CN111683546A - 用于治疗或预防感染的酶促水解果胶多糖 - Google Patents

用于治疗或预防感染的酶促水解果胶多糖 Download PDF

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Abstract

本发明涉及感染的治疗或预防处理中使用的产品，处理包括产品口服给予，其中产品选自营养制剂、食物产品、膳食补充剂、饮料和药物产品，产品包含胡萝卜RG‑I多糖具有以下组合特征：分子量在10‑300kDa范围内；骨架由半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基组成，鼠李糖残基含在α(1→4)‑半乳糖醛酸‑α(1→2)‑鼠李糖残基中；以下单糖组成：20‑60mol.％半乳糖醛酸残基，其中可甲基化和/或乙酰基酯化单独半乳糖醛酸；8‑50mol.％鼠李糖残基；0‑40mol.％***糖残基；0‑40mol.％半乳糖残基；半乳糖醛酸残基与鼠李糖残基摩尔比在5:1至1:1范围内；半乳糖醛酸残基、鼠李糖残基、***糖残基和半乳糖残基一起构成胡萝卜RG‑I多糖中至少85mol.％单糖残基。可通过部分水解存在于胡萝卜果胶分离物中的果胶多糖产生这些胡萝卜RG‑I多糖。通过酶促水解RG‑I多糖以去除至少部分同型半乳糖醛酸聚糖组分，显著提高胡萝卜RG‑I多糖对感染的有效性。

Description

用于治疗或预防感染的酶促水解果胶多糖
发明领域
本发明涉及酶促水解果胶多糖在诸如上呼吸道感染的感染的预防或治疗处理中的使用。酶促水解果胶多糖来源于胡萝卜，并且特征在于极高的鼠李半乳糖醛酸聚糖I(RG-I)含量。
更具体地，本发明提供选自以下的产品：营养制剂、食品产品、膳食补充剂、饮料或药物产品，所述产品包含前述酶促水解胡萝卜RG-I多糖。本发明还涉及上述产品在感染处理中的使用以及制备酶促水解胡萝卜RG-I多糖的方法。
发明背景
感染是由致病剂对有机体的体组织的入侵、它们的繁殖以及宿主组织对这些有机体及其产生的毒素的反应。有机体可使用它们的免疫***来抵抗感染。免疫***是包括有机体内许多生物结构和过程的预防疾病的宿主防御***。营养是免疫功能的关键调节剂。例如，膳食纤维可调节免疫***的各种性质，从而改变对感染的抵抗力。刺激或支持免疫***可对致病有机体产生更有效的免疫应答。这可导致对有症状感染的预防，或导致感染的更快恢复。
上呼吸道感染是涉及上呼吸道的由急性感染引起的疾病，所述上呼吸道包括鼻子、鼻窦、咽或喉。这通常包括鼻塞、喉咙痛、扁桃体炎、咽炎、喉炎、鼻窦炎、中耳炎、某些类型的流感和普通感冒。大多数感染在本质上是病毒性的，在其他情况下，原因是细菌性的。上呼吸道感染也可能在起源上是真菌或蠕虫，但远不常见。下呼吸道感染通常比上呼吸道感染更严重，并且是所有感染性疾病的主要死因。
可引起急性呼吸道感染的病毒包括鼻病毒、流感病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和人偏肺病毒。可引起上呼吸道感染的细菌包括A组β-溶血链球菌、白喉棒状杆菌、淋病奈瑟氏菌、肺炎衣原体、C组β-溶血链球菌。
儿童每年有2-9种病毒性呼吸道疾病。上呼吸道感染是人们失业和失学的主要原因。针对流感病毒、腺病毒、麻疹、风疹、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、白喉、炭疽杆菌和百日咳博代氏杆菌的疫苗可防止它们感染URT或降低感染的严重度。
免疫***提供保护的其他感染包括肠道感染。肠道感染病包括霍乱、伤寒、副伤寒、其他类型的沙门氏菌感染、志贺氏菌病、波特淋菌中毒、胃肠炎和阿米巴病等。胃肠炎(也称为感染性腹泻)是涉及胃和小肠的胃肠道炎症。病征和症状包括腹泻、呕吐和腹痛的综合征。也可能出现发烧、精力缺失和脱水。胃肠炎可归因于由病毒、细菌、寄生虫和真菌引起的感染。已知轮状病毒、诺罗病毒、腺病毒和星状病毒可引起病毒性胃肠炎。轮状病毒是儿童胃肠炎的最常见原因。
在发达国家，空肠弯曲菌是细菌性胃肠炎的主要原因。可引起胃肠炎的其他细菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和弯曲杆菌。产毒素的艰难梭菌是在老年人中更多发的腹泻的重要原因。多种原生动物也可引起胃肠炎，最常见的是蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)，但也与溶组织内阿米巴、隐孢子虫(Sryptosporidium spp)和其他物种有关。
US 2004/072791描述了果胶水解产物用于阻止有害物质或有机体附着到哺乳动物细胞，特别是用于抵抗感染的使用。果胶可从柑橘类、苹果或糖用甜菜获得。
US 2002/0022601描述了一种预防或治疗普通感冒的方法，其包括给予包括选自几丁质低聚糖、壳聚糖低聚糖和部分脱乙酰几丁质低聚糖中的至少一种组分的剂。
US 2011/0112048描述了一种减少应激受试者中的上呼吸道感染症状的方法，所述方法包括：给予有效量的β-葡聚糖。
US 2013/0137757描述了一种抑制流感病毒感染的方法，所述方法包括：用主要包含果胶和多核苷酸的组合物处理受试者的粘膜以抑制流感病毒的血凝素与唾液酸之间的粘附。
US 2014/0288021描述了来自落叶松树的***半乳聚糖和多酚在上呼吸道感染的预防处理中的使用。
US 2016/0250625描述了一种用于处理上呼吸道感染的方法，所述方法包括给予包含选自由以下项组成的组的非复制性益生微生物的组合物：双歧杆菌、乳杆菌、丙酸杆菌及其组合。
果胶是存在于陆生植物的原代细胞壁中的结构性杂多糖。
果胶多糖是包括不同量的以下多糖组分的多糖的异质组：
(i)同型半乳糖醛酸聚糖(HG)，
(ii)木糖半乳糖醛酸聚糖(XG)，
(iii)芹半乳糖醛酸聚糖(AG)
(iv)鼠李半乳糖醛酸聚糖-I(RG-I)，以及
