CN111690576A - 一株产生物表面活性剂的贝莱斯芽孢杆菌mmb-51及其应用 - Google Patents

一株产生物表面活性剂的贝莱斯芽孢杆菌mmb-51及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产生物表面活性剂的贝莱斯芽孢杆菌MMB‑51及其应用，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis MMB‑51，保藏编号为CGMCC No.19099，制备叶面肥增效剂的步骤是：将菌种接种于种子液培养基中，180rpm，37℃摇床培养12‑16h获得种子液；将种子液按1％(v/v)的比例转接到发酵培养基中，180rpm，37℃摇床培养36‑48h获得发酵液；离心，收集上清液；向上清液中加入适量HCl使得上清液pH＝2.0，混匀，4℃条件下静置过夜，然后在4℃的条件下离心，收集沉淀，去除上清液，使用1M NaOH溶液将沉淀残留液体调节至中性，用冷冻干燥后得到生物表面活性剂产品；将生物表面活性剂产品溶解于水中，配制成溶液，作为叶面肥增效剂。

Description

一株产生物表面活性剂的贝莱斯芽孢杆菌MMB-51及其应用
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一株产生物表面活性剂的贝莱斯芽孢杆菌MMB-51及其应用。
背景技术
生物表面活性剂是指微生物在发酵生长过程中分泌的具有一定表面活性的代谢产物，是一种可生物降解的表面活性成分，具有表面活性剂所共有的性能，如增溶、乳化、分散、降低表面张力等。与化学合成的表面活性剂相比，生物表面活性剂还具有安全性好，无毒无害、表面活性高等优点，与人体和环境相容性好，广泛用于洗涤剂，石油开采，化妆品等领域。
表面活性剂可以通过化学合成和微生物发酵的方法进行生产，其中化学合成法所需的反应步骤较多且具有毒性高，生物难降解等缺点；因此近年来，微生物发酵生产生物表面活性剂在国内外研究中受到越来越多的重视。生物表面活性剂根据其结构的不同可以分为脂肽和脂蛋白类、糖脂类、磷脂类、中性脂类以及多聚物类。自然界中有很多种微生物能够通过发酵代谢产生表面活性物质，主要包括假单胞菌(Pseudomonas sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、节杆菌(Arthrobacter sp.)、分支杆菌(Mycobacterium sp.)和丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)等。其中假单胞菌和芽孢杆菌是目前报道较多的，前者主要产生鼠李糖脂类生物表面活性剂；而后者主要产生脂肽类生物表面活性剂，两者都表现出良好的表面活性和应用前景。从环境样品中分离筛选的生物表面活性剂的产生菌的生物表面活性剂产量普遍较低，且生物表面活性剂产生后部分与产生菌的菌体相结合，增加了提取难度，同时影响生物表面活性剂的提取纯度。产量低和提取工艺复杂导致生物表面活性剂价格相对较高，限制了生物表面活性剂的应用范围。为降低生物表面活性剂的生产成本，目前的研究主要集中在选育高产菌株、构建高产基因工程菌、优化发酵条件和工艺参数，以及改善提取工艺等方面来提高生物表面活性剂的产量和质量，但目前真正产业化应用的菌株较少，筛选高产功能菌株和扩大生物表面活性剂的应用范围仍是该领域的重点研究工作之一。
我国是农业大国，施用化肥和农药是保证粮食高产的一种重要手段，农药和化肥对我国粮食产量的贡献率达到40％～60％，因此其对农业的重要性不言而喻。叶面肥是以植物的叶面吸收为目的，将农作物所需要的养分直接施用于叶面的肥料，叶面肥具有吸收快，作用强和效率高等优点，可以作为植物根部施肥的重要补充。叶面肥多以液体方式将营养元素喷施用于农作物叶片表面，通过叶片表面的气孔进入叶内，促进叶片吸收养分、发挥促生增产等功能。增加单位叶面肥液体量与叶面的接触面积或提高叶面肥液体在叶面的粘附力是提高叶面肥施用效率，减少叶面肥的用量的有效途径，然而目前对叶面肥增效剂的研究却极少。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株产生物表面活性剂的贝莱斯芽孢杆菌 MMB-51。
本发明的目的之二是提供上述产生物表面活性剂的贝莱斯芽孢杆菌 MMB-51在制备叶面肥增效剂中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种株产生物表面活性剂的贝莱斯芽孢杆菌MMB-51，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis MMB-51，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京，保藏日期为 2019年12月5日，保藏编号为CGMCC No.19099。
该菌株Bacillus velezensis MMB-51分离自黑龙江省大庆市东城区的环境样品活性污泥中，其16S rRNA如SEQ ID No.1所示，序列长度为1441bp。
