys

245 250 255

Glu Val Pro Ala Gly Lys Tyr Pro Phe Ile Val Thr Ser Asp Asp Gly

260 265 270

Arg Lys Val Pro Val Val Gln Ala Tyr Ala Phe Gly Lys Tyr Leu Gly

275 280 285

Tyr Leu Lys Ile Glu Phe Asp Glu Arg Gly Asn Val Ile Ser Ser His

290 295 300

Gly Asn Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Ile Pro Glu Asp Pro Ser Ile

305 310 315 320

Lys Ala Asp Ile Asn Lys Trp Arg Ile Lys Leu Asp Asn Tyr Ser Thr

325 330 335

Gln Glu Leu Gly Lys Thr Ile Val Tyr Leu Asp Gly Ser Ser Gln Ser

340 345 350

Cys Arg Phe Arg Glu Cys Asn Met Gly Asn Leu Ile Cys Asp Ala Met

355 360 365

Ile Asn Asn Asn Leu Arg His Thr Asp Glu Met Phe Trp Asn His Val

370 375 380

Ser Met Cys Ile Leu Asn Gly Gly Gly Ile Arg Ser Pro Ile Asp Glu

385 390 395 400

Arg Asn Asn Gly Thr Ile Thr Trp Glu Asn Leu Ala Ala Val Leu Pro

405 410 415

Phe Gly Gly Thr Phe Asp Leu Val Gln Leu Lys Gly Ser Thr Leu Lys

420 425 430

Lys Ala Phe Glu His Ser Val His Arg Tyr Gly Gln Ser Thr Gly Glu

435 440 445

Phe Leu Gln Val Gly Gly Ile His Val Val Tyr Asp Leu Ser Arg Lys

450 455 460

Pro Gly Asp Arg Val Val Lys Leu Asp Val Leu Cys Thr Lys Cys Arg

465 470 475 480

Val Pro Ser Tyr Asp Pro Leu Lys Met Asp Glu Val Tyr Lys Val Ile

485 490 495

Leu Pro Asn Phe Leu Ala Asn Gly Gly Asp Gly Phe Gln Met Ile Lys

500 505 510

Asp Glu Leu Leu Arg His Asp Ser Gly Asp Gln Asp Ile Asn Val Val

515 520 525

Ser Thr Tyr Ile Ser Lys Met Lys Val Ile Tyr Pro Ala Val Glu Gly

530 535 540

Arg Ile Lys Phe Ser Thr Gly Ser His Cys His Gly Ser Phe Ser Leu

545 550 555 560

Ile Phe Leu Ser Leu Trp Ala Val Ile Phe Val Leu Tyr Gln

565 570

<210> 2

<211> 1725

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 2

atgtgtcccc gagccgcgcg ggcgcccgcg acgctactcc tcgccctggg cgcggtgctg 60

tggcctgcgg ctggcgcctg ggagcttacg attttgcaca ccaacgacgt gcacagccgg 120

ctggagcaga ccagcgagga ctccagcaag tgcgtcaacg ccagccgctg catgggtggc 180

gtggctcggc tcttcaccaa ggttcagcag atccgccgcg ccgaacccaa cgtgctgctg 240

ctggacgccg gcgaccagta ccagggcact atctggttca ccgtgtacaa gggcgccgag 300

gtggcgcact tcatgaacgc cctgcgctac gatgccatgg cactgggaaa tcatgaattt 360

gataatggtg tggaaggact gatcgagcca ctcctcaaag aggccaaatt tccaattctg 420

agtgcaaaca ttaaagcaaa ggggccacta gcatctcaaa tatcaggact ttatttgcca 480

tataaagttc ttcctgttgg tgatgaagtt gtgggaatcg ttggatacac ttccaaagaa 540

accccttttc tctcaaatcc agggacaaat ttagtgtttg aagatgaaat cactgcatta 600

caacctgaag tagataagtt aaaaactcta aatgtgaaca aaattattgc actgggacat 660

tcgggttttg aaatggataa actcatcgct cagaaagtga ggggtgtgga cgtcgtggtg 720

ggaggacact ccaacacatt tctttacaca ggcaatccac cttccaaaga ggtgcctgct 780

gggaagtacc cattcatagt cacttctgat gatgggcgga aggttcctgt agtccaggcc 840

tatgcttttg gcaaatacct aggctatctg aagatcgagt ttgatgaaag aggaaacgtc 900