(v)鼠李半乳糖醛酸聚糖-II(RG-II)。
图1提供果胶多糖的结构的示意性表示，包括前述5种多糖组分。注意，多糖组分AG、XG和RG-II通常代表果胶多糖的仅较小级分。
多糖组分HG、AG、XG和RG-II各自包括由α-(1-4)-连接的D-半乳糖醛酸单糖单元的直链组成的骨架。
仅RG-I包括由以下重复的二糖单元的直链组成的骨架：4)-α-D-半乳糖醛酸-(1,2)-α-L-鼠李糖-(1。在图2中示出RG-I的结构的示意性表示。
果胶多糖组成和精细结构取决于植物来源和所应用提取条件而大有不同。同型半乳糖醛酸聚糖结构域可具有高达约100个连续D-GalA残基的长度。包含侧链的RG-I结构域通常被称为“分枝区”或“毛状区”，而同型半乳糖醛酸聚糖结构域(连接至RG-I结构域)通常不被糖苷或糖苷侧链取代。
RG-I中的GalA残基通过1和4位置连接至Rha残基，而Rha残基通过异头位置和2-OH位置连接至GalA残基。一般来说，约20-80％的Rha残基在4-OH位置处分支(这取决于植物来源和分离方法)，带有中性和酸性侧链。这些侧链主要由以各种方式连接的Ara残基和Gal残基组成，从而构成称为***聚糖、***半乳聚糖I(AG-I)和/或AG-II的聚合物。AG I由β-(1,4)-连接的D-Gal骨架构成，所述骨架在3-OH处是α-L-***糖基取代物；Gal骨架可具有间隔的α(1,5)-L-Ara单元。AG-II由高度分枝的半乳聚糖组成，主要内部是β(1,3)连接的D-Gal，外部是短(1,6)连接链的取代物。后者具有(1,3)-和/或α(1,5)-连接的L-Ara的另外的附着体。低聚糖侧链可以是直链或支链的，并且这些侧链中的一些可被α-L-岩藻糖苷、β-D-葡糖醛酸苷和4-O-甲基β-D-葡糖醛酸残基封端。
WO 2011/069781描述了包括从茶树种的植物获得的多糖的可食用产品，其中多糖的骨架包括交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖-1核心和α(1,4)连接的聚半乳糖醛酸或α(1,4)-连接的低聚半乳糖醛酸核，其中多糖骨架中的半乳糖醛酸残基与鼠李糖基残基的摩尔比为2.5:1至1:1，并且其中多糖具有至少70kDa的分子量。可食用产品可另外包含可从一种或多种属于伞形科的植物，优选地从胡萝卜(Daucus carota)(胡萝卜)种的植物获得的多糖。表1描述从胡萝卜分离的分子量大于110kDa的果胶多糖级分。表2表明此多糖级分具有体外免疫调节活性。
WO 2012/148277描述具有至少20重量％的干物质含量的制剂，所述制剂包含至少50重量％的果胶多糖混合物的干物质，包括至少20重量％(按果胶的重量计)的分子量大于40kDa的鼠李半乳糖醛酸聚糖-I果胶，所述果胶多糖混合物的特征在于：
-半乳糖醛酸残基的甲基化程度不超过20％；
-半乳糖醛酸残基的乙酰化程度不超过20％；
其中当用50mM碳酸氢铵水性溶液稀释至固体含量为2.5重量％时，制剂不形成凝胶。实施例描述了使用不同的提取程序从胡萝卜中分离出的果胶多糖级分。发现这些级分中的一些具有免疫调节活性。
WO 2004/084652描述了一种生产蔬菜泥的方法，包括以下顺序步骤：
a)将蔬菜压碎、切碎或切片成1至30mm的块；
b)在60℃至90℃的温度下将蔬菜片漂烫；
c)使漂烫的蔬菜块接触浸解酶活性；
d)将浸解的蔬菜块共混并获得果泥。国际专利申请的实施例描述了使用此方法来制备胡萝卜泥。
Broxterman等人(Acetylated pectins in raw and heat processed carrot,Carbohydrate Polymers 177(2017)58-66)描述了一项研究，其中研究了热处理对果胶的影响。从已去皮胡萝卜或经热处理胡萝卜立方体中分离出的不溶于醇的固体级分中提取水溶性固体(WSS)。为了研究果胶的精细化学结构，进行果胶分解酶的受控降解。WSS被来自棘孢曲霉(A.aculeatus)的聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)和来自黑曲霉(A.niger)的果胶裂解酶(PL)降解。
发明概述
发明人已发现，通过对RG-I多糖进行酶促水解以去除同型半乳糖醛酸聚糖组分的至少一部分，可显著提高胡萝卜RG-I多糖对感染的有效性。本发明的酶促水解的胡萝卜RG-I多糖的特征在于以下特征的组合：
·在10-300kDa的范围内的分子量；
·由半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基组成的骨架，所述鼠李糖残基包含在α(1→4)-半乳糖醛酸-α(1→2)-鼠李糖残基中；
·以下单糖组成：
—20-60mol.％的半乳糖醛酸残基，其中单独的半乳糖醛酸可被甲基化和/或乙酰基酯化；
-8-50mol.％的鼠李糖残基；
-0-40mol.％的***糖残基；
-0-40mol.％的半乳糖残基；
-半乳糖醛酸残基与鼠李糖残基的摩尔比为5:1至1:1；
-半乳糖醛酸残基、鼠李糖残基、***糖残基和半乳糖残基一起构成胡萝卜RG-I多糖中单糖残基的至少85mol.％。
本发明的一方面涉及包含前述胡萝卜RG-I多糖的产品在感染的治疗或预防处理中的使用。
虽然发明人不希望受到理论的束缚，但据信去除同型半乳糖醛酸聚糖组分(降低[GalA]:[Rha]比)改变RG-I多糖的理化性质，从而产生与肠道中和人外周血单核细胞上的所谓模式识别受体更有效地相互作用的三维分子构型。据信RG-I多糖与在上皮细胞和其他免疫活性细胞上表达的模式识别受体的相互作用可调节它们的功能反应性，这通过介体的产生和免疫活性细胞的再循环可改善对肠道以及体内包括口腔、呼吸道、泌尿道、***和皮肤的其他部位的感染的抵抗力。
使用果胶分解酶去除同型半乳糖醛酸聚糖组分的优点在于，它提供增加免疫调节RG-I多糖产量的经济有效的方式。