本发明还提供上述产生物表面活性剂的贝莱斯芽孢杆菌MMB-51在制备叶面肥增效剂中的应用，具体步骤是：
步骤1：将菌种Bacillus velezensis MMB-51接种于种子液培养基中，180rpm， 37℃恒温摇床培养12-16小时获得种子液；
步骤2：将步骤1中获得的种子液按1％(v/v)的比例转接到以蔗糖为碳源，以酵母粉为氮源的发酵培养基中，180rpm，37℃恒温摇床培养36-48小时获得发酵液；
步骤3：将发酵液离心，收集上清液；
步骤4：向步骤3中获得的上清液中加入适量体积的6M HCl使得上清液 pH＝2.0，混匀，4℃条件下静置过夜，然后在4℃的条件下离心，收集沉淀，去除上清液，使用1M NaOH溶液将沉淀残留液体调节至中性，用冷冻干燥后得到生物表面活性剂产品；
步骤5：将步骤4制得的生物表面活性剂产品溶解于水中，配制成浓度为5 mg/L至16mg/L的溶液，作为叶面肥增效剂。
优选的，步骤1中所述种子液培养基的组成成分为：葡萄糖2.0g/L，淀粉2.0 g/L，酸水解酪素2.0g/L，酵母粉2.0g/L，胰蛋白胨2.0g/L，七水合硫酸镁0.2 g/L，磷酸氢二钾1.3g/L，115℃高温高压蒸汽灭菌30min。
优选的，步骤3中所述发酵培养基的组成成分为：蔗糖10.0g/L，酵母粉10.0 g/L，七水合硫酸镁0.05g/L，磷酸氢二钾0.325g/L，高温高压蒸汽灭菌(115℃， 30min)。
优选的，步骤3的离心转速为6000-10000rpm，离心10min；步骤4的离心转速为10000rpm，离心15min。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明所用的菌株Bacillus velezensis MMB-51生长速度快，发酵周期短，生物表面活性剂活性及产量较高；
2.本发明所用的贝莱斯芽孢杆菌产生的生物表面活性剂的活性高，可将其直接应用于叶面肥增效剂的应用中。
附图说明
图1是基于16S rRNA基因序列构建的菌株MMB-51***发育树；
图2是菌株MMB-51的菌落形态照片；
图3是生产生物表面活性剂和叶面肥增效剂的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规的分子生物学方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1菌株的筛选、鉴定
1.1菌株的筛选
采集黑龙江省大庆市东城区的环境样品活性污泥，装至无菌自封袋中密封，带回实验室及时进行菌种分离。
筛选过程如下：
(1)取0.5g活性污泥，加入1mL生理盐水(0.9％NaCl)，涡旋震荡混匀，对混合液进行梯度稀释10、102、103、104和105倍；
(2)在超净台中，分别吸取上述梯度稀释液100μL进行平板涂布操作，置于恒温培养箱中(37℃)，培养1天；
(3)在超净台中挑取不同的单菌落，分别接种于种子液培养基中，置于摇床中(37℃，180rpm)，培养1天；其中种子液培养基组分如下：葡萄糖2.0g/L，淀粉2.0g/L，酸水解酪素2.0g/L，酵母粉2.0g/L，胰蛋白胨2.0g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，磷酸氢二钾1.3g/L；
(4)取出摇床中的培养液1mL于1.5mL的离心管中，取离心(12000rpm， 1min)后上清液50μL，垂直悬加在平皿(3mL豆油+60mL ddH2O)油圈中央，轻微刺破液滴，观察扩油圈直径；
(5)如上述扩油圈直径大于4cm，则对该菌株进行纯化后保种在50％甘油保种管中(-80℃冰箱保藏)。
1.2菌株的鉴定
(1)菌株形态学鉴定：将菌种接种至LB固体平板上，37℃培养24小时后，观察菌落形态，菌落呈圆形、湿润，淡黄色菌落(如图2所示)；
(2)16S rRNA基因测序与***发育分析：从LB固体平板上刮取菌体，提取并扩增菌株16S rRNA基因，对PCR产物进行凝胶电泳分析，若出现目标条带，则把PCR产物送样至生工(上海)有限公司测序。测序结果在NCBI上比对初步鉴定具体的属，然后在EzBioCloud网站上调取该属相似性最接近的典型种进行进化树的构建，用Mega 6.0软件进行序列比对及分析，最后用邻接法构建***进化树并进行***发育分析。
(3)菌株16S rRNA基因测序与***发育分析：
经测序，MMB-51菌株的16S rRNA碱基序列长度为1441bp，如SEQ ID NO.1 所示。16SrRNA基因序列比对发现该菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus)的成员，EzBio Cloud网站上调取该属相似性最接近的典型种，比对发现与该属有效发表种贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis的相似性最高，且聚在一个独立的进化分支上(图1)。因此，综合形态观察以及16S rDNA序列分析，初步鉴定菌株MMB-51属于芽孢杆菌属的成员，为贝莱斯芽孢杆菌，命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis MMB-51，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年12月5日，保藏编号为CGMCC No.19099。
