CN111684062A - 制造t细胞的方法 - Google Patents

制造t细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111684062A
CN111684062A CN201980011930.8A CN201980011930A CN111684062A CN 111684062 A CN111684062 A CN 111684062A CN 201980011930 A CN201980011930 A CN 201980011930A CN 111684062 A CN111684062 A CN 111684062A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hours
days
cells
cell
hour
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980011930.8A
Other languages
English (en)
Inventor
M·卡尔拉
Z·科赫兰
A·阿尔珀特
S·沃尔特
A·***
A·布尔戈尼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Imatix Usa Inc
Original Assignee
Imatix Usa Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE102018108996.1A external-priority patent/DE102018108996B4/de
Application filed by Imatix Usa Inc filed Critical Imatix Usa Inc
Publication of CN111684062A publication Critical patent/CN111684062A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2312—Interleukin-12 (IL-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Abstract

本公开涉及用于过继免疫疗法的T细胞制造方法。本公开还提出了基因转导T细胞的方法、使用T细胞及其T细胞群的方法。一方面，本公开提出解冻冷冻的外周血单核细胞(PBMC)、静置解冻的PBMC、用固定于固相上的抗CD3抗体和抗CD28抗体激活培养的PBMC中的T细胞、用病毒载体转导激活的T细胞、扩增转导的T细胞以及获得扩增T细胞的方法。

