CN103323374A - 一种高通量筛选生物表面活性剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了辅助鉴定待测物质中是否含有生物表面活性剂的方法。本发明方法包括如下步骤：将混合物的液滴置于油滴上，静置，然后观察所述液滴是否扩散，若扩散，则所述待测物质中候选含有生物表面活性剂，若不扩散，则所述待测物质中候选不含有生物表面活性剂；所述混合物由待测物质、DMSO、缓冲液和染料组成。本发明方法具有操作简单、便捷、高通量的特点。

Description

一种高通量筛选生物表面活性剂的方法

技术领域

本发明涉及一种从海洋微生物天然产物库中高通量筛选生物表面活性剂的方法。

背景技术

海洋微生物是小分子药物、酶及生物表面活性剂等重要活性天然产物的重要来源。2008年，海洋天然产物中新化合物的数量超过了1000个，其中有差不多253个天然产物是来源于海洋微生物的。另外，大多数无脊椎动物来源的衍生物是微生物来源的，这一事实证明更多的海洋天然产物是微生物来源的。事实上分类学以及宏基因组学的不断发展为进一步研究海洋细菌及放线菌代谢产物提供了优势，而且为研究不可培养微生物带来很大的便利。例如，仅2009年一年的时间，至少60个新菌种在分类学的指导下发表。由于新化合物可以不断从新的菌种中分离得到，不断增加的海洋微生物以及从中分离到的新化合物形成了一个自然的天然产物库。2003年我国提出了建立生物资源保藏中心的目标，在微生物资源保藏项目中包括了三个层次的库：1.菌种库和基因库；（2）二级库：包括活性库、化合物库，指纹图谱等；（3）信息库：便于用户的使用。有效利用这些资源，构建高质量微生物天然产物库将是新型活性天然产物的发现的关键。但是，目前并没有构建天然产物库并进行生物表面活性剂筛选的研究。

表面活性剂作为应用广泛的精细化工原料，其在国外市场经历了较长的发展历程，需求增长相对平稳。2009年全球表面活性剂市场规模已达1,270万吨。据预测，全球表面活性剂市场需求的年均增长约在2%左右，亚洲已经超越欧美成为世界最大的表面活性剂市场，占全球市场份额上升至32%。中国和印度是亚洲表面活性剂最大消费市场，印度的日化产品市场正在以年均20%的速度快速增长，对表面活性剂的需求大幅增加。然而，化学表面活性剂的广泛利用导致的毒性、环境污染等问题为建立绿色环保可持续利用的生命环境带来了困难。众所周知，表面活性剂是化妆品和个人护理用品的一个必要成分，因此毒性及可降解性是表面活性剂在化妆品和个人护理用品中应用的重要指标。生物表面活性剂是一类极具吸引力的微生物表面活性化合物，具有丰富的结构多样性、广泛的生物活性以及独特的作用机制。生物表面活性剂具有环境友好、相对来讲无毒、已经可以生物降解等优点而成为代替化学合成表面活性剂的绿色产品。例如枯草芽孢杆菌产生的表面活性素，其钠盐的临界胶束浓度是十二烷基硫酸钠的1000倍，同时稳定性好、具有较低的刺激性和毒性。目前微生物来源的天然表面活性剂主要限制在脂肽（表面活性素）和糖脂（鼠李糖脂和槐糖脂）的研究上。然而，高生产成本阻碍了这些生物表面活性剂走向商业化生产的道路。研究者认为，新型生物表面活性剂的开发有助于突破生物表面活性剂难以产业化的瓶颈。

生物表面活性剂的需求使得研究者开始建立生物表面活性剂的筛选方法。早期的生物表面活性剂筛选方法基于生物表面活性剂的物理化学性质如降低表面张力、乳化等作用对微生物的代谢产物进行评价，也有根据生物表面活性剂的溶血活性进行筛选方法的研究。也有研究根据部分生物表面活性剂在溶液中形成沉淀的性质建立了浊度法对生物表面活性剂进行定量分析。随后也有利用分子生物学的方法筛选生物表面活性剂的合成基因。然而，缺乏针对天然产物库的高通量生物表面活性剂筛选方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种高通量筛选生物表面活性剂的方法。

本发明所提供的高通量筛选生物表面活性剂的方法，包括如下步骤：

建立高通量油滴塌陷法对构建的粗体物库进行筛选，将混合物的液滴置于油滴上，静置，然后观察所述液滴是否扩散，若扩散，则所述待测物质中候选含有生物表面活性剂，若不扩散，则所述待测物质中候选不含有生物表面活性剂。