本发明的另一方面涉及一种选自营养制剂、食物产品、膳食补充剂、饮料和药物产品的产品，所述产品包含如上所述的胡萝卜RG-I多糖的至少0.1重量％的干物质，并且其中所述胡萝卜RG-I多糖代表存在于产物中的果胶多糖的至少20重量％，所述果胶多糖定义为具有大于10kDa的分子量并且包括由半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基组成的骨架的任选分支的多糖，所述鼠李糖残基包含在α(1→4)-半乳糖醛酸-α(1→2)-鼠李糖残基中。
本发明的酶促水解胡萝卜RG-I多糖可通过包括以下的方法产生：
·从胡萝卜(例如，胡萝卜果渣)提供果胶分离物，所述分离物包括具有至少15kDa的分子量并且具有由半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基组成的骨架的果胶多糖的至少5重量％的干物质，所述鼠李糖残基包含在α(1→4)-半乳糖醛酸-α(1→2)-鼠李糖残基中；
·使用选自果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)、果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)、内聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、外聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67和EC 3.2.1.82)的一种或多种半乳聚糖酶部分地水解所述果胶多糖；以及
·对部分水解的果胶多糖进行选自离心、倾析、过滤以及它们的组合的固液分离技术以产生包含部分水解的果胶多糖的液体级分；
·使用具有10至100kDa的截留分子量的超滤膜对所述液体级分进行超滤；以及
·回收包含部分水解的果胶多糖的渗余物。
发明详述
因此，本发明的第一方面涉及一种在感染的治疗或预防处理中使用的产品，所述处理包括所述产品的口服给予，其中所述产品选自营养制剂、食物产品、膳食补充剂、饮料和药物产品，所述产品包含具有以下组合特征的胡萝卜RG-I多糖的至少0.1重量％的干物质：
·在10-300kDa的范围内的分子量；
·由半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基组成的骨架，所述鼠李糖残基包含在α(1→4)-半乳糖醛酸-α(1→2)-鼠李糖残基中；
·以下单糖组成：
-20-60mol.％的半乳糖醛酸残基，其中单独的半乳糖醛酸可在C-6位置甲基化和/或在O-2和/或O-3位置乙酰化；
-8-50mol.％的鼠李糖残基；
-0-40mol.％的***糖残基；
-0-40mol.％的半乳糖残基；
-半乳糖醛酸残基与鼠李糖残基的摩尔比为5:1至1:1；
-半乳糖醛酸残基、鼠李糖残基、***糖残基和半乳糖残基一起构成胡萝卜RG-I多糖中单糖残基的至少85mol.％。
如本文所用的术语“分支多糖”是指包括通过糖苷键连接结合在一起的单糖单元线性骨架链的多糖，其中骨架链内的至少一个单糖单元携带一个或多个糖苷连接的单糖单元的侧链。
术语“骨架链”和“骨架”是同义词。
如本文所用的术语“果胶多糖”是指分子量大于10kDa并且包括由半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基组成的骨架的任选分支的多糖，所述鼠李糖残基包含在α(1→4)-半乳糖醛酸-α(1→2)-鼠李糖残基中。
如本文所用的术语“片段(stretch)”是指多糖骨架内两个糖苷连接的单糖单元的序列，不包括其所附着到的任何侧链。
如本文所用的术语“结构域”是指一个片段加上附着到所述片段的任何侧链。
术语“鼠李半乳糖醛酸聚糖-I片段”或“RG-I片段”是指由半乳糖醛酸(GalA)和鼠李糖(Rha)对组成的片段，其中GalA残基通过1位置和4位置连接至Rha残基，而Rha残基通过异头位置和2-OH位置连接至GalA残基相连，即交替的α(1→4)-半乳糖醛酸-α(1→2)-鼠李糖残基。RG-I结构域可包括侧链，诸如例如半乳聚糖、***聚糖和***半乳聚糖侧链。
术语“鼠李半乳糖醛酸聚糖-I”或“RG-I”多糖是指任选分支的果胶多糖，其包括包含一个或多个鼠李半乳糖醛酸聚糖-I片段的骨架。
术语“α(1，4)-连接的半乳糖醛酸片段”是指由α(1→-4)-半乳糖醛残基组成的片段。
除RG-I结构域之外，本发明的胡萝卜RG-I多糖可包含以下结构域中的一者或多者：
·同型半乳糖醛酸聚糖(HG)，
·木糖半乳糖醛酸聚糖(XG)，
·芹半乳糖醛酸聚糖(AG)
·鼠李半乳糖醛酸聚糖-II(RG-II)。
结构域XG、AG和RG-II通常代表RG-I多糖的仅较小级分。
任选存在于本发明的RG-I多糖中的HG结构域、XG结构域、AG和RG-II结构域包括由两个或更多个α-(1-4)-连接的D-半乳糖醛酸的直链组成的骨架。
HG结构域不包含任何侧链。HG结构域的骨架内的半乳糖醛酸残基的羧基可被酯化。酯化的半乳糖醛酸可以甲酯或乙酰酯的形式出现。
XG结构域的骨架包含一个或多个D-木糖形式的侧链。
AG结构域的骨架包含由一个或多个D-芹菜糖残基构成的一个或多个侧链。
RG-II的骨架包含并非仅由D-木糖或D-芹菜糖构成的一个或多个侧链。RG-II结构域的骨架内的半乳糖醛酸残基的羧基可被酯化。半乳糖醛酸可被甲基或乙酰基酯化，从而分别形成甲基或乙酰基酯。
术语“乙酰化程度”是指每个半乳糖醛酸残基的乙酰基残基数目，以百分比表示。
术语“甲基化程度”是指每个半乳糖醛酸残基的甲基残基数目，以百分比表示。
可通过技术人员已知的分析技术来确定不同多糖的浓度及其单糖组成。在酸水解(甲烷水解)之后，中性糖的单糖组成可通过与脉冲安培检测组合的高性能阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)来适当地确定。