Description

制造T细胞的方法
相关申请的交叉引用
本申请为美国临时申请，其要求2018年9月3日提交的美国临时申请号62/726,350、2018年3月23日提交的美国临时申请号62/647,571、2018年2月21日提交的美国临时申请号62/633,113、2018年2月9日提交的美国临时申请号62/628,521、2018年4月16日提交的德国专利申请号10 2018 108 996.1、2018年2月28日提交的德国专利申请号102018 104628.6、2018年2月9日提交的德国专利申请号10 2018 102 971.3的优先权，各自内容透过引用整体并入本文。
发明领域
本公开一般涉及用于过继免疫疗法的T细胞制造方法。本公开还提出了基因转导T细胞的方法、使用T细胞及其T细胞群的方法。
背景
最近，透过T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的基因强制表达重定向T细胞对肿瘤相关抗原的特异性提升了过继性T细胞转移领域。第二代和第三代CAR的使用有助于解决长期存在的转移后体内T细胞持久性不足的问题，而该问题严重阻碍了其功效。然而，更广泛应用的重大障碍仍然存在，例如：需要在个体化的基础上生产T细胞产物，这使得此种具有前景的治疗方法难以在经济上可行。虽然使用T细胞(例如自体T细胞)已经显示出前景，但在先前高度治疗的患者中可能难以获得合适数量的自体细胞。
US 2003/0170238和US 2003/0175272描述了过继性免疫疗法的方法，其中可透过将T细胞从激活刺激物移开而使T细胞静置至少48-72小时(通常至少约72-120小时)，然后透过用有丝***单克隆抗体(mAb)(诸如可溶性抗CD3和抗CD28 mAb)等标记细胞在输注前重新激活它们，再将标记的细胞与任选在单核细胞和粒细胞中增强的自体单核细胞混合。
美国2017/0051252描述了制造T细胞治疗剂的方法，包括获得含有T细胞和抗原呈递细胞(APC)的细胞群的步骤；在细胞培养基中培养细胞群，所述细胞培养基包含(i)一种或多种细胞因子、(ii)一种抗CD3抗体或其CD3结合片段和(iii)一种抗CD28抗体或其CD28结合片段、B7-1或其CD28结合片段或B7-2或其CD28结合片段，其中培养物激活并刺激T细胞；用病毒载体转导激活的细胞群；以及在细胞生长培养基中培养细胞群以扩增转导的T细胞；从而制造T细胞治疗剂。
需要改进的策略来体外转导细胞群，从而可能产生足够的T细胞用于研究、诊断和治疗目的。本文提出了该技术问题的一种解决方案。
简要概述
一方面，本公开涉及一种转导T细胞的方法，包括解冻冷冻的外周血单核细胞(PBMC)、静置解冻的PBMC、用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活培养PBMC中的T细胞、用病毒载体转导激活的T细胞、扩增转导的T细胞以及获得扩增的T细胞。
一方面，T细胞在培养的PBMC中被固定于固相支持物上的抗CD3抗体和抗CD28抗体激活。
另一方面，静置步骤可能在不超过约1小时、不超过约2小时、不超过约3小时、不超过约4小时、不超过约5小时、不超过约6小时、不超过约7小时、不超过约8小时、不超过约9小时、不超过约10小时、不超过约11小时、不超过约12小时、不超过约18小时、不超过约24小时、不超过约48小时、不超过约36小时、不超过约48小时、不超过约60小时、不超过约72小时、不超过约84小时、不超过约96小时、不超过约108小时或不超过约120小时的时间段内进行。
另一方面，静置可能在约0.5小时至约48小时、约0.5小时至约36小时、约0.5小时至约24小时、约0.5小时至约18小时、约0.5小时至约12小时、约0.5小时至约6小时、约1小时至约6小时、约2小时至约5小时、约3小时至约5小时、约3小时至约4小时、约4至约5小时、或约1小时至约24小时、约2至约24小时、约12至约48小时、约0.5小时至约120小时、约0.5小时至约108小时、约0.5小时至约96小时、约0.5小时至约84小时、约0.5小时至约72小时或约0.5小时至约60小时的时间段内进行。
另一方面，静置步骤可能在约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时或约10小时的时间段内进行。
一方面，透过约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约2小时至约5小时、约3小时至约5小时、约3小时至约4小时或约4至约5小时的静置步骤所产生的T细胞倍数扩增是透过约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约24小时或约16至约20小时的静置步骤所产生的T细胞倍数扩增的约相等(约1:1)、约至少1.1倍、约至少1.2倍、约至少1.3倍、约至少1.5倍、约至少1.7倍或约至少2.0倍。在一优选方面，透过约4小时的静置步骤所产生的T细胞的倍数扩增是透过约16小时(例如，过夜)的静置步骤产生的T细胞的倍数扩增的约至少1.5倍。一方面，T细胞产生之间的唯一差异是静置时间减少。
一方面，透过约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约2小时至约5小时、约3小时至约5小时、约3小时至约4小时或约4至约5小时的静置步骤所产生的T细胞数量是透过约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约24小时或约16至约20小时的静置步骤所产生的T细胞数量的约相等(约1:1)、约至少1.1倍、约至少1.2倍、约至少1.3倍、约至少1.5倍、约至少1.7倍或约至少2.0倍。在一优选方面，透过约4小时的静置步骤所产生的T细胞数量是透过约16小时(例如，过夜)的静置步骤所产生的T细胞的倍数扩增的约至少1.5倍或约1.3倍至约2.0倍。一方面，T细胞产生之间的唯一差异是静置时间减少。
再一方面，抗CD3抗体和抗CD28抗体各自的浓度可能不超过约0.1μg/ml、不超过约0.2μg/ml、不超过约0.3μg/ml、不超过约0.4μg/ml、不超过约0.5μg/ml、不超过约0.6μg/ml、不超过约0.7μg/ml、不超过约0.8μg/ml、不超过约0.9μg/ml、不超过约1.0μg/ml、不超过约2.0μg/ml、不超过约4.0μg/ml、不超过约6.0μg/ml、不超过约8.0μg/ml或不超过约10.0μg/ml。
再一方面，抗CD3抗体和抗CD28抗体各自的浓度可能为约0.1μg/ml至约1.0μg/ml、约0.1μg/ml至约0.8μg/ml、约0.1μg/ml至约0.6μg/ml、约0.1μg/ml至约0.5μg/ml、约0.1μg/ml至约0.25μg/ml、约0.2μg/ml至约0.5μg/ml、约0.2μg/ml至约0.3μg/ml、约0.3μg/ml至约0.5μg/ml、约0.3μg/ml至约0.4μg/ml、约0.2μg/ml至约0.5μg/ml、约0.1μg/ml至约10.0μg/ml、约0.1μg/ml至约8.0μg/ml、约0.1μg/ml至约6.0μg/ml、约0.1μg/ml至约4.0μg/ml或约0.1μg/ml至约2.0μg/ml。
一方面，本文所述的激活可能在不超过约1小时、不超过约2小时、不超过约3小时、不超过约4小时、不超过约5小时、不超过约6小时、不超过约7小时、不超过约8小时、不超过约9小时、不超过约10小时、不超过约11小时、不超过约12小时、不超过约14小时、不超过约16小时、不超过约18小时、不超过约20小时、不超过约22小时、不超过约24小时、不超过约26小时、不超过约28小时、不超过约30小时、不超过约36小时、不超过约48小时、不超过约60小时、不超过约72小时、不超过约84小时、不超过约96小时、不超过约108小时或不超过约120小时的时间段内进行。
另一方面，本文所述的激活可能在约1小时至约120小时、约1小时至约108小时、约1小时至约96小时、约1小时至约84小时、约1小时至约72小时、约1小时至约60小时、约1小时至约48小时、约1小时至约36小时、约1小时至约24小时、约2小时至约24小时、约4小时至约24小时、约6小时至约24小时、约8小时至约24小时、约10小时至约24小时、约12小时至约24小时、约12小时至约72小时、约24小时至约72小时、约6小时至约48小时、约24小时至约48小时、约6小时至约72小时或约1小时至约12小时的时间段内进行。
一方面，本文所述的T细胞对患者或个体是自体的。另一方面，本文所述的T细胞对患者或个体是同种异体的。
另一方面，本文所述的固相可能为珠、板、烧瓶或袋的表面。
再一方面，本文所述的板可能为6孔、12孔或24孔板。
一方面，本文所述***接种表面积可能为至少约25cm2、约75cm2、约92.6cm2、约100cm2、约150cm2、约162cm2、约175cm2、约225cm2、约235cm2、约300cm2、约1720cm2、约25cm2至约75cm2、约25cm2至约225cm2或约25cm2至约1720cm2。
另一方面，本文所述袋的容积可能为约50ml至约100升、约100ml至约100升、约150ml至约100升、约200ml至约100升、约250ml至约100升、约500ml至约100升、约1升至约100升、约1升至约75升、约1升至约50升、约1升至约25升、约1升至约20升、约1升至约15升、约1升至约10升、约1升至约5升、约1升至约2.5升或约1升至约2升。
再一方面，本文所述的激活可能在存在T细胞激活刺激物的情况下进行。
一方面，本文所述的细胞因子可能包括白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素15(IL-15)和/或白细胞介素21(IL-21)。
另一方面，IL-7的浓度可能为不超过约1ng/ml、不超过约2ng/ml、不超过约3ng/ml、不超过约4ng/ml、不超过约5ng/ml、不超过约6ng/ml、不超过约7ng/ml、不超过约8ng/ml、不超过约9ng/ml、不超过约10ng/ml、不超过约11ng/ml、不超过约12ng/ml、不超过约13ng/ml、不超过约14ng/ml、不超过约15ng/ml、不超过约16ng/ml、不超过约17ng/ml、不超过约18ng/ml、不超过约19ng/ml、不超过约20ng/ml、不超过约25ng/ml、不超过约30ng/ml、不超过约35ng/ml、不超过约40ng/ml、不超过约45ng/ml、不超过约50ng/ml、不超过约60ng/ml、不超过约70ng/ml、不超过约80ng/ml、不超过约90ng/ml或不超过约100ng/ml。
另一方面，IL-7的浓度可能为约1ng/ml至100ng/ml、约1ng/ml至90ng/ml、约1ng/ml至80ng/ml、约1ng/ml至70ng/ml、约1ng/ml至60ng/ml、约1ng/ml至50ng/ml、约1ng/ml至40ng/ml、约1ng/ml至30ng/ml、约1ng/ml至20ng/ml、约1ng/ml至15ng/ml、约1ng/ml至10ng/ml、约2ng/ml至10ng/ml、约4ng/ml至10ng/ml、约6ng/ml至10ng/ml或约5ng/ml至10ng/ml。
再一方面，IL-15的浓度可能为不超过约5ng/ml、不超过约10ng/ml、不超过约15ng/ml、不超过约20ng/ml、不超过约25ng/ml、不超过约30ng/ml、不超过约35ng/ml、不超过约40ng/ml、不超过约45ng/ml、不超过约50ng/ml、不超过约60ng/ml、不超过约70ng/ml、不超过约80ng/ml、不超过约90ng/ml、不超过约100ng/ml、不超过约110ng/ml、不超过约120ng/ml、不超过约130ng/ml、不超过约140ng/ml、不超过约150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、350ng/ml、400ng/ml、450ng/ml或500ng/ml。
另一方面，IL-15的浓度可能为约5ng/ml至500ng/ml、约5ng/ml至400ng/ml、约5ng/ml至300ng/ml、约5ng/ml至200ng/ml、约5ng/ml至150ng/ml、约5ng/ml至100ng/ml、约10ng/ml至100ng/ml、约20ng/ml至100ng/ml、约30ng/ml至100ng/ml、约40ng/ml至100ng/ml、约50ng/ml至100ng/ml、约60ng/ml至100ng/ml、约70ng/ml至100ng/ml、约80ng/ml至100ng/ml、约90ng/ml至100ng/ml、约1ng/ml至50ng/ml、约5ng/ml至50ng/ml、约10ng/ml至50ng/ml或约20ng/ml至50ng/ml。
另一方面，IL-2的浓度可能为不超过约1000IU/ml、不超过约950IU/ml、不超过约900IU/ml、不超过约850IU/ml、不超过约800IU/ml、不超过约750IU/ml、不超过约700IU/ml、不超过约650IU/ml、不超过约600IU/ml、不超过约550IU/ml、不超过约500IU/ml、不超过约450IU/ml、不超过约400IU/ml、不超过约350IU/ml、不超过约300IU/ml、不超过约250IU/ml、不超过约200IU/ml、不超过约150IU/ml、不超过约100IU/ml、不超过约90IU/ml、不超过约80IU/ml、不超过约70IU/ml、不超过约65IU/ml、不超过约60IU/ml、不超过约55IU/ml、不超过约50IU/ml、不超过约40IU/ml、不超过约30IU/ml、不超过约20IU/ml、不超过约10IU/ml或不超过约5IU/ml。
另一方面，IL-2的浓度可能为约10IU/ml至1000IU/ml、约20IU/ml至900IU/ml、约30IU/ml至800IU/ml、约40IU/ml至700IU/ml、约50IU/ml至600IU/ml、约50IU/ml至550IU/ml、约50IU/ml至500IU/ml、约50IU/ml至450IU/ml、约50IU/ml至400IU/ml、约50IU/ml至350IU/ml、约50IU/ml至300IU/ml、约50IU/ml至250IU/ml、约50IU/ml至200IU/ml、约50IU/ml至150IU/ml或约50IU/ml至100IU/ml。
另一方面，IL-21的浓度可能为不超过约1ng/ml、不超过约2ng/ml、不超过约3ng/ml、不超过约4ng/ml、不超过约5ng/ml、不超过约6ng/ml、不超过约7ng/ml、不超过约8ng/ml、不超过约9ng/ml、不超过约10ng/ml、不超过约11ng/ml、不超过约12ng/ml、不超过约13ng/ml、不超过约14ng/ml、不超过约15ng/ml、不超过约16ng/ml、不超过约17ng/ml、不超过约18ng/ml、不超过约19ng/ml、不超过约20ng/ml、不超过约25ng/ml、不超过约30ng/ml、不超过约35ng/ml、不超过约40ng/ml、不超过约45ng/ml、不超过约50ng/ml、不超过约60ng/ml、不超过约70ng/ml、不超过约80ng/ml、不超过约90ng/ml或不超过约100ng/ml。
另一方面，IL-21的浓度可能为约1ng/ml至100ng/ml、约1ng/ml至90ng/ml、约1ng/ml至80ng/ml、约1ng/ml至70ng/ml、约1ng/ml至60ng/ml、约1ng/ml至50ng/ml、约1ng/ml至40ng/ml、约1ng/ml至30ng/ml、约1ng/ml至20ng/ml、约1ng/ml至15ng/ml、约1ng/ml至10ng/ml、约2ng/ml至10ng/ml、约4ng/ml至10ng/ml、约6ng/ml至10ng/ml、约5ng/ml至10ng/ml、约10ng/ml至20ng/ml、约10ng/ml至30ng/ml、约10ng/ml至40ng/ml、约10ng/ml至50ng/ml、约10ng/ml至60ng/ml、约10ng/ml至70ng/ml、约10ng/ml至80ng/ml、约10ng/ml至90ng/ml或约10ng/ml至100ng/ml。
一方面，本文所述的转导可能在不超过约1小时、不超过约2小时、不超过约3小时、不超过约4小时、不超过约5小时、不超过约6小时、不超过约7小时、不超过约8小时、不超过约9小时、不超过约10小时、不超过约11小时、不超过约12小时、不超过约14小时、不超过约16小时、不超过约18小时、不超过约20小时、不超过约22小时、不超过约24小时、不超过约26小时、不超过约28小时、不超过约30小时、不超过约36小时、不超过约42小时、不超过约48小时、不超过约54小时、不超过约60小时、不超过约66小时、不超过约72小时、不超过约84小时、不超过约96小时、不超过约108小时或不超过约120小时的时间段内进行。
再一方面，本文所述的转导可能在约1小时至约120小时、约1小时至约108小时、约1小时至约96小时、约1小时至约72小时、约1小时至约48小时、约1小时至约36小时、约1小时至约24小时、约1小时至约12小时、约2小时至约24小时、约4小时至约24小时、约12小时至约24小时、约12小时至约48小时、约12小时至约72小时、约24小时至约72小时或约36小时至约72小时的时间段内进行。
另一方面，本文所述的病毒载体可能为表达T细胞受体(TCR)的γ-逆转录病毒载体。
再一方面，本文所述的病毒载体可能为表达TCR的慢病毒载体。
一方面，本文所述的转导可能在存在T细胞激活刺激物的情况下进行。
一方面，本文所述的扩增可能在存在T细胞激活刺激物的情况下进行。
一方面，本文所述的扩增可能在不超过约1天、不超过约2天、不超过约3天、不超过约4天、不超过约5天、不超过约6天、不超过约7天、不超过约8天、不超过约9天、不超过约10天、不超过约15天、不超过约20天、不超过约25天或不超过约30天的时间段内进行。
另一方面、本文所述的扩增可能在约1天至约30天、约1天至约25天、约1天至约20天、约1天至约15天、约1天至约10天、约2天至约10天、约3天至约10天、约4天至约10天、约4天至约30天、约6天至约25天、约10天至约30天或约12天至约30天的时间段内进行。
一方面，获得的T细胞数量可能至少约1x 109、可能至少约2x 109、可能至少约3x109、可能至少约4x 109、可能至少约5x 109、可能至少约6x 109、可能至少约7x 109、可能至少约8x 109、可能至少约9x 109、可能至少约1x 1010、可能至少约5x1010、可能至少约1x1011、可能至少约5x 1011、可能至少约1x 1012、可能至少约5x 1012或可能至少约1x 1013个细胞。
另一方面，获得的T细胞数量可能约1x 109至约1x 1013、约1x 109至约5x 1012、约1x 109至约1x 1012、约1x 109至约5x 1011、约1x 109至约1x 1011、约1x 109至约5x 1010、约1x 109至约1x 1010、约2x 109至约1x 1010、约3x 109至约1x 1010、约4x 109至约1x 1010、约5x 109至约1x 1010、约6x 109至约1x 1010、约7x 109至约1x 1010、约8x 109至约1x 1010或约9x 109至约1x 1010个细胞。
一方面，获得的T细胞可能为CD3+CD8+T细胞和/或CD3+CD4+T细胞。
另一方面，PBMC可能获得自患者。
再一方面，本公开涉及透过本文所述的方法产生基因转导T细胞。
另一方面，本公开涉及含有透过本文所述方法产生的基因转导T细胞和药用载剂的药物组合物。
另一方面，本公开涉及一种制备T细胞群的方法，包括解冻冷冻的外周血单核细胞(PBMC)、静置解冻的PBMC、用固定于固相上的抗CD3抗体和抗CD28抗体激活静置PBMC中的T细胞、扩增激活的T细胞以及获得包含扩增T细胞的T细胞群。
再一方面，本公开涉及透过本文所述方法制备的T细胞群。
另一方面，本公开涉及治疗患有癌症或有癌症治疗需要的患者或个体的方法，包括向患者施用有效量的本文所述扩增T细胞。一方面，有此需要的患者或个体是癌症患者。一方面，待治疗的癌症选自肝细胞癌(HCC)、结直肠癌(CRC)、胶质母细胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、肾细胞癌(RCC)、良性***增生(BPH)、***癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、梅克尔细胞癌(MCC)、小细胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、胆囊癌和胆管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和子宫癌(UEC)中的一种或多种。
另一方面，扩增可能在至少一种选自IL-2、IL-7、IL-12、IL-15和IL-21组成的组的细胞因子存在的情况下进行。一方面，扩增在IL-7和IL-15组合存在的情况下发生。
另一方面，解冻、静置、激活、转导、扩增和/或获得可能在封闭***中进行。
另一方面，本公开涉及一种制备T细胞群的方法，包括获得新鲜的外周血单核细胞(PBMC)(即PBMC不是透过解冻冷冻保存的PBMC来获得)、用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活新鲜PBMC中的T细胞、用病毒载体转导激活的T细胞、扩增转导的T细胞以及收获扩增的T细胞。
一方面，获得和激活执行时间可能不超过1天。
一方面，扩增执行时间可能超过1天。
另一方面，扩增执行时间可能约1天至2天、约1天至3天、约1天至约4天、约1天至约5天、约1天至6天、约1天至7天、约1天至8天、约1天至9天、约1天至10天、约2天至3天、约2天至4天、约2天至5天、约2天至6天、约2天至7天、约2天至8天、约2天至9天、约2天至10天、约3天至4天、约3天至5天、约3天至6天、约3天至7天、约3天至8天、约3天至9天、约3天至10天、约4天至5天、约4天至6天、约4天至7天、约4天至8天、约4天至9天、约4天至10天、约5天至6天、约5天至7天、约5天至8天、约5天至9天或约5天至10天。
另一方面，收获可能在激活后约4天至约12天、约4天至约11天、约4天至约10天、约4天至约9天、约4天至约8天、约4天至约7天、约4天至约6天、约4天至约5天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天、约5天至约7天或约5天至约6天内进行。
另一方面，收获的T细胞数量可能选自约2x 109至约5x 109、约5x 109至约10x109、约10x 109至约15x 109、约5x 109至约35x 109、约5x 109至约30x 109、约10x 109至约30x 109、约15x 109至约20x 109、约20x 109至约35x 109、约24x 109至约33x 109以及约24.8x 109至约32.2x 109组成的组。
另一方面，激活、转导、扩增和收获可能在封闭或半封闭的***中进行。
另一方面，封闭***可能为CliniMACS、ProdigyTM、WAVE(XURITM)生物反应器、WAVE(XURITM)生物反应器与BioSafe SepaxTM II组合、G-Rex/GatheRexTM封闭***或G-Rex/GatheRexTM封闭***与BioSafe SepaxTM II组合。
附图简要说明
为了进一步理解本公开的本质、目的和优点，应参考以下详细描述并结合以下附图，其中类似的元件符号表示类似的元件。
图1A和1B显示了透过延长从不同供体获得的T细胞的离体培养丢失Tnaive/scm和Tcm表型。
图2显示了与第10天生长的不同供体细胞相比，第15天生长的细胞中IFN-γ分泌减少。
图3显示了测试静置条件对T细胞激活和扩增影响的实验设计。
图4显示了不同实验组中CD25、CD69和hLDL-R的表达水平。
图5A和5B分别显示了第7天扩增和第10天扩增时不同实验组中的倍数扩增和细胞存活性。
图6显示了用病毒载体转导的激活T细胞在不同实验组中第9天的倍数扩增和存活性。
图7显示了用病毒载体转导的激活T细胞在不同实验组中第9天的倍数扩增和存活性。
图8显示了由不同静置时间和不同生产规模产生的T细胞中转基因表达。
图9显示了第10天由不同静置时间和不同生产规模产生的倍数扩增。
图10显示了测试抗CD3和抗CD28抗体浓度对T细胞激活影响的实验设计。
图11显示了不同浓度抗CD3和抗CD28抗体激活的T细胞中CD25、CD69和hLDL-R的表达。
图12显示了第10天扩增时，在存在不同浓度的IL-15情况下，由不同浓度抗CD3和抗CD28抗体激活的T细胞的细胞计数。
图13显示了在存在不同浓度的IL-15情况下，由不同浓度抗CD3和抗CD28抗体激活的重组TCR-转导T细胞的四聚体染色。
图14A显示了不同激活持续时间产生的CD3+CD8+四聚体+T细胞的百分比。
图14B显示了不同激活持续时间产生的转基因表达。
图15显示了由板结合或烧瓶结合的抗CD3和抗CD28抗体激活的T细胞中CD25、CD69和LDL-R的表达。
图16A显示了烧瓶结合(FB)和板结合(PB)激活T细胞中的转导水平。
图16B显示了烧瓶结合(FB)和板结合(PB)激活T细胞中的倍数扩增。
图17显示了由烧瓶结合(FB)激活LV-R73(表达T细胞受体的慢病毒载体)转导的T细胞和板结合(PB)激活转导的T细胞应对不同供体中表达肿瘤相关抗原(TAA)的肿瘤细胞而引发的抗原特异性IFN-γ水平。
图18显示了测试使用抗CD3和抗CD28抗体包覆的袋和板对T细胞激活影响的实验设计。
图19显示了在袋结合或烧瓶结合的抗CD3和抗CD28抗体中激活的T细胞之CD25、CD69和LDL-R的表达。
图20显示了第6天扩增时，由不同浓度的袋结合抗体激活的T细胞和在FB条件下激活的T细胞产生的细胞扩增。
图21显示了第10天扩增时，由不同浓度的袋结合抗体激活的T细胞和在FB条件下激活的T细胞产生的细胞扩增。
图22显示了根据本公开一实施方案所述的T细胞制造工艺。
图23A显示了根据本公开一实施方案所制造T细胞的倍数扩增。
图23B显示了根据本公开一实施方案所制造T细胞的转导TCR表达。
图23C显示了根据本公开一实施方案所制造T细胞的表型。
图23D显示了根据本公开一实施方案所制造T细胞的肿瘤细胞生长抑制活性。
图23E显示了根据本公开另一实施方案所制造T细胞的肿瘤细胞生长抑制活性。
图23F显示了根据本公开另一实施方案所制造T细胞的肿瘤细胞生长抑制活性。
图23G显示了根据本公开另一实施方案所制造T细胞的肿瘤细胞杀灭活性。
图23H显示了根据本公开另一实施方案所制造T细胞的肿瘤细胞杀灭活性。
图24显示了过夜静置(约16小时)的T细胞制造工艺。
图25A显示了过夜静置(约16小时)制造的T细胞倍数扩增。
图25B显示了过夜静置(约16小时)制造的T细胞的转导TCR表达。
图25C显示了过夜静置(约16小时)制造的T细胞的表型。
图25D显示了过夜静置(约16小时)制造的T细胞的肿瘤细胞生长抑制活性。
图25E和25F显示了过夜静置(约16小时)制造的T细胞的细胞毒性活性。
图26显示了开放和封闭***中的离体操作方案。
图27显示了根据本公开的一实施方案所述封闭***中的离体操作方案。
图28显示了根据本公开的另一实施方案所述封闭***中的离体操作方案。
图29显示了开放和封闭***中制造的T细胞的IFN-γ释放。
图30显示了根据本公开一些实施方案所述的T细胞制造示意图。
图31显示了根据本公开的一实施方案所述从白细胞分离术收集到输注就绪的代表性周转时间。LP#：白细胞分离术收集、处理和冷冻(可选)。COA：签发分析报告所需的额外时间。
图32显示了根据本公开一实施方案所述的T细胞制造工艺。
图33显示了根据本公开一实施方案所述的制造工艺生产的T细胞的T细胞记忆表型。
图34显示了根据本公开一实施方案所述的制造工艺生产的T细胞的CD27和CD28共刺激表型。
图35显示了根据本公开一实施方案，IL-7、IL-15或IL-2诱导的T细胞生长以扩增时间依赖性方式降低。
图36显示了根据本公开一实施方案，IFN-γ分泌以扩增时间依赖性方式降低。
图37显示了根据本公开一实施方案，EC50以扩增时间依赖性方式增加。
图38显示了根据本公开一实施方案所述的扩增量化指标。
图39显示了根据本公开一实施方案所述的TCR的表面表达。
图40显示了根据本公开一实施方案所述最终产物的T细胞记忆表型。
图41显示了根据本公开一实施方案所述的应对暴露于靶细胞的IFN-γ释放。
图42显示了根据本公开一实施方案所述的EC50测定。
图43显示了根据本公开一实施方案所述之T细胞的细胞毒性可能性。
图44显示了根据本公开一实施方案所述从健康供体和癌症患者所获得T细胞产物之间细胞回收的比较。
图45显示了根据本公开一实施方案所述从健康供体和癌症患者所获得T细胞产物之间细胞存活性的比较。
图46显示了根据本公开一实施方案所述从健康供体和癌症患者所获得T细胞产物之间倍数扩增的比较。
图47显示了根据本公开一实施方案所述从健康供体和癌症患者所获得T细胞产物之间细胞表型的比较。
图48显示了根据本公开一实施方案所述从健康供体和癌症患者所获得T细胞产物之间细胞表型的比较。
图49显示了根据本公开一实施方案所述T细胞产物的TCR表达。
图50显示了根据本公开一实施方案所述从健康供体和癌症患者所获得T细胞产物之间TCR表达的比较。
图51显示了根据本公开一实施方案所述从健康供体和癌症患者所获得T细胞产物之间TCR表达的比较。
图52显示了根据本公开一实施方案所述的门控方案和Tmemory亚群。
图53显示了根据本公开一实施方案所述从健康供体和癌症患者所获得T细胞产物之间细胞表型的比较。
图54显示了根据本公开一实施方案所述T细胞产物中的细胞因子表达。
图55显示了根据本公开一实施方案所述获得自健康供体的T细胞产物中的细胞因子表达。