所述混合物由待测物质、DMSO、缓冲液和染料组成。

上述方法中，所述不扩散指液滴的直径在静置前和静置后无显著差异，所述扩散指液滴的直径在静置前和静置后有显著差异。

上述方法中，所述染料为只溶于水不溶于油的染料；所述缓冲液为只溶于水不溶于油的缓冲液；进一步的，所述缓冲液最好为能够溶解所述待测物质的缓冲液。

上述方法中，所述混合物是按照包括如下步骤的方法制备得到的：用DMSO溶解所述待测物质，得到溶液Ⅰ，将所述溶液Ⅰ与所述缓冲液和所述染料的水溶液混匀，得到所述混合物；所述溶液Ⅰ、所述缓冲液和所述染料的水溶液的体积比为5：100：5；所述溶液Ⅰ是将200-400mg待测物质溶于1mL DMSO中得到的，所述染料的水溶液中染料的浓度为2g/L。

上述方法中，所述缓冲液为浓度为0.1M、pH值为7.0的PBS缓冲液；所述染料为次甲基蓝。

上述方法中，所述油滴为石蜡油的油滴。

上述方法中，所述油滴的体积为2μL，所述混合物的液滴的体积为5μL。

上述方法中，所述静置的时间为15min。

上述方法中，所述生物表面活性剂为表面活性素、达托霉素或鼠李糖脂。

所述方法中，在将混合物的液滴置于油滴上之前，包括如下步骤：将所述混合物放置1h，将油滴滴在96孔板上，静置1h。

上述方法中，所述待测物质为菌的发酵物。

上述方法中，所述油滴滴在96孔板上。

本发明的另一个目的是提供一种构建海洋微生物天然产物库的方法。

本发明所提供的构建海洋微生物天然产物库的方法，包括如下步骤：

1）从海洋的海泥中分离得到若干株芽孢菌菌株和/或放线菌菌株；

2）分别发酵培养所述芽孢菌菌株或放线菌菌株，分别得到发酵物；

3）制备提取物：

a）所述菌株为芽孢菌，将所述发酵物离心，取上清，将上清进行酸沉淀，取沉淀物；将沉淀物用甲醇或CH₂Cl₂萃取，取有机相，干燥，得到粗提物；将粗提物用于鉴定；

b）所述菌株为放线菌，将所述发酵物用大孔吸附树脂进行吸附，再离心，收集沉淀物；将沉淀物用甲醇或CH₂Cl₂萃取，取有机相，干燥，得到粗提物；将粗提物用于鉴定；

4）所有菌株的提取物构成海洋微生物天然产物库。

由上述方法构建得到的海洋微生物天然产物库也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的从海洋微生物天然产物库中辅助筛选生物表面活性剂产生菌的方法，包括如下步骤：

1）按照上述方法构建海洋微生物天然产物库；

2）按照辅助鉴定待测物质中是否含有生物表面活性剂的方法，分别鉴定所述海洋微生物天然产物库中每株菌的提取物中是否含有生物表面活性剂，若含有生物表面活性剂，则所述菌株候选为生物表面活性剂产生菌。

上述从海洋微生物天然产物库中辅助筛选生物表面活性剂产生菌的方法中，在所述步骤2）后，包括如下去重复的步骤：将步骤2）得到的生物表面活性剂产生菌分别进行16S rDNA序列测定，和对步骤2）得到的生物表面活性剂产生菌的所述提取物分别进行质谱检测，如果其中某些所述生物表面活性剂产生菌的16S rDNA序列相同且其发酵物的质谱检测结果相同，则只保留其中的一株菌，将其余重复的菌株舍弃。

本发明针对的是具有丰富多样性的高质量微生物天然产物库。其具体构建策略如下：针对海洋来源的放线菌新菌，采用十种培养基进行新菌进行高通量摇瓶发酵，刺激多样性的代谢产物的产生，提高活性代谢产物发现的几率。针对生物表面活性剂大多数是微生物的胞外次生代谢产物，本发明采用大孔树脂吸附结合甲醇萃取的方法制备粗体物库。对于海洋来源的芽孢菌，不同的芽孢菌在同一培养基中发酵来，利用酸沉淀、冷冻干燥以及甲醇萃取的方法来制备粗体物。放线菌和芽孢菌产生的粗体物库均保存在96孔浅孔板中，每孔大概含有粗体物0.2-0.4mg。