糖醛酸(半乳糖醛酸是糖醛酸的主要形式)可使用间羟基联苯比色法测定来确定。
分子大小分布可通过使用折射率(R1)检测(浓度)的高性能尺寸排阻色谱法来确定。
上述分析方法在以下期刊中有所描述：Analytical Biochemistry，第207卷，第1期，1992版，第176页(用于中性糖分析)；以及Mol.Nutr.Food Res.，第61卷，第1期，2017版，1600243(用于糖醛酸分析和分子大小分布)。
除非另外陈述，否则本文提及的所有百分比是指重量百分比。
在本处理的上下文中的口服给予包括自我给予。
根据本发明在治疗或预防处理中的使用优选地包括以提供至少100mg，更优选地至少350mg，最优选350mg-5000mg胡萝卜RG-I多糖的剂量口服给予产品。
在另一优选实施方式中，处理包括以提供至少100mg，更优选至少350mg，最优选350mg-5000mg的胡萝卜RG-I多糖的每日剂量口服给予产品。
根据特别优选的实施方式，产品用于治疗或预防处理上呼吸道感染，诸如感冒或流感。
根据另一优选实施方式，产品用于治疗或预防处理肠道感染，诸如胃肠炎。
口服给予包含本发明的组成的RG-I多糖的受试者优选地是哺乳动物，更优选地是人类受试者。
本发明的产品优选地是营养制剂、食物产品、膳食补充剂或饮料。
产品优选地包含胡萝卜RG-I多糖的至少0.2重量％的干物质，更优选0.3-10重量％的干物质，最优选0.4-5重量％的干物质。
胡萝卜RG-I多糖优选地以富含RG-I多糖的果胶多糖分离物形式掺入本发明的产品中。因此，在特别优选的实施方式中，胡萝卜RG-I多糖代表产品中存在的果胶多糖的至少20重量％，更优选地至少30重量％，甚至更优选地60重量％，并且最优选地至少80重量％，所述果胶多糖定义为分子量超过10kDa并且包括由半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基组成的骨架的任选分支的多糖，所述鼠李糖残基包含在α(1→4)-半乳糖醛酸-α(1→2)-鼠李糖残基中。
根据本发明采用的胡萝卜RG-I多糖具有包括鼠李半乳糖醛酸聚糖-I片段和任选的α(1,4)-连接的同型半乳糖醛酸片段的骨架。胡萝卜RG-I多糖中的半乳糖醛酸残基与鼠李糖残基的摩尔比在5:1至1:1的范围内。优选地，胡萝卜RG-I多糖中的半乳糖醛酸残基与鼠李糖残基的摩尔比为4.8:1至1:1，更优选地为4.5:1至1:1，甚至更优选地为4.2:1至1:1，最优选地从4:1到1.1:1。
鼠李糖残基通常代表胡萝卜RG-I多糖中包含的所有单糖残基(即包括侧链中包含的单糖残基)的9-45％，更优选地10-40％，并且最优选地11-35％。
半乳糖醛酸残基通常代表胡萝卜RG-I多糖中包含的所有单糖残基(即包括侧链中包含的单糖残基)的21-55％，更优选地22-50％，并且最优选地23-45％。
***糖残基通常代表胡萝卜RG-I多糖中包含的所有单糖残基的4-38％，更优选地6-36％，并且最优选地8-34％。
半乳糖残基通常代表胡萝卜RG-I多糖中包含的所有单糖残基的4-42％，更优选地8-40％，并且最优选地10-38％。
半乳糖醛酸残基、鼠李糖残基、***糖残基和半乳糖残基的组合优选地一起构成胡萝卜RG-I多糖中单糖残基的至少88mol.％，更优选地至少90mol.％，并且最优选地至少92mol.％。
胡萝卜RG-I多糖通常具有至少10kDa的分子量。更优选地，一种或多种RG-I多糖具有在20kDa与300kDa之间，最优选地在40kDa与300kDa之间的分子量。
本发明的胡萝卜RG-I多糖可适当地通过存在于胡萝卜中的果胶多糖的酶促水解来产生。存在于胡萝卜中的果胶多糖通常具有30-50％的乙酰化程度和60-80％的甲基化程度。通过酶促水解从这些果胶多糖中去除同型半乳糖醛酸聚糖(HG)结构域通常产生甲基化程度降低和乙酰化程度提高的富含RG-I的多糖。
发明人发现，根据本发明采用的酶促水解通常产生具有至少20％，更优选地30-110％，甚至优选地35-90％，并且最优选地40-70％的乙酰化程度的胡萝卜RG-I多糖。
根据本发明的优选实施方式，胡萝卜RG-I多糖的酶促制备例如由于果胶酯酶的活性而导致甲基化程度的显著降低。优选地，胡萝卜RG-I多糖具有不超过50％，更优选不超过40％，并且最优选地10-30％的甲基化程度。
根据另一优选实施方式，胡萝卜RG-I多糖的乙酰化程度(DA)与胡萝卜RG-I多糖的甲基化程度(DM)之比优选地是1或以上，更优选地是2或以上，更优选地是3或以上，并且最优选地是5或以上。由于果胶酯酶活性对酶促制备的胡萝卜RG-I多糖的乙酰化程度没有显著影响，因此可通过使用果胶酶(聚半乳糖醛酸酶和/或裂解酶)和果胶酯酶的组合部分地水解胡萝卜果胶多糖来获得具有极高DA:DM比的RG-I多糖。
根据另一优选实施方式，由果胶多糖的胡萝卜RG-I多糖的酶促制备产生在末端含有不饱和半乳糖醛酸残基的胡萝卜RG-I多糖。存在于胡萝卜中的果胶多糖通常不包含不饱和半乳糖醛酸残基。然而，这些果胶多糖通过果胶裂解酶和/或果胶酸裂解酶进行的水解不可避免地产生包含末端不饱和非还原性半乳糖醛酸残基的多糖碎片。优选地，RG-I多糖中至少10％，更优选地至少25％，并且最优选地至少50％的末端非还原性半乳糖醛酸残基是不饱和半乳糖醛酸残基。不饱和半乳糖醛酸可很容易地鉴定出来，例如通过测量235nm下的紫外线吸收率。
胡萝卜RG-I多糖的骨架可包括一个或多个侧链。这些侧链可包含***糖和/或半乳糖的残基，以及少量的单体岩藻糖、葡萄糖、葡糖醛酸、木糖和/或糖醛酸的残基。一个或多个侧链优选地选自半乳聚糖侧链、***聚糖侧链和***半乳聚糖侧链。