图56显示了根据本公开一实施方案所述从健康供体和癌症患者所获得T细胞产物之间细胞因子表达的比较。
图57显示了根据本公开一实施方案所述获得自癌症患者的T细胞产物中的IFN-γ释放。
图58显示了根据本公开一实施方案所述获得自健康供体的T细胞产物中的IFN-γ释放。
图59显示了根据本公开一实施方案所述获得自健康供体的T细胞产物中的IFN-γ释放。
图60显示了根据本公开一实施方案所述获得自癌症患者的T细胞产物中的IFN-γ释放。
图61显示了根据本公开一实施方案所述获得自健康供体的T细胞产物的细胞杀灭活性。
图62显示了根据本公开一实施方案所述获得自健康供体的T细胞产物的细胞杀灭活性。
图63A显示了根据本公开一实施方案所述从健康供体和癌症患者所获得T细胞产物之间细胞杀灭的比较。
图63B显示了根据本公开一实施方案所述从健康供体和癌症患者所获得T细胞产物之间细胞杀灭的比较。
图63C显示了根据本公开一实施方案所述从健康供体和癌症患者所获得T细胞产物之间细胞杀灭的比较。
详细说明
一方面，本公开提出了透过以下方法产生T细胞群，所述方法包括解冻冷冻的外周血单核细胞(PBMC)、静置解冻的PBMC、用固定于固相上的抗CD3抗体和抗CD28抗体激活静置PBMC中的T细胞、扩增激活的T细胞以及获得包含扩增T细胞的T细胞群。
一方面，本公开提出了转导T细胞的方法，包括解冻冷冻的外周血单核细胞(PBMC)、静置解冻的PBMC、用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活培养PBMC中的T细胞、用病毒载体转导激活的T细胞、扩增转导的T细胞以及获得扩增的T细胞；制备T细胞群的方法，包括解冻冷冻的外周血单核细胞(PBMC)、静置解冻的PBMC、用固定于固相上的抗CD3抗体和抗CD28抗体激活静置PBMC中的T细胞、扩增激活的T细胞以及获得包含扩增T细胞的T细胞群；以及治疗患有癌症或有癌症治疗需要的患者或个体的方法，包括向患者施用有效量的本文所述扩增T细胞。一方面，有此需要的患者或个体是癌症患者。一方面，待治疗的癌症选自肝细胞癌(HCC)、结直肠癌(CRC)、胶质母细胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、肾细胞癌(RCC)、良性***增生(BPH)、***癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、梅克尔细胞癌(MCC)、小细胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、胆囊癌和胆管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和子宫癌(UEC)中的一种或多种。
基于T细胞的免疫治疗靶向作用于主要组织相容性复合体(MHC)分子提呈的来源于肿瘤相关蛋白或肿瘤特异性蛋白的肽表位。肿瘤特异性T淋巴细胞所识别的抗原，即其表位，可以是源自所有蛋白类型的分子，如酶、受体、转录因子等，它们在相应肿瘤的细胞中被表达，并且与同源未变的细胞相比，其表达通常上调。
MHC分子有两类：MHC I类和MHC II类。MHC I类分子由一条α重链和β-2-微球蛋白，MHC II类分子由一条α和一条β链组成。其三维构形形成一个结合槽，用于与肽进行非共价相互作用。大部分有核细胞上都可发现MHC-I类分子。它们提呈主要为内源性的蛋白、缺陷核糖体产物(DRIP)和较大肽裂解生成的肽。然而，源自内体隔室或外源性来源的肽也经常在MHC-I类分子上发现。这种I-类分子非经典提呈方式被称为交叉提呈。MHC II类分子主要发现于专业抗原提呈细胞(APC)上，并且主要提呈，例如，在内吞作用过程中由APC摄入并且随后被加工的外源性或跨膜蛋白的肽。
肽和MHC I类的复合体由负载适当T细胞受体(TCR)的CD8阳性T细胞进行识别，而肽和MHC II类分子的复合体由负载适当TCR的CD4阳性辅助T细胞进行识别。本领域已熟知TCR、肽和MHC由此按1:1:1的化学计算量而存在。
CD4阳性辅助T细胞在诱导和维持CD8阳性细胞毒性T细胞的有效反应中发挥重要作用。肿瘤相关抗原(TAA)衍生的CD4阳性T细胞表位的识别对开发能触发抗肿瘤免疫反应的药物产品可能非常重要。在肿瘤部位，T辅助细胞维持着对细胞毒性T细胞(CTL)友好的细胞因子环境并吸引效应子细胞，如CTL、天然杀手(NK)细胞、巨噬细胞和粒细胞。
在没有炎症的情况下，MHC II类分子的表达主要局限于免疫***细胞，尤其是专业抗原提呈细胞(APC)，例如，单核细胞、单核细胞源性细胞、巨噬细胞、树突状细胞。在癌症患者的肿瘤细胞中发现有MHC II类分子的表达。本说明书的拉长(较长)肽可发挥MHC II类活性表位的功能。
MHC-II类表位活化的辅助T细胞在编排抗肿瘤免疫的CTL效应子功能中发挥着重要作用。触发TH1型的T辅助细胞反应的辅助T细胞表位支持CD8阳性杀手T细胞的效应子功能，其中包括直接作用于肿瘤细胞的细胞毒性功能(该类肿瘤细胞表面显示有肿瘤相关肽/MHC复合体)。这样，肿瘤相关T辅助细胞肽表位单独使用或与其他肿瘤相关肽组合使用可作为刺激抗肿瘤免疫反应的疫苗组合物的活性药物成分。
哺乳动物(如小鼠)模型显示，即使没有CD8阳性T淋巴细胞，CD4阳性T细胞也能透过分泌干扰素-γ(IFNγ)抑制血管生成而足以抑制肿瘤的表现。有CD4阳性T细胞作为直接抗肿瘤效应子的证据。
由于HLA II类分子的组成性表达通常仅限于免疫细胞，因此，直接从原发肿瘤中分离II类肽之前被认为是不可能的事。然而，Dengjel等人成功地在肿瘤中直接识别了多个MHC II类表位(WO 2007/028574,EP 1 760 088 B1，其内容透过引用整体并入本文)。
由于CD8依赖型和CD4依赖型这两种反应共同并协同地促进抗肿瘤作用，因此，确定和表征由CD8+T细胞(配体：MHC I类分子+肽表位)或CD4阳性T辅助细胞(配体:MHC II类分子+肽表位)识别的肿瘤相关抗原对开发肿瘤疫苗非常重要。
对于MHC I类肽若要触发(引发)细胞免疫反应，其也必须与MHC分子结合。这一过程依赖于MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特异性多态性。MHC-1类-结合肽的长度通常为8-12个氨基酸残基，并且在其与MHC分子相应结合沟槽相互作用的序列中通常包含两个保守残基(“锚”)。这样，每个MHC的等位基因都有“结合基序”，从而确定哪些肽能与结合沟槽特异性结合。
在MHC I类依赖性免疫反应中，肽不仅能与肿瘤细胞表达的某些MHC-I类分子结合，而且它们之后还必须能被负载特异性T细胞受体(TCR)的T细胞识别。
对于被T淋巴细胞识别为肿瘤特异性抗原或相关性抗原以及用于治疗的蛋白质，必须具备特殊的条件。所述抗原应主要由肿瘤细胞表达，而不由正常健康组织表达，或表达数量相对较少。在一个优选的实施方案中，与正常健康组织相比，所述肽应在肿瘤细胞中过度提呈。更为适宜的情况是，该相应抗原不仅出现于一种肿瘤中，而且浓度(即每个细胞的相应肽拷贝数目)亦高。肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原往往是源自直接参与因细胞周期控制或凋亡抑制中的其功能而发生的正常细胞向肿瘤细胞转化的蛋白。另外，这些直接导致转化事件的蛋白的下游靶标可能会被上调，因此可能与肿瘤间接相关。这些间接肿瘤相关抗原也可能是预防接种方法的靶标。表位存在于抗原氨基酸序列中，以确保这种肽(“免疫原性肽”)源自肿瘤相关抗原，并可导致体外或体内T细胞反应。
因此，TAA是基于T细胞疗法(包括但不限于肿瘤疫苗)研发的起点。识别和表征TAA的方法通常基于使用可分离自患者或健康受试者的T细胞，或基于肿瘤与正常组织之间的差别转录特性或差别肽表达模式的产生。然而，对肿瘤组织或人肿瘤细胞株中过度表达或选择性表达的基因的识别并不提供在免疫疗法中使用这些基因所转录抗原的准确资讯。这是因为，有着相应TCR的T细胞必须要存在而且对这个特定表位的免疫耐受性必须不存在或为最低水平，因此，这些抗原的表位只有一部分适合这种应用。因此，在本说明书的一个非常优选的实施方案中，只选择那些针对可发现功能性和/或增殖性T细胞情况的过量提呈或选择性提呈肽，这一点非常重要。这种功能性T细胞被定义为在以特异性抗原刺激后能够克隆地扩增并能够执行效应子功能(“效应子T细胞”)的T细胞。
如本文所用的术语“T细胞受体(TCR)”是指T细胞上的蛋白质受体，其由α(α)和β(β)链的异二聚体组成，尽管在一些细胞中TCR由γ和δ(γ/δ)链组成。在本公开的实施方案中，可能在包含TCR的任何细胞上修饰TCR，例如：包括辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、天然杀手T细胞和γδT细胞。
TCR是存在于T淋巴细胞(或T细胞)表面上的一种分子，其通常负责识别与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原。在95％T细胞中，它是由α和β链组成的异二聚体，而5％的T细胞具有由γ和δ链组成的TCR。TCR与抗原和MHC的结合透过由相关酶、共同受体和特化辅助分子介导的一系列生化事件导致其T淋巴细胞的激活。在免疫学中，CD3抗原(CD代表分化簇)是由哺乳动物中四条不同链(CD3-γ、CD3δ和两个CD3ε)组成的蛋白质复合体，所述链与被称为T细胞受体(TCR)的分子和ζ链相关联而在T淋巴细胞中产生激活信号。TCR、ζ-链和CD3分子一起构成TCR复合体。CD3-γ、CD3δ和CD3ε链是含有单个细胞外免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关细胞表面蛋白。CD3链的跨膜区带负电荷，这种特征可使这些链与带正电荷的TCR链(TCRα和TCRβ)相关联。CD3分子的细胞内尾部含有一种称为免疫受体酪氨酸激活基序(简称ITAM)的单个保守基序，其对于TCR的信号传导能力至关重要。。
CD28是在T细胞上表达的分子之一，这些分子提供T细胞激活所需的共刺激信号。CD28是B7.1(CD80)和B7.2(CD86)的受体。被Toll样受体配体激活时，B7.1表达在抗原呈递细胞(APC)中上调。抗原呈递细胞上的B7.2表达为组成性表达。CD28是在幼稚T细胞上组成性表达的唯一B7受体。除了TCR之外，透过CD28的刺激可以为T细胞提供有效的共刺激信号，以产生各种白细胞介素(特别是IL-2和IL-6)。
一方面，T细胞的扩增和/或激活在存在一种或多种IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21的情况下发生。另一方面，T细胞的扩增和/或激活发生于单独的IL-2、单独的IL-7、单独的IL-15、IL-2和IL-15组合或IL-7和IL-15组合。
透过降低肿瘤大小或防止肿瘤在这些受试者中生长或再生长，本公开的TCR构建体可能适用于患有或疑似患有癌症的受试者。因此，本公开进一步涉及一种在受试者中降低生长或或防止肿瘤形成的方法，其透过将本公开的TCR构建体引入受试者的分离T细胞中并且将转化T细胞重新引入受试者中，从而实现抗肿瘤反应来减小或消除受试者的肿瘤。可以使用的合适T细胞包括：细胞毒性淋巴细胞(CTL)或含有需要破坏的T细胞受体的任何细胞。正如本领域技术人员所熟知的，可很容易获得分离受试者这些细胞的各种方法。例如，使用细胞表面标志物表达或使用市售试剂盒(例如，来自Pierce,Rockford,伊利诺伊州的ISOCELLTM)。
预期TCR构建体可以作为裸DNA引入受试者自身T细胞中或引入合适的载体中。本领域中使用裸DNA透过电穿孔稳定转染T细胞的方法，请参见，例如，美国专利号6,410,319，其内容透过引用整体并入。裸DNA通常系指以适当表达方向包含于质粒表达载体中的编码本公开TCR的DNA。有利的情况是，使用裸DNA可减少产生表达本公开TCR的T细胞所需的时间。
或者，可以使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体)将TCR构建体引入T细胞。根据本公开的方法使用的合适载体在受试者的T细胞中为非复制型。已知有大量基于病毒的载体，其中细胞中维持的病毒拷贝数足够低，可维持细胞的存活性。示例性载体包括：pFB-neo载体
Figure BDA0002619310400000201
以及基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的载。
一旦确立转染或转导T细胞能够将TCR构建体表达为具有所需调节和所需水平的表面膜蛋白，则可以确定TCR在宿主细胞中是否具有提供所需信号诱导的功能。随后，将转导的T细胞重新引入或给予受试者以激活受试者的抗肿瘤反应。
为了便于用药，可以将根据本公开所述的转导T细胞制成药物组合物或制成适于体内给药的植入体，同时具有合适的载剂或稀释剂，其还可以为药用型的。本领域已经描述了制备这种组合物或植入物的方法(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,16th Ed.,Mack,ed.(1980，其内容透过引用整体并入本文))。在合适的时候，可按照其各自的给药途径以常规方法将转导T细胞配制成半固体或液体形式的制剂，例如：胶囊、溶液、注射剂、吸入剂或气雾剂。可利用本领域已知的方法来防止或最小化组合物到达靶组织或器官之前的释放和吸收，或确保组合物定时释放。但是，理想的情况是，使用不妨碍细胞表达TCR的药用形式。因此，理想的情况是，转导T细胞可以制成含有平衡盐溶液(优选为Hanks平衡盐溶液或生理盐水)的药物组合物。
在某些方面，本发明包括制备和/或扩增抗原特异性重定向T细胞的方法，其包括用含有编码TCR的DNA构建体的表达载体来转染T细胞，然后，任选地用抗原阳性细胞、重组抗原或受体抗体来刺激细胞，而使细胞增殖。
另一方面，提出了使用裸DNA透过电穿孔或其他非病毒基因转移(例如但不限于声孔作用)来稳定地转染和重定向T细胞的方法。大多数研究者已使用病毒载体将异源基因携带入T细胞中。透过使用裸DNA，可以减少产生重定向T细胞所需的时间。“裸DNA”系指以适当表达方向包含于表达盒或载体中的编码TCR的DNA。本公开的电穿孔方法可产生稳定的转染子，其表达并在其表面上携带TCR。
在某些方面，T细胞为原代人T细胞，例如：源自人外周血单核细胞(PBMC)、用G-CSF刺激后收集PBMC、骨髓或脐带血的T细胞。条件包括使用mRNA和DNA以及电穿孔。转染后，可能立即输注细胞或者可能储存细胞。在某些方面，转染后，细胞可能在基因转移入细胞后约1、2、3、4、5天或更长时间内离体繁殖数天、数周或数月作为主体群。另一方面，转染后，克隆转染子并离体扩增证明存在单个整合或附加体型维持的表达盒或质粒且表达TCR的克隆。选择用于扩增的克隆显示出了特异性识别和裂解肽表达靶细胞的能力。可透过用IL-2或结合共同γ链的其他细胞因子(例如：IL-7、IL-12、IL-15、IL-21等)刺激来扩增重组T细胞。可透过用人工抗原呈递细胞刺激来扩增重组T细胞。重组T细胞可用人工抗原呈递细胞进行扩增，或者用抗体(如：OKT3，其与T细胞表面上的CD3交联)进行扩增。重组T细胞亚群可用人工抗原提呈细胞进行删除，或者用抗体(如：Campath，其与T细胞表面上的CD52结合)进行删除。另一方面，可冷冻保存基因修饰的细胞。
本发明的组合物的形式可以为单位剂型，其中每个剂量单位(例如：注射剂)含有预定量的组合物，其单独或与其他活性剂适当组合使用。本文所用的单位剂型术语系指适合作为人和动物受试者单位剂量的物理离散单位，每个单位含有预定量的本发明组合物，其单独或与其他活性剂组合使用，该预定量经计算为足以产生所需效果的量，适当情况下与药用稀释剂、载剂(carrier或vehicle)相关。本发明新单位剂型的规格取决于特定受试者中与药物组合物相关的特定药效学。
理想的情况是，有效量或足够量的分离转导T细胞存在于组合物中并引入受试者中，从而确立长期、特异性抗肿瘤反应，相较于这种治疗不存在将导致的情况降低肿瘤大小或消除肿瘤生长或再生长。理想的情况是，与除了不存在转导T细胞以外相同的条件相比，重新引入受试者的转导T细胞数量使肿瘤大小降低约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或约99％。
因此，转导T细胞的给予量应考虑给予途径，并且应该使得引入足够数量的转导T细胞以实现所需的治疗反应。此外，本文所述组合物中所含每种活性剂的量(例如，依照每种待接触细胞的量或依照特定体重的量)在不同应用中可能不同。一般来说，转导T细胞的理想浓度应该足以在接受治疗的受试者中提供至少约1×106至约1×109个转导T细胞/患者m2(或kg)，更理想的情况是，约1×107至约5×108个转导T细胞/患者m2(或kg)，但是可使用任何超出，例如，大于5×108个细胞/患者m2(或kg)，或低于，例如，小于1×107个细胞/患者m2(或kg)的合适的量。给药方案可以基于公认的基于细胞的疗法(参见，例如，美国专利号4,690,915，其内容透过引用整体并入本文)，或者可采用交替连续输注策略。
这些值为在优化实施本发明的本发明方法后医师所使用的转导T细胞范围提供了一般指导。本文中对这些范围的叙述绝不排除使用更高或更低量的组分，因为这在特定应用中可能是必要的。例如，根据组合物是否与其他药物组合物联合使用，或根据药代动力学、药物分布和代谢的个体间差异，实际剂量和方案可能会不同。本领域技术人员可根据特定情况的紧急需要进行任何必要的调整。
术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是本领域公认的，包括胸腺细胞、幼稚T淋巴细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静置T淋巴细胞或激活T淋巴细胞。适用于特定实施方案的示例性T细胞群包括但不限于辅助性T细胞(HTL；CD4+T细胞)、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞、CD4-CD8-T细胞或其他任何T细胞亚群。适用于特定实施方案的其他示例性T细胞群包括但不限于表达以下一种或多种标志物的T细胞：CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD127、CD197和HLA-DR，如果需要，可透过阳性或阴性选择技术进一步分离。
外周血单核细胞(PBMC)定义为具有圆形细胞核的任何血细胞(即，淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞)。这些血细胞是免疫***中抵抗感染和适应入侵细菌的关键组成部分。淋巴细胞群由CD4+和CD8+T细胞、B细胞和自然杀手细胞、CD14+单核细胞和嗜碱性粒细胞/嗜中性粒细胞/嗜酸性粒细胞/树突细胞组成。这些细胞通常使用FICOLLTM(一种分离血液层的亲水性多糖)从全血或白细胞分离术产物中分离，单核细胞和淋巴细胞在血浆层下形成血沉棕黄层。在一实施方案中，“PBMC”是指包含至少T细胞和任选NK细胞以及抗原呈递细胞的细胞群。
术语“激活”系指T细胞已被充分刺激而诱导可检测细胞增殖的状态。在特定的实施方案中，激活还可与诱导细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“激活的T细胞”尤其系指正在增殖的T细胞。仅透过TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，还需要一种或多种次级信号或共刺激信号。因此，T细胞激活包括透过TCR/CD3复合体的初级刺激信号以及一种或多种次级共刺激信号。共刺激可以透过已经接受主要激活信号的T细胞的增殖和/或细胞因子产生来证明，例如透过CD3/TCR复合体或透过CD2的刺激。
本文所使用的静置T细胞系指不***或产生细胞因子的T细胞。与激活的T细胞(约12-15微米)相比，静置T细胞较小(约6-8微米)。
本文所使用的预引发T细胞为静置T细胞，其已经预先激活至少一次并已从激活刺激物中移除至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约48小时、至少约60小时、至少约72小时、至少约84小时、至少约96小时、至少约108小时或至少约120小时。或者，静置可能在约0.5小时至约120小时、约0.5小时至约108小时、约0.5小时至约96小时、约0.5小时至约84小时、约0.5小时至约72小时、约0.5小时至约60小时、约0.5小时至约48小时、约0.5小时至约36小时、约0.5小时至约24小时、约0.5小时至约18小时、约0.5小时至约12小时、约0.5小时至约6小时、约1小时至约6小时、约2小时至约5小时、约3小时至约5小时或约4小时至约5小时的时间段内进行。预引发的T细胞通常具有记忆表型。
可透过激活T细胞并用与辅助分子结合的配体刺激T细胞表面上的辅助分子来诱导T细胞群增殖。可透过使T细胞与第一制剂接触来完成T细胞群的激活，所述第一制剂可刺激T细胞中TCR/CD3复合体相关信号。可以透过连接T细胞受体(TCR)/CD3复合体或CD2表面蛋白或透过直接刺激受体偶联信号传导途径来完成T细胞中TCR/CD3复合体相关信号的刺激。因此，抗CD3抗体、抗CD2抗体或蛋白激酶C激活剂可与钙离子载体一起使用来激活T细胞群。
为了诱导增殖，可使激活的T细胞群与第二制剂接触，所述第二制剂可刺激T细胞表面上的辅助分子。例如，可用针对T细胞表面上CD28分子的抗CD28抗体来刺激CD4+T细胞群增殖。或者，CD4+T细胞可以用CD28的天然配体(例如：B7-1和B7-2)来刺激。天然配体可为可溶性、在细胞膜上、或与固相表面偶联。可透过使用单克隆抗体ES5.2D8来完成CD8+T细胞群的增殖，所述单克隆抗体ES5.2D8与CD9(激活T细胞上存在的分子量为约27kD的辅助分子)结合。或者，可透过刺激一种或多种细胞内信号诱导激活T细胞群的增殖，所述细胞内信号由连接辅助分子(如：CD28)产生。
提供主要激活信号的制剂和提供共刺激剂的制剂可以以可溶性形式加入或偶联至固相表面。在一项优选实施方案中，两种制剂可以偶联至相同的固相表面。
在激活和刺激T细胞表面上的辅助分子之后，可监测应对持续暴露于配体或其他制剂(其在细胞内作用以模拟辅助分子介导的途径)的T细胞增殖进展。当T细胞增殖速率降低时，可用另外的抗CD3抗体和共刺激配体等重新激活和重新刺激T细胞，以诱导进一步的增殖。在一项实施方案中，可透过检查细胞大小来监测T细胞增殖速率。或者，可透过测定应对暴露于配体或其他制剂(例如B7-1或B7-2)的细胞表面分子表达来监测T细胞增殖。可重复监测和再刺激T细胞以持续增殖，从而产生比原始T细胞群数量增加约100倍至约100,000倍的T细胞群。
本公开的方法可用于扩增选择的T细胞群以用于治疗传染病或癌症。得到的T细胞群可以进行基因转导并用于免疫疗法，或者可用于感染因子的体外分析。在T细胞群扩增至足够数量后，可将扩增的T细胞恢复至个体。本公开的方法还可提供可再生的T细胞来源。因此，来自个体的T细胞可以离体扩增，一部分扩增的细胞群可重新给予个体，而另一部分则可等分冷冻长期保存，随后扩增和给予个体。类似地，可从患有癌症的个体中获得肿瘤浸润淋巴细胞群，并刺激T细胞增殖至足够数量并恢复至个体。
本公开还可能涉及的组合物含有向T细胞提供共刺激信号以用于T细胞扩增的制剂(例如，抗CD28抗体、B7-1或B7-2配体)，其与固相表面偶联，可能另外包括与相同的固相表面偶联的向T细胞提供主要激活信号的制剂(例如，抗CD3抗体)。这些制剂可能优选附着于珠或烧瓶或袋上。包含每种制剂与不同固相表面偶联(即，提供主要T细胞激活信号的制剂与第一固相表面偶联和提供共刺激信号的制剂与第二固相表面偶联)的组合物也可能在本公开的范围内。
一方面，能够与本文所述的方法和实施方案一起使用的TAA肽包括，例如，美国专利公开号20160187351、美国专利公开号20170165335、美国专利公开号20170035807、美国专利公开号20160280759、美国专利公开号20160287687、美国专利公开号20160346371、美国专利公开号20160368965、美国专利公开号20170022251、美国专利公开号20170002055、美国专利公开号20170029486、美国专利公开号20170037089、美国专利公开号20170136108、美国专利公开号20170101473、美国专利公开号20170096461、美国专利公开号20170165337、美国专利公开号20170189505、美国专利公开号20170173132、美国专利公开号20170296640、美国专利公开号20170253633、美国专利公开号20170260249、美国专利公开号20180051080和美国专利公开号20180164315所述的TAA肽，本文所述的这些专利公开内容和序列表透过引用整体并入本文。
一方面，本文所述的T细胞选择性地识别提呈上述一个或多个专利和公开内容中所述TAA肽的细胞。
另一方面，能够与本文所述的方法和实施方案一起使用的TAA包括选自SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:157的至少一种。
Figure BDA0002619310400000251
Figure BDA0002619310400000261
Figure BDA0002619310400000271
Figure BDA0002619310400000281
实施例
实施例1
自体T细胞制造工艺
纯化幼稚(Tn)、干细胞记忆(Tscm)以及中央记忆(Tcm)T细胞亚群的过继细胞转移与分化程度更高的效应子记忆(Tem)和效应子(Teff)T细胞转移相比，可导致更佳的肿瘤消退。工程化T细胞产物的传统制造工艺可能需要10-15天。但是，长于约12天(例如14天)的工艺可能导致细胞效力降低，例如，更有效的Tn、Tscm和Tcm T细胞亚群减少和更低效的Tem和Teff T细胞亚群增加。例如，图1A显示了来自两个健康供体(例如：供体6和供体8)的T细胞离体培养时间延长(例如14天)，其中期望的Tcm T细胞亚群相较于培养0天、6天或10天减少。另一方面，分化较高且持久时间较短的Tem T细胞亚群相较于培养0、6或10天数量增加。图1B显示了来自三名患者(例如：患者864、患者453和患者265)的T细胞离体培养时间延长(例如14天)，其中期望的Tcm T细胞亚群相较于培养0天、6天或10天减少。另一方面，分化较高且持久时间较短的Tem T细胞亚群相较于培养0、6或10天数量增加。
更有效的Tn、Tscm和Tcm T细胞亚群较少可导致分泌细胞因子(例如，干扰素γ(INF-γ))的有效激活T细胞更少。图2显示了与激活和培养10天相比，激活和培养15天后，从三名健康供体(例如：供体6(D6)、供体7(D7)和供体8(D8)获得的外周血单核细胞(PBMC)所分泌的INF-γ减少。
为了缩短制造工艺，本公开的实施方案包括约7至约10天的工艺，可制造超过100亿(10x 109)个细胞而未丧失效力。此外，可优化几种原料的浓度以将商品成本降低30％。
自体T细胞制造工艺中消除或修改静置条件对T细胞激活的影响
图3显示了用于测试静置条件对T细胞激活和扩增影响的实验设计。简言之，A组表示第一批次PBMC，其在第0天解冻，之后在无细胞因子的情况下静置过夜(O/N)(即，24小时)，接着用固定在非组织培养处理板上的抗CD3和抗CD28抗体激活所述静置PBMC。IL-7是一种稳态细胞因子，其透过阻止细胞凋亡来促进T细胞存活。静置期间可将IL-7添加到PBMC中。B1-B3组表示第二批次PBMC，其在第1天解冻，之后在存在IL-7(B1组)或存在IL-7+IL-15(B2组)或无细胞因子(B3组)的情况下静置4-6小时，接着用固定在非组织培养处理板上的抗CD3和抗CD28抗体激活所述静置PBMC。C组表示第三批次PBMC，其在第1天解冻(无静置且无细胞因子)，接着用固定在组织培养板上的抗CD3和抗CD28抗体激活所述解冻PBMC。可在第8-10天收获细胞并计数，之后进行激活系列分析。
CD25和CD69是细胞因子或丝裂原激活的淋巴细胞表面上的激活标志物。VSV-G假型慢病毒载体(例如：LV-R73)的结合和进入已被证明由VSV-G包膜蛋白与宿主细胞上的低密度脂蛋白受体(LDL-R)相互作用介导。静置T细胞不表达LDL-R，但是，用抗CD3和抗CD28抗体激活可诱导LDL-R在T细胞上表达并允许有效的慢病毒转导。这表明受激活水平调节的LDL-R表达的动力学可影响VSV-G慢病毒载体的转导效率。
图4显示了A、B1-B3和C组中的CD25、CD69和hLDL-R表达水平相当，提示静置时间可能缩短，例如，从24小时缩短至4-6小时，而未显著降低T细胞激活。
自体T细胞制造工艺中消除或修改静置条件对T细胞扩增的影响
图5A和5B分别显示A和B1-B3组经第7天扩增和第10天扩增后，倍数扩增和细胞存活性相当。但是，无静置的C组在第7天扩增(5倍)(图5A)和第10天扩增(16倍)(图5B)的倍数扩增最小。这些结果表明静置时间可能缩短，例如：从24小时缩短到4-6小时，而不会显著减少T细胞扩增。
图6和7显示了在2个供体(即，供体1(图6)或供体2(图7))中用表达TCR的病毒载体(例如LV-R73)转导的激活T细胞在A、B1-B3和C组第9天扩增的倍数扩增和存活性。B1和B2组显示出比A、B3和C组更好的细胞扩增，提示在存在细胞因子(例如，IL-7或IL-7+IL-15)的情况下简短静置时间(例如，5小时)可能会增加转导T细胞的扩增。Rep1和Rep2表示两次重复。这些结果支持在存在细胞因子(例如，IL-7和/或IL-15)的情况下在自体T细胞制造过程中缩短静置时间(例如，从24小时缩短至4-6小时)，而不会显著减少T细胞扩增。
自体T细胞制造工艺中消除或修改静置条件对T细胞中转基因表达的影响
使用肽/MHC复合体载入的四聚体来检测T细胞表达之与肽/MHC复合体特异性结合的转导TCR，图8显示了在大规模生产中，针对供体13、供体14和供体16，在T75组织培养瓶中静置4小时(用IL-7)和24小时(无细胞因子)或在G-Rex 100烧瓶中静置4小时(用IL-7)的T细胞中转基因表达(例如，重组TCR表达)相当。这些结果表明，大规模制造工艺中可缩短静置时间，例如从24小时缩短到4-6小时，不会显著降低转导T细胞中的转基因表达。此外，使用一个G-Rex 100烧瓶可替代多个T75烧瓶而进一步简化静置过程。