实施例2生物表面活性剂的生产
如图3所示，具体步骤如下：
步骤1、种子液制备：将菌株Bacillus velezensis MMB-51接种至种子液培养基中，37℃，180rpm摇床过夜培养；其中种子液培养基组分如下：葡萄糖2.0g/L，淀粉2.0g/L，酸水解酪素2.0g/L，酵母粉2.0g/L，胰蛋白胨2.0g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，磷酸氢二钾1.3g/L。
步骤2、发酵生产生物表面活性剂：将步骤1获得的种子液按1％(v/v)比例接种至发酵培养基中，37℃，180rpm摇床发酵培养36-48h；其中发酵培养基组分如下：蔗糖10.0g/L，酵母粉10.0g/L，七水合硫酸镁0.05g/L，磷酸氢二钾 0.325g/L。
步骤3、生物表面活性剂产物的提取：将步骤2所得发酵液在6000-10000 rpm，离心10min，收集上清液，再向新的发酵培养基中加入离心后所得的菌体沉淀，实现后续的连续发酵；向步骤3中获得的上清液中加入适量体积的6M HCl 使得上清液pH＝2.0，轻柔混匀，置于4℃冰箱中12-24h，然后在4℃，10000rpm 条件下离心15min，收集沉淀，弃除上清液，使用1M NaOH溶液将沉淀残留液体调节至中性，用真空冷冻干燥机冻干后得到生物表面活性剂的产品。
产品性能实验过程如下：
(1)在最适条件下(37℃，180rpm摇床发酵培养36-48h)，取培养液1mL 于1.5mL的离心管中，取离心(12000rpm，1min)后上清液50μL，垂直悬加在平皿(3mL豆油+60mL ddH2O)油圈中央，轻微刺破液滴，测量扩油圈直径(cm)；生物表面活性剂的扩油圈直径可达7cm以上。
(2)将上述上清液倒入新的50mL离心管中，加入适量体积的6M HCl使得上清液pH＝2.0，轻柔混匀，置于4℃冰箱中12-24h，然后在4℃，10000rpm 条件下离心15min，收集沉淀，弃除上清液，使用1M NaOH溶液将沉淀残留液体调节至中性，用真空冷冻干燥机冻干后得到生物表面活性剂的产品。在浓度为 11mg/L的情况下，表面张力值(ST)可降至28.5mN/m。
实施例3生物表面活性剂在制备叶面肥增效剂方面的应用
配制叶面肥与浓度为5mg/L至16mg/L的生物表面活性剂混合液，测量混合液在植物叶面上的铺展面积(空白对照为纯净水)；逐渐倾斜叶面使叶面肥缓慢流下叶面，计算叶面上混合液的残留量。通过比较叶面肥混合与叶面的接触面积以及叶面肥混合液在叶面上的残留量来评估生物表面活性剂作为叶面肥增效剂的效果。
通过实验结果分析：统一施加量为200μL，对照组(水)的叶面铺展直径约为1cm，残留量为9.9％左右；实验组叶面肥混合液的叶面铺展直径约为2cm，残留量可达39％以上。
序列表
<110> 江苏师范大学
<120> 一株产生物表面活性剂的贝莱斯芽孢杆菌MMB-51及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1441
<212> DNA
<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)
<400> 1
ggcgcgtgct ataatgcagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga tgttagcggc 60
ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc cgggaaaccg 120
gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt ggcttcggct 180
accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg 240
cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca 300
gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca 360
acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg gaagaacaag 420
tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg 480
tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag 540
ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg gggagggtca 600
ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg tagcggtgaa 660
atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct gtaactgacg 720
ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 780
acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta acgcattaag 840
cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 900
acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga 960
catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga caggtggtgc 1020
atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1080
ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt gacaaaccgg 1140
aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct 1200
acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca caaatctgtt 1260
ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct agtaatcgcg 1320
gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg 1380
agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aacctttagg agccagccgc cgaagtgaca 1440
a 1441

Claims (6)

1.一株产生物表面活性剂的贝莱斯芽孢杆菌MMB-51，其特征在于，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis MMB-51，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年12月5日，保藏编号为CGMCC No.19099。
2.权利要求1所述的产生物表面活性剂的贝莱斯芽孢杆菌MMB-51在制备叶面肥增效剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的产生物表面活性剂的贝莱斯芽孢杆菌MMB-51在制备叶面肥增效剂中的应用，其特征在于，具体步骤是：
步骤1：将菌种Bacillus velezensis MMB-51接种于种子液培养基中，180rpm，37℃恒温摇床培养12-16小时获得种子液；
步骤2：将步骤1中获得的种子液按体积比1％的比例转接到以蔗糖为碳源，以酵母粉为氮源的发酵培养基中，180rpm，37℃恒温摇床培养36-48小时获得发酵液；
步骤3：将发酵液离心，收集上清液；
步骤4：向步骤3中获得的上清液中加入适量体积的6M HCl使得上清液pH＝2.0，混匀，4℃条件下静置过夜，然后在4℃的条件下离心，收集沉淀，去除上清液，使用1M NaOH溶液将沉淀残留液体调节至中性，冷冻干燥后得到生物表面活性剂产品；
步骤5：将步骤4制得的生物表面活性剂产品溶解于水中，配制成浓度为5mg/L至16mg/L的溶液，作为叶面肥增效剂。
4.根据权利要求3所述的产生物表面活性剂的贝莱斯芽孢杆菌MMB-51在制备叶面肥增效剂中的应用，其特征在于，步骤1中所述种子液培养基的组成成分为：葡萄糖2.0g/L，淀粉2.0g/L，酸水解酪素2.0g/L，酵母粉2.0g/L，胰蛋白胨2.0g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，磷酸氢二钾1.3g/L。
5.根据权利要求3所述的产生物表面活性剂的贝莱斯芽孢杆菌MMB-51在制备叶面肥增效剂中的应用，其特征在于，步骤3中所述发酵培养基的组成成分为：蔗糖10.0g/L，酵母粉10.0g/L，七水合硫酸镁0.05g/L，磷酸氢二钾0.325g/L。
6.根据权利要求3所述的产生物表面活性剂的贝莱斯芽孢杆菌MMB-51在制备叶面肥增效剂中的应用，其特征在于，步骤3的离心转速为6000-10000rpm，离心10min；步骤4的离心转速为10000rpm，离心15min。
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