***聚糖侧链包括至少一个或多个α(1,5)-连接的***糖残基，并且取代至RG-I结构域中鼠李糖残基的4-OH位置。***聚糖侧链可以是直链或支链的。如果侧链是直链的，则侧链由α(1,5)-连接的***糖残基组成。在***聚糖侧链是支链侧链的情况下，一个或多个α-***糖残基连接至α(1，5)连接的***糖的O-2和/或O-3。
半乳聚糖侧链包含至少一个或多个β(1,4)-连接的半乳糖残基，并且取代于RG-I结构域中的鼠李糖残基的0-4位置处。
***半乳聚糖侧链取代于RG-I结构域中的鼠李糖残基的0-4位置处，并且可以是I型***半乳聚糖(AGI)或II型***半乳聚糖(AGII)。AGI由(1→4)-β-D-Galp骨架构成，在其上可发生单体Galρ单元在0-6或0-3位置处的取代。AGI进一步被α-L-Araf-p残基和/或(1→5)-α-L-Araf短侧链取代。AGII由装饰有(1→6)-β-D-Galp二次链的α(1→3)-β-D-Galp骨架构成，这些链是***糖基化的。
优选地，胡萝卜RG-I多糖中的***糖残基和鼠李糖残基的摩尔比小于4:1，更优选地小于3:1，最优选地小于2:1。
半乳糖残基和鼠李糖残基优选地以小于4:1，更优选地小于3.2:1，最优选地小于2.5:1的摩尔比存在于胡萝卜RG-I多糖中。
胡萝卜RG-I多糖中***糖残基和半乳糖残基的组合与鼠李糖残基的摩尔比优选地小于7:1，更优选地小于5:1，并且最优选小于4:1。
半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基的组合优选地构成胡萝卜RG-I多糖中所包含的单糖残基的至少30mol.％，更优选地35-90mol.％，并且最优选地40-75mol.％。
根据特别优选的实施方式，胡萝卜RG-I多糖具有以下单糖组成：
·21-55mol.％的半乳糖醛酸残基，其中单独的半乳糖醛酸可被甲基化和/或乙酰基酯化；
·9-35mol.％的鼠李糖残基；
·5-35mol.％的***糖残基；
·5-40mol.％的半乳糖残基。
本发明产品中的胡萝卜RG-I多糖优选地是通过胡萝卜果胶的部分酶促水解获得的。根据特别优选的实施方式，胡萝卜RG-I多糖是通过使用选自果胶裂解酶(EC4.2.2.10)、果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)、内聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)、外聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67和EC 3.2.1.82)的一种或多种果胶酶对胡萝卜果胶进行酶促水解获得的。最优选地，胡萝卜RG-I多糖是通过使用选自果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)和内聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)的一种或多种果胶酶对胡萝卜果胶进行酶促水解获得的。
本发明的产品优选地包含痕量的一种或多种前述果胶酶。这些果胶酶可以活性和/或非活性形式存在于产品中。
根据一个优选实施方式，胡萝卜RG-I多糖是通过结合果胶酯酶组合(EC3.1.1.11)使用内聚半乳糖醛酸酶和/或外聚半乳糖醛酸酶对胡萝卜果胶进行酶促水解获得的。
根据另一优选实施方式，胡萝卜RG-I多糖是通过使用果胶裂解酶和/或果胶酸裂解酶对胡萝卜果胶进行酶促水解获得的。
除了胡萝卜RG-I多糖外，本发明的产品还优选地包含选自乳果糖、菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、乳低聚糖、瓜尔豆胶和***胶的一种或多种益生元的至少1重量％的干物质，更优选地至少3重量％的干物质。甚至更优选地，产品包含选自乳果糖、菊粉、果糖低聚糖、低聚半乳糖和乳低聚糖的一种或多种益生元的至少1重量％的干物质，更优选地至少3重量％的干物质。
本发明的另一方面涉及一种选自营养制剂、食物产品、膳食补充剂、饮料和药物产品的产品，所述产品包含如上所述的胡萝卜RG-I多糖的至少0.1重量％的干物质；其中胡萝卜RG-I多糖代表存在于产物中的果胶多糖的至少20重量％，所述果胶多糖定义为分子量大于10kDa并且包括由半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基组成的骨架的任选分支的多糖，所述鼠李糖残基包含在α(1→4)-半乳糖醛酸-α(1→2)-鼠李糖残基中。
本发明的另一方面涉及一种制备胡萝卜RG-I多糖的方法，所述方法包括：
·从胡萝卜提供果胶分离物，所述分离物包括具有至少15kDa的分子量并且具有由半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基组成的骨架的果胶多糖的至少5重量％的干物质，优选地至少10重量％的干物质，更优选地至少25重量％的干物质，所述鼠李糖残基包含在α(1→4)-半乳糖醛酸-α(1→2)-鼠李糖残基中；
·使用选自果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)、果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)、内聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、外聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67和EC 3.2.1.82)的一种或多种果胶酶部分地水解所述果胶多糖。
·对部分水解的果胶多糖进行选自离心、倾析、过滤以及它们的组合的固液分离技术以产生包含部分水解的果胶多糖的液体级分；
·使用具有10至100kDa的截留分子量的超滤膜对液体级分进行超滤；以及
·回收包含部分水解的果胶多糖的渗余物。