图9显示了对于供体13、供体14和供体16的小规模或大规模生产中静置4-6小时、6小时或24小时的T细胞在第10天扩增时倍数扩增相当。这些结果表明，大规模制造工艺中可缩短静置时间，例如从24小时缩短到4-6小时，不会显著影响转导T细胞的扩增。
自体T细胞制造工艺中抗CD3和抗CD28抗体浓度对T细胞激活的影响
激活是自体T细胞制造工艺中一个重要步骤，这是因为转导效率和扩增速率都依赖于T细胞激活。透过使用抗体结合CD3受体和共受体(例如CD28)而刺激T细胞是激活T细胞的常用方法。T细胞激活可作为病毒载体(例如，慢病毒载体)转导的准备步骤。
图10显示了用于测试抗CD3和抗CD28抗体浓度对T细胞激活影响的实验设计。简言之，第0天，解冻和在无激活细胞因子的情况下培养或静置PBMC过夜或24小时。第1天，静置PBMC的激活方式为：在存在IL-7+IL-15的情况下，在两个包覆有不同浓度(例如，0.1μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml)抗CD3和抗CD28抗体的24孔板中孵育。第2天，分析激活T细胞的CD25、CD69和hLDL-R表达，并用VSV-G假型化慢病毒载体(例如，1xEng LV-R73)转导。第6/7和第9天，进行分析，例如：细胞计数、存活性和用dextramers(Dex)萤光激活细胞分选(FACS)，dextramers(Dex)是基于葡聚糖骨架的多聚体，该骨架载有多个萤光素和肽/MHC复合体，用于检测表达重组TCR的T细胞。
图11显示，在病毒转导之前，用0.5μg/ml和1.0μg/ml抗CD3和抗CD28抗体激活的T细胞在供体16和供体14内均具有相当水平的CD25、CD69和hLDL-R表达。但是，这些表达水平显著高于用较低浓度(例如0.1μg/ml和0.25μg/ml)抗CD3和抗CD28抗体激活的T细胞的表达水平。这些结果表明，可降低抗CD3和抗CD28抗体的浓度，例如从1.0μg/ml降低至0.5μg/ml，不会显著减少T细胞激活。
自体T细胞制造工艺中抗CD3抗体、抗CD28抗体和细胞因子浓度对T细胞扩增的影响
图12显示，在第10天扩增时，在存在不同浓度(例如，25ng/ml、50ng/ml或100ng/ml)IL-15的情况下，由0.5μg/ml或1.0μg/ml抗CD3和抗CD28抗体激活的T细胞的细胞计数在各供体16、供体13和供体14内相当。这些结果表明，可降低抗CD3和抗CD28抗体的浓度，例如，从1.0μg降低/ml至0.5μg/ml，并且可降低IL-15的浓度，例如，从100ng/ml降低至25ng/ml，不会显著降低T细胞扩增。
图13显示，在存在不同浓度(例如，25ng/ml、50ng/ml或100ng/ml)IL-15的情况下，由0.5μg/ml或1.0μg/ml抗CD3和抗CD28抗体激活的重组TCR转导T细胞的四聚体染色在各供体16、供体13和供体14内相当。这些结果表明，可降低抗CD3和抗CD28抗体的浓度，例如，从1.0μg降低/ml至0.5μg/ml，并且可降低IL-15的浓度，例如，从100ng/ml降低至25ng/ml，不会显著降低T细胞的病毒转导。
这些结果一起表明：(1)解冻PBMC后的静置时间可缩短，例如，从24小时缩短至4-6小时，不会显著降低T细胞激活、转基因表达和T细胞扩增；(2)可降低抗CD3和抗CD28抗体的浓度，例如，从1.0μg/ml降低至0.5μg/ml且可降低细胞因子(例如，IL-15)的浓度；例如，从100ng/ml降低至25ng/ml，不会显著降低T细胞激活、转基因表达和T细胞扩增。
自体T细胞制造工艺中激活持续时间对慢病毒载体转导效率的影响
开发自体T细胞制造工艺的主要目标之一是用编码TCR的慢病毒构建体在原代人T细胞中提高转导速率。与仅能转导***细胞的γ逆转录病毒不同，慢病毒理论上既可转导***细胞又可转导非***细胞。但是，用慢病毒转导静置T细胞的转导效率较差。T细胞的激活已被证明可促进彼等之慢病毒转导。因此，用固定的珠或可溶形式的抗CD3和抗CD28抗体刺激T细胞已成为进行慢病毒转导的先决条件，是制造用于过继细胞疗法的基因修饰T细胞的标准部分。
由于T细胞激活步骤在制备用于转导的T细胞中起着关键作用，因此，可能需要优化用抗CD3和抗CD28抗体激活的有效持续时间。
为了确定最佳激活持续时间，进行了评估不同激活持续时间对转导效率影响的时程研究。结果显示，转导T细胞的最佳时间窗可能在用抗CD3和抗CD28抗体激活16-24h后。因此，对于所有进一步的工艺开发和临床制造，转导前T细胞激活的时间可从48h减至16-24h。
在本公开的另一项实施方案中，对于新鲜PBMC(即，未冷冻的PBMC)，可能无需静置。因此，未静置的新鲜PBMC可透过抗CD3抗体和抗CD28抗体激活，之后透过病毒载体转导，以获得转导的T细胞。
尽管转导T细胞的方法可能涉及以下顺序步骤：在组织培养物中激活T细胞，然后将激活的T细胞转移到不同的组织培养物中，并在此过程中用病毒载体转导激活的T细胞，但是，可同时进行激活和转导步骤。例如，当T细胞在被抗CD3和抗CD28抗体激活时，转导激活的T细胞可在相同的培养物中同时进行。透过这种方法，整个T细胞转导过程(即从提供PBMC至获得转导的T细胞)可缩短至3-4天。
实施例2
确定提高慢病毒构建体转导效率的T细胞激活最佳持续时间
来自健康供体的PBMC使用抗CD3和抗CD28抗体以不同的时间间隔激活以准备转导。来自PBMC的激活T细胞用表达靶向作用于R7P1D5 TCR的TAA的不同慢病毒构建体产生的浓缩上清液进行处理。转导细胞在存在IL-7和IL-15的情况下进行扩增。所述产物基于R7P1D5 TCR转基因表达进行比较，基因表达使用特异性dextramer/四聚体透过流式细胞术测定。
代表性材料与方法
Figure BDA0002619310400000331
Figure BDA0002619310400000341
代表性方法
为了比较T细胞激活的不同持续时间，本文所述的代表性实验遵循标准的小规模T细胞制备过程进行，涉及例如4个步骤：解冻/静置、激活、转导和扩增。
解冻和静置
来自健康供体(n＝3，D3、D4、D9)的冷冻PBMC在以5％人AB血清补充的温热TexMACS培养基中解冻。细胞用benzonase核酸酶(50U/ml)在37℃下处理15分钟、洗涤、计数并在完全TexMACS培养基中静置过夜。
激活
在解冻细胞当日，用以PBS稀释的抗CD3和抗CD28抗体(1μg/mL)包覆24孔非组织培养板，密封并在4℃下孵育过夜。次日，收获静置PBMC，计数、洗涤并以1x106/ml浓度重悬。吸出抗体溶液，用完全培养基洗涤孔，之后向每个孔中加入2x 106个细胞。在37℃下进行激活指定时间间隔。
转导
收获、洗涤和计数激活的T细胞。制备含有浓缩病毒上清液、硫酸鱼精蛋白(10μg/ml)、IL-7(10ng/ml)和IL-15(100ng/ml)的转导混合物。对于每次转导，在无菌微量离心管中分离1.0x 106个细胞，并以400×g离心5分钟。每个细胞团重悬于对应于特定MOI的0.5ml转导混合物中。细胞悬浮液置于24孔G-Rex板的适当标记孔中。在37℃和5％CO2下孵育24小时后，向每个孔中加入以IL-7(10ng/ml)和IL-15(100ng/ml)补充的1.5ml培养基。转导后96小时，透过流式细胞术确定转基因表达。使用多聚MHC-肽复合体(Dextramer或四聚体)透过FACS监测转基因TCR的表面表达。
流式细胞术
简言之，以给定的慢病毒感染复数(MOI)转导的1.0x 106个细胞按照工作说明进行染色。对于四聚体染色，细胞用含1μl TAA四聚体的50μl流式缓冲液在室温下避光孵育15分钟。四聚体染色后用T细胞表面标志物(例如CD3、CD4、CD8等)的抗体染色。用来自补偿珠的自补偿基质获取样品。
结果
从2个供体(D3和D4)获得的PBMC使用与板结合的抗CD3和CD28抗体激活16、24和48小时。细胞用3种不同的慢病毒构建体(R72、R21和R22)转导。
图14A显示CD3+CD8+四聚体+T细胞百分比随着激活持续时间的增加而逐渐减少，大约为16h>24h>48h。在检测的构建体和供体中始终都观察到该顺序。
为了确定可导致转基因高表达的病毒转导的最佳激活持续时间，进行了时程研究。来自一个供体(D9)的PBMC用与板结合的抗CD3和抗CD28抗体激活指定的激活持续时间(例如，0至48小时)，并用编码R7P1D5 TCR的两种不同慢病毒构建体(即，LV-R73和LV-R78)中的每一种进行转导。
图14B显示在激活16-20小时的细胞中转基因表达最高。结果表示转导后96小时透过流式细胞术以CD3+CD8+四聚体+T细胞％测得的转基因表达水平。最佳激活视窗确定为约16至约20小时，且可延长至最大24小时以增加GMP制造的灵活性。
总之，这些结果可解释在激活48小时的T细胞中观察到的低转导率的其中一种原因，并且显示16至24小时的较短激活时间对于执行慢病毒转导可能是最佳时间。尽管将激活时间限制为16至24小时可能影响48小时激活所实现的稳健扩增，但是，认为这种变化可对产品非常有益并且被实施用于所有进一步的工艺开发和临床制造。
实施例3
与所有生物过程一样，T细胞制造规模扩大是该过程开发的挑战性部分。在扩大规模的所有阶段，维持T细胞功能和品质以保持产品功效至关重要。对于自体T细胞制造工艺，本发明人确定了关键步骤并将规模扩大分为两部分：可在非组织培养表面上进行激活规模扩大，以及可在G-Rex装置中进行转导和扩增规模扩大。
尽管珠或可溶性抗体呈现出较为简单的、易于扩大规模的激活细胞方法，但是，在非组织培养物表面(24孔板)上使用固定的抗体进行激活的自体T细胞制造工艺产生最佳的慢病毒转导和扩增率。但是，从多个24孔非组织培养抗体包覆的板中收获激活细胞是费力耗时的步骤，为原本简单的工艺增加了复杂性。考虑到激活至多1x 109个PBMC，在每次制造运行中可能需要大约20个板和480次操作来收获激活细胞。
激活T细胞的常规方法可能包括开放***和劳动密集型工艺，其使用市售珠或非组织培养物处理的24孔或6孔板且包覆有抗CD3和抗CD28抗体(“板结合”)，各抗体的浓度为1ug/mL。但是，开放***方法可能需要较长的时间(例如，大约8小时)才能完成。为了简化开放***和劳动密集型工艺，本公开的实施方案可能包括：适用于封闭***的简单工艺，所述封闭***可与市售封闭***(例如，G-RexTM***和XuriTM细胞扩增***)的容器(例如，袋)配合使用，从而使终产物的T细胞激活谱、T细胞转导性和功能性与使用常规方法激活的T细胞相当。另外，本公开所述的方法(例如，烧瓶结合方法)可能需要较短的时间(例如，约1小时)即可完成，这比传统方法快约8倍。
用于开发自体T细胞制造工艺的优化在小规模下进行，采用24孔非组织培养板进行激活和采用24孔G-Rex板进行转导和扩增。在此规模下，第2天转导的1-2百万个T细胞进行30倍至40倍扩增直至第10天，在收获时产生3-8千万个细胞。但是，最终工艺的目标可能是转导2.5-4亿个激活细胞并扩增至超过100亿个存活CD3+T细胞，从而维持10天的制造时间表。因此，一方面，本文提出了整个工艺的规模扩大。
对于包括更多数量细胞激活方法的本公开实施方案，非组织培养物处理的T175cm2烧瓶可提供更大的表面积和更简单的平台，从而使需要的操作非常少。优化后，使用烧瓶结合抗体激活T细胞使得扩增和转导与板结合抗体相当。因此，激活步骤的规模扩大是简化用于临床制造的自体T细胞制造工艺的主要开发内容。基于更多的细胞数量，转导和扩增规模从G-Rex-24孔板扩大至G-Rex 100。使用G-Rex装置可促进激活后步骤的接近线性规模扩大，尤其是在接种密度方面。其他参数(例如：进料和分瓶次数)可进行标准化，从而实现最大的扩增率和存活性。在全规模PD运行中验证整个规模扩大工艺可确保在GMP中T细胞产物1号工艺的技术成功转移。
板结合与烧瓶结合
T细胞激活与之后的转导和扩增是T细胞制造的关键步骤。为了优化条件以扩大这些步骤的规模，使用T175cm2烧瓶提供了合适的激活平台，表面积更大、操作更少，从而可替代包覆有抗CD3和抗CD28抗体的24孔板。在优化T175cm2***关键参数后进行的比较研究中，使用包覆在烧瓶上(烧瓶结合)的抗体激活的多个供体的细胞显示出与使用包覆在24孔板上(板结合)的抗体激活的细胞具有相当的激活、转导和扩增水平。
此外，转导和扩增步骤从小规模(G-Rex-24孔板)扩大至中等规模(2-6个G-Rex10或1个G-Rex100)，再扩大至全规模(5-8个G-Rex100)。整个规模扩大工艺可能在2次全规模工艺开发(PD)运行中进行验证。使用最终工艺产生的所有产物在Dex+
CD3+CD8+细胞百分比方面符合临床放行标准，并产生足以满足临床剂量的细胞数。
透过板结合方法和烧瓶结合方法(非组织培养物处理的烧瓶用抗CD3和抗CD28抗体包覆)激活的T细胞之间在激活水平(流式细胞术)、转导性(Dextramer染色，FACS)、扩增(细胞计数)和功能性(IFN-γELISA)方面的比较
来自健康供体的PBMC使用抗CD3和抗CD28抗体使用非组织培养物处理的T175cm2烧瓶或24孔板激活以准备转导。激活的T细胞用编码R7P1D5 TCR的慢病毒构建体进行转导，并接种于G-Rex 24孔板或G-Rex10/G-Rex100烧瓶中。转导的T细胞在存在IL-7和IL-15的情况下扩增，并在所述工艺的第10天收获。对产物进行过程中测试和最终测试，以确定细胞计数、存活性和转导的CD8+T细胞的百分比。
代表性材料与方法
Figure BDA0002619310400000381
Figure BDA0002619310400000391
方法
实验遵循标准的自体T细胞制造工艺，其涉及4个步骤：解冻/静置，激活，转导和扩增，但是规模不同。
解冻和静置
来自健康供体的冷冻PBMC在以5％人AB血清补充的温热TexMACS培养基(完全培养基)中解冻。细胞用benzonase核酸酶(50U/ml)在37℃下处理15分钟，洗涤，计数并在完全TexMACS培养基中静置过夜。
激活
在解冻细胞当日，用以PBS稀释的抗CD3和抗CD28抗体(1μg/mL)包覆24孔非组织培养板或T175cm2烧瓶，密封并在4℃下孵育过夜。次日，收获静置PBMC，计数、洗涤并以1x 106/ml浓度重悬。吸出抗体溶液，用完全培养基洗涤孔，之后向每个孔中加入2x 106个细胞。在37℃下进行激活指定时间间隔。
转导
收获、洗涤和计数激活的T细胞。转导混合物含有临床前慢病毒上清液(基于指定的MOI计算)、硫酸鱼精蛋白(10μg/ml)、IL-7(10ng/mL)和IL-15(100ng/mL)。对于每次转导，激活的细胞被分离，并以400×g离心5分钟。每个细胞团重悬于转导混合物(1ml/2x 106个细胞)并接种于适当大小的G-Rex烧瓶中。在37℃和5％CO2下孵育24小时后，使用以IL-7(10ng/ml)和IL-15(100ng/ml)补充的培养基将每个G-Rex烧瓶中的培养物体积调至指定的一半或满容量。定期监测细胞计数和存活性直到该工艺的第10天。使用多聚MHC-肽复合体(Dextramer或四聚体)透过FACS监测转基因TCR的表面表达。
流式细胞术
简言之，按照工作说明对1.0x 106个转导细胞进行染色。四聚体染色后用T细胞表面标志物的抗体染色。用来自补偿珠的自补偿基质获取样品。
结果
为了评价非组织培养物处理的T175cm2烧瓶作为24孔板的替代物用于包覆抗CD3和抗CD28抗体以激活T细胞，抗体浓度保持与小规模相同，其他参数(例如，包覆体积、细胞密度和接种体积)针对烧瓶较大面积进行了优化。
为了比较激活标志物CD25、CD69和LDL-R在板结合(PB)和烧瓶结合(FB)激活的PBMC中的存活性和表达，在激活后16-24小时使用FB或PB抗CD3和CD28抗体进行FACS染色和采集。未刺激的PBMC用作阴性对照。
图15显示，在优化的条件下，T175 cm2烧瓶中激活的T细胞(烧瓶结合，FB)与在板结合(PB)条件下激活的T细胞相比，激活标志物CD25，CD69和LDL-R表达水平相当。这些结果表明，鉴于FB和PB激活的T细胞产生的激活水平相当，因此使用FB抗体进行规模扩大激活是可行的。
为了比较第10天收获的使用PB或FB抗体激活之T细胞产物(来自供体6、供体7和供体8)的转基因表达和扩增，使用TAA特异性dextramer或转基因TCRβ链特异性抗体透过流式细胞术测定R7P1D5 TCR的表面表达。倍数扩增的计算基于转导时(第2天)接种于G-Rex板或烧瓶和收获当天(第10天)的存活细胞数。图16A和16B分别显示了FB和PB激活T细胞中相当的转导和倍数扩增水平。这些结果表明，鉴于FB和PB激活T细胞产生的转导和扩增水平相当，因而使用FB抗体进行规模扩大转导和扩增是可行的。
为了进一步验证激活的成功规模扩大，比较了FB和PB激活方法产生的T细胞产物的功能性。为了评价使用PB或FB抗体激活产生的LV-R73转导T细胞产物的抗原特异性IFN-γ诱导，与肿瘤细胞系(Target+ve、Target-ve)共培养的T细胞上清液中释放的IFN-γ使用市售的ELISA试剂盒进行定量。
图17显示，FB激活LV-R73转导的T细胞与PB激活转导的T细胞分泌相当水平的抗原特异性IFN-γ以应对供体6、供体7和供体8中表达TAA的肿瘤细胞。这些结果表明，鉴于FB和PB激活的T细胞产生的IFN-γ分泌水平相当，因而使用FB抗体扩大IFN-γ分泌T细胞的规模是可行的。
为了扩大其余过程的规模，转导2.5x 108-4.0x 108个激活T细胞，并以0.5x 106/cm2 G-Rex100烧瓶表面积的最佳接种密度进行接种。使用多个G-Rex100烧瓶以最佳密度接种转导的细胞。其他参数(例如：细胞进料和分瓶条件)也可进行优化，从而实现最大的扩增。最终制造工艺在2次全规模工艺开发运行中进行检测。使用最终工艺产生的所有产物均符合％Dextramer和整合拷贝数放行标准。这些制造运行中产生的细胞数量满足所有世代水准的临床剂量。PD规模扩大运行的结果总结于以下的表1中。
表1：2次全规模PD运行的产物特征小结
Figure BDA0002619310400000411
采用上述方法的GMP制造已在少数供体中产生了超过200亿个细胞。
烧瓶结合与袋结合
透过烧瓶结合方法和袋结合方法(例如，包覆有抗CD3和抗CD28抗体的Saint-Gobain VueLife AC袋)激活的T细胞之间在激活水平(流式细胞术)，转导性(Dextramer染色，FACS)和扩展(细胞计数)方面的比较
为了比较使用抗CD3和抗CD28抗体包覆的袋与板的T细胞激活，图18显示了用于测试使用包覆抗CD3和抗CD28抗体的袋和板对T细胞激活影响的实验设计。简言之，第0天，解冻PBMC并静置过夜(24小时)。第1天，静置的PBMC透过将其接种于使用抗CD3和抗CD28抗体包覆16-20小时的烧瓶(例如，T175cm2烧瓶)或袋(例如，Saint-Gobain VueLife AC袋)来激活。第2天，分析激活T细胞的CD25，CD69和hLDL-R表达，并用VSV-G假型化慢病毒载体(例如，1xEng LV-R73)进行转导。第6/7和第10天，进行分析，例如：细胞计数，存活性和用dextramers(Dex)萤光激活细胞分选(FACS)。
图19显示，在优化的条件下，在浓度为1μg/ml或2μg/ml的抗体结合的袋中激活的T细胞(来自供体16和供体14)与烧瓶结合(T175cm2烧瓶，标记为“标准”)条件下激活的T细胞相比，激活标志物CD25，CD69和LDL-R表达水平相当。这些结果表明，鉴于袋结合(Bag)和烧瓶结合(FB)激活的T细胞产生的激活水平相当，因此使用袋结合(Bag)抗体进行规模扩大激活是可行的。
图20和21分别显示了扩增的第6天和第10天，在浓度为1μg/ml或2μg/ml的抗体结合的袋中激活的T细胞(来自供体16和供体14)与FB条件下激活的T细胞相比，T细胞计数(即，细胞扩增)相当。这些结果表明，鉴于袋结合和烧瓶结合激活的T细胞产生的扩增水平相当，因而使用袋结合抗体进行规模扩大扩增是可行的。
实施例4
T细胞制造工艺中的短暂静置与过夜静置
图22显示了根据本公开一实施方案所述透过使PBMC静置约4小时时间段的T细胞制造工艺220。例如，T细胞制造工艺220可包括分离和冷冻保存来自白细胞分离术的PBMC(221)，其中可测试无菌性；解冻、静置(例如，约4小时)并激活T细胞(222)；用病毒载体转导(223)；用细胞因子扩增(224)；分瓶/进料细胞(225)，其中可测试细胞计数和免疫表型；收获和冷冻保存药物产品细胞(226)，其中可测试细胞计数和霉浆菌；以及冷冻保存后放行(227)，其中可测试存活性、无菌性、内毒素、免疫表型、整合载体拷贝数和水疱性口炎病毒糖蛋白G(VSV-g)。
图2显示了根据本公开一实施方案所述透过T细胞制造工艺220的三次不同试产(qualification run)制造的T细胞的特征，方法是：在存在IL-7的情况下，使PBMC静置较短时间(例如，约4至约6小时)。
表2：透过静置PBMC较短时间(例如，约4至约6小时，优选为约4小时，在GMP洁净室中)的T细胞制造工艺220的试产(QR)
Figure BDA0002619310400000431
图23A和表2显示了透过过夜静置PBMC制造的T细胞平均倍数扩增(n＝7)为78.7倍。
为了确定转导TCR是否在扩增T细胞的细胞表面上表达，扩增T细胞用特异性结合转导TCR的肽/MHC复合体载入的dextramer染色，然后透过流式细胞术鉴定表达转导TCR的CD8+T细胞。图23B和表2显示了透过短时间静置制造的Dex+/CD8+T细胞平均百分比(n＝7)为约53.4％，提示转导TCR在扩增T细胞的细胞表面上表达。
为了确定在表达转导TCR的扩增T细胞中存在哪些T细胞表型，用各种免疫细胞表面标志物染色细胞，然后以流式细胞术鉴定T细胞表型(例如，Tn/scm、Tcm、Tem和Teff)。其中，Tn/scm可能比其他更适合于免疫疗法，这是因为Tn/scm可能具有淋巴归巢、增殖可能性、自我更新和多能性的特性。图23C显示平均约50％的表达转导TCR的扩增T细胞(n＝4)表现出Tn/scm表型。
为了确定表达转导TCR的扩增T细胞的细胞毒性活性，用不同浓度靶肽脉冲处理的肿瘤细胞与表达转导TCR的扩增T细胞一起孵育，所述TCR特异性识别靶肽/MHC复合体，然后测量肿瘤细胞生长。图23D显示，表达转导TCR的扩增T细胞以肽浓度依赖性方式抑制肿瘤细胞生长。
从不同健康供体(例如，供体7、13、17、18和21)(图23E)中获得的PBMC与从不同患者(例如，患者312、319、351、472和956)(图23F)中获得的PBMC之间表达转导TCR的扩增T细胞的细胞毒性活性似乎相当。
为了确定表达转导TCR的扩增T细胞的细胞毒性可能性，表达靶肽的肿瘤细胞与表达转导TCR的扩增T细胞(220-T)一起孵育，所述TCR特异性识别靶肽/MHC复合体，然后测量肿瘤细胞的倍数生长。图23G和图23H显示，与缺乏靶特异性TCR的未转导T细胞(NT)相比，在效应子与肿瘤细胞比为10:1和3:1的情况下，透过用表达转导TCR的扩增T细胞(220-T)(效应子)孵育，可增加对肿瘤生长的缓解或抑制。
图24显示了过夜静置PBMC(约16小时)的T细胞制造工艺240。例如，T细胞制造工艺240可包括分离PBMC(241)，其中PBMC可为新鲜使用或在准备使用前可为冷冻保存的，或可用作T细胞制造的起始材料，也可能选择淋巴细胞群(例如，CD8、CD4或两者均选择)；将淋巴细胞解冻并静置过夜(例如约16小时)(242)，这可让凋亡细胞死亡并恢复T细胞的功能性(如果使用新鲜材料，则可能无需此步骤)；激活淋巴细胞(243)，可使用抗CD3和抗CD28抗体(可溶性或表面结合，例如：磁珠或生物可降解珠)；用CAR或TCR转导(244)，可使用编码CAR或TCR的慢病毒或逆转录病毒构建体，或可使用非病毒方法；和扩增淋巴细胞、收获和冷冻保存(245)，可在存在细胞因子、血清(ABS或FBS)和/或冷冻保存培养基的情况下进行。
图3显示了透过过夜静置PBMC(例如，约16小时)的T细胞制造工艺(240)的三次不同试产所制造的T细胞的特征。
表3：过夜静置PBMC(在GMP洁净室中)的T细胞制造工艺的试产(QR)。
Figure BDA0002619310400000451
与短时间静置(例如，约4小时)的T细胞制造工艺相比，约16小时静置时间下制造的T细胞产生较少的T细胞倍数扩增。图25A和表3显示透过静置PBMC约16小时制造的T细胞平均倍数扩增(n＝7)为约45倍，而静置约4小时的较短时间为约78.7倍(表2)。TT和PQ分别表示技术转移和工艺试产。
与静置约4小时相比，过夜静置(约16小时)产生的表达转导TCR的扩增T细胞较少。图25B和表3显示透过过夜静置PBMC约16小时制造的Dex+/CD8+T细胞平均百分比(n＝7)为约51.9％，而静置约4小时为约53.4％(表2)。
与静置约4小时相比，过夜静置约16小时产生的表达具有Tn/scm表型的表达转导TCR的扩增T细胞较少。图25C显示，平均约40％的扩增T细胞(n＝5)具有Tn/scm表型，相比之下，静置约4小时约为50％(图23C)。
图25D显示，与阴性对照组(例如，肿瘤细胞与不表达转导TCR(Target-ve)的扩增T细胞一起孵育或无效应子)相比，在效应子与肿瘤细胞比为10:1、3:1和1:1的情况下，透过肿瘤细胞与表达转导TCR的扩增T细胞(效应子)一起孵育，可显著更多地抑制肿瘤生长。此外，从健康供体(n＝5)(图25E)中获得的PBMC与从癌症患者(n＝7)(图25F)中获得的PBMC之间表达转导TCR的扩增T细胞的细胞毒性活性似乎相当。
表4总结了根据本公开的一实施方案以约4小时短时间静置(工艺220)以及过夜静置约16小时(工艺240)制造的T细胞的特征。
表4
Figure BDA0002619310400000461
表4显示了短时间静置的工艺220(约4-6小时)可能允许多一天的扩增(例如，工艺240的第8天为工艺220的第9天)，因此，产生更多细胞。
实施例5
封闭***中的T细胞制造
如上所述，工艺220和240可在开放***(例如，G-RexTM)中执行。但是，开放***中对造血细胞(例如，T细胞)的离体操作可能引入感染因子污染的风险，并可能降低移植的可能性和造血合适性。在制造临床细胞产品过程中，由于整个培养过程需保证无菌，因此，可优选封闭培养***。
图26显示了开放和封闭***中的离体操作方案。封闭***不仅可减轻外部处理风险和污染，还可促进产品的稳健性和品质，并提高产品安全性，从而减少下游加工、最终产品分析和测试的挑战。尽管数量相对较少的细胞(例如，≤1x 109)可在开放***中以相对小的体积培养(例如，1升)，但是，数量相对较大的细胞(例如，约1x 109至约2x 1011)可在封闭***中以相对大的体积培养，例如，5升(例如，WAVE(XURITM))生物反应器袋和G-RexTM烧瓶)至50升(例如，静态袋)。这些封闭***的细胞培养技术可提供高品质、个体化的细胞疗法，作为受控、更便捷和经济有效的细胞制造途径。
本公开的T细胞制造工艺可在任何细胞培养封闭***中实施，包括市售***，例如：CliniMACS ProdigyTM(Miltenyi)、WAVE(XURITM)生物反应器(GE Biosciences)单用或与BioSafe SepaxTM II联合使用、以及G-Rex/GatheRexTM封闭***(Wilson Wolf)单用或与BioSafe SepaxTM II联合使用。G-RexTM封闭***为扩增容器，GatheRexTM为用于浓缩和收获的泵。
CliniMACS ProdigyTM(Miltenyi)
CliniMACS ProdigyTM含有TCT工艺软件和TS520管套件，可进行封闭***处理，用于细胞富集、转导、洗涤和扩增。例如，MACS-CD4和CD8-MicroBeads可用于富集，TransACT珠(例如，CD3/CD28试剂)可用于激活，表达重组TCR的慢病毒载体可用于转导，TexMACS培养基-3％-HS-IL2可用于培养，磷酸盐缓冲盐水/乙二胺四乙酸缓冲液可用于洗涤。此***可以产生约4-5x 109个细胞，包含用于制造腔室最大～300mL填充体积的自动化方案，并在10至14天的工艺期间执行选择和激活(TransACT珠)、转导和扩增。
WAVE(XuriTM)生物反应器(GE Biosciences)
WAVE(XuriTM)生物反应器可在进行和/或不进行灌注的情况下在培养袋(例如，Xuri Cellbags)中培养T细胞。用于进料的培养基袋可为5升的Hyclone Labtainer。废物袋可为Mbag(购自GE Healthcare)。此***可产生约15-30x 109个细胞，使用可进行培养控制和监测的独角兽软件，包含可容纳约0.3升至约25升的摇动托盘，并执行灌注功能以保持培养体积的同时调节气体交换并将新鲜培养基和细胞因子引入细胞培养物。
WAVE(XuriTM)生物反应器可包括用于扩增的Xuri袋、用于解冻和静置的SaintGobain‘s VueLife袋以及用于激活的VueLife AC袋。WAVE(XuriTM)生物反应器可与其他技术(例如SepaxTM细胞分离***(GE Biosciences)配合使用，以进行培养物洗涤和体积减少步骤。无菌焊接机(Terumo BCTTM)可用于连接用于溶液转移的无菌袋和用于管道密封的热封机。
SepaxTM细胞分离***依赖于分离腔，所述分离室透过注射器腔的旋转进行分离(离心)和透过注射器活塞的移位进行组分转移。光学感测器可测量分离组分的吸光度，并管理正确输出容器中每种组分的流动方向，例如，可从血液样品中分离和收集血浆、血沉棕黄层和红细胞。
图27显示，第0天，SepaxTM细胞分离***分离的冷冻PBMC可进行解冻、洗涤、静置(例如，过夜(O/N))，培养袋(例如，VueLife AC细胞袋)可用抗CD3抗体和抗CD28抗体包覆；第1天，可将静置的PBMC转移至包覆有抗CD3抗体和抗CD28抗体的培养袋中进行激活；第2天，可洗涤细胞并透过SepaxTM细胞分离***将培养基减少为适于病毒转导(例如，用表达TCR的慢病毒载体转导)的合适体积。细胞扩增可在有灌注功能的摇动托盘上面的XuriTM培养袋中进行，以维持培养体积，同时调节气体交换并将新鲜培养基和细胞因子引入细胞培养物。可使用SepaxTM细胞分离***收获并洗涤扩增的转导T细胞。