atctcttccc atggaaatcc cattcttcta aacagcagca ttcctgaaga tccaagcata 960

aaagcagaca ttaacaaatg gaggataaaa ttggataatt attctaccca ggaattaggg 1020

aaaacaattg tctatctgga tggctcctct caatcatgcc gctttagaga atgcaacatg 1080

ggcaacctga tttgtgatgc aatgattaac aacaacctga gacacacgga tgaaatgttc 1140

tggaaccacg tatccatgtg cattttaaat ggaggtggta tccggtcgcc cattgatgaa 1200

cgcaacaatg gcacaattac ctgggagaac ctggctgctg tattgccctt tggaggcaca 1260

tttgacctag tccagttaaa aggttccacc ctgaagaagg cctttgagca tagcgtgcac 1320

cgctacggcc agtccactgg agagttcctg caggtgggcg gaatccatgt ggtgtatgat 1380

ctttcccgaa aacctggaga cagagtagtc aaattagatg ttctttgcac caagtgtcga 1440

gtgcccagtt atgaccctct caaaatggac gaggtatata aggtgatcct cccaaacttc 1500

ctggccaatg gtggagatgg gttccagatg ataaaagatg aattattaag acatgactct 1560

ggtgaccaag atatcaacgt ggtttctaca tatatctcca aaatgaaagt aatttatcca 1620

gcagttgaag gtcggatcaa gttttccaca ggaagtcact gccatggaag cttttcttta 1680

atatttcttt cactttgggc agtgatcttt gttttatacc aatag 1725

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcggccgcgg gacgcatggc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcggccgcgg gacgcatggc 20

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggggacacat ggctggctag agcgcgttga 30

<210> 6

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctagccagcc atgtgtcccc gagccgcgcg ggcgcccgcg acgctactcc tcgccc 56

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tattcatcgc gctattggta taaaacaaag atcactgccc aaagtg 46

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taccaatagc gcgatgaata aatgaaagct tgc 33

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gccgcgggac gggttccgga tcagcttgat g 31

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tccggaaccc gtcccgcggc cgctaaggta cccaag 36

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggaccggttt aattaaagag gtggaggaga ctgggatg 38

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tagctgtcag gtttacccgc tag 23

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ataactgggc actcgacact tg 22

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttggaggcac atttgaccta gtc 23

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcattgtgct cggacttcag ag 22

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tcctctactc cgcagtttag tagag 25

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acgtcgtttg tgtgcaggat c 21

Claims

1.一种CD73人源化小鼠模型的构建方法，其特征在于，将人CD73编码氨基酸序列***鼠CD73基因5’UTR后面，末端加入一段终止序列3×ployA，使得小鼠CD73蛋白无法表达，人源CD73蛋白受小鼠CD73基因的启动子及5’UTR调控，包括以下步骤：(1)构建表达人源化CD73的表达载体用于人源化CD73基因的***，具体采用SLIC方式将多个片段连接在一起构建打靶载体；(2)确定用于模型制备的sgRNA序列；(3)将表达人源化CD73的表达载体和sgRNA连同Cas9蛋白注射到受精卵，移植至假孕小鼠，其中人源化CD73基因的序列如SEQ IDNO：2所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：选择将人源序列插在鼠源5’UTR之后，针对目的片段选取脱靶率最低的sgRNA，其序列如SEQ ID NO：3所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：打靶片段载体制备步骤如下：