根据一个优选实施方式，果胶多糖是使用选自内聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)和外聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67和EC 3.2.1.82)的一种或多种果胶酶部分地水解的。
根据另一个优选的实施方式，果胶多糖是使用选自果胶裂解酶(EC4.2.2.10)和果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)的一种或多种果胶酶部分地水解的。如上文所解释，果胶多糖通过这些裂解酶进行的水解不可避免地产生包含末端不饱和非还原性半乳糖醛酸残基的多糖碎片。
在本发明方法中，优选地使用前述一种或多种果胶酶和一种或多种果胶酯酶(EC3.1.1.11)的组合将果胶多糖水解。一种或多种果胶酯酶可在一种或多种果胶酶之前或与此同时采用。果胶酶和果胶酯酶的组合使用在所采用果胶酶选自内聚半乳糖醛酸酶、外聚半乳糖醛酸酶以及它们的组合的情况下特别有利。结合使用果胶酶和果胶酯酶通常产生甲基化程度降低并且乙酰化/甲基化比提高的部分水解的胡萝卜果胶多糖。
果胶多糖的部分水解优选地通过将果胶多糖和果胶酶的水性溶液在15至70℃的温度下保持至少10分钟，优选地15-300分钟来进行。
在本发明方法中采用的来自胡萝卜的果胶分离物优选地是从胡萝卜果汁生产中获得的胡萝卜浆或这种胡萝卜浆的级分。
如本文所用，术语“超滤”还涵盖使用超滤膜的透析。在本方法的特别优选的实施方式中，使用具有12至80kDa的截留分子量的超滤膜对从固液分离获得的液体级分进行超滤。更优选地，所述超滤膜的截留分子量在10至60kDa的范围内，最优选在20至45kDa的范围内。
根据特别优选的实施方式，将在超滤步骤中获得的渗余物浓缩至小于50重量％的含水量。甚至更优选地，将渗余物干燥至含水量小于15重量％，最优选地小于12重量％。
前述渗余物优选地使用选自喷雾干燥、转筒干燥和冷冻干燥的干燥技术进行干燥。更优选地，所用干燥技术是喷雾干燥或转筒干燥。最优选地，渗余物通过喷雾干燥来干燥。
本方法优选地不采用有机溶剂。
通过本发明的方法获得的胡萝卜RG-I多糖优选地为如上文所述的胡萝卜RG-I多糖。
本发明还提供一种制备选自营养制剂、食物产品、饮料、膳食补充剂和药物产品的产品的方法，所述方法包括在其中掺入胡萝卜RG-I多糖的0.1-50重量％的干物质，如上文所述。产品优选地通过将胡萝卜RG-I多糖与一种或多种可食用成分混合来制备。
本方法的一个实施方式涉及制备选自营养制剂、食品和饮料的产品，所述方法包括在其中掺入胡萝卜RG-I多糖的0.5-40重量％的干物质，更优选地1-30重量％的干物质。
在另一实施方式中，使用本方法来制备选自膳食补充剂和药物产品的产品，所述方法包括在其中掺入胡萝卜RG-I多糖的10-90重量％的干物质，优选地20-80重量％的干物质，并且最优选地30-60重量％的干物质。
胡萝卜RG-I多糖优选地以分离物形式掺入产品中，所述分离物包含至少5重量％，更优选地至少10重量％，甚至更优选地至少20重量％并且最优选地至少30重量％的胡萝卜RG-I多糖的干物质。
根据另一优选实施方式，将胡萝卜RG-I多糖以粉末形式，优选以含水量小于15重量％，更优选地小于12重量％的粉末形式掺入产品中。
优选地，前述粉末包含小于30重量％、更优选地小于20重量％、最优选地小于10重量％的材料，所述材料具有小于10kDa的分子量。
胡萝卜RG-I多糖优选地以分离物的形式掺入产品中，胡萝卜RG-I多糖代表存在于分离物中的果胶多糖的至少20重量％，更优选地至少30重量％，甚至更优选地至少60重量％，并且最优选地80重量％，所述果胶多糖定义具有大于10kDa分子量的并且包含由半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基组成的骨架的任选分支的多糖，所述鼠李糖残基包含在α(1→4)-半乳糖醛酸-α(1→2)-鼠李糖残基中。
本发明通过以下非限制性实施例来进一步说明。
实施例
实施例1
将干燥的胡萝卜果渣(胡萝卜纤维粉末，GreendFields，波兰)(胡萝卜果汁生产的残留物)分散在去离子水(100g/l)中，并使用3种不同的商业酶在实验室规模下进行酶促水解(酶解条件：45℃，120分钟)：
1.来自诺维信公司(Novozymes)的
Figure BDA0002492673940000151
Yield Mash(总分散体的0.02％)
2.来自诺维信公司的
Figure BDA0002492673940000152
Ultra Mash(总分散体的0.02％)
3.来自诺维信公司的
Figure BDA0002492673940000153
Ultra Mash(总分散体的0.05％)
通过在90℃下加热10分钟来终止酶解，之后进行离心并使用具有10kDa截留的膜(Microdyn Nadir；UP010)进行渗析。
通过将干燥的胡萝卜果渣引入水(100g/l)中，将溶液在90℃的温度下保持120分钟，离心，并以与酶解的分散体相同的渗析对上清液进行渗析，来产生参考分离物。
实施例2
实施例1的非水解胡萝卜RG-I多糖(参考)和实施例1的酶促水解的胡萝卜RG-I多糖(样品1至3)的单糖组成如下确定：
使用以下描述的分析方法来确定不同多糖的浓度及其单糖组成：AnalyticalBiochemistry，第207卷，第1期，1992版，第176页(中性糖分析)；以及Mol.Nutr.Food Res.，第61卷，第1期，2017版，1600243(用于糖醛酸分析和分子大小分布)。
单糖分析的结果示于表1中(Rha＝鼠李糖；GalA＝半乳糖醛酸；Ara＝***糖；Gal＝半乳糖。
表1
Figure BDA0002492673940000161
实施例3
使用人外周血单核细胞(PBMC)来确定实施例1的非水解胡萝卜RG-I多糖(参考)和实施例1的酶解胡萝卜RG-I多糖(样品1至3)的免疫调节活性。
免疫调节测定。
为了评估多糖材料对免疫功能的影响，将它们与新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)一起温育。简而言之，使用菲科帕克(Ficoll-plaque)(Amersham)从血沉棕黄层中分离PBMC。将PBMC(2*10E6细胞/mL)在含有300μg RG-I多糖的RPMI培养基(GibcoTMRPMI 1640培养基)中温育20小时(5％CO2，37℃)。随后，收集上清液，并根据制造商的说明，使用在流式细胞仪(BD FACSCANTO II)上测量的珠子阵列(CBA人炎症试剂盒，BD-Bioscience)来测量细胞因子。将RPMI用作阴性对照，并将LPS(来自大肠杆菌-Sigma L3012-5mG)用作参考，将结果以LPS作为100％进行归一化。数据表示为相对于LPS诱导的反应归一化的百分比，是针对4种不同细胞因子及其总和的3个不同供体的平均值。
表2示出免疫调节测定的结果。
表2
样品 TNF IL10 IL6 IL1B 总计
参考文献 23 6 22 17 69
1 200 68 91 81 441
2 367 106 142 214 828
3 435 124 124 150 832
实施例4
使用来自诺维信公司的酶
Figure BDA0002492673940000171
Ultra Mash(条件：总分散体的0.1％w/w，45℃，2小时，酶失活：90℃下10分钟)来按不同规模即在20L(样品1)、5000L(样品2)和10000L(样品3)下重复实施例1。在样品2和3中，代替离心，使用倾析来使固体与液体分离。使用10kDa膜对上清液进行超滤，以去除小分子组分。
使用实施例2中所述的方法来分析水解多糖材料的单糖组成。
分析的结果在表3中示出。
表3
样品 Mol.％Rha Mol.％GalA Mol.％Ara Mol.％Gal [GalA]:[Rha] [Gal]:[Rha] [Ara]:[Rha]
1 17 28 30 22 1.6 1.3 1.7
2 17 23 33 20 1.4 1.2 2.0
3 15 28 29 19 1.8 1.2 1.9
乙酰化和甲基化程度如下确定：用氢氧化钠(0.1M，过夜，20℃)处理多糖样品(2-5mg)。使用配备有DB-WAX ETR柱、Cryo Focus-4冷阱和FID检测(改编自Huisman等人，FoodHydrocolloids，18，4，4，2004，665-668)的顶空GC来测量所释放甲醇。
将样品中和(1M HCl)，然后使用配备有带保护柱和RI检测(改编自Voragen等人，Food Hydrocolloids，1,1,1986,65-70)的Aminex HPX 87H柱的HPLC来对所释放乙酰基进行定量。酯化程度表示为释放的甲醇和乙酸的摩尔量，以糖醛酸的量的百分比表示。
酯化程度分析的结果在表4中示出。
表4
DM％<sup>1</sup> DA％<sup>2</sup> DA:DM
2 16 42 2.6
3 21 36 1.7
1甲基化程度
2乙酰化程度
实施例5
使用如针对实施例3所述的人外周血单核细胞(PBMC)测定确定实施例4的酶促水解胡萝卜RG-I多糖(样品1至3)的免疫调节活性。结果在表5中所示。
表5
TNF IL10 IL6 IL1B 总计
1 131 61 105 72 368
2 181 70 124 136 511
3 107 35 97 72 311
实施例6
实施例4的样品2的水解多糖材料被进一步水解，之后进行高分子量级分的分离。将多糖材料溶解在去离子水(100g/l)中，并进行进一步的酶促水解(来自诺维信公司的
Figure BDA0002492673940000181
Ultra Mash，45℃，14小时)。通过加热至90℃达10分钟来终止酶解。
使用半制备尺寸排阻色谱法将一部分酶解多糖溶液进行分级分离，以产生包含分子量大于70k Da的多糖的级分。
使用针对实施例2所述的方法来分析未分级水解多糖和分离的高分子级分的单糖组成。
分析的结果在表6中示出。
表6
Mol.％Rha Mol.％GalA Mol.％Ara Mol.％Gal [GalA]:[Rha] [Ara]:[Rha] [Gal]:[Rha]
未分级 23 31 14 19 1.3 0.6 0.8
＞70kDa 15 23 17 38 1.5 1.1 2.5
使用实施例3中描述的方法来确定酶解多糖及其高分子级分的免疫调节活性。结果在表7中示出。
表7
14小时酶解 TNF IL10 IL6 IL1B 总计
未分级 295 95 130 158 678
＞70kDa级分 302 112 139 174 726
实施例7
通过将胡萝卜果渣分散在水中(100g/L)来制备水解果胶多糖分离物。
样品1在不添加酶的情况下在90℃下提取120分钟(提取收率：4.8％)
样品2通过添加Rapidase C600(一种含有果胶裂解酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶、纤维素酶和半纤维素酶活性的酶混合物，Militz，H.Wood Sci.Technol.(1993)28:9)在45℃下以1g/100mL总分散液的酶浓度提取120分钟。通过在100℃下加热10分钟来终止酶解(提取收率：5.6％)
随后将两个样品离心(18.000g，10分钟)，并使用截留值为12-14kDa的膜(Visking，伦敦，英国)充分渗析上清液。在超滤/渗滤之后，使用实验室规模的冷冻干燥机将分离物冷冻干燥。
图3显示样品1和样品2的分子大小分布，通过HPSEC并通过折射率检测确定。
使用针对实施例2所述的方法来分析两个样品的单糖组成。分析的结果在表8中示出。
表8