G-Rex/GatheRexTM封闭***(Wilson Wolf)
G-Rex/GatheRexTM封闭***包括：用于细胞扩增的气体交换容器(G-Rex-CS)和自动泵(GatheRex)，所述自动泵可让操作者排出培养物中存在的过量培养基并收集细胞，而没有污染的风险。收获过程可分为两个阶段：细胞浓缩和细胞收获。在细胞浓缩工艺中，GatheRexTM封闭***可透过空气泵操作，所述空气泵用无菌空气对G-RexTM装置(例如：烧瓶)加压，可让细胞上方90％的培养基移至培养基收集袋中。此工艺一旦完成，第一光学检测器则会感应培养基收集管线中存在空气，自动停止泵运行。在开始收获工艺之前，操作者可透过手动旋转G-RexTM装置以使细胞自透气膜脱附而使用剩余的10％培养基来重悬细胞。然后，重新激活空气泵，并将重悬的细胞吸入细胞收集袋中。一旦第二光学检测器检测到细胞收集管线有空气，则自动结束该阶段。此***可产生约15-20x 109个细胞，每容器容纳5升。
G-Rex/GatheRexTM封闭***可支持在容器中转导和扩增并用泵收获。解冻、静置和激活步骤可在VueLifeTM袋中进行。GatheRexTM封闭***可与其他技术(例如SepaxTM细胞分离***)配合使用，以进行培养物洗涤和体积减少步骤。无菌焊接机(Terumo BCTTM)可用于连接用于溶液转移的无菌袋和用于管道密封的热封机。
图28显示，第0天，SepaxTM细胞分离***分离的冷冻PBMC可进行解冻、洗涤、静置(例如，过夜(O/N))；第1天，培养袋可用抗CD3抗体和抗CD28抗体包覆，可将静置的PBMC转移至包覆培养袋进行激活；第2天，可洗涤细胞并透过SepaxTM细胞分离***将培养基减少为适于病毒转导(例如，用表达TCR的慢病毒载体转导)的合适体积。细胞扩增和进料可在G-RexTM封闭***装置中进行。然后，可用GatheRexTM泵收获、用SepaxTM细胞分离***洗涤扩增的转导T细胞。
表5显示透过开放***(例如，G-RexTM)获得的T细胞(如表4所示，即，工艺220和240)和透过封闭***(例如，CliniMACS ProdigyTM、WAVE(XURITM)生物反应器与BioSafeSepaxTM II联合使用、以及G-Rex/GatheRexTM封闭***与BioSafe SepaxTM II联合使用)获得的T细胞之间的比较。
表5
Figure BDA0002619310400000491
Figure BDA0002619310400000501
这些结果显示，本公开的T细胞制造工艺可易于在封闭***中实施，使产生的T细胞与开放***产生的T细胞具有相当的特征，同时减轻外部处理风险和污染，促进产品的稳健性和品质，并提高产品安全性，从而减少下游加工、最终产品分析和测试的挑战。
为了进一步比较在封闭***中制造与在开放***中制造工程化T细胞的功能特征，根据本公开的工艺对获自供体17的PBMC进行处理，以产生扩增的转导T细胞。然后在存在或不存在TCR特异性肽/MHC复合体(靶标)的情况下测量表达TCR的扩增转导T细胞的IFN-γ释放。
图29显示，透过两次运行(运行#1和运行#2)所测得的封闭***中制造的工程化T细胞，在存在靶标的情况下，比开放***中制造(例如，工艺220)的细胞释放显著更多的IFN-γ。这些结果表明，封闭***中制造的工程化T细胞可能比开放***中制造的细胞具有更大的细胞毒性活性。
实施例6
约5-6天内GMP制造TCR工程化T细胞
使用自体工程化T细胞方法的过继性细胞疗法利用安全有效靶标及其同源TCR的转化开发。这些TCR经基因工程改造为患者自身(自体)的T细胞，以用于实体瘤的免疫治疗。
图30显示了三种T细胞产物(T细胞产物#1、T细胞产物#2和T细胞产物#3)的制造概况，各产物表达对抗其自身各自HLA-A*02:01限制性肿瘤靶向抗原的转基因TCR。T细胞产物#1和T细胞产物#2使用开放***从解冻冷冻的PBMC、静置解冻的PBMC、激活静置的PBMC(步骤2)、转导激活的T细胞(步骤3)、到“收获和冷冻保存药物产品细胞”(步骤6)分别在约8-11天和约7-10天内制造，用于IND驱动的第1期首次应用于人体试验。
T细胞产物#3可透过将扩增期从约5-8天(T细胞产物#1和#2)缩短至约3-4天来制造。此外，T细胞产物#3可透过在第0天激活新鲜PBMC(即，PBMC未冷冻保存然后解冻)来制造。此不同于T细胞产物#1的制造(在第0天解冻冷冻保存的PBMC，然后在第1天激活解冻的PBMC)和T细胞产物#2的制造(在第0天解冻冷冻保存的PBMC并激活解冻的PBMC)。
相对于使用开放***制造的T细胞产物#1和#2，T细胞产物#3可使用完全封闭***或半封闭***来制造，其中一些步骤可透过使用开放***进行，例如从T细胞激活到为了转导而减少体积和/或从收获到洗涤、浓缩和冷冻保存。
图31显示了从白细胞分离术收集到输注就绪的TCR T细胞产物#1的周转时间可能需要约30天，例如，从样品收集到收获约14天，从品质控制(QC)到产品放行约16天；制造TCRT细胞产物#2的周转时间可能需要约26天，例如，从样品收集到收获约10天，从QC到产品放行约16天。
但是，需要快速的周转。图30显示，T细胞产物#3使用较短的制造工艺制造，例如从“可选解冻、静置和激活”(步骤2)到“收获和冷冻保存药物产品细胞”(步骤6)5-6天，并使用半封闭***。图31显示，TCR T细胞产物#3的制造可能需要约23天，例如从样品收集到收获约7天，从QC到产品放行约16天。对于商业制造，例如，TCR T细胞产物(如，T细胞产物#1、T细胞产物#2和T细胞产物#3)可能需要约13天制造，例如，从样品收集到收获约6天，从QC到产品放行约7天。
图32显示了使用新鲜PBMC的T细胞制造工艺320，所述新鲜PBMC不是透过解冻冷冻保存的PBMC获得，因此，可最大限度地减少因冷冻、解冻和/或静置PBMC导致的细胞损失，并在制造工艺开始时使细胞数最大化。例如，T细胞制造工艺320可包括第0天，分离新鲜PBMC(321)，使用在袋(例如，Saint-Gobain VueLife AC袋，用抗CD3和抗CD28抗体包覆)中的例如抗CD3和抗CD28抗体(可溶性或表面结合性，如：磁珠或生物可降解珠)激活新鲜淋巴细胞(322)；第1天，用CAR或TCR转导(323)，使用例如编码CAR或TCR的慢病毒或逆转录病毒构建体或非病毒方法(例如，脂质体)；以及在存在细胞因子、血清(ABS或FBS)和/或冷冻保存培养基的情况下，第2天，扩增淋巴细胞，第5/6天收获和冷冻保存(324)。
用更短的扩增改进产品特征
T细胞免疫的品质、有效性、寿命和位置可源自幼稚T细胞(Tn)多样化成为在保护性免疫中具有特定作用的各种表型不同的亚群。这些包括记忆干(Tscm)细胞、中枢记忆(Tcm)细胞、效应子记忆(Tem)细胞和高度分化效应子(Teff)T细胞。抗原特异性Tn产生长寿命的Tscm和Tcm，其可自我更新并提供寿命较短的Tem和Teff细胞增殖群。因此，选择分化程度较低的Tn、Tscm或Tcm亚群用于基因修饰可提供具有更高治疗功效的细胞。
为了评价在不同制造时间收获的T细胞产物的分化状态，在制造第4天(扩增3天)、第7天(扩增6天)和第10天(扩增9天)收获从3个供体(供体1、供体2和供体3)获得的CD8+T细胞，然后进行T细胞记忆表型分析。
图33显示，表现为较低分化表型(例如，Tn/scm-CD45RA+CCR7+和Tcm-CD45RO+CCR7+)的CD8+T细胞数量以扩增时间依赖性方式降低，即，第4天>第7天>第10天。相反，表现为较高分化表型(例如，Tem-CD45RO+CCR7-和Teff-CD45RA+CCR7-)的CD8+T细胞数量以扩增时间依赖性方式增加，即，第4天<第7天<第10天，提示第4天的扩增细胞比第7天和第10天的扩增细胞具有更多的较低分化表型。这些结果表明，T细胞扩增时间越短，T细胞表现较低分化记忆表型就越多，从而具有更高的治疗功效。
在原代CD8+T细胞反应期间可能需要CD27和CD28共刺激。这种共刺激可为幼稚CD8+T细胞提供增殖和存活提示。为了评价在不同制造时间收获的T细胞产物的CD27和CD28共刺激可能性，在制造第4天、第7天和第10天收获从3个供体(供体1、供体2和供体3)获得的CD8+T细胞，然后进行CD27和CD28表达分析。
图34显示，表现CD27+CD28+共刺激表型的CD8+T细胞数量以扩增时间依赖性方式降低，即第4天>第7天>第10天，提示第4天扩增细胞的CD27和CD28共刺激优于第7天和第10天扩增细胞的CD27和CD28共刺激。这些结果表明，一般情况下，T细胞扩增时间越短，T细胞表达CD27和CD28就越多。
为了评价在不同制造时间收获的T细胞产物的复制可能性，在制造第4、7和10天收获T细胞，并用细胞因子敏感性测定法监测应对相关细胞因子(例如，IL-7、IL-15或IL-2)的生长。
图35显示，以IL-7、IL-15或IL-2诱导约21天的T细胞生长以扩增时间依赖性方式降低，即第4天>第7天>第10天，提示第4天扩增细胞的复制可能性优于第7天和第10天扩增细胞的复制可能性。这些结果表明，T细胞扩增时间越短，T细胞对细胞因子的增殖反应就越多。
为了评价在不同制造时间收获的T细胞产物的抗肿瘤活性，在制造第5天、第7天和第9天收获从4个供体(供体1、供体2、供体3和供体4)获得的T细胞产物，然后进行应对暴露于靶阳性细胞系的干扰素-γ(IFN-γ)释放测定。
图36显示，IFN-γ分泌以扩增时间依赖性方式降低，即第5天>第7天>第9天，提示一般情况下第5天扩增细胞的抗肿瘤活性优于第7天和第9天扩增细胞的抗肿瘤活性。这些结果表明，一般情况下，T细胞扩增时间越短，T细胞分泌IFN-γ就越多。
为了进一步评价在不同制造时间收获的T细胞产物的细胞毒性活性，测定基于对用递减浓度同源肽脉冲的T2细胞的IFNγ反应之EC50。
图37显示，EC50以扩增时间依赖性方式增加，即第5天>第7天>第9天，提示第5天扩增细胞的肽特异性细胞毒性活性优于第7天和第9天扩增细胞的肽特异性细胞毒活性。
T细胞产物#3的GMP制造。
用最终T细胞产物#3工艺制造的产物的特征
图38显示了扩增量化指标。在两次技术转移(TT)制造运行和两次工艺试产(PQ)制造运行(n＝4)中，短期(例如，约6天)扩增后收获平均1.3x 1010个细胞，具有>90％的存活性。
图39显示了使用TCR特异性HLA-dextramer透过流式细胞术检测的T细胞产物#3TCR的表面表达。显示的代表性FACS图和合并资料(平均值±SD)基于使用来自健康供体的白细胞分离术产物进行的技术转移(TT)和工艺试产(PQ)制造运行(n＝4)。
图40显示了最终T细胞产物#3的T细胞记忆表型，其中在表现出用于制造的PBMC中的T细胞群为高度可变记忆表型的供体中(n＝4)(分别为Tn/scm-17.9％、19.2％、11.2％、35.0％Tcm-23.4％、15.7％、0.9％、2.4％Tem-34.8％、27.0％、25.9％、43％Teff-23.8％、38.2％、62.0％、16.1％)，透过技术转移(TT1,TT2)和工艺试产(PQ1,PQ2)制造运行所产生的T细胞保持着较低分化的表型。
图41显示了应对暴露于靶阳性(LVR11KEA)和阴性(NT)细胞系的IFN-γ释放。透过技术转移(TT)和工艺试产(PQ)制造运行产生的T细胞显示对靶阳性细胞的特异性细胞毒性活性(例如，IFN-γ释放)。阴性对照细胞中未检测到IFN-γ释放。
图42显示，EC50的测定系基于对递减浓度同源肽脉冲靶细胞的IFNγ反应。结果显示，透过工艺试产(PQ1)制造运行产生的T细胞表现的抗肿瘤活性(EC50＝0.3149)与所述测定中阳性对照产生的抗肿瘤活性(EC50＝0.7037)相当。
图43的代表图显示了T细胞产物#3在
Figure BDA0002619310400000552
杀灭测定中的细胞毒性可能性。资料表示为存在T细胞产物#3的情况下，在与递减浓度相关肽脉冲处理的靶阴性细胞系共培养的72小时期间的肿瘤生长倍数。结果显示，透过工艺试产(PQ1)制造运行产生的T细胞对靶细胞有肽剂量依赖性杀灭。
总之，较短的离体扩增和总体“周转时间”不仅可对细胞产物的品质产生重大影响，而且还可对细胞免疫疗法的临床适用性产生重大影响。在TCR工程化T细胞的GMP制造期间缩短扩增期的工艺开发工作已经完成，其开发了用于T细胞产物#3的为期5-6天的强大半封闭T细胞制造工艺。在GMP环境洁净室中T细胞产物#3制造的技术转移(TT)和工艺试产(PQ)运行证实了缩短扩增期制造工艺的可重复性和可行性。对于GMP制造的T细胞产物，确认了TCR工程化T细胞的所有放行、表型和功能测试。
实施例7
从癌症患者产生的T细胞产物的制造和功能
如上所述，从健康供体中产生的T细胞产物#3显示了T细胞记忆表型和细胞毒性可能性。如下所示，与健康供体产生的T细胞产物#3相比，在癌症患者产生的T细胞产物#3中观察到了相似的特征。
患者和供体特征
Figure BDA0002619310400000551
Figure BDA0002619310400000561
W＝白人；AI＝美洲印第安人；H＝西班牙裔
使用从癌症患者和健康供体中获得的PBMC以小规模制造T细胞产物#3。简言之，第0天，将从4名癌症患者和4名健康供体的白细胞分离术产物中分离的冷冻保存PBMC解冻并在存在IL-7的情况下静置约4-6小时，然后在NTC 24孔板中激活并孵育大约16-24小时。第1天，用表达重组TCR(例如，R11KEA TCR)的病毒载体以5μl/106个细胞转导细胞。未转导(NT)细胞作为对照。转导和未转导细胞以至少1.0x 106个细胞/ml(例如，2.0x 106个细胞/ml)接种。第2天，将转导和未转导细胞在含有IL-7和IL-15的TexMACS完全培养基中扩增。第6天(即，扩增4天)，收获扩增的细胞，然后进行流式细胞术分析和功能测定，以确定回收率、存活性、表型、整合DNA拷贝数和功能。
圖44顯示，在解凍後、靜置後和激活後，從癌症患者(Pt)和健康供體(HD)中獲得的T細胞回收率相當。
图45显示，第6天(即，扩增4天)，除PT1和PT4外(其中转导了所有细胞)，各患者转导和未转导细胞中T细胞产物#3的总存活细胞和存活性％均相当。
图46显示，第6天(即，扩增4天)，除PT1和PT4外(其中转导了所有细胞)，各患者转导和未转导细胞中T细胞产物#3的倍数扩增均相当。
表型分析
图47显示，在从癌症患者(PT1-PT4)和健康供体(D1-D4)中获得的PBMC中，CD3+CD8+细胞的扩增(如箭头所示)优先于CD3+CD4+细胞。
图48显示，在从患者(PT1-PT4)和健康供体(D1-D4)中获得的T细胞产物#3和未转导细胞(NT)中，CD3+CD8+细胞的总平均值与CD3+CD4+细胞相当。
图49显示了T细胞产物#3的流式细胞术分析的实例。结果提示，43.8％的T细胞产物#3含有CD3+CD8+细胞，其中64.7％的细胞表达R11KEA TCR(如肽/MHC dextramer(Dex)染色所示)，35.3％的细胞不表达R11KEA TCR。
图50显示，在从癌症患者(PT1-PT4)和健康供体(D1-D4)产生的CD8+T细胞产物#3中，R11KEA TCR表达相当。
图51也显示，R11KEA TCR平均表达量在从癌症患者(PT1-PT4)(如，64.3％)和健康供体(D1-D4)(如，68.2％)产生的CD8+T细胞产物#3中相当。
图52显示了确定T细胞产物#3的T细胞记忆(Tmemory)表型的门控方案。例如，透过门控CD45RA和CCR7，可识别幼稚“年轻”T细胞(CD45RA+CCR7+)、终末分化的“老”T细胞(TemRA)(CD45RA+CCR7-)、效应子记忆T细胞(Tem)(CD45RA-CCR7-)和中央记忆T细胞(Tcm)(CD45RA-CCR7+)。
图53显示，在从患者(PT1-PT4)和健康供体(D1-D4)产生的T细胞产物#3的理想幼稚和Tcm隔室都有显著的平均值增加。这些结果表明，转导的细胞可能拥有更强的输注后持久能力并在体内产生更持续的反应。
功能测定
为了确定T细胞产物#3的功能性，可用特异性结合R11KEA TCR的相关肽(例如，1μg/ml)或不与R11KEA TCR结合的不相关肽(例如，1μg/ml，作为对照)刺激细胞。用激活所有淋巴细胞的PMA和离子霉素刺激作为阳性对照，不刺激作为阴性对照。刺激2小时后，加入蛋白质转运抑制剂。刺激后6小时，透过细胞内染色(ICS)评估CD3+CD8+细胞中的细胞因子和信号分子(例如，CD107a、IFN-γ、TNF-α、IL-2)和巨噬细胞炎性蛋白-1-β(MIP-1β)的表达。
图54显示T细胞产物#3的实例，在用相关肽(d)刺激后，与用不相关肽(c)刺激相比，T细胞产物#3中CD107a、IFN-γ、TNF-α、IL-2和MIP-1β的表达水平增加。用激活所有淋巴细胞的PMA和离子霉素刺激作为阳性对照(b)，不刺激作为阴性对照(a)。
图55显示了T细胞产物#3的多功能性。数字0、1、2、3、4和5分别表示T细胞产物#3表达CD107a、IFN-γ、TNF-α、IL-2和MIP-1β中无、任何1者、任何2者、任何3者、任何4者以及全部5者的部分。例如，在用相关肽刺激后，从R11KEA TCR(R11)转导的健康供体(D3)中获得的T细胞产物#3超过50％表达来自CD107a、IFN-γ、TNF-α、IL-2和MIP-1β中的至少2种细胞因子，而相比之下，用不相关肽刺激后，0％的细胞表达至少2种细胞因子。相反，在用相关肽和不相关肽刺激之间，未转导(NT)细胞中细胞因子表达无显著差异。这些结果显示，由健康供体产生并用R11KEA TCR转导的T细胞产物#3具有多功能性。阳性对照(即，用PMA/离子霉素刺激的T细胞)在有或没有TCR转导的情况下均表现出多功能性。阴性对照(即，没有刺激的T细胞)在有或没有TCR转导的情况下功能性均较差。
图56显示，在用相关肽刺激后，健康供体(例如，D3和D2)和癌症患者(例如，PT1、PT2和PT3)产生的R11KEA TCR+(CD8+Vb8+)T细胞产物#3均具有多功能性。根据这些功能测定确定，D1、D4和PT4产生的T细胞可能不会出现多功能性。但是，如下所示，D1、D4和PT4产生的T细胞仍然具有针对靶细胞的细胞毒性活性。
图57显示了当癌症患者(例如，PT1-PT4)产生的T细胞产物#3与高靶细胞系(约有1,000个拷贝/细胞的相关肽提呈于细胞表面)接触时，这些细胞的IFN-γ释放呈现E:T比依赖性方式，例如，10:1>3.3:1>1:1。请注意，PT4产生的T细胞(在图56中似乎不具有多功能性)也显示了E:T比依赖性方式的IFN-γ释放。
图58显示了当健康供体(例如，D1-D4)产生的T细胞产物#3与高靶细胞系(约有1,000个拷贝/细胞的相关肽提呈于细胞表面)接触时，这些细胞的IFN-γ释放呈现E:T比依赖性方式，例如，10:1>3.3:1>1:1。请注意，D1和D4产生的T细胞(在图56中似乎不具有多功能性)也显示了E:T比依赖性方式的IFN-γ释放。
图59显示了当健康供体(D1-D4)产生的T细胞产物#3与细胞表面上提呈不同水平相关肽的细胞(例如，细胞表面上提呈约1,000拷贝/细胞的相关肽的高靶细胞系，细胞表面上提呈约50拷贝/细胞的相关肽的低靶细胞系，以及细胞表面上不提呈相关肽的无靶细胞系)接触时，这些细胞的平均IFN-γ释放呈现肽提呈水平依赖性方式，即，高靶>低靶>无靶。
类似地，图60显示了当癌症患者(PT1-PT4)产生的T细胞产物#3与高靶细胞系、低靶细胞系以及无靶细胞系接触时，这些细胞的平均IFN-γ释放呈现肽提呈水平依赖性方式，即，高靶>低靶>无靶。
图61显示，与细胞表面不提呈相关肽的靶阴性细胞系接触时，健康供体(例如，D3)产生的T细胞产物#3缺乏杀灭活性。简言之，用R11KEA TCR(R11)转导或不转导(NT)的D3产生的T细胞与靶阴性细胞系以10:1、3.3:1和1:1的E:T比进行共培养。透过使用IncuCyteKilling Assay测定细胞杀灭活性。这些结果显示，用(R11)和不用(NT)TCR转导的T细胞之间对靶阴性细胞系的细胞杀灭无显著差异。
相反，图62显示，与细胞表面提呈相关肽的靶阳性细胞系接触时，健康供体(例如，D3)产生的T细胞产物#3具有TCR特异性杀灭活性。也就是说，表达R11KEA TCR的T细胞以E:T比依赖性方式杀灭靶阳性细胞，例如，10:1>3.3:1>1:1。相反，在不转导(NT)的T细胞之间在不同E:T比下细胞杀灭无显著差异。
图63A-63C显示，与细胞表面提呈相关肽的靶阳性细胞系接触时，健康供体(例如，D3和D4)和癌症患者(例如，PT1和PT2)产生的用R11KEA TCR(R11)转导的T细胞产物#3的TCR特异性杀灭活性。D3、D4、PT1和PT2产生的表达R11KEA TCR(R11)的T细胞以E:T比依赖性方式杀灭靶阳性细胞，例如：10:1(图63A)>3.3:1(图63B)>1:1(图63C)。相反，在不同的E:T比下无R11KEA TCR转导(NT)的T细胞之间细胞杀灭无显著差异。
总之，这些结果显示，T细胞产物#3工艺可产生具有靶特异性的表达TCR转基因的T细胞产物。此工艺同时适用于从癌症患者以及从健康供体中获得的起始材料。T细胞产物#3工艺比制备T细胞产物#1和#2的时间短，但仍可产生含有大量幼稚和Tcm细胞的产物。T细胞产物#3可以是多功能的，并应对靶阳性肿瘤细胞系而分泌IFN-γ。T细胞产物#3还可在细胞系杀灭测定中表现出良好的效应子功能。
本公开的优势可包括自体T细胞制造工艺，其可将临床制造工程化TCR T细胞产物的静置时间缩短至例如4-6小时，将激活时间缩短至例如16-20小时，将转导时间缩短至例如24小时，将扩增期缩短至例如5-7天。影响各步骤的关键参数可***评估，并且可对其进行优化以产生超过100亿个具有高度识别和有效杀灭靶表达肿瘤细胞能力的年轻肿瘤反应性T细胞。除了提高T细胞产物的品质外，这些优化还可使制造成本降低30％。此外，本公开的自体T细胞制造工艺的规模扩大可使用激活T细胞的烧瓶结合和/或袋结合的抗CD3和抗CD28抗体进行，以产生相当水平的激活、转导性和扩增，并且这些规模扩大工艺可能比使用板结合抗体的工艺更快捷。
本专利说明书中引用的所有参考文献均透过引用并入本文，如同每篇参考文献被具体和单独地指出透过引用并入。任何参考文献的引用均为其在申请日之前的公开内容，不应解释为认可本公开内容无权凭借之前的发明而先于此类参考文献。
应当理解，上述每个元素或者两个或更多个元素一起也可以在与上述类型不同的其他类型方法中找到有用的应用。在无进一步分析的情况下，前述内容同样充分地揭示本公开的要点，其他人可以透过应用当前知识，容易地将其适用于各种应用场合而不会遗漏从现有技术观点来看公平构成所附权利要求中阐述的本公开的通用或具体方面基本特点的特征。前述实施方案仅作为示例呈现；本公开内容的范围仅透过以下权利要求进行限制。
序列名单
<110> 伊玛提克斯美国公司
<120> 制造 T 细胞的方法
<130> 3000011-006977
<150> US62/726,350
<151> 2018-09-03
<150> US62/647,571
<151> 2018-03-23
<150> US62/633,113
<151> 2018-02-21
<150> US62/628,521
<151> 2018-02-09
<150> DE10 2018 108 996.1
<151> 2018-04-16
<150> DE10 2018 102 971.3
<151> 2018-02-09
<150> DE10 2018 104 628.6
<151> 2018-02-28
<160> 157
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Tyr Leu Tyr Asp Ser Glu Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
His Leu Met Asp Gln Pro Leu Ser Val
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Gly Leu Leu Lys Lys Ile Asn Ser Val
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Phe Leu Val Asp Gly Ser Ser Ala Leu
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Phe Leu Phe Asp Gly Ser Ala Asn Leu Val
1 5 10
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Phe Leu Tyr Lys Ile Ile Asp Glu Leu
1 5
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Phe Ile Leu Asp Ser Ala Glu Thr Thr Thr Leu
1 5 10
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Ser Val Asp Val Ser Pro Pro Lys Val
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Val Ala Asp Lys Ile His Ser Val
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Ile Val Asp Asp Leu Thr Ile Asn Leu
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Gly Leu Leu Glu Glu Leu Val Thr Val
1 5
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Thr Leu Asp Gly Ala Ala Val Asn Gln Val
1 5 10
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Ser Val Leu Glu Lys Glu Ile Tyr Ser Ile
1 5 10
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Leu Leu Asp Pro Lys Thr Ile Phe Leu
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Tyr Thr Phe Ser Gly Asp Val Gln Leu
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Tyr Leu Met Asp Asp Phe Ser Ser Leu
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Lys Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu
1 5
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Leu Leu Trp Gly His Pro Arg Val Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Lys Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val
1 5 10
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Leu Leu Ile Pro Phe Thr Ile Phe Met
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Phe Leu Ile Glu Asn Leu Leu Ala Ala
1 5
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Leu Leu Trp Gly His Pro Arg Val Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Phe Leu Leu Glu Arg Glu Gln Leu Leu
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Ser Leu Ala Glu Thr Ile Phe Ile Val
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Thr Leu Leu Glu Gly Ile Ser Arg Ala
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Ile Leu Gln Asp Gly Gln Phe Leu Val
1 5
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Val Ile Phe Glu Gly Glu Pro Met Tyr Leu
1 5 10
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Ser Leu Phe Glu Ser Leu Glu Tyr Leu
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Ser Leu Leu Asn Gln Pro Lys Ala Val
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Gly Leu Ala Glu Phe Gln Glu Asn Val