1)通过NOTI+SPEI酶切pl253-DTA质粒获得线性化的pl253-DTA线性化；

2)使用C57BL/6基因组PCR扩增CD73-5arm、CD73-3arm，获得huCD73-CDS片段，及连接在CDS片段之后的3xployA序列，回收备用；

4.如权利要求3所述的方法，其中扩增CD73-5arm、CD73-3arm、huCD73-CDS及3xployA序列的引物如下：

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：还包括对假孕生的仔鼠进行基因型鉴定，筛选成功***正确人源片段的阳性鼠F0小鼠，F0与B6背景鼠配繁获得F1，对F1代鼠尾进行基因鉴定。

6.根据权利要求5所述的方法，其中鉴定基因型所使用的引物如下：

7.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：还包括对CD73蛋白表达的检测、免疫***验证和/或CD73抑制剂抗肿瘤药效验证。

8.根据权利要求7所述的方法，其中免疫***验证步骤为：选取小鼠的主要免疫器官胸腺或脾脏，剪取B6-hCD73纯合小鼠和C57BL/6背景鼠胸腺或脾脏，将组织研磨消化成单个细胞，用鼠源T\B\NK表面抗体对组织细胞胞外蛋白进行染色，用PBS清洗细胞后，进行流式细胞检测T(CD4+、CD8+)、B、NK细胞数量。

9.根据权利要求7所述的方法，其中CD73抑制剂抗肿瘤药效验证步骤为：将B6背景PD1与PDL1双人源化小鼠与hCD73人源化小鼠配繁获得B6-hPD1/hPDL1/hCD73三人源化小鼠，采用B6-hPD1/hPDL1/hCD73人源化鼠进行药效评价；选取6-7w B6-hPD1/hPDL1/hCD73纯合小鼠，皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38-hPDL1(Tg)-mPDL1(KO)-hCD73(Tg)-mCD73(KO)，该细胞系为CD73人源化与PDL1人源化同时鼠源PDL1和CD73均敲除的肿瘤细胞，待肿瘤体积约100±50^mm3后随即分为4组，分别为对照组、PDL1单药组、PDL1与CD73-1抗体联用组以及PDL1与CD73-2抗体联用组；给药频次为每周2次，连续给药3周，给药终点，将小鼠处死。

10.根据权利要求7所述的方法，其中CD73蛋白通过流式检测方法检测：

(2)封闭：根据实验需要，将100uL细胞分到不同的流式管中，加Fc block(CD16/32抗体)每管加1ul CD16/32抗体(1:100稀释)混匀，冰上孵育5min；

(4)清洗：FACS buffer洗涤，加入FACS buffer，上机检测，上样前5min添加Sytox blue(终浓度1:10000稀释)，区分死活细胞。

11.根据权利要求7或8所述的一种CD73人源化小鼠模型的构建方法，其特征在于：免疫细胞流式检测方法：

消化：脾脏使用酶消化液，37℃，消化30min。将消化完成的脾脏细胞加300ul0.1M的EDTA终止消化，取1mL用滤膜过滤，除去未消化完全的组织块，每管加2mLFACS buffer中和EDTA；8℃,400g,离心5min,去上清，脾脏每管加3ml1×RBC混匀，室温避光裂解红细胞5min，8℃,400g,离心5min,去上清，加1mLFACS buffer重悬，过滤；8℃,400g,离心5min,去上清，加FACS buffer重悬，调整细胞浓度1×10⁷/mL，分到流式管中100uL，准备孵育抗体；

(1)封闭：根据实验需要，将100uL细胞分到不同的流式管中，加Fc block(CD16/32抗体)每管加1ulCD16/32抗体(1:100稀释)混匀，冰上孵育5min；

(3)清洗：FACS buffer洗涤，加入FACS buffer，上机检测，上样前5min添加Sytox blue(终浓度1:10000稀释)，区分死活细胞。