Mol.％Rha Mol.％GalA Mol.％Ara Mol.％Gal [GalA]:[Rha] [Ara]:[Rha] [Gal]:[Rha]
样品1 3.7 47.5 8.0 11.5 12.8 3.1 2.2
样品2 8.4 34.7 7.3 12.2 4.1 1.5 0.9

Claims (15)

1.一种在感染的治疗或预防处理中使用的产品，所述处理包括所述产品的口服给予，其中所述产品选自营养制剂、食物产品、膳食补充剂、饮料和药物产品，所述产品包含具有以下组合特征的胡萝卜RG-I多糖的至少0.1重量％的干物质：
·在10-300kDa的范围内的分子量；
·由半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基组成的骨架，所述鼠李糖残基包含在α(1→4)-半乳糖醛酸-α(1→2)-鼠李糖残基中；
·以下单糖组成：
-20-60mol.％的半乳糖醛酸残基，其中单独的半乳糖醛酸可在C-6位置甲基化和/或在O-2和/或O-3位置乙酰化；
-8-50mol.％的鼠李糖残基；
-0-40mol.％的***糖残基；
-0-45mol.％的半乳糖残基；
-半乳糖醛酸残基与鼠李糖残基的摩尔比为5:1至1:1；
-半乳糖醛酸残基、鼠李糖残基、***糖残基和半乳糖残基一起构成胡萝卜RG-I多糖中单糖残基的至少85mol.％。
2.根据权利要求1所述的使用的产品，其中所述胡萝卜RG-I多糖的甲基化程度不超过50％。
3.根据权利要求1或2所述的使用的产品，其中所述胡萝卜RG-I多糖的乙酰化程度与所述胡萝卜RG-I多糖的甲基化程度之比是1或以上。
4.根据权利要求1所述的使用的多糖，其中所述RG-I多糖中至少10％的末端非还原性半乳糖醛酸残基是不饱和半乳糖醛酸残基。
5.根据前述权利要求中任一项所述使用的产品，其中所述胡萝卜RG-I多糖代表存在于所述产品中的果胶多糖的至少20重量％，所述果胶多糖定义为具有大于10k Da的分子量10％并且包括由半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基组成的骨架的任选分支的多糖，所述鼠李糖残基包含在α(1→4)-半乳糖醛酸-α(1→2)-鼠李糖残基中。
6.根据前述权利要求中任一项所述的使用的产品，其中所述胡萝卜RG-I多糖中***糖残基和半乳糖残基的组合与鼠李糖残基的摩尔比小于5:1，优选地小于4.5:1。
7.根据前述权利要求中任一项所述的使用的产品，其中所述胡萝卜RG-I多糖具有以下单糖组成：
·21-55mol.％的半乳糖醛酸残基，其中单独的半乳糖醛酸可被甲基化和/或乙酰基酯化；
·9-35mol.％的鼠李糖残基；
·5-40mol.％的***糖残基；
·5-40mol.％的半乳糖残基。
8.根据前述权利要求中任一项所述的使用的产品，其中所述胡萝卜RG-I多糖是通过对胡萝卜果胶进行部分酶促水解获得的。
9.根据权利要求8所述的用于在治疗或预防处理中使用的产品，所述使用包括以提供至少200mg的所述胡萝卜RG-I多糖的剂量口服给予所述产品。
10.一种选自营养制剂、食物产品、膳食补充剂、饮料和药物产品的产品，所述产品包含如权利要求1-4和6-8中任一项所述的胡萝卜RG-I多糖的至少0.1重量％的干物质；其中所述胡萝卜RG-I多糖代表存在于所述产品中的果胶多糖的至少20重量％，所述果胶多糖定义为具有大于10kDa的分子量并且包括由半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基组成的骨架的任选分支的多糖，所述鼠李糖残基包含在α(1→4)-半乳糖醛酸-α(1→2)-鼠李糖残基中。
11.一种制备胡萝卜RG-I多糖的方法，所述方法包括：
·从胡萝卜提供果胶分离物，所述分离物包括具有至少15kDa的分子量并且具有由半乳糖醛酸残基和鼠李糖残基组成的骨架的果胶多糖的至少5重量％的干物质，所述鼠李糖残基包含在α(1→4)-半乳糖醛酸-α(1→2)-鼠李糖残基中；
·使用选自果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)、果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)、内聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、外聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67和EC 3.2.1.82)的一种或多种果胶酶部分地水解所述果胶多糖，以及
·对部分水解的果胶多糖进行选自离心、倾析、过滤以及它们的组合的固液分离技术以产生包含部分水解的果胶多糖的液体级分；
·使用具有10至100kDa的截留分子量的超滤膜对所述液体级分进行超滤；以及
·回收包含部分水解的果胶多糖的渗余物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中在使用内聚半乳糖醛酸酶和/或外聚半乳糖醛酸酶的所述部分水解之前或与此同时，使用一种或多种果胶酯酶(EC 3.1.1.11)来水解所述果胶多糖。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中将所述回收的渗余物干燥至小于15重量％的含水量。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中通过所述方法获得的所述胡萝卜RG-I多糖是如权利要求1-8中任一项所述的胡萝卜RG-I多糖。
15.一种制备选自营养制剂、食物产品、膳食补充剂、饮料或药物产品的产品的方法，所述方法包括在其中掺入如权利要求1-8中任一项所述的胡萝卜RG-I多糖的0.1-50重量％的干物质。
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