本发明所建立的高通量筛选模型利用水溶性的色素次甲基蓝来清楚地观察液滴在油膜表面的行为。因为次甲基蓝是水溶性的，它不溶于石蜡油，而生物表面活性剂的存在增加了水滴和油滴的亲和性，所以含有次甲基蓝的生物表面活性剂溶液在油滴表面的行为就是蓝色水滴的行为。为了使微生物代谢物粗提物很好地溶于水中，本发明利用了与水互溶的DMSO作为助溶剂，将粗提物DMSO溶液加入到PBS中，用于油滴塌陷实验。DMSO本身在一定的浓度下有表面活性，而通过排油圈实验找出没有表面活性的DMSO的浓度，用于溶解微生物粗体物，在此条件下的检测结果代表的就是粗提物的表面活性。另外，该方法除了在96孔板板盖上操作，还可以在浅孔板中以及其它任何具有聚苯乙烯材料的表面完成，充分体现了其方便性。本发明方法操作简便，结果准确可靠。

利用建立的方法对芽孢菌和放线菌代谢物库进行了筛选。发现放线菌代谢物中很多具有表面活性，而且菌株不同，其产生表面活性物质的培养基不一样。这说明本发明所采取的多种培养基发酵同一株菌确实提高了表面活性化合物发现的几率。同时，对粗提物的高效液相色谱分析发现这些代谢物具有丰富的多样性。

LC-MS方法对阳性粗体物进行去重复，及排除发现已知生物表面活性剂（如脂肽）的可能性。

本发明所建立的微生物粗体物库也是重要的药物粗体物库。当用其它抗微生物模型对天然产物库的筛选的时候，还发现了具有抗微生物活性的粗提物。进一步比较分析生物表面活性剂筛选和抗微生物活性筛选所得的结果，发现一些粗提物既具有生物表面活性剂性质，又具有抗微生物活性。因此这种方法不仅增加了生物表面活性剂的多样性，而且增加了粗体物库中的代谢物的活性多样性。

本发明方法具有操作简单、便捷、高通量的特点。

附图说明

图1为利用本发明方法对不同浓度的生物表面活性剂进行筛选的结果。

图2为利用本发明方法对放线菌代谢物的检测结果。

图3为MS523和MS534的代谢物的复筛结果。

图4为对含有阳性和阴性结果的图。

图5为基于16S rRNA对19株活性菌株建立的***发育树。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、高通量筛选模型和筛选条件的确定

一、DMSO浓度的确定

DMSO本身具有表面活性，为研究DMSO活性可以忽略的稀释比率，分别用PBS对DMSO进行了0，2，5，10，20和50的稀释，然后用排油圈检测稀释的DMSO的活性。

排油圈法：在直径9cm的平板上加上15mL自来水，然后加10μL石蜡油，稳定后将5μL DMSO溶液小心地加入石蜡油油滴的中央，由此扩散开来的油圈的直径的大小用于表示所测溶液的表面活性的大小。排油圈实验中油圈的直径大小与表面活性剂的浓度成正相关。

实验设3次重复，结果如表1所示。由表1中的结果可以看出，当DMSO稀释10倍，20倍和50倍的时候，其排油圈直径为0，可以得出此稀释浓度下DMSO的浓度可以忽略不计。以后的实验中，选择20倍稀释的DMSO用作粗提物的溶剂。

表1、DMSO浓度对PBS表面活性的影响

二、液滴中粗提物浓度的确定

油滴制备：所用的96孔板为聚苯乙烯材料的浅孔板。每个孔上滴加2μL石蜡油，放置1h后进行油滴塌陷实验。

液滴制备：将粗体物溶于200μL DMSO，得到不同浓度的生物表面活性剂的DMSO溶液；取5μL生物表面活性剂的DMSO溶液放入100μL浓度为0.1M、pH值为7.0的PBS缓冲液中，然后加入5μL2g/L的次甲基蓝水溶液，得到的混合液记作检测液。

检测：取5μL检测液滴加到油滴上，放置15min，再观察液滴的形状。再观察液滴是否扩散。不含表面活性剂的检测液滴的扩散直径在放置15min前和放置15min后无显著差异，含有表面活性剂的检测液滴扩散后的直径在放置15min前和放置15min后有显著差异。