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Lys Leu Leu Ala Val Ile His Glu Leu
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu
1 5
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Thr Leu Tyr Asn Pro Glu Arg Thr Ile Thr Val
1 5 10
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Lys Leu Gln Glu Lys Ile Gln Glu Leu
1 5
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Ser Val Leu Glu Lys Glu Ile Tyr Ser Ile
1 5 10
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Arg Val Ile Asp Asp Ser Leu Val Val Gly Val
1 5 10
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Val Leu Phe Gly Glu Leu Pro Ala Leu
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Gly Leu Val Asp Ile Met Val His Leu
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Phe Leu Asn Ala Ile Glu Thr Ala Leu
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Ala Leu Leu Gln Ala Leu Met Glu Leu
1 5
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Ala Leu Ser Ser Ser Gln Ala Glu Val
1 5
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Ser Leu Ile Thr Gly Gln Asp Leu Leu Ser Val
1 5 10
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Gln Leu Ile Glu Lys Asn Trp Leu Leu
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Leu Leu Asp Pro Lys Thr Ile Phe Leu
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Arg Leu His Asp Glu Asn Ile Leu Leu
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Tyr Thr Phe Ser Gly Asp Val Gln Leu
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
Gly Leu Pro Ser Ala Thr Thr Thr Val
1 5
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
Gly Leu Leu Pro Ser Ala Glu Ser Ile Lys Leu
1 5 10
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Lys Thr Ala Ser Ile Asn Gln Asn Val
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Tyr Leu Met Asp Asp Phe Ser Ser Leu
1 5
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Leu Met Tyr Pro Tyr Ile Tyr His Val
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Lys Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu
1 5
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Leu Leu Trp Gly His Pro Arg Val Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
Val Leu Asp Gly Lys Val Ala Val Val
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
Gly Leu Leu Gly Lys Val Thr Ser Val
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 57
Lys Met Ile Ser Ala Ile Pro Thr Leu
1 5
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
Gly Leu Leu Glu Thr Thr Gly Leu Leu Ala Thr
1 5 10
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 59
Thr Leu Asn Thr Leu Asp Ile Asn Leu
1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Val Ile Ile Lys Gly Leu Glu Glu Ile
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 61
Tyr Leu Glu Asp Gly Phe Ala Tyr Val
1 5
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
Lys Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val
1 5 10
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
Leu Leu Ile Pro Phe Thr Ile Phe Met
1 5
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Ile Ser Leu Asp Glu Val Ala Val Ser Leu
1 5 10
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val
1 5 10
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
Lys Leu Ile Gly Asn Ile His Gly Asn Glu Val
1 5 10
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 67
Ile Leu Leu Ser Val Leu His Gln Leu
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
Leu Asp Ser Glu Ala Leu Leu Thr Leu
1 5
<210> 69
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 69
Val Leu Gln Glu Asn Ser Ser Asp Tyr Gln Ser Asn Leu
1 5 10
<210> 70
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
His Leu Leu Gly Glu Gly Ala Phe Ala Gln Val
1 5 10
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 71
Ser Leu Val Glu Asn Ile His Val Leu
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 72
Tyr Thr Phe Ser Gly Asp Val Gln Leu
1 5
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 73
Ser Leu Ser Glu Lys Ser Pro Glu Val
1 5
<210> 74
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 74
Ala Met Phe Pro Asp Thr Ile Pro Arg Val
1 5 10
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 75
Phe Leu Ile Glu Asn Leu Leu Ala Ala
1 5
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
Phe Thr Ala Glu Phe Leu Glu Lys Val
1 5
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 77
Ala Leu Tyr Gly Asn Val Gln Gln Val
1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
Leu Phe Gln Ser Arg Ile Ala Gly Val
1 5
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
Ile Leu Ala Glu Glu Pro Ile Tyr Ile Arg Val
1 5 10
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
Phe Leu Leu Glu Arg Glu Gln Leu Leu
1 5
<210> 81
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 81
Leu Leu Leu Pro Leu Glu Leu Ser Leu Ala
1 5 10
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 82
Ser Leu Ala Glu Thr Ile Phe Ile Val
1 5
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 83
Ala Ile Leu Asn Val Asp Glu Lys Asn Gln Val
1 5 10
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 84
Arg Leu Phe Glu Glu Val Leu Gly Val
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 85
Tyr Leu Asp Glu Val Ala Phe Met Leu
1 5
<210> 86
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 86
Lys Leu Ile Asp Glu Asp Glu Pro Leu Phe Leu
1 5 10
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 87
Lys Leu Phe Glu Lys Ser Thr Gly Leu
1 5
<210> 88
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 88
Ser Leu Leu Glu Val Asn Glu Ala Ser Ser Val
1 5 10
<210> 89
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 89
Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val
1 5 10
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 90
Gly Leu Tyr Pro Val Thr Leu Val Gly Val
1 5 10
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 91
Ala Leu Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala
1 5
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 92
Thr Leu Leu Glu Gly Ile Ser Arg Ala
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 93
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Glu Glu Leu
1 5
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 94
Ala Leu Tyr Val Gln Ala Pro Thr Val
1 5
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 95
Lys Leu Ile Tyr Lys Asp Leu Val Ser Val
1 5 10
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 96
Ile Leu Gln Asp Gly Gln Phe Leu Val
1 5
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 97
Ser Leu Leu Asp Tyr Glu Val Ser Ile
1 5
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 98
Leu Leu Gly Asp Ser Ser Phe Phe Leu
1 5
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 99
Val Ile Phe Glu Gly Glu Pro Met Tyr Leu
1 5 10
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 100
Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Pro Tyr Leu
1 5
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 101
Phe Leu Phe Val Asp Pro Glu Leu Val
1 5
<210> 102
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 102
Ser Glu Trp Gly Ser Pro His Ala Ala Val Pro
1 5 10
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 103
Ala Leu Ser Glu Leu Glu Arg Val Leu
1 5
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 104
Ser Leu Phe Glu Ser Leu Glu Tyr Leu
1 5
<210> 105
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 105
Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val
1 5
<210> 106
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 106
Val Leu Leu Asn Glu Ile Leu Glu Gln Val
1 5 10
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 107
Ser Leu Leu Asn Gln Pro Lys Ala Val
1 5
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 108
Lys Met Ser Glu Leu Gln Thr Tyr Val
1 5
<210> 109
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 109
Ala Leu Leu Glu Gln Thr Gly Asp Met Ser Leu
1 5 10
<210> 110
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 110
Val Ile Ile Lys Gly Leu Glu Glu Ile Thr Val
1 5 10
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 111
Lys Gln Phe Glu Gly Thr Val Glu Ile
1 5
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 112
Lys Leu Gln Glu Glu Ile Pro Val Leu
1 5
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 113
Gly Leu Ala Glu Phe Gln Glu Asn Val
1 5
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 114
Asn Val Ala Glu Ile Val Ile His Ile
1 5
<210> 115
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 115
Ala Leu Ala Gly Ile Val Thr Asn Val
1 5
<210> 116
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 116
Asn Leu Leu Ile Asp Asp Lys Gly Thr Ile Lys Leu
1 5 10
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 117
Val Leu Met Gln Asp Ser Arg Leu Tyr Leu
1 5 10
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 118
Lys Val Leu Glu His Val Val Arg Val
1 5
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 119
Leu Leu Trp Gly Asn Leu Pro Glu Ile
1 5
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 120
Ser Leu Met Glu Lys Asn Gln Ser Leu
1 5
<210> 121
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 121
Lys Leu Leu Ala Val Ile His Glu Leu
1 5
<210> 122
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 122
Ala Leu Gly Asp Lys Phe Leu Leu Arg Val
1 5 10
<210> 123
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 123
Phe Leu Met Lys Asn Ser Asp Leu Tyr Gly Ala
1 5 10
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 124
Lys Leu Ile Asp His Gln Gly Leu Tyr Leu
1 5 10
<210> 125
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 125
Gly Pro Gly Ile Phe Pro Pro Pro Pro Pro Gln Pro
1 5 10
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 126
Ala Leu Asn Glu Ser Leu Val Glu Cys
1 5
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 127
Gly Leu Ala Ala Leu Ala Val His Leu
1 5
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 128
Leu Leu Leu Glu Ala Val Trp His Leu
1 5
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 129
Ser Ile Ile Glu Tyr Leu Pro Thr Leu
1 5
<210> 130
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 130
Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu
1 5
<210> 131
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 131
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
1 5
<210> 132
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 132
Phe Leu Leu Asp Lys Pro Gln Asp Leu Ser Ile
1 5 10
<210> 133
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 133
Tyr Leu Leu Asp Met Pro Leu Trp Tyr Leu
1 5 10
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 134
Gly Leu Leu Asp Cys Pro Ile Phe Leu
1 5
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 135
Val Leu Ile Glu Tyr Asn Phe Ser Ile
1 5
<210> 136
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 136
Thr Leu Tyr Asn Pro Glu Arg Thr Ile Thr Val
1 5 10
<210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 137
Ala Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser Val
1 5
<210> 138
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 138
Lys Leu Gln Glu Glu Leu Asn Lys Val
1 5
<210> 139
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 139
Lys Leu Met Asp Pro Gly Ser Leu Pro Pro Leu
1 5 10
<210> 140
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 140
Ala Leu Ile Val Ser Leu Pro Tyr Leu
1 5
<210> 141
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 141
Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ala Asn Val
1 5
<210> 142
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 142
Ala Leu Asp Pro Ser Gly Asn Gln Leu Ile
1 5 10
<210> 143
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 143
Ile Leu Ile Lys His Leu Val Lys Val
1 5
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 144
Val Leu Leu Asp Thr Ile Leu Gln Leu
1 5
<210> 145
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 145
His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala
1 5
<210> 146
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 146
Ser Met Asn Gly Gly Val Phe Ala Val
1 5
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 147
Met Leu Ala Glu Lys Leu Leu Gln Ala
1 5
<210> 148
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 148
Tyr Met Leu Asp Ile Phe His Glu Val
1 5
<210> 149
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 149
Ala Leu Trp Leu Pro Thr Asp Ser Ala Thr Val
1 5 10
<210> 150
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 150
Gly Leu Ala Ser Arg Ile Leu Asp Ala
1 5
<210> 151
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 151
Ser Tyr Val Lys Val Leu His His Leu
1 5
<210> 152
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 152
Val Tyr Leu Pro Lys Ile Pro Ser Trp
1 5
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 153
Asn Tyr Glu Asp His Phe Pro Leu Leu
1 5
<210> 154
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 154
Val Tyr Ile Ala Glu Leu Glu Lys Ile
1 5
<210> 155
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 155
Val His Phe Glu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Leu Phe
1 5 10
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 156
Val Leu Ser Pro Phe Ile Leu Thr Leu
1 5
<210> 157
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 157
His Leu Leu Glu Gly Ser Val Gly Val
1 5

Claims (88)

1.权利要求内容为：
一种转导T细胞的方法，其包括
解冻冷冻的外周血单核细胞(PBMC)，
静置解冻的PBMC，
用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活静置PBMC中的T细胞，
用病毒载体转导激活的T细胞，
扩增转导的T细胞，以及
获得扩增的T细胞。
2.权利要求1中所述的方法，其中，激活步骤包括用固相支持物上的抗CD3抗体和抗CD28抗体固定静置PBMC中的T细胞。
3.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中，静置步骤在约0.5小时至约48小时、约0.5小时至约36小时、约0.5小时至约24小时、约0.5小时至约18小时、约0.5小时至约12小时、约0.5小时至约6小时、约1小时至约6小时、约2小时至约5小时、约3小时至约5小时、或约1小时至约24小时、约2至约24小时、约12至约48小时、约0.5小时至约120小时、约0.5小时至约108小时、约0.5小时至约96小时、约0.5小时至约84小时、约0.5小时至约72小时或约0.5小时至约60小时的时间段内进行。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，抗CD3抗体和抗CD28抗体各自的浓度不超过约0.1μg/ml、不超过约0.2μg/ml、不超过约0.3μg/ml、不超过约0.4μg/ml、不超过约0.5μg/ml、不超过约0.6μg/ml、不超过约0.7μg/ml、不超过约0.8μg/ml、不超过约0.9μg/ml、不超过约1.0μg/ml、不超过约2.0μg/ml、不超过约4.0μg/ml、不超过约6.0μg/ml、不超过约8.0μg/ml或不超过约10.0μg/ml。
5.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，抗CD3抗体和抗CD28抗体各自的浓度为约0.1μg/ml至约10.0μg/ml、约0.1μg/ml至约8.0μg/ml、约0.1μg/ml至约6.0μg/ml、约0.1μg/ml至约4.0μg/ml、约0.1μg/ml至约2.0μg/ml、约0.1μg/ml至约1.0μg/ml、约0.1μg/ml至约0.8μg/ml、约0.1μg/ml至约0.6μg/ml、约0.1μg/ml至约0.5μg/ml、约0.1μg/ml至约0.25μg/ml、约0.2μg/ml至约0.5μg/ml、约0.2μg/ml至约0.3μg/ml、约0.3μg/ml至约0.5μg/ml、约0.3μg/ml至约0.4μg/ml或约0.4μg/ml至约0.5μg/ml。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，激活在不超过约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时、约24小时、约26小时、约28小时、约30小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时、约84小时、约96小时、约108小时或约120小时的时间段内进行。
7.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，激活在约1小时至约120小时、约1小时至约108小时、约1小时至约96小时、约1小时至约84小时、约1小时至约72小时、约1小时至约60小时、约1小时至约48小时、约1小时至约36小时、约1小时至约24小时、约2小时至约24小时、约4小时至约24小时、约6小时至约24小时、约8小时至约24小时、约10小时至约24小时、约12小时至约24小时、约12小时至约72小时、约24小时至约72小时、约6小时至约48小时、约24小时至约48小时、约6小时至约72小时或约1小时至约12小时的时间段内进行。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述固相为珠、板、烧瓶或袋的表面。
9.权利要求8所述的方法，其中，所述板为6孔、12孔或24孔板。
10.权利要求8所述的方法，其中，所述***接种表面积为约25cm2至约75cm2、约25cm2至约100cm2、约25cm2至约150cm2或约50cm2至约1720cm2。
11.权利要求8所述的方法，其中，所述袋的容积为约5ml至约100升、约100ml至约100升、约150ml至约100升、约200ml至约100升、约250ml至约100升、约500ml至约100升、约1升至约100升、约1升至约75升、约1升至约50升、约1升至约25升、约1升至约20升、约1升至约15升、约1升至约10升、约1升至约5升、约1升至约2.5升或约1升至约2升。
12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述静置在存在至少一种细胞因子的情况下进行。
13.权利要求12所述的方法，其中，所述至少一种细胞因子包括白细胞介素7(IL-7)和/或白细胞介素15(IL-15)。
14.权利要求13所述的方法，其中IL-7的浓度为不超过约1ng/ml、不超过约2ng/ml、不超过约3ng/ml、不超过约4ng/ml、不超过约5ng/ml、不超过约6ng/ml、不超过约7ng/ml、不超过约8ng/ml、不超过约9ng/ml、不超过约10ng/ml、不超过约11ng/ml、不超过约12ng/ml、不超过约13ng/ml、不超过约14ng/ml、不超过约15ng/ml、不超过约16ng/ml、不超过约17ng/ml、不超过约18ng/ml、不超过约19ng/ml、不超过约20ng/ml、不超过约25ng/ml、不超过约30ng/ml、不超过约35ng/ml、不超过约40ng/ml、不超过约45ng/ml、不超过约50ng/ml、不超过约60ng/ml、不超过约70ng/ml、不超过约80ng/ml、不超过约90ng/ml或不超过约100ng/ml。
15.权利要求13所述的方法，其中IL-7的浓度为约1ng/ml至90ng/ml、约1ng/ml至80ng/ml、约1ng/ml至70ng/ml、约1ng/ml至60ng/ml、约1ng/ml至50ng/ml、约1ng/ml至40ng/ml、约1ng/ml至30ng/ml、约1ng/ml至20ng/ml、约1ng/ml至15ng/ml、约1ng/ml至10ng/ml、约2ng/ml至10ng/ml、约4ng/ml至10ng/ml、约6ng/ml至10ng/ml或约5ng/ml至10ng/ml。
16.权利要求13至15中任一项所述的方法，其中IL-15的浓度为不超过约5ng/ml、不超过约10ng/ml、不超过约15ng/ml、不超过约20ng/ml、不超过约25ng/ml、不超过约30ng/ml、不超过约35ng/ml、不超过约40ng/ml、不超过约45ng/ml、不超过约50ng/ml、不超过约60ng/ml、不超过约70ng/ml、不超过约80ng/ml、不超过约90ng/ml、不超过约100ng/ml、不超过约110ng/ml、不超过约120ng/ml、不超过约130ng/ml、不超过约140ng/ml、不超过约150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、350ng/ml、400ng/ml、450ng/ml或500ng/ml。
17.权利要求13至15中任一项所述的方法，其中IL-15的浓度为约5ng/ml至500ng/ml、约5ng/ml至400ng/ml、约5ng/ml至300ng/ml、约5ng/ml至200ng/ml、约5ng/ml至150ng/ml、约5ng/ml至100ng/ml、约10ng/ml至100ng/ml、约20ng/ml至100ng/ml、约30ng/ml至100ng/ml、约40ng/ml至100ng/ml、约50ng/ml至100ng/ml、约60ng/ml至100ng/ml、约70ng/ml至100ng/ml、约80ng/ml至100ng/ml、约90ng/ml至100ng/ml、约10ng/ml至50ng/ml、约20ng/ml至50ng/ml、约30ng/ml至50ng/ml或约40ng/ml至50ng/ml。
18.权利要求1至16中任一项所述的方法，其中转导在不超过约1小时、不超过约2小时、不超过约3小时、不超过约4小时、不超过约5小时、不超过约6小时、不超过约7小时、不超过约8小时、不超过约9小时、不超过约10小时、不超过约11小时、不超过约12小时、不超过约14小时、不超过约16小时、不超过约18小时、不超过约20小时、不超过约22小时、不超过约24小时、不超过约26小时、不超过约28小时、不超过约30小时、不超过约36小时、不超过约42小时、不超过约48小时、不超过约54小时、不超过约60小时、不超过约66小时、不超过约72小时、不超过约84小时、不超过约96小时、不超过约108小时或不超过约120小时的时间段内进行。
19.权利要求1至16中任一项所述的方法，其中转导在约1小时至120小时、约1小时至108小时、约1小时至96小时、约1小时至72小时、约1小时至48小时、约1小时至36小时、约1小时至24小时、约2小时至24小时、约4小时至24小时、约6小时至24小时、约8小时至24小时、约10小时至24小时、约12小时至24小时、约14小时至24小时、约16小时至24小时、约18小时至24小时、约20小时至24小时或约22小时至24小时的时间段内进行。
20.权利要求1至19中任一项所述的方法，其中病毒载体是表达T细胞受体(TCR)的逆转录病毒载体。
21.权利要求1至20中任一项所述的方法，其中病毒载体是表达TCR的慢病毒载体。
22.权利要求1至21中任一项所述的方法，其中，所述转导在存在至少一种细胞因子的情况下进行。
23.权利要求22所述的方法，其中，所述至少一种细胞因子包括白细胞介素7(IL-7)和/或白细胞介素15(IL-15)。
24.权利要求23所述的方法，其中IL-7的浓度为不超过约1ng/ml、不超过约2ng/ml、不超过约3ng/ml、不超过约4ng/ml、不超过约5ng/ml、不超过约6ng/ml、不超过约7ng/ml、不超过约8ng/ml、不超过约9ng/ml、不超过约10ng/ml、不超过约11ng/ml、不超过约12ng/ml、不超过约13ng/ml、不超过约14ng/ml、不超过约15ng/ml、不超过约16ng/ml、不超过约17ng/ml、不超过约18ng/ml、不超过约19ng/ml、不超过约20ng/ml、不超过约25ng/ml、不超过约30ng/ml、不超过约35ng/ml、不超过约40ng/ml、不超过约45ng/ml、不超过约50ng/ml、不超过约60ng/ml、不超过约70ng/ml、不超过约80ng/ml、不超过约90ng/ml或不超过约100ng/ml。
25.权利要求23所述的方法，其中IL-7的浓度为约1ng/ml至100ng/ml、约1ng/ml至90ng/ml、约1ng/ml至80ng/ml、约1ng/ml至70ng/ml、约1ng/ml至60ng/ml、约1ng/ml至50ng/ml、约1ng/ml至40ng/ml、约1ng/ml至30ng/ml、约1ng/ml至20ng/ml、约1ng/ml至15ng/ml、约1ng/ml至10ng/ml、约2ng/ml至10ng/ml、约4ng/ml至10ng/ml、约6ng/ml至10ng/ml、约8ng/ml至10ng/ml或约9ng/ml至10ng/ml。
26.权利要求23至25中任一项所述的方法，其中IL-15的浓度为不超过约5ng/ml、不超过约10ng/ml、不超过约15ng/ml、不超过约20ng/ml、不超过约25ng/ml、不超过约30ng/ml、不超过约35ng/ml、不超过约40ng/ml、不超过约45ng/ml、不超过约50ng/ml、不超过约60ng/ml、不超过约70ng/ml、不超过约80ng/ml、不超过约90ng/ml、不超过约100ng/ml、不超过约110ng/ml、不超过约120ng/ml、不超过约130ng/ml、不超过约140ng/ml、不超过约150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、350ng/ml、400ng/ml、450ng/ml或500ng/ml。
27.权利要求23至25中任一项所述的方法，其中IL-15的浓度为约5ng/ml至500ng/ml、约5ng/ml至400ng/ml、约5ng/ml至300ng/ml、约5ng/ml至200ng/ml、约5ng/ml至150ng/ml、约5ng/ml至100ng/ml、约10ng/ml至100ng/ml、约20ng/ml至100ng/ml、约30ng/ml至100ng/ml、约40ng/ml至100ng/ml、约50ng/ml至100ng/ml、约60ng/ml至100ng/ml、约70ng/ml至100ng/ml、约80ng/ml至100ng/ml、约90ng/ml至100ng/ml、约10ng/ml至50ng/ml、约20ng/ml至50ng/ml、约30ng/ml至50ng/ml或约40ng/ml至50ng/ml。
28.权利要求1至27中任一项所述的方法，其中，所述扩增在存在至少一种细胞因子的情况下进行。
29.权利要求28所述的方法，其中，所述至少一种细胞因子包括白细胞介素7(IL-7)和/或白细胞介素15(IL-15)。
30.权利要求29所述的方法，其中IL-7的浓度为不超过约1ng/ml、不超过约2ng/ml、不超过约3ng/ml、不超过约4ng/ml、不超过约5ng/ml、不超过约6ng/ml、不超过约7ng/ml、不超过约8ng/ml、不超过约9ng/ml、不超过约10ng/ml、不超过约11ng/ml、不超过约12ng/ml、不超过约13ng/ml、不超过约14ng/ml、不超过约15ng/ml、不超过约16ng/ml、不超过约17ng/ml、不超过约18ng/ml、不超过约19ng/ml、不超过约20ng/ml、不超过约25ng/ml、不超过约30ng/ml、不超过约35ng/ml、不超过约40ng/ml、不超过约45ng/ml、不超过约50ng/ml、不超过约60ng/ml、不超过约70ng/ml、不超过约80ng/ml、不超过约90ng/ml或不超过约100ng/ml。
31.权利要求29所述的方法，其中IL-7的浓度为约1ng/ml至100ng/ml、约1ng/ml至90ng/ml、约1ng/ml至80ng/ml、约1ng/ml至70ng/ml、约1ng/ml至60ng/ml、约1ng/ml至50ng/ml、约1ng/ml至40ng/ml、约1ng/ml至30ng/ml、约1ng/ml至20ng/ml、约1ng/ml至15ng/ml或约1ng/ml至10ng/ml。
32.权利要求29至31中任一项所述的方法，其中IL-15的浓度为不超过约5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、120ng/ml、130ng/ml、140ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、350ng/ml、400ng/ml、450ng/ml或500ng/ml。
33.权利要求29至31中任一项所述的方法，其中IL-15的浓度为约5ng/ml至500ng/ml、约5ng/ml至400ng/ml、约5ng/ml至300ng/ml、约5ng/ml至200ng/ml、约5ng/ml至150ng/ml、约5ng/ml至100ng/ml、约10ng/ml至100ng/ml、约20ng/ml至100ng/ml、约30ng/ml至100ng/ml、约40ng/ml至100ng/ml、约50ng/ml至100ng/ml、约60ng/ml至100ng/ml、约70ng/ml至100ng/ml、约80ng/ml至100ng/ml、约90ng/ml至100ng/ml、约10ng/ml至50ng/ml、约20ng/ml至50ng/ml、约30ng/ml至50ng/ml或约40ng/ml至50ng/ml。
34.权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述扩增在不超过约1天、不超过约2天、不超过约3天、不超过约4天、不超过约5天、不超过约6天、不超过约7天、不超过约8天、不超过约9天、不超过约10天、不超过约15天、不超过约20天、不超过约25天或不超过约30天的时间段内进行。
35.权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述扩增在约1天至约30天、约1天至约25天、约1天至约20天、约1天至约15天、约1天至约10天、约2天至约10天、约3天至约10天、约4天至约10天、约5天至约10天、约6天至约10天、约7天至约10天、约8天至约10天或约9天至约10天的时间段内进行。
36.权利要求1至35中任一项所述的方法，其中，所述获得的T细胞数量为至少约1x109、可能至少约2x109、可能至少约3x109、可能至少约4x109、可能至少约5x109、可能至少约6x109、可能至少约7x109、可能至少约8x109、可能至少约9x109、可能至少约1x1010、可能至少约5x1010、可能至少约1x1011、可能至少约5x1011、可能至少约1x1012、可能至少约5x1012或可能至少约1x1013个细胞。
37.权利要求1至35中任一项所述的方法，其中，所述获得的T细胞数量为约1x109至约1x1013、约1x109至约5x1012、约1x109至约1x1012、约1x109至约5x1011、约1x109至约1x1011、约1x109至约5x1010、约1x109至约1x1010、约2x109至约1x1010、约3x109至约1x1010、约4x109至约1x1010、约5x109至约1x1010、约6x109至约1x1010、约7x109至约1x1010、约8x109至约1x1010或约9x109至约1x1010个细胞。
38.权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述获得的T细胞为CD3+CD8+T细胞。
39.一种治疗癌症患者的方法，包括向该患者给予有效量的按照权利要求1至38中任一项所述方法产生获得的T细胞。
40.权利要求39所述的方法，其中PBMC获得自患者。
41.一种基因转导T细胞，其透过权利要求1至38中任一项所述的方法产生。
42.一种药物组合物，其包含权利要求41所述的基因转导T细胞和一种药用载剂。
43.一种制备T细胞群的方法，其包括
解冻冷冻的外周血单核细胞(PBMC)，
静置解冻的PBMC，
用固定于固相上的抗CD3抗体和抗CD28抗体激活静置PBMC中的T细胞，扩增激活的T细胞，以及
获得包含扩增T细胞的T细胞群。
44.权利要求43所述的方法，其中，静置在不超过约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时、约24小时、约26小时、约28小时、约30小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时、约84小时、约96小时、约108小时或约120小时的时间段内进行。
45.权利要求43所述的方法，其中，静置在约1小时至约120小时、约1小时至约108小时、约1小时至约96小时、约1小时至约84小时、约1小时至约72小时、约1小时至约60小时、约1小时至约48小时、约1小时至约36小时、约1小时至约24小时、约2小时至约24小时、约4小时至约24小时、约6小时至约24小时、约8小时至约24小时、约10小时至约24小时、约12小时至约24小时、约12小时至约72小时、约24小时至约72小时、约6小时至约48小时、约24小时至约48小时、约6小时至约72小时或约1小时至约12小时的时间段内进行。
46.权利要求43至45中任一项所述的方法，其中，抗CD3抗体和抗CD28抗体各自的浓度不超过约0.1μg/ml、不超过约0.2μg/ml、不超过约0.3μg/ml、不超过约0.4μg/ml、不超过约0.5μg/ml、不超过约0.6μg/ml、不超过约0.7μg/ml、不超过约0.8μg/ml、不超过约0.9μg/ml、不超过约1.0μg/ml、不超过约2.0μg/ml、不超过约4.0μg/ml、不超过约6.0μg/ml、不超过约8.0μg/ml或不超过约10.0μg/ml。
47.权利要求43至45中任一项所述的方法，其中，抗CD3抗体和抗CD28抗体各自的浓度为约0.1μg/ml至约10.0μg/ml、约0.1μg/ml至约8.0μg/ml、约0.1μg/ml至约6.0μg/ml、约0.1μg/ml至约4.0μg/ml、约0.1μg/ml至约2.0μg/ml、约0.1μg/ml至约1.0μg/ml、约0.1μg/ml至约0.8μg/ml、约0.1μg/ml至约0.6μg/ml、约0.1μg/ml至约0.5μg/ml、约0.1μg/ml至约0.25μg/ml或约0.2μg/ml至约0.5μg/ml。
48.权利要求43至47中任一项所述的方法，其中激活在不超过约1小时、不超过约2小时、不超过约3小时、不超过约4小时、不超过约5小时、不超过约6小时、不超过约7小时、不超过约8小时、不超过约9小时、不超过约10小时、不超过约11小时、不超过约12小时、不超过约14小时、不超过约16小时、不超过约18小时、不超过约20小时、不超过约22小时、不超过约24小时、不超过约26小时、不超过约28小时、不超过约30小时、不超过约36小时、不超过约42小时、不超过约48小时、不超过约54小时、不超过约60小时、不超过约66小时、不超过约72小时、不超过约84小时、不超过约96小时、不超过约108小时或不超过约120小时的时间段内进行。
49.权利要求43至47中任一项所述的方法，其中，激活在约1小时至约120小时、约1小时至约108小时、约1小时至约96小时、约1小时至约84小时、约1小时至约72小时、约1小时至约60小时、约1小时至约48小时、约1小时至约36小时、约1小时至约24小时、约2小时至约24小时、约4小时至约24小时、约6小时至约24小时、约8小时至约24小时、约10小时至约24小时、约12小时至约24小时、约14小时至约24小时、约16小时至约24小时、约18小时至约24小时、约20小时至约24小时、约22小时至约24小时或约23小时至约24小时的时间段内进行。
50.权利要求43至49中任一项所述的方法，其中，所述固相为珠、板、烧瓶或袋的表面。
51.权利要求50所述的方法，其中，所述板为6孔、12孔或24孔板。
52.权利要求50所述的方法，其中，所述***接种表面积为约25cm2至约75cm2、约25cm2至约100cm2、约25cm2至约150cm2或约50cm2至约1720cm2。
53.权利要求50所述的方法，其中，所述袋的容积为约50ml至约100升、约100ml至约100升、约150ml至约100升、约200ml至约100升、约250ml至约100升、约500ml至约100升、约1升至约100升、约1升至约75升、约1升至约50升、约1升至约25升、约1升至约20升、约1升至约15升、约1升至约10升、约1升至约5升、约1升至约2.5升或约1升至约2升。
54.权利要求43至53中任一项所述的方法，其中，所述激活在存在至少一种细胞因子的情况下进行。
55.权利要求54所述的方法，其中，所述至少一种细胞因子包括白细胞介素7(IL-7)和/或白细胞介素15(IL-15)。
56.权利要求55所述的方法，其中IL-7的浓度为不超过约1ng/ml、不超过约2ng/ml、不超过约3ng/ml、不超过约4ng/ml、不超过约5ng/ml、不超过约6ng/ml、不超过约7ng/ml、不超过约8ng/ml、不超过约9ng/ml、不超过约10ng/ml、不超过约11ng/ml、不超过约12ng/ml、不超过约13ng/ml、不超过约14ng/ml、不超过约15ng/ml、不超过约16ng/ml、不超过约17ng/ml、不超过约18ng/ml、不超过约19ng/ml、不超过约20ng/ml、不超过约25ng/ml、不超过约30ng/ml、不超过约35ng/ml、不超过约40ng/ml、不超过约45ng/ml、不超过约50ng/ml、不超过约60ng/ml、不超过约70ng/ml、不超过约80ng/ml、不超过约90ng/ml或不超过约100ng/ml。
57.权利要求55所述的方法，其中IL-7的浓度为约1ng/ml至100ng/ml、约1ng/ml至90ng/ml、约1ng/ml至80ng/ml、约1ng/ml至70ng/ml、约1ng/ml至60ng/ml、约1ng/ml至50ng/ml、约1ng/ml至40ng/ml、约1ng/ml至30ng/ml、约1ng/ml至20ng/ml、约1ng/ml至15ng/ml、约1ng/ml至10ng/ml、约2ng/ml至10ng/ml、约4ng/ml至10ng/ml、约6ng/ml至10ng/ml或约5ng/ml至10ng/ml。
58.权利要求55至57中任一项所述的方法，其中IL-15的浓度为不超过约5ng/ml、不超过约10ng/ml、不超过约15ng/ml、不超过约20ng/ml、不超过约25ng/ml、不超过约30ng/ml、不超过约35ng/ml、不超过约40ng/ml、不超过约45ng/ml、不超过约50ng/ml、不超过约60ng/ml、不超过约70ng/ml、不超过约80ng/ml、不超过约90ng/ml、不超过约100ng/ml、不超过约110ng/ml、不超过约120ng/ml、不超过约130ng/ml、不超过约140ng/ml或不超过约500ng/ml。
59.权利要求55至57中任一项所述的方法，其中IL-15的浓度为约5ng/ml至500ng/ml、约5ng/ml至400ng/ml、约5ng/ml至300ng/ml、约5ng/ml至200ng/ml、约5ng/ml至150ng/ml、约5ng/ml至100ng/ml、约10ng/ml至100ng/ml、约20ng/ml至100ng/ml、约30ng/ml至100ng/ml、约40ng/ml至100ng/ml、约50ng/ml至100ng/ml、约60ng/ml至100ng/ml、约70ng/ml至100ng/ml、约80ng/ml至100ng/ml、约90ng/ml至100ng/ml、约1ng/ml至50ng/ml、约5ng/ml至50ng/ml、约10ng/ml至50ng/ml或约20ng/ml至50ng/ml。
60.权利要求43至59中任一项所述的方法，还包括用病毒载体转导激活的T细胞。
61.权利要求62所述的方法，其中病毒载体是表达T细胞受体(TCR)的逆转录病毒载体。
62.权利要求60或61所述的方法，其中病毒载体是表达TCR的慢病毒载体。
63.权利要求60至62中任一项所述的方法，其中，所述转导在存在至少一种细胞因子的情况下进行。
64.权利要求63所述的方法，其中，所述至少一种细胞因子包括白细胞介素7(IL-7)和/或白细胞介素15(IL-15)。
65.权利要求64所述的方法，其中IL-7的浓度为不超过约1ng/ml、不超过约2ng/ml、不超过约3ng/ml、不超过约4ng/ml、不超过约5ng/ml、不超过约6ng/ml、不超过约7ng/ml、不超过约8ng/ml、不超过约9ng/ml、不超过约10ng/ml、不超过约11ng/ml、不超过约12ng/ml、不超过约13ng/ml、不超过约14ng/ml、不超过约15ng/ml、不超过约16ng/ml、不超过约17ng/ml、不超过约18ng/ml、不超过约19ng/ml、不超过约20ng/ml、不超过约25ng/ml、不超过约30ng/ml、不超过约35ng/ml、不超过约40ng/ml、不超过约45ng/ml、不超过约50ng/ml、不超过约60ng/ml、不超过约70ng/ml、不超过约80ng/ml、不超过约90ng/ml或不超过约100ng/ml。
66.权利要求64所述的方法，其中IL-7的浓度为约1ng/ml至100ng/ml、约1ng/ml至90ng/ml、约1ng/ml至80ng/ml、约1ng/ml至70ng/ml、约1ng/ml至60ng/ml、约1ng/ml至50ng/ml、约1ng/ml至40ng/ml、约1ng/ml至30ng/ml、约1ng/ml至20ng/ml、约1ng/ml至15ng/ml或约1ng/ml至10ng/ml。
67.权利要求64至66中任一项所述的方法，其中IL-15的浓度为不超过约5ng/ml、不超过约10ng/ml、不超过约15ng/ml、不超过约20ng/ml、不超过约25ng/ml、不超过约30ng/ml、不超过约35ng/ml、不超过约40ng/ml、不超过约45ng/ml、不超过约50ng/ml、不超过约60ng/ml、不超过约70ng/ml、不超过约80ng/ml、不超过约90ng/ml、不超过约100ng/ml、不超过约110ng/ml、不超过约120ng/ml、不超过约130ng/ml、不超过约140ng/ml、不超过约150ng/ml、不超过约200ng/ml、不超过约250ng/ml、不超过约300ng/ml、不超过约350ng/ml、不超过约400ng/ml、不超过约450ng/ml或不超过约500ng/ml。
68.权利要求64至66中任一项所述的方法，其中IL-15的浓度为约5ng/ml至500ng/ml、约5ng/ml至400ng/ml、约5ng/ml至300ng/ml、约5ng/ml至200ng/ml、约5ng/ml至150ng/ml、约5ng/ml至100ng/ml、约10ng/ml至100ng/ml、约20ng/ml至100ng/ml、约30ng/ml至100ng/ml、约40ng/ml至100ng/ml或约50ng/ml至100ng/ml。
69.一种T细胞群，其透过权利要求43至68中任一项所述的方法制备。
70.权利要求1至38和43至68中任一项所述的方法，其中，所述扩增在存在至少一种选自IL-2、IL-7、IL-12、IL-15和IL-21组成的组的细胞因子的情况下进行。
71.权利要求70所述的方法，其中，所述至少一种细胞因子包括IL-2。
72.权利要求70所述的方法，其中，所述至少一种细胞因子包括IL-7和IL-15。
73.一种制备T细胞群的方法，其包括
解冻外周血单核细胞(PBMC)，
静置解冻的PBMC约4至约6小时，
用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活静置PBMC中的T细胞，
用病毒载体转导激活的T细胞，
扩增转导的T细胞，以及
获得扩增的T细胞。
74.权利要求73所述的方法，其中，所述获得的T细胞从约2倍至5倍、约5倍至约10倍、约5倍至约15倍、约5倍至约20倍、约5倍至约25倍、约25倍至约50倍、约50倍至约60倍、约60倍至约100倍、约65倍至约90倍、约70倍至约85倍和约67倍至约88倍组成的组中扩增。
75.权利要求73所述的方法，其中，静置时间约4至约6小时所获得的T细胞扩增倍数，是相同条件下静置时间约16至约20小时所制备获得的T细胞扩增倍数的至少约1.5倍。
76.权利要求73所述的方法，其中获得的T细胞数量是选自约2x109至约5x109、约5x109至约10x109、约10x109至约15x109、约5x109至约35x109、约5x109至约30x109、约10x109至约30x109、约15x109至约20x109、约20x109至约35x109、约24x109至约33x109以及约24.8x109至约32.2x109组成的组。
77.权利要求73所述的方法，其中，静置时间约4小时至约6小时所获得的T细胞数量，是相同条件下静置时间约16小时至约20小时所制备获得的T细胞数量的约1.5至2.0倍。
78.权利要求1至38、43至68和70至77中任一项所述的方法，其中，所述解冻、静置、激活、转导、扩增和获得在封闭***中进行。
79.权利要求78所述的方法，其中，封闭***为CliniMACSProdigyTM、WAVE(XURITM)生物反应器、WAVE(XURITM)生物反应器与BioSafeSepaxTMII组合、G-Rex/GatheRexTM封闭***或G-Rex/GatheRexTM封闭***与BioSafeSepaxTMII组合。
80.一种制备T细胞群的方法，其包括
获得新鲜的外周血单核细胞(PBMC)，
用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活新鲜PBMC中的T细胞，
用病毒载体转导激活的T细胞，
扩增转导的T细胞，以及
收获扩增的T细胞。
81.权利要求80所述的方法，其中扩增执行时间为约1天至2天、约1天至3天、约1天至约4天、约1天至约5天、约1天至6天、约1天至7天、约1天至8天、约1天至9天、约1天至10天、约2天至3天、约2天至4天、约2天至5天、约2天至6天、约2天至7天、约2天至8天、约2天至9天、约2天至10天、约3天至4天、约3天至5天、约3天至6天、约3天至7天、约3天至8天、约3天至9天、约3天至10天、约4天至5天、约4天至6天、约4天至7天、约4天至8天、约4天至9天、约4天至10天、约5天至6天、约5天至7天、约5天至8天、约5天至9天或约5天至10天。
82.权利要求80所述的方法，其中收获在激活后约4天至约12天、约4天至约11天、约4天至约10天、约4天至约9天、约4天至约8天、约4天至约7天、约4天至约6天、约4天至约5天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天、约5天至约7天或约5天至约6天内进行。
83.权利要求80至82中任一项所述的方法，其中收获的T细胞数量是选自约2x109至约5x109、约5x109至约10x109、约10x109至约15x109、约5x109至约35x109、约5x109至约30x109、约10x109至约30x109、约15x109至约20x109、约20x109至约35x109、约24x109至约33x109以及约24.8x109至约32.2x109组成的组。
84.权利要求80至83中任一项所述的方法，其中，所述激活、转导、扩增和收获在封闭***中进行。
85.权利要求84所述的方法，其中，封闭***为CliniMACSProdigyTM、WAVE(XURITM)生物反应器、WAVE(XURITM)生物反应器与BioSafeSepaxTMII组合、G-Rex/GatheRexTM封闭***或G-Rex/GatheRexTM封闭***与BioSafeSepaxTMII组合。
86.权利要求80至85中任一项所述的方法，其中所述新鲜PBMC不是透过解冻冷冻保存的PBMC获得。
87.权利要求80至86中任一项所述的方法，其中，所述获得和激活执行时间不超过1天。
88.权利要求80至87中任一项所述的方法，其中，所述扩增执行时间不超过1天。
CN201980011930.8A 2018-02-09 2019-02-08 制造t细胞的方法 Pending CN111684062A (zh)