结果如表2和图2所示。A—H表示DMSO溶液中生物表面活性剂的浓度，A，B，C，D，E，F，G和H所对应的表面活性剂的浓度为800，400，200，100，50，25，12.5和6.25μg/mL。1-8分别表示对照和不同的天然产物，依次为：1.DMSO、2.表面活性素（Surfactin）、3.达托霉素（Daptomycin）、4.鼠李糖脂（Rhamnolipid）、5.Aspergillus ustus在M22培养基中培养的粗提物、6.Aspergillus ustus用M20培养基培养的粗提物、7.Bacillus velezensis H3代谢物的酸沉淀、8.穿心莲内酯衍生物（14-Alpha-lipoyl andrographolide）。

结果表明，在同一行中，含有DMSO的PBS溶液的液滴依然保持不变，用“-”表示（表2）。而表面活性素和鼠李糖脂的液滴（200μg/mL）在油滴表面扩散开来，用“+”表示（表2）。Aspergillus ustus在M22和M20培养基中生长的代谢物也在油滴表面扩散，但比表面活性素和鼠李糖脂的弱，这说明该代谢物的表面活性比表面活性素和鼠李糖脂的弱。

在同一列中，仅含有DMSO的PBS的液滴仍然不变，而表面活性素和鼠李糖脂的液滴随着浓度的稀释，其液滴的形状也变得越来越小。当表面活性剂的浓度稀释到6.25μg/mL时，表面活性素仍然具有表面活性而此浓度下的鼠李糖脂的表面活性却不存在。“+”的数量表示活性的强弱，数量越多，表示活性越强（表2）。

表2与图1中活性对应的符号标记

	1	2	3	4	5	6	7	8
									A	-	+++++	-	+++++	+	+++++	+++++	-
B	-	+++++	-	+++++	+	+++	++++	-
									C	-	+++++	-	++++	-	+++	++++	-
D	-	++++	-	+++	-	++	++	-
									E	-	+++	-	++	-	++	++	-
F	-	++	-	+	-	+	+	-
									G	-	+	-	-	-	-	+	-
H	-	-	-	-	-	-	-	-

三、筛选方法

油滴准备：所用的96孔板为聚苯乙烯材料的浅孔板。每个孔上滴加2μL石蜡油，放置10min后进行检测。

液滴准备：将200-400mg待测物质溶于1mL DMSO中，得到待测物质的DMSO溶液；取5μL待测物质的DMSO溶液与100μL浓度为0.1M、pH值为7.0的PBS缓冲液混合；再加入5μL2g/L的次甲基蓝水溶液，得到的混合物记作检测液。将检测液静置1h后，进行检测。

检测：取5μL检测液加入到油滴形成的油膜上，放置15min，再观察液滴是否扩散，若扩散，则所述待测物质中候选含有生物表面活性剂，若不扩散，则所述待测物质中候选不含有生物表面活性剂。不具有表面活性的液滴直径在放置15min前和放置15min后无显著差异（即不扩散），具有表面活性的液滴在放置15min前和放置15min后有显著差异（即扩散）。

仍然保持球状（即不扩散）的液滴表示无表面活性，用“-”表示；扩散的液滴表示有表面活性，用“+”表示；液体扩散的越大，其表面活性越强，用更多的“+”表示。

实施例2、生物表面活性剂产生菌的筛选

一、本发明筛选方法如下：

1、菌株来源；本发明将海泥进行纯培养，分别获得放线菌和芽孢菌单菌株。其中海泥来源于大连黄渤海海泥50米，南海海泥3602米，南海海泥3622米，南海海泥3601米。

2、菌株发酵物的粗提物的制备

（1）芽孢菌：将各芽孢菌分别接种到含LB培养基的平板上并在35℃培养24h，然后接种到LB液体培养基上培养48h，作为种子培养液。种子培养液按4%接种量接种到液体发酵培养基中，35℃培养2天，发酵液8000转离心5min去除菌体，上清液进行酸沉淀（酸沉淀的具体操作为：向上清液中加入6M HCl，使溶液pH值为2.0，然后置于4℃冰箱中静置过夜），然后进行冷冻干燥。冷冻干燥后的每个样品用甲醇或CH₂Cl₂萃取，取有机相，干燥，得到粗提物。

（2）放线菌：将各放线菌分别接种到ISP2平板培养基上培养（温度28℃，时间3-4天）；再接种到ISP2液体培养基，培养（温度28℃，时间7天），得到种子培养液；按4%的接种量接种到十种不同的发酵培养基上，在28℃、150rpm培养7天，发酵结束后，向每一瓶中分别加入2mL大孔吸附树脂，并振摇使之充分吸附，然后在8000rpm离心5min，所获得的沉淀进行冷冻干燥。冷冻干燥后的每个样品用甲醇或CH₂Cl₂萃取，取有机相，干燥，得到粗提物。

十种不同的发酵培养基分别为：

1)M1：可溶性淀粉20g，酵母浸出液8.0g，蛋白胨4.0g，CaCO₃1.0g，蒸馏水1L，pH7.2，121℃灭菌20min。

2)M2：可溶性淀粉20g；葡萄糖4g；磷酸氢二钾0.5g；硝酸钾1.0g；七水硫酸镁0.5g；七水硫酸亚铁0.01g；3%海盐1L，pH7.0-7.2。

3)M3：淀粉5g；葡萄糖20g；大豆粉10g；蛋白胨2g；酵母膏2g；氯化钠4g；磷酸氢二钾0.5g；七水硫酸镁0.5g；碳酸钙2g，3%海盐1L，pH7.8。

4)M4：麦芽浸膏10g；酵母膏4g；葡萄糖4g；3%海盐1L，pH7.2-7.4。

5)M5：葡萄糖10g，稷粉（millet meal）20g，药媒20g，MOPS20g，蒸馏水1L，pH7.0。

6)M6（静置液体培养基）：葡萄糖1g，乳糖10g，甘油20ml，大豆蛋白胨5g，硝酸铵1.5g（1.5g硝酸铵可用1.24g硫酸铵和1.89g硝酸钾代替），酵母粉1g，1倍微量元素液0.2ml，蒸馏水1L，pH6.0。

微量元素液配方1倍（Trace Mix）:硫酸亚铁4g，硫酸锰5g，七水硫酸锌2.5g，硼砂1.4g，六水氯化钴0.2g，五水硫酸铜0.5g，二水硫酸镁钠0.2g，蒸馏水1L，pH7.2，121°C灭菌20min。

7)M7:葡萄糖5g,淀粉10g,蛋白胨10g,大豆蛋白胨10g,酵母提取物3g,硝酸钾1g,痕量元素0.2ml,碳酸钙1g,蒸馏水1L，pH7.0。

8)M8:蔗糖20g,细菌蛋白胨2g,蔗糖蜜5g,七水硫酸亚铁0.1g,七水硫酸镁0.2g,碘化钾0.1g,碳酸钙2.5g，蒸馏水1L，pH7.0。

9)M9：葡萄糖10g，淀粉10g，大豆粉15g，磷酸二氢钾1g，七水硫酸镁1g，氯化钠3g，五水硫酸铜0.007g，七水硫酸亚铁0.001g，四水氯化锰0.008g，五水硫酸锌0.002g，蒸馏水1L，pH7.0。

10)M10：淀粉10g，葡萄糖10g，甘油10g，玉米浆干粉(Marcor)2.5g，蛋白胨(Difco)5g，酵母提取物2g，氯化钠1g，碳酸钙3g，蒸馏水1L，pH7.3。

3、筛选：按照实施例1中实验三中所述方法进行筛选。

4、将筛选得到的生物表面活性剂产生菌进行去重复：

（1）16S rDNA的测定：对各个有活性的纯培养物进行16S rDNA序列测定，并进行序列比对；

16S rDNA序列测定的方法：活性菌株基因组DNA的提取根据TINAamp BacteriaDNA试剂盒的说明书进行操作。扩增所用引物：27f:5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';1492r:5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3')。用于PCR扩增的引物、聚合物酶及DNA的浓度分别为25μM,5.0U/μL和10mg/L。PCR参数设定：94°C预变性5min；95°C扩增变性1min，55°C退火1min，72°C延伸1min15s，最后72°C延伸10min，4°C保存。利用CLUSTAL X1进行与最相似芽孢菌DNA的平行序列比对以及相似度计算。利用MEGA4.0软件，采用Saitou和Nei提出的neighbor-joining进化树算法构建进化树。通过重复抽样1000次分析进化树的拓扑结构。

（2）电喷雾质谱

将有生物表面活性剂的各纯培养物的粗提物分别进行液相色谱-质谱连用的分析。反相液相色谱（Zorbax SB-C18,5mm,250×4.6mm i.d.）所用***为Agilent1100系列（Agilent Technologies Inc.,Palo Alto,CA,USA）。

色谱条件：流动相为甲醇和水，0min，5%甲醇，20分钟，100%甲醇，流速为1mL/min.紫外检测波长为210nm.

质谱条件：离子化模式：电喷雾；喷雾压：30.0psi，干燥器流速:10.0L/min,离子化温度:350°C，检测方式：正离子模式；质荷比扫描范围：200-2000。

二、采用现有技术检测粗提物中是否含有生物表面活性剂

（一）表面张力法检测

将粗提物溶于0.1M PBS溶液，测其表面张力。表面张力使用Krüss DSA100张力仪（德国汉堡）采用悬滴法测定。实验采用直径0.2mm的不锈钢针头，相对湿度20%。通过针头将液滴形状符合拉普拉斯方程，液滴的形状与界面张力相关。当表面张力值在1min内变化值小于0.02mN/m时认为表面张力处于稳定状态。表面张力小于等于35mN/m，则认为所测粗提物中含有生物表面活性剂。

（二）电喷雾质谱

将有生物表面活性剂的粗提物分别进行液相色谱-质谱连用的分析。反相液相色谱（Zorbax SB-C18,5mm,250×4.6mm i.d.）所用***为Agilent1100系列（AgilentTechnologies Inc.,Palo Alto,CA,USA）。

色谱条件：流动相为甲醇和水，0min，5%甲醇，20分钟，100%甲醇，流速为1mL/min.紫外检测波长为210nm。

质谱条件：离子化模式：电喷雾；喷雾压：30.0psi，干燥器流速:10.0L/min,离子化温度:350°C，检测方式：正离子模式；质荷比扫描范围：200-2000。

三、结果

（一）对芽孢菌的筛选结果

结果如表3所示。结果一共筛选到14个生物表面活性剂产生菌。通常，表面张力降低到35mN/m的液滴认为含有生物表面活性剂。表3表明，本发明方法可以成功筛选到生物表面活性剂产生菌。MB240发酵液的表面张力降低到23.88mN/m，而34.49mN/m表明MB195的表面活性最弱。

表3、芽孢菌活性菌株的来源及其活性

将芽孢菌中的14株活性芽孢菌进行16S rDNA序列测定，进而进行菌株鉴定，结果如表4所示。

对各菌株的粗提物的活性成分进行了质谱分析。结果如表4所示。

MB217,MB221和MB241属于同一菌种。ESI-MS分析结果表明，MB217,MB221和MB241的代谢物中均含有surfactin，然而，MB241除了能产生surfactin，还产生另外一类分子量为1108,1123,1137,1151的化合物。它们对应的表面张力值依次为31.51，29.55和28.46mN/m，相差不多；由于这种表面张力值相差不大，所以菌株MB217和MB221对应的不同的表面张力可能是由于同种粗提物的产量不同造成的，而菌株MB221和MB241对应的表面张力不同，其代谢物的量以及种类均可能是影响因素。

MB191和MB195属于同一菌种，但其对应的表面张力值分别为25.14和34.19mN/m，相差较大，表明其发酵物提取物的活性不同；为确定活性的不同是否是粗提物种类的不同造成的，采用ESI-MS针对MB191和MB195的粗提物进行了研究，质谱分析结果表明MB191和MB195粗提物的分子量分别为1007,1021,1035和1179,1197,1121；前者代谢物为表面活性素，而后者代谢物为不同surfactin的其它化合物，可能为新化合物。表明，在本筛选方法中，同一菌株产生的粗提物可能是多个种类的，不应仅凭16S rDNA进行去重复。

表4、芽孢菌的鉴定及其代谢物的质谱分析结果

*CH₂Cl₂萃取发酵液上清液所得粗提物。

（二）对放线菌的筛选结果

对放线菌新菌代谢产物的筛选结果如表4所示，结果一共筛选到31个生物表面活性剂产生菌。

其中，部分菌株的油滴塌陷图如图2所示，与该图对应的实验设计如表6所示（图2和表5中，1表示DMSO；12表示鼠李糖脂；2-11表示同一纯培养菌株在10种不同的培养基中培养得到的粗提物；A-H表示不同的纯培养菌株）。说明菌株MS525和MS537通过10种培养基培养出来的代谢物均有油滴塌陷作用。

针对MS523和MS534中活性较好的粗提物进行了二倍梯度稀释，以进行复筛，实验设计如表7所示，实验结果如图3所示。从结果中可以看出MS523和MS534中活性较好的代谢物粗提物针对的培养基为分别为M6和M7。上述实验数据证明，利用本发明方法，可以从天然产物库中发现活性菌株及其响应的产表面活性剂的培养条件。

表5、放线菌代谢物的筛选结果

产物板

菌株

本发明的筛选方法

阳性结果对应的培养基数目

最优培养基

111	MS511	++	3Medium	M9
					121	MS512	+++	4Medium	M6
111	MS513	++++	2Medium	M5
					121	MS514	+++	4Medium	M5
121	MS516	+++	8Medium	M4
					121	MS517	+++	4Medium	M2
119	MS523	+++++	8Medium	all
					115	MS524	++++	9Medium	M6
119	MS525	++++	1Medium	M9
					112	MS528	+++++	7Medium	all
113	MS534	+++++	10Medium	all
					120	MS535	+++++	5Medium	M5
120	MS536	+++++	10Medium	M7
					113	MS538	++++	1Medium	M5
120	MS539	++++	1Medium	M2
					120	MS540	+++	1Medium	M2
117	MS541	+++++	3Medium	M3
					117	MS542	+++	4Medium	M9
117	MS544	+++	1Medium	M5
					117	MS546	+++	2Medium	M5
117	MS547	++	2Medium	M7
					117	MS548	++	1Medium	M5
115	MS549	++++	8Medium	M9
					115	MS551	+++	8Medium	M7
116	MS580	+++	6Medium	all
					116	MS581	++	6Medium	all
116	LS1750	+++	5Medium	all
					119	LS1754	++++	2Medium	M9
119	LS1755	++++	1Medium	M9
					119	LS1756	+++	2Medium	M9
119	LS1757	+++	3Medium	M9

表6、与图2对应的产物板

表7、MS523和MS534的复筛的实验设计（与图3对应的实验设计）

LS1754

LS1755

MS523

MS523

MS523

MS523

MS523

MS523

MS523

MS523

M9

M9

M10

M5

M3

M9

M6

M1

M4

Ca

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

100

2×

2×

2×

2×

2×

2×

2×

2×

2×

2×

8

B

100

4×

4×

4×

4×

4×

4×

4×

4×

4×

4×

4

C

100

8×

8×

8×

8×

8×

8×

8×

8×

8×

8×

2

D

100

16×

16×

16×

16×

16×

16×

16×

16×

16×

16×

1

E

100

32×

32×

32×

32×

32×

32×

32×

32×

32×

32×

0.5

F

100

64×

64×

64×

64×

64×

64×

64×

64×

64×

64×

0.25

G

100

128×

128×

128×

128×

128×

128×

128×

128×

128×

128×

0.125

H

100

256×

256×

256×

256×

256×

256×

256×

256×

256×

256×

0.0625

MS534

MS534

MS534

MS534

MS534

MS534

MS534

MS534

MS534

MS534

M2

M7

M6

M1

M8

M5

M9

M3

Ab

M4

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

100

2×

2×

2×

2×

2×

2×

2×

2×

2×

2×

8

B

100

4×

4×

4×

4×

4×

4×

4×

4×

4×

4×

4

C

100

8×

8×

8×

8×

8×

8×

8×

8×

8×

8×

2

D

100

16×

16×

16×

16×

16×

16×

16×

16×

16×

16×

1

E

100

32×

32×

32×

32×

32×

32×

32×

32×

32×

32×

0.5

F

100

64×

64×

64×

64×

64×

64×

64×

64×

64×

64×

0.25

G

100

128×

128×

128×

128×

128×

128×

128×

128×

128×

128×

0.125

H

100

256×

256×

256×

256×

256×

256×

256×

256×

256×

256×

0.0625

对芽孢菌和放线菌代谢物的筛选结果如表8所示，从中可以看出芽孢菌和放线菌中，产生生物表面活性剂的菌的比率分别为8.3%和24.3%。

表8、芽孢菌及放线菌新菌的活性筛选率

天然产物库	芽孢菌	放线菌
			菌株数量	60	70
生物表面活性剂产生菌(粗提物)	14(60)	17(700)
			去重复后的阳性菌株	5	17
阳性率	8.3%	24.3%

实施例3、本发明高通量筛选方法（模型）的评价

根据如下方程计算筛选模型的信噪比(S:N)和Z′因子(Du et al.,2006,Zhang et al.,1999):

其中，SDn和SDp是阴性对照(n)DMSO和阳性对照(p)鼠李糖脂的标准偏差，μ_n–μ_p是DMSO和鼠李糖脂的平均值之差。

Z′factor=1–(3SD_n+3SD_p)/|μn–μp|。其中，Z′因子是模型不受检测化合物的干扰的一个稳定性指标。

阴性对照打分为1，阳性对照根据液滴在石蜡油表面的表现行为给予4-5分。所有的实验数据通过Microsoft Excel(Microsoft Corporation,Redmond,WA)和Prism5.0(Graphpad Software,San Diego,CA)进行分析。

经过计算图4中的数值，可以得出Z’因子和信噪比分别为

Z’factor=1-3*0.46/(4.75-1)=0.63，S:N=(4.75-1)/(0.46²+0²)^0.5=8.15.

图4中，A1-H1为阴性对照(DMSO),A12-H12为阳性对照(200μg/mL鼠李糖脂).

实施例4、利用高通量筛选方法对天然产物库进行评价

选择了19株活性菌株进行了***发育树的构建，该树采用NJ法建立，标尺代表每个核苷酸位置有0.02次替代。结果如图5所示。从图中可以看出，生物表面活性剂产生菌一共有七个类群，其中一些分类学地位十分相近，可以看出天然产物库中存在丰富的生物表面活性剂及其产生菌。说明表面活性剂产生菌的多样性，进而说明天然产物库具有较好的质量。

Claims (10)

1.一种高通量鉴定待测物质中是否含有生物表面活性剂的方法，包括如下步骤：将混合物的液滴置于油滴上，静置，然后观察所述液滴是否扩散，若扩散，则所述待测物质中候选含有生物表面活性剂，若不扩散，则所述待测物质中候选不含有生物表面活性剂；

所述混合物由待测物质、DMSO、缓冲液和染料组成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述混合物是按照包括如下步骤的方法制备得到的：用DMSO溶解所述待测物质，得到溶液Ⅰ，将所述溶液Ⅰ与所述缓冲液和所述染料的水溶液混匀，得到所述混合物；所述溶液Ⅰ、所述缓冲液和所述染料的水溶液的体积比为5：100：5；所述溶液Ⅰ是将200-400mg待测物质溶于1mLDMSO中得到的，所述染料的水溶液中染料的浓度为2g/L。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述缓冲液为浓度为0.1M、pH值为7.0的PBS缓冲液；所述染料为次甲基蓝。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述油滴为石蜡油的油滴。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述油滴的体积为2μL，所述混合物的液滴的体积为5μL。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述静置的时间为15min。

7.一种构建海洋微生物天然产物库的方法，包括如下步骤：

1）从海洋的海泥中分离得到若干株芽孢菌菌株和/或放线菌菌株；

2）分别发酵培养所述芽孢菌菌株或放线菌菌株，分别得到发酵物；

3）制备提取物：

a）所述菌株为芽孢菌，将所述发酵物离心，取上清，将上清进行酸沉淀，取沉淀物；将沉淀物用甲醇或CH₂Cl₂萃取，取有机相，干燥，得到粗提物；将粗提物用于鉴定；

b）所述菌株为放线菌，将所述发酵物用大孔吸附树脂进行吸附，再离心，收集沉淀物；将沉淀物用甲醇或CH₂Cl₂萃取，取有机相，干燥，得到粗提物；将粗提物用于鉴定；

4）所有菌株的提取物构成海洋微生物天然产物库。

8.由权利要求7所述方法构建得到的海洋微生物天然产物库。

9.一种从海洋微生物天然产物库中辅助筛选生物表面活性剂产生菌的方法，包括如下步骤：

1）按照权利要求7所述方法构建海洋微生物天然产物库；

2）按照权利要求1-6中任一所述方法，分别鉴定所述海洋微生物天然产物库中每株菌的提取物中是否含有生物表面活性剂，若含有生物表面活性剂，则所述菌株候选为生物表面活性剂产生菌。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：在所述步骤2）后，包括如下去重复的步骤：将步骤2）得到的生物表面活性剂产生菌分别进行16S rDNA序列测定，和对步骤2）得到的生物表面活性剂产生菌的所述提取物分别进行质谱检测，如果其中某些所述生物表面活性剂产生菌的16S rDNA序列相同且其发酵物的质谱检测结果相同，则只保留其中的一株菌，将其余重复的菌株舍弃。

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