Applications Claiming Priority (15)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862628521P 2018-02-09 2018-02-09
DE102018102971.3 2018-02-09
US62/628,521 2018-02-09
DE102018102971 2018-02-09
US201862633113P 2018-02-21 2018-02-21
US62/633,113 2018-02-21
DE102018104628 2018-02-28
DE102018104628.6 2018-02-28
US201862647571P 2018-03-23 2018-03-23
US62/647,571 2018-03-23
DE102018108996.1 2018-04-16
DE102018108996.1A DE102018108996B4 (de) 2018-02-09 2018-04-16 Verfahren zur Herstellung autologer T-Zellen
US201862726350P 2018-09-03 2018-09-03
US62/726,350 2018-09-03
PCT/US2019/017237 WO2019157298A1 (en) 2018-02-09 2019-02-08 Methods for manufacturing t cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111684062A true CN111684062A (zh) 2020-09-18

Family

ID=67542216

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980011930.8A Pending CN111684062A (zh) 2018-02-09 2019-02-08 制造t细胞的方法

Country Status (13)

Country Link
US (2) US11464800B2 (zh)
EP (1) EP3749753A1 (zh)
JP (1) JP7470640B2 (zh)
KR (1) KR20200119840A (zh)
CN (1) CN111684062A (zh)
AU (1) AU2019218093A1 (zh)
BR (1) BR112020016176A2 (zh)
CA (1) CA3090416A1 (zh)
IL (1) IL276600B1 (zh)
MA (1) MA51792A (zh)
MX (1) MX2020008327A (zh)
SG (1) SG11202007543TA (zh)
WO (1) WO2019157298A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113512529A (zh) * 2021-07-21 2021-10-19 上海赛傲生物技术有限公司 特异性抗病毒过继免疫细胞ab的制备方法
CN117343927A (zh) * 2023-12-06 2024-01-05 上海药明巨诺生物医药研发有限公司 一种工程化细胞的核酸提取方法

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201700621D0 (en) 2017-01-13 2017-03-01 Guest Ryan Dominic Method,device and kit for the aseptic isolation,enrichment and stabilsation of cells from mammalian solid tissue
EP3976805A1 (en) 2019-05-27 2022-04-06 Immatics US, Inc. Viral vectors and their use in adoptive cellular therapy
MX2021015033A (es) 2019-06-06 2022-01-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Clasificacion con contraseleccion utilizando peptidos de secuencias similares.
DE102019121007A1 (de) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigenbindende Proteine, die spezifisch an MAGE-A binden
TW202132333A (zh) * 2019-11-13 2021-09-01 瑞士商Ｃｒｉｓｐｒ治療公司 製造可表達嵌合抗原受體的ｔ細胞製法
CN114901808A (zh) * 2019-11-13 2022-08-12 克里斯珀医疗股份公司 生产car-t细胞的方法
AU2020408017A1 (en) * 2019-12-20 2022-07-14 Instil Bio (Uk) Limited Devices and methods for isolating tumor infiltrating lymphocytes and uses thereof
WO2021148019A1 (zh) * 2020-01-22 2021-07-29 科济生物医药（上海）有限公司 病毒载体转导细胞的方法
DE102020106710A1 (de) 2020-03-11 2021-09-16 Immatics US, Inc. Wpre-mutantenkonstrukte, zusammensetzungen und zugehörige verfahren
DE102020111571A1 (de) 2020-03-11 2021-09-16 Immatics US, Inc. Wpre-mutantenkonstrukte, zusammensetzungen und zugehörige verfahren
CN113801844A (zh) * 2020-06-12 2021-12-17 西比曼生物科技（香港）有限公司 一种全封闭一体化免疫细胞制备方法
WO2022147029A2 (en) 2020-12-31 2022-07-07 Immatics US, Inc. Cd8 polypeptides, compositions, and methods of using thereof
DE102021100038A1 (de) 2020-12-31 2022-06-30 Immatics US, Inc. Modifizierte cd8-polypeptide, zusammensetzungen und verfahren zu deren verwendung
BR112023022975A2 (pt) 2021-05-05 2024-01-23 Immatics Biotechnologies Gmbh Polipeptídeos de ligação ao antígeno bma031 melhorados
KR20230143764A (ko) * 2022-04-06 2023-10-13 주식회사 지씨셀 면역세포에 대한 표적 유전자 도입 방법
WO2023212691A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Immatics US, Inc. DOMINANT NEGATIVE TGFβ RECEPTOR POLYPEPTIDES, CD8 POLYPEPTIDES, CELLS, COMPOSITIONS, AND METHODS OF USING THEREOF
WO2023212697A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Immatics US, Inc. Membrane-bound il-15, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof
WO2023212655A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Immatics US, Inc. Il-12 polypeptides, il-15 polypeptides, il-18 polypeptides, cd8 polypeptides, compositions, and methods of using thereof
WO2023215825A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Immatics US, Inc. Methods for improving t cell efficacy

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102875667A (zh) * 2012-09-05 2013-01-16 南方医科大学 一种HIV-1肽Env120-128特异性TCR、其重组逆转录病毒载体与应用
WO2017176932A1 (en) * 2016-04-08 2017-10-12 Emory University Methods of treating cancer and infectious diseases using cell based therapies

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US5827642A (en) 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
WO2000023573A2 (en) 1998-10-20 2000-04-27 City Of Hope Cd20-specific redirected t cells and their use in cellular immunotherapy of cd20+ malignancies
JP3501775B2 (ja) 2000-05-31 2004-03-02 ファイザー株式会社 ヒトバニロイド受容体様タンパク質
DE10134604A1 (de) 2001-07-17 2003-02-06 Hilti Ag Spreizdübel
EP1450828B1 (en) 2001-08-17 2015-04-01 Roger Williams Hospital In situ immunization
US20030170238A1 (en) * 2002-03-07 2003-09-11 Gruenberg Micheal L. Re-activated T-cells for adoptive immunotherapy
US20030175272A1 (en) * 2002-03-07 2003-09-18 Medcell Biologics, Inc. Re-activated T-cells for adoptive immunotherapy
WO2006120439A2 (en) * 2005-05-10 2006-11-16 Avaris Ab Cellular vaccine and use thereof
DK1760088T3 (da) 2005-09-05 2008-06-09 Immatics Biotechnologies Gmbh Tumor associerede peptider, der bindes promiskuöst til human leuko-cyt-antigen (HLA) klasse II-molekyler
JP5666903B2 (ja) 2007-05-23 2015-02-12 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 導入遺伝子の発現を増強するための方法および組成物
DK2279253T3 (en) * 2008-04-09 2017-02-13 Maxcyte Inc Construction and application of therapeutic compositions of freshly isolated cells
KR102238226B1 (ko) 2013-05-14 2021-04-09 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 가공된 키메라 항원 수용체 (ｃａｒ) ｔ-세포의 인간 적용
US10050071B2 (en) 2013-12-09 2018-08-14 Sony Semiconductor Solutions Corporation Imaging unit, lens barrel, and portable terminal
EP3102609A4 (en) * 2014-02-04 2017-08-23 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Methods for producing autologous t cells useful to treat b cell malignancies and other cancers and compositions thereof
CA2946552A1 (en) * 2014-04-25 2015-10-29 Bluebird Bio, Inc. Improved methods for manufacturing adoptive cell therapies
ES2878449T3 (es) * 2014-07-24 2021-11-18 2Seventy Bio Inc Receptores antigénicos quiméricos de BCMA
IL292450A (en) 2014-11-05 2022-06-01 Juno Therapeutics Inc Transduction methods and cellular processing
GB201423361D0 (en) 2014-12-30 2015-02-11 Immatics Biotechnologies Gmbh Method for the absolute Quantification of naturally processed HLA-Restricted cancer peptides
US9944894B2 (en) 2015-01-16 2018-04-17 General Electric Company Pluripotent stem cell expansion and passage using a rocking platform bioreactor
GB201504502D0 (en) 2015-03-17 2015-04-29 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against pancreatic cancer and other cancers
GB201505305D0 (en) 2015-03-27 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various tumors
GB201505585D0 (en) 2015-03-31 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapy against renal cell carinoma (RCC) and other cancers
GB201507719D0 (en) 2015-05-06 2015-06-17 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides and scaffolds thereof for use in immunotherapy against colorectal carcinoma (CRC) and other cancers
GB201510771D0 (en) 2015-06-19 2015-08-05 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy and methods for generating scaffolds for the use against pancreatic cancer
GB201511191D0 (en) 2015-06-25 2015-08-12 Immatics Biotechnologies Gmbh T-cell epitopes for the immunotherapy of myeloma
GB201511546D0 (en) 2015-07-01 2015-08-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers
GB201511792D0 (en) 2015-07-06 2015-08-19 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against esopageal cancer and other cancers
MY189596A (en) 2015-07-15 2022-02-18 Immatics Biotechnologies Gmbh A novel peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers
GB201513921D0 (en) 2015-08-05 2015-09-23 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against prostate cancer and other cancers
US20170136108A1 (en) 2015-08-28 2017-05-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides, combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapeutic treatment of various cancers
GB201517538D0 (en) 2015-10-05 2015-11-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against small cell lung cancer and other cancers
WO2017060201A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Anti-wt1/hla-specific antibodies
CA3002742A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Juno Therapeutics Gmbh Methods, kits, agents and apparatuses for transduction
BR112018011089A2 (pt) * 2015-12-04 2018-12-04 Intellia Therapeutics Inc composições e métodos para a imuno-oncologia
GB201521746D0 (en) 2015-12-10 2016-01-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against CLL and other cancers
GB201521894D0 (en) 2015-12-11 2016-01-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various cancers
GB201522667D0 (en) 2015-12-22 2016-02-03 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against breast cancer and other cancers
CN116376826A (zh) * 2016-01-20 2023-07-04 菲特治疗公司 用来在过继性免疫疗法中进行免疫细胞调节的组合物和方法
GB201602918D0 (en) 2016-02-19 2016-04-06 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against NHL and other cancers
GB201603568D0 (en) 2016-03-01 2016-04-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Efficient treatment options including peptides and combination of peptide and cell based medicaments for use in immunotherapy against urinary bladder cancer
GB201603987D0 (en) 2016-03-08 2016-04-20 Immatics Biotechnologies Gmbh Uterine cancer treatments
AU2017238054B2 (en) * 2016-03-21 2023-10-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. T-cell exhaustion state-specific gene expression regulators and uses thereof
US20190161530A1 (en) * 2016-04-07 2019-05-30 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptor t cell compositions
JP2019527537A (ja) * 2016-06-07 2019-10-03 マックス−デルブリュック−セントルム フュール モレキュラー メディツィン イン デア ヘルムホルツ−ゲマインシャフト キメラ抗原受容体と、ｂｃｍａに結合するｃａｒ−ｔ細胞
US11242376B2 (en) * 2016-08-02 2022-02-08 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
DE102016115246C5 (de) 2016-08-17 2018-12-20 Immatics Biotechnologies Gmbh Neue t-zellrezeptoren und deren verwendung in immuntherapie
DE102016123859B3 (de) 2016-12-08 2018-03-01 Immatics Biotechnologies Gmbh Neue T-Zellrezeptoren und deren Verwendung in Immuntherapie

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102875667A (zh) * 2012-09-05 2013-01-16 南方医科大学 一种HIV-1肽Env120-128特异性TCR、其重组逆转录病毒载体与应用
WO2017176932A1 (en) * 2016-04-08 2017-10-12 Emory University Methods of treating cancer and infectious diseases using cell based therapies

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTOPHER T PETERSEN等: "Improving T-cell expansion and function for adoptive T-cell therapy using ex vivo treatment with PI3Kδ inhibitors and VIP antagonists", 《BLOOD ADV》, vol. 2, no. 3, pages 210 - 223, XP055915745, DOI: 10.1182/bloodadvances.2017011254 *
XIAO-YI TANG等: "Third-generation CD28/4-1BB chimeric antigen receptor T cells for chemotherapy relapsed or refractory acute lymphoblastic leukaemia: a non-randomised, open-label phase I trial protocol", 《BMJ OPEN》, vol. 6, no. 12, pages 013904 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113512529A (zh) * 2021-07-21 2021-10-19 上海赛傲生物技术有限公司 特异性抗病毒过继免疫细胞ab的制备方法
CN113512529B (zh) * 2021-07-21 2022-11-25 上海赛傲生物技术有限公司 特异性抗病毒过继免疫细胞ab的制备方法
CN117343927A (zh) * 2023-12-06 2024-01-05 上海药明巨诺生物医药研发有限公司 一种工程化细胞的核酸提取方法
CN117343927B (zh) * 2023-12-06 2024-03-12 上海药明巨诺生物医药研发有限公司 一种工程化细胞的核酸提取方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA3090416A1 (en) 2019-08-15
WO2019157298A1 (en) 2019-08-15
KR20200119840A (ko) 2020-10-20
BR112020016176A2 (pt) 2022-02-22
EP3749753A1 (en) 2020-12-16
MX2020008327A (es) 2020-10-28
US11464800B2 (en) 2022-10-11
TW202002995A (zh) 2020-01-16
JP2021512621A (ja) 2021-05-20
JP7470640B2 (ja) 2024-04-18
US20190247433A1 (en) 2019-08-15
IL276600A (en) 2020-09-30
IL276600B1 (en) 2024-03-01
SG11202007543TA (en) 2020-09-29
AU2019218093A1 (en) 2020-09-10
MA51792A (fr) 2020-12-16
US20210030803A1 (en) 2021-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7470640B2 (ja) Ｔ細胞を製造する方法
Thomas et al. A cell-based artificial antigen-presenting cell coated with anti-CD3 and CD28 antibodies enables rapid expansion and long-term growth of CD4 T lymphocytes
EP2099902B1 (en) Adoptive transfer of cd8+ t cell clones derived from central memory cells
JP6230208B2 (ja) 樹状細胞／腫瘍細胞融合物および抗ｃｄ３／ｃｄ２８を使用する抗腫瘍免疫の刺激
KR20220031615A (ko) 직접 분류에 의한 t 세포의 제조 방법 및 이의 조성물
JP2011504101A5 (zh)
AU2015218865B2 (en) TSCM cells and methods for use
US6465251B1 (en) Method of promoting b-cell proliferation and activation with CD40 ligand and cyclosporin
DiGiusto et al. Preparing clinical grade Ag-specific T cells for adoptive immunotherapy trials
TWI834635B (zh) 製造t細胞的方法
JP5485139B2 (ja) 遺伝子導入細胞の製造方法
EA045289B1 (ru) Способ получения т-клеток
US20220096615A1 (en) Compositions and methods for treating immunological dysfunction
US20210017492A1 (en) Use of retinoic acid in t-cell manufacturing
US20240117309A1 (en) Methods for expanding t cell populations
TW202043465A (zh) Cd28 t 細胞培養物、組合物及其使用方法
CN117979978A (zh) 从干细胞产生经工程化的t细胞
TW202332765A (zh) 用於ｔ細胞療法之ｔ細胞群體的單核球耗盡
CN117940139A (zh) 对用于同种异体car t细胞疗法的干细胞进行工程化
Peperzak Molecular mechanisms underlying CD27-CD70 costimulation
MX2008004225A (es) Metodo para la produccion de una poblacion de celulas t

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination