CN102762597A - 适合调节免疫应答的多糖 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供多糖，其调节免疫应答，并且可以用作可食用产品或药物组合物中的成分。本发明提供获得自物种茶树的此类多糖，其包含鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I核心，其中所述多糖的骨架中半乳糖醛酸残基与鼠李糖基残基的摩尔比接近1:1。本发明还提供包含此类多糖的可食用产品或药物组合物以调节免疫应答。

Description

适合调节免疫应答的多糖
技术领域
本发明涉及一种可以用于调节免疫应答的多糖。本发明还涉及用作药物的所述多糖。本发明还涉及包含所述多糖的可食用产品或药物组合物。本发明还涉及一种制备包含所述多糖的可食用产品或药物组合物的方法。本发明还涉及一种分离所述多糖的方法。
背景技术
西方世界的许多成年人每年患有2-5次感冒，并且婴儿和学龄前儿童甚至每年平均患有4-8次感冒。上呼吸道感染如普通感冒和流感以及胃肠道感染是工作或学校缺勤的最重要的原因。在75年的寿命中，我们平均患有超过200次普通感冒。这意味着，如果每次感冒持续5-7天，我们消耗大约3年的生命在感冒的咳嗽和喷嚏上。因此，消费者亟需这些急性感染的“自我预防”和“自我治疗”。
功能性食品成分领域最近关注使用免疫调节剂来增强宿主防御应答，例如，提供针对普通感冒更强的保护。宿主防御应答最重要的部分是先天免疫***。免疫***的先天武器是针对病原体的快速激活的最早防线。其涉及吞噬细胞和自然杀伤(NK)细胞等。诸如嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞的吞噬细胞可以产生反应性氧物质(ROS)以杀死诸如真菌、细菌和病毒感染的细胞的病原体。NK细胞可以杀死丧失或表达不足量的I类MHC的靶细胞，这在肿瘤细胞或病毒感染的细胞中常见。
据报道一些可食用产品或食品具有免疫刺激性质。例如，US2005/0002962 A1公开了一种植物性物质作为免疫刺激成分的黑色素制品，所述植物性物质例如紫锥花(Echinacea)、西洋参、黑胡桃、绿茶、Partheniumintegrifolium、高丽参、苜蓿芽(alfalfa sprout)、姜、白毛茛、红三叶草、蒲公英、黑升麻、甘草、甘菊、乳薊、苜蓿、马尾、黄芪、雷公根、小白菊、缬草、山楂、迷迭香、锯棕榈、麻黄、保哥果(pau d'arco)、银杏、大蒜、金丝桃(St.John's wort)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus,普通蘑菇)、双孢蘑菇褐种(Agaricus bisporus brown strain,褐蘑菇)、香菇(Lentinus edodes,香菇(shiitake mushroom))或牛肝菌(Boletus edulis,牛肝菌菇)。
WO 2009/071425 A1和WO 2009/080447 A1公开了包含大量分别来自马利筋(Asclepiadoideae)亚科(例如蝴蝶亚仙人掌(hoodia))和葱(Alliaceae)科(例如葱(Allium)属的洋葱和大蒜)的植物的寡糖和/或低分子量糖的组分的免疫刺激效果。
Westereng等人(Mol.Nutr.Food Res.2009,vol.53,p.780-789)描述了提取自白球甘蓝(Brassica oleracea var.Capitata,Bartolo cultivar)的果胶物质的单侧链的释放和表征以及它们的补体结合活性(其在人免疫***中发挥作用)。Westereng等人关注于作为果胶物质在补体结合中发挥活性的要素的侧链，并且该作者表明包含多个侧链的结构元件对于有效的补体结合活性是必需的。果胶物质包含分子量分别为630kDa和40kDa的两种部分，并且在补体结合中是有活性的。多糖的半乳糖醛酸与鼠李糖基残基的平均比为5.7。果胶物质被β-消除降解为一个带电的部分和两个中性的部分，分子量分别为90kDa、17kDa和8kDa。中性部分由β-消除释放的侧链组成，并且17kDa的部分表现出补体结合活性，而8kDa部分则不表现出补体结合活性；90kDa部分未进行测试。显然，基于分子量，大中性部分包含具有至少两个侧链的分子，而小中性部分则仅包含一个侧链。
Sakurai等人(Immunology，1999,vol.97,p.540-547)公开了从草药(柴胡(Bupleurum falcatum L.))制备的果胶多糖部分(称为bupleuran 2IIc)，并口服给予小鼠。所述多糖在中性糖链中包含半乳糖醛酸区域和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(rhamnogalacturonan)核心，并且提示RG核心的侧链对于该多糖的促有丝***活性是重要的。
WO 2001/76609 A1公开了聚半乳糖醛酸作为食物成分的用途。聚半乳糖醛酸通过包含果胶的植物的内聚半乳糖醛酸酶(endopolygalacturonidase)处理制备。聚半乳糖醛酸用作食品中的增粘剂。果胶已知具有有用的生理学效果。
US 6,794,495公开了一种增强免疫***的伸展蛋白和果胶的组合物。伸展蛋白是双子叶植物细胞壁中丰富的富含羟脯氨酸的糖蛋白。
Lau等人(Carbohydrate Research,1985,vol.137,p.111-125)公开了一种RG-I多糖，MW为约200kDa，具有约400个残基的Rha和GalA的交替序列。尚不知侧链的性质，尽管它们包含L-***糖基和D-半乳糖基残基。
US 2003/0159178 A1公开了GalA/Rha比例为~1.3的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I多糖。所述多糖可以源自遗传修饰的番茄，其中所述植物的修饰导致RG-I侧链中减少量的***糖或半乳糖。
EP 1 550 448 A1公开了一种包含果胶的组胺释放抑制剂。
Hansen等人(Journal of AOAC International,2001,vol.84,p.1851-1854)公开了一种分析果胶的方法。
Nergard等人(Carbohydrate Research,2005,vol.340,p.115-130)公开了来自植物Vernonia kotschyana的多糖以及它们对补体结合的作用。
Zhao等人(Food Research International,2006,vol.39,p.917-923)公开了涉及免疫学活性的多糖，尽管其并未指明该多糖的哪一部分涉及免疫应答的调节。
Nakamura等人(Biosci.Biotechnol.Biochem.,2001,vol.65,p.2249-2258)公开了源自大豆的多糖的结构。
Oechslin等人(Carbohydrate Polymers,2003,vol.51,p.301-310)公开了分离自苹果纤维质残余物的RG-I的结构。
发明概述
尽管有现有技术的公开，但是仍然亟需增强人体的天然防御，以对抗可能导致感冒或流感或者使得消费者感觉虚弱或患病的任何其他症状的侵入者。消费者特别关注通过天然存在的化合物或成分，特别是作为普通食品或膳食的一部分来实现这一目的，因为消费者通常不期望仅依赖药物。为了实现这一点，消费者可以摄入一种或多种成分或者可食用产品，其调节所述消费者的免疫应答并提供所需的天然防御。因此，持续需求具有这样的免疫刺激性质的新的或替代性可食用产品，特别是食品。本发明的目的是提供这样的可食用产品，特别是食品。本发明的另一目的是提供可以用于这样的可食用产品或食品的物质，特别是可以用于调节摄入此类物质的人的免疫应答但不会不良地影响所述可食用产品或食品自身的物质。
为了用作可食用产品或食品的成分，所述成分的性质应当是这样的：所述成分可以用于可食用产品或食品而不会不良地影响所述可食用产品或食品的性质。这些性质可以涉及所述成分的感官性质，如味道、风味、气味、颜色。例如，所述成分不应当具有不良的味道或气味，否则消费者会不喜欢可食用产品并且不愿意使用。在另一方面，所述性质还可以涉及用作可食用产品中的成分时所述成分的一些技术方面。对于食物生产商，重要事的是所述成分不负面影响可食用产品或食品的技术性质，例如材质、粘度、均质、乳化以及其他相关性质。
因此，本发明的另一目的是提供一种可以在摄入时调节消费者的免疫应答的成分，并且其不负面地影响可食用产品或食品的性质。例如，本发明的目的是提供一种在可食用产品或食品中使用时不导致增稠效果或仅非常有限地导致增稠效果的成分。本发明的另一目的是提供一种可以在摄入时调节消费者的免疫应答的成分，并且其具有作为乳化剂或稳定剂的技术功能，从而可以省去使用其他乳化剂或稳定剂。
一个或多个这些目的可以通过获得自物种茶树(Camellia sinensis)的植物的多糖来实现，其中所述多糖的骨架包含交替的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I核心和α(1,4)-连接的聚半乳糖醛酸或α(1,4)-连接的低聚半乳糖醛酸核心，其中所述多糖骨架中半乳糖醛酸残基与鼠李糖基残基的摩尔比为2.5:1-1:1，并且所述多糖的分子量为至少70kDa。因此，该多糖中α(1,4)-连接的聚半乳糖醛酸和/或α(1,4)-连接的低聚半乳糖醛酸核心的量非常低。现有技术中的免疫刺激、免疫抑制或免疫调节效果基于各种分子结构，包括小生物碱类型分子和葡聚糖类型多糖或者它们非常不均匀的组合。它们的效果差异很大。本发明提供具有良好表征的活性的良好表征的分离的多糖物质。
本发明的多糖的优势在于其不仅适合于调节免疫应答从而增加消费者针对感冒或流感或类似病症的天然防御，还可以用作可食用产品，更特别地是食品的成分。与标准果胶相比，本发明的多糖的增稠效果仅非常有限。这样，所述成分可以用于各种食品，特别是诸如饮料和汤的液体食品，而不会负面影响这些食品诸如粘性和材质的性质。此外，所述多糖的应用并不限于食品，其还可以用作药物。
因此，在第一方面，本发明提供一种获得自物种茶树的植物的多糖，其中所述多糖的骨架包含交替的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I核心和α(1,4)-连接的聚半乳糖醛酸或α(1,4)-连接的低聚半乳糖醛酸核心，其中所述多糖的骨架中半乳糖醛酸残基与鼠李糖基残基的摩尔比为2.5:1-1:1，并且其中所述多糖的分子量为至少70kDa。本发明的第一方面还提供一种获得自物种茶树的植物的制品，其包含本发明的多糖。
在第二方面，本发明提供用作药物的本发明第一方面的多糖或者包含本发明第一方面的多糖的获得自物种茶树的植物的制品。
在第三方面，本发明提供用作调节免疫应答(优选人的免疫应答)的药物的本发明第一方面的多糖或者包含本发明第一方面的多糖的获得自物种茶树的植物的制品。
在第四方面，本发明提供可食用产品或药物组合物，其包含本发明第一方面的多糖或者包含本发明第一方面的多糖的获得自物种茶树的植物的制品。
在第五方面，本发明提供一种制备包含本发明第一方面的多糖或者包含本发明第一方面的多糖的获得自物种茶树的植物的制品的可食用产品或药物组合物的方法，其中使所述多糖与所述可食用产品或药物组合物的至少一种成分接触。
最后，在第六方面，本发明提供一种分离本发明第一方面的多糖或者包含本发明第一方面的多糖的获得自物种茶树的植物的制品的方法，所述方法包括以下步骤：在20-100°C的温度下、在1-6小时的时间段内制备合适的植物原料的含水提取物以从所述植物原料释放本发明的多糖；然后纯化提取的多糖。
发明详述
除非另外指明，本文中所用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员的通常理解相同的含义。
除非另外指明，所有的百分比指重量百分比。
在本发明的上下文中指定范围的情况下，所指的范围包括所述的终点。
缩写：kDa-千道尔顿；Gal-D-半乳糖；GalA-D-半乳糖醛酸；Rha-L-鼠李糖；Ara-L-***糖；Fuc-L-岩藻糖；Glc-D-葡萄糖；GlcA-D-葡萄糖醛酸。此处指定的这些单体的L-和D-形式也适用于本说明书的其他地方的单体(其可以不是简写而是全称)。
植物原料：在本发明的上下文中，植物原料指源于植物的原料，并且这种原料可源自蔬菜(vegetable)或果实(如厨房或食谱语境中的通常理解)。
联系本发明的第一、二、三、四、五和六方面，本文公开的优选方面还可以应用于本发明的其他方面(已进行必要的修改)。按照需要，本发明的各个方面和实施方案(在下文合适地称为单独的章节)适用于其他章节(已进行必要的修改)。因此，按照需要，在一个章节中指明的特征可以与其他章节中指明的特征组合。本说明书中所述的所有出版物援引加入本文。本发明所述的方法和产品各种修饰和变化对于本领域技术人员是显而易见的，并且不会偏离本发明的范围。尽管根据具体的优选实施方案描述本发明，但是应当理解所要求保护的发明不应当局限于此类具体实施方案。实际上，用于实施本发明的所述模式的各种修饰对于本领域技术人员是显而易见的，并且意图涵盖于本发明的范围内。
免疫应答
本文所用的术语“调节免疫应答”表示调节保护机体免疫***的活性或能力。这可以涉及免疫刺激或免疫抑制。免疫***的主要任务是针对诸如真菌、细菌、病毒、原生动物和寄生虫的病原体提供保护。在该语境中，调节免疫应答优选表示刺激免疫应答。合适地，免疫应答的刺激归因于身体天然防御的增强。在另一方面，免疫***有时产生(mount)针对诸如尘螨、灰尘或花粉的无害物质的免疫应答，从而导致过敏反应。此外，许多生理学病症如高胆固醇血症和肥胖导致低级炎性状态。诸如过敏反应或炎症的异常免疫应答的上下文中的免疫调节表示抑制或抵消超敏免疫应答。本发明不但涉及免疫***的主要任务，还涉及这种第二“异常”免疫应答。
几种测定可用于鉴定可修饰免疫力的组分。本发明人选择使用吞噬细胞和自然杀伤(NK)细胞以辅助鉴定免疫刺激化合物，因为这些细胞是先天免疫***的一部分，并且是针对病原体的快速激活的非特异性第一防线。
诸如嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞的吞噬细胞可产生反应性氧物质(ROS)以杀死诸如真菌和细菌的病原体。成分对吞噬作用活性的效果可通过用FITC标记的大肠杆菌温育的健康人志愿者的新鲜血液来离体测量。粒细胞群体中吞噬细胞的百分比可通过流式细胞术来确定。结果通常标准化为脂多糖(LPS)的效果，脂多糖是一种公知的有效免疫刺激参考化合物。合适地，大于40%的标准化的百分比吞噬粒细胞视为显著的免疫刺激效果。
NK细胞可以杀死丧失或表达不足量的I类MHC的靶细胞，这在肿瘤细胞或病毒感染的细胞中常见。成分对NK细胞活性的效果可以通过分离自健康人志愿者的新鲜血液的外周血单核细胞(PBMC)离体测量。用所述成分预温育PBMC后，通常添加预标记的K562靶细胞，然后进行温育，可以加入碘化丙啶来检测死细胞。死亡的靶细胞的百分比可以通过流式细胞术来确定。结果通常标准化为白介素-2(IL-2)的效果，白介素-2是一种公知的有效NK细胞刺激参考化合物。合适地，大于17%的标准化的%NK细胞活性视为显著的免疫刺激效果。
果胶和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖多糖
果胶是在单子叶植物(单子叶)和双子叶植物(双子叶)的初级细胞壁中发现的胶质多糖的复杂混合物。其特征在于存在鼠李糖基、半乳糖醛酸、***糖基和半乳糖基残基作为主要组分，以及至少间或的木糖基、甘露糖基、葡萄糖基和芹菜糖基残基。通常，果胶由于其胶凝和稠化性质而已知用于果冻、果酱和桔子酱的工业和家庭生产，并且为其增稠和稠化性质而广泛使用。果胶通常认为是聚-D-半乳糖醛酸(同聚半乳糖醛酸，HG)，其中半乳糖醛酸部分经由α(1-4)键连接。半乳糖醛酸残基的羧基可以由甲醇酯化以产生高甲氧基和低甲氧基果胶。甲酯化程度影响果胶的胶凝行为。而且，除了甲酯以外，半乳糖醛酸可以被乙酰化。在羟基2-OH和3-OH位之一被酯化取代以产生乙酸酯的情况下，乙酰化通常防止凝胶形成，但是增加果胶的稳定和乳化效果。果胶多糖为多糖的异质集合，其包含有时存在或不存在的不同量的各种组分，例如(i)同聚半乳糖醛酸(HG)；(ii)木糖半乳糖醛酸聚糖(xylogalacturonan，XGA)；(iii)鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I骨架，其包含***聚糖和***半乳聚糖I和II侧链(RG-I)；以及(iv)鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-II(RG-II)(Ralet et al.,Carbohydrate Research,vol.344,2009,p.1798-1807)。果胶多糖组成和细微结构根据植物来源和所用的提取条件而变化很大。聚-GalA核心的长度可以为约100个连续D-GalA残基。包含侧链的RG-I核心通常称为“分叉区域”或“毛发状区域”，而聚-GalA核心(2个RG-I核心之间)则通常不被寡糖取代。
鼠李糖半乳糖醛酸聚糖为一组紧密联系的细胞壁果胶多糖，其包含重复二糖的骨架：
[→4)-D-GalA-α(1→2)-L-Rha-α(1→]
(其还可以表示为：[-4)-D-GalA-α(1-2)-L-Rha(p)-α(1-])
鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I(RG-I)指30-40个GalA和鼠李糖(Rha)对的重复的区域[Westereng 2009 ibid.]，并且具有可变数目的Rha残基。GalA残基经由1和4位连接至Rha残基，而Rha残基经由异头物和2-OH位连接至GalA残基。通常，约20-80%的Rha残基在4-OH位分支(取决于植物来源和分离方法)，并且具有中性和酸性侧链(或4-OH位)。这些侧链主要由以各种方式连接的Ara和Gal残基组成，构成已知为***半乳聚糖I(AG-I)和/或AG-II的聚合物。AG-I由具有3-OH处的α-L-***糖基基团的取代的β(1,4)-连接的D-Gal骨架组成，Gal骨架可以具有间隔的(interspacing)α(1,5)-L-Ara单元。AG-II由高度分叉的半乳聚糖组成，所述半乳聚糖具有主要是内部的β(1,3)-连接的D-Galp，并且具有短(1,6)-连接的链的外部取代。后者还具有(1,3)-和/或α(1,5)-连接的L-Ara的附着。寡糖侧链可以是线性或支化的，并且这些侧链中的一些可以由α-L-岩藻糖苷、β-D-葡萄糖醛酸苷和4-O-甲基β-D-葡萄糖醛酸基残基终止。
本发明的多糖
在第一方面，本发明提供一种获得自物种茶树的植物的多糖，其中所述多糖的骨架包含交替的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I核心和α(1,4)-连接的聚半乳糖醛酸或α(1,4)-连接的低聚半乳糖醛酸核心，其中所述多糖的骨架中半乳糖醛酸残基与鼠李糖基残基的摩尔比为2.5:1-1:1，并且其中所述多糖的分子量为至少70kDa。
物种茶树，通常称为茶植物，属于茶(Theaceae)科。优选地，所述多糖获得自这种植物的叶子。
半乳糖醛酸残基与鼠李糖基残基的摩尔比指本发明的多糖中存在的半乳糖醛酸的残基总数。因此，这包括存在于连接至Rha残基的RG-I核心中的GalA残基，以及存在于由此连接至其他GalA残基的α(1,4)-连接的聚半乳糖醛酸或α(1,4)-连接的低聚半乳糖醛酸核心中的GalA残基。聚半乳糖醛酸认为是互相连接的至少10个半乳糖醛酸残基的聚合物(的一部分)；低聚半乳糖醛酸认为是互相连接的2-10个半乳糖醛酸残基分子(的一部分)。
例如，如果半乳糖醛酸残基与鼠李糖基残基的摩尔比为2:1，则所述多糖包含每鼠李糖基残基(其存在于RG-I核心中)一个对应的GalA残基(其也存在于连接至Rha残基的RG-I核心中)，以及α(1,4)-连接的聚半乳糖醛酸或α(1,4)-连接的低聚半乳糖醛酸核心中的一个GalA残基。
例如，如果半乳糖醛酸残基与鼠李糖基残基的摩尔比为1:1，则所述多糖包含每鼠李糖基残基(其存在于RG-I核心中)一个对应的α(1,2)-连接的GalA残基(也存在于连接至Rha残基的RG-I核心中)。在这种情况下，所述多糖不包含来自α(1,4)-连接的聚半乳糖醛酸或α(1,4)-连接的低聚半乳糖醛酸核心的GalA残基。
优选地，本发明第一方面的多糖为这样的多糖，其中所述多糖骨架中半乳糖醛酸残基与鼠李糖基残基的摩尔比为2:1-1:1，优选1.5:1-1:1。甚至更优选地，所述多糖骨架中半乳糖醛酸残基与鼠李糖基残基的摩尔比为1.2:1-1:1。在摩尔比为1:1或接近1:1的情况下，所述多糖完全或几乎完全由RG-I核心组成，不含或含很低比例的α(1,4)-连接的聚半乳糖醛酸或α(1,4)-连接的低聚半乳糖醛酸核心。
RG-I核心的长度优选为10-60个二糖单元，其中二糖单元包含鼠李糖基和半乳糖醛酸残基(如上文解释的)。优选地，RG-I核心的长度为20-50、更优选20-40个二糖单元。
本发明的所有聚合物调节免疫应答，优选刺激免疫应答。优选地，随着分子量的增加，免疫应答的调节也随每重量多糖的量增加。本发明的多糖的分子量为至少70kDa。优选地，本发明第一方面的多糖的分子量为70-2,000kDa。本发明的多糖的分子量优选为70-110kDa，更优选110-2,000kDa。合适地，本发明的多糖的分子量为110-1,000kDa，优选110-500kDa或500-1,000kDa。
优选地，本发明的多糖为这样的多糖，其中所述鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I核心包含一个或多个侧链，其中所述一个或多个侧链包含至少一个或多个α(1,5)-连接的***糖基残基的骨架，并且其中所述一个或多个侧链在鼠李糖基残基的4-OH位处进行取代。所述包含α(1,5)-连接的***糖基残基的优选侧链可以是基本上线性或支化的。在侧链主要为线性的情况下，所述侧链主要包含α(1,5)-连接的***糖基残基，其形成所述侧链的骨架。在所述侧链为支化侧链的情况下，一个或多个α-***糖基残基连接至α(1,5)-连接的***聚糖的2-OH和/或3-OH。
所述包含α(1,5)-连接的***糖基残基的优选侧链的优选分子量可以表示为相对数目：***糖基残基的数目与鼠李糖基残基的数目的摩尔比。如果本发明的多糖包含含有α(1,5)-连接的***糖基残基的侧链，则优选地***糖基残基与鼠李糖基残基的摩尔比为50:1-1:2，更优选40:1-1:2，更优选30:1-1:2，更优选20:1-1:2，更优选20:1-1:1，并且更优选20:1-2:1。或者，优选的比例为10:1-1:2，优选6:1-1:2，优选4:1-1:2。
如果存在包含***糖基单体的侧链，则所述侧链的长度(表示为单体单元的数目)优选为1-100个单体单元，更优选1-50个单元，更优选1-30个单元。
本发明的另一优选多糖为这样的多糖，其中所述鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I核心包含一个或多个侧链，其中所述一个或多个侧链包含至少一个或多个β(1,4)-连接的半乳糖基残基的骨架，并且其中所述一个或多个侧链在鼠李糖基残基的4-OH处进行取代。如果本发明的优选多糖包含含有一个或多个β(1,4)-连接的半乳聚糖残基的侧链，则所述侧链主要是线性的未取代的链。优选地，不存在其他半乳聚糖，如β(1,3)-连接的半乳聚糖和/或β(1,6)-连接的半乳聚糖，或者至少基本上不存在其他半乳聚糖，如β(1,3)-连接的半乳聚糖和/或β(1,6)-连接的半乳聚糖，这表示优选地，侧链中存在的小于10摩尔%的半乳聚糖残基为β(1,3)-连接的或β(1,6)-连接的半乳聚糖残基，优选小于5摩尔%，优选小于2摩尔%，优选小于1摩尔%。
包含β(1,4)-连接的半乳聚糖残基的优选侧链的优选分子量可以表示为相对数目：半乳糖基残基的数目与鼠李糖基残基的数目的摩尔比。如果本发明的多糖包含含有β(1,4)-连接的半乳聚糖残基的侧链，则优选地半乳糖基残基与鼠李糖基残基的摩尔比为80:1-1:1，优选60:1-1:1，更优选50:1-1:1，更优选30:1-1:1，更优选20:1-1:1，更优选20:1-2:1，并且更优选20:1-3:1。或者，优选的比例为30:1-1:2，优选25:1-1:1，优选20:1-1:1，优选10:1-2:1，优选6:1-2:1。
如果存在包含半乳糖基单体的侧链，则所述侧链的长度(表示为单体单元的数目)优选为1-100个单体单元，更优选1-50个单元，甚至更优选1-30个单元。
如果本发明的多糖包含侧链，其在鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I核心的鼠李糖基残基的4-OH位置处进行取代，则优选地最多5%的侧链为***半乳聚糖侧链，更优选最多1%的侧链为***半乳聚糖侧链。这应当理解为表示本发明的多糖优选基本上不含***半乳聚糖侧链，更优选不含***半乳聚糖侧链。***半乳聚糖侧链为包含***糖基和半乳糖基残基的侧链。上文已描述***半乳聚糖I (AGI)和AGII。
优选地，本发明多糖的RG-I核心包含侧链，从而至少20摩尔%的鼠李糖基残基在4-OH位置被取代，优选至少30摩尔%，优选至少40摩尔%，优选至少45摩尔%，并且最多90摩尔%，优选最多80摩尔%。
通常，当本发明的多糖溶解时，与标准果胶相比，如果有的话，对液体组合物的粘度或增稠具有小的影响。随着分子量增加，增稠效果优选随单位重量增加，但是这种增稠效果优选仍然很小。优选地，作为增稠剂的效果取决于RG-I核心可能的侧链支化程度和/或平均链长度：随着支化程度增加和/或侧链平均长度增加，增稠效果变小。
本发明的多糖包含单体鼠李糖、半乳糖醛酸的残基，并且如果所述聚合物包含一个或多个侧链，则所述多糖可以还包含***糖和/或半乳糖的残基。此外，所述多糖可以包含少量的单体岩藻糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、木糖和/或糖醛酸的残基。如果存在，这些单体可以，例如终止侧链。在一优选的实施方案中，本发明涉及包含木糖的多糖。
用于确定本发明多糖结构的方法是本领域技术人员已知的。这些方法包括利用1H和13C NMR的分析。
优选地，本发明第一方面的多糖或者包含本发明第一方面的多糖的获得自物种茶树的植物的制品用于调节免疫应答。优选地，本发明的多糖或者包含本发明的多糖的获得自物种茶树的植物的制品适合于调节免疫应答，更优选地适合于刺激免疫应答。优选地，本发明的多糖或者包含本发明的多糖的获得自物种茶树的植物的制品适合于调节动物或人的免疫应答，更优选人的免疫应答。适合于摄入本发明的多糖或所述制品的方法可以是口服摄入，例如通过摄入可食用产品或药物组合物。或者，所述多糖或所述制品可以作为本领域中常见的药物组合物成分摄入。包括人在内的不同动物物种之间的免疫调节效果可能存在差异。本发明的免疫学效果已经利用免疫细胞确立，因此对于人和相关的哺乳动物是最适当的。
所述多糖获得自物种茶树的植物，以提供包含本发明第一方面的多糖的制品。所述制品可以通过下文所述的方法获得。与提取和/或衍生所述多糖的植物原料相比，这样的制品富含本发明的多糖。这样的制品优选包含所述制品0.5重量%-99重量%的多糖。
消耗本发明第一方面的多糖的消费者的生理学免疫应答可以通过所述消费者的吞噬细胞和自然杀伤(NK)细胞活性的离体分析来确定。摄取本发明的多糖时免疫调节应答通常在数小时如2或3小时内发生。所述效果可以持续约24小时或更长。合适地，连续消耗包含本发明的多糖的产品时，例如在连续的天中每天1次或2次，可以刺激并延长免疫应答，并且可以增强消费者对抗流感或感冒的天然防御。
获得优选的免疫应答调节效果所需的本发明的多糖的每日剂量优选为每天1-10,000毫克。更优选的多糖给药剂量为每天5-10,000毫克，优选每天10-10,000毫克，甚至更优选每天10-5,000毫克。更优选的给药剂量为每天10-1,000毫克，并且最优选每天10-500毫克。这个量可以作为每天的单剂量给予，或者作为每天2、3、4、5、6、7、8、9或10个剂量给予。优选地，本发明的多糖的合适量为每天递送1或2个剂量。
用作药物的多糖
在第二方面，本发明提供用作药物的本发明第一方面的多糖或者包含本发明第一方面的多糖的获得自物种茶树的植物的制品。更具体地，本发明第一方面的多糖或者包含本发明第一方面的多糖的获得自物种茶树的植物的制品用于调节免疫应答，优选用于增加免疫应答。这样的药物可以用于治疗患者以从诸如普通感冒的疾病恢复，并且还可以由消费者使用以预防生病或感冒。本发明意义上的药物应当解释为广泛的术语，并且涵盖但不限于处方药、非处方药、柜台药品(overthe counter medicine)、膳食补充剂、膳食食品、临床食品、可食用产品、片剂、胶囊、丸剂和诸如饮料的食品或任何其他合适的食品，以及本领域技术人员通常公知的任何其他组合物。或者，药物可以为可注射物质，或者可吸入物质，如鼻喷剂。
优选地，本发明第一方面的多糖用于疗法或治疗。所述疗法或治疗不仅可以治疗经典意义上的人，这意味着治疗患者以从疾病恢复。治疗还包括预防，这意味着防止消费者生病，或者感冒或流感。本发明提供本发明第一方面的多糖或者包含本发明第一方面的多糖的获得自物种茶树的植物的制品作为药物的用途。本发明提供本发明第一方面的多糖或者包含本发明第一方面的多糖的获得自物种茶树的植物的制品调节免疫应答、优选刺激免疫应答的用途。患有感冒或流感的个体以这种方式可以进行治疗以比不进行治疗更早地恢复，和/或个体以这种方式可以减少患有感冒或流感的机会。本发明提供一种通过给予本发明第一方面的多糖或者通过给予包含本发明第一方面的多糖的获得自物种茶树的植物的制品来治疗感冒或流感的方法。
所述多糖的优选剂量已经在本发明第一方面的上下文中指明，并且也适用于本发明的第二方面。
在第三方面，本发明提供用作调节免疫应答的药物的本发明第一方面的多糖或者包含本发明第一方面的多糖的获得自物种茶树的植物的制品。这种用途优选地涉及调节人的免疫应答，或者还可以涉及兽医用途，从而调节动物的免疫应答，优选哺乳动物。优选地，本发明第一方面的多糖用作刺激人或动物的免疫应答的药物，更优选刺激人的免疫应答。
本发明第一方面的多糖或者包含本发明第一方面的多糖的获得自物种茶树的植物的制品适合用作调节免疫应答的药物，优选人的免疫应答。优选地，所述多糖适合用作调节动物的免疫应答的药物，优选哺乳动物，从而用于兽医用途。优选地，摄入所述药物使得刺激免疫应答，这意味着免疫***被增强，并且能够更好地使得动物或人体防御不期望的侵入者。这样的药物可以用于治疗动物或人以从诸如普通感冒的疾病恢复，并且使得动物或人预防生病或感冒。
优选地，本发明提供本发明第一方面的多糖或者包含本发明第一方面的多糖的获得自物种茶树的植物的制品在制备用于调节动物或人、优选人的免疫应答的药物中的用途。优选地，本发明提供本发明第一方面的多糖或者包含本发明第一方面的多糖的获得自物种茶树的植物的制品在制备用于刺激动物或人、优选人的免疫应答的药物中的用途。
所述多糖的优选剂量已经在本发明第一方面的上下文中指明，并且也适用于本发明的第三方面。
公众中期望增强人体的天然防御，以对抗可能导致感冒或流感或者使得消费者感觉虚弱或患病的任何其他症状的侵入者。本发明优选地涉及保护a)口和喉免于例如局部和/或呼吸或中耳感染，和/或b)胃肠道免于胃肠道感染。所述感染通常由病毒或细菌引起。对于存在针对这类病原体的次优免疫防御的个体特别相关，例如由于受损的NK细胞功能。受损的NK细胞功能与增加的对这类普通感染的易感性有关，这充分提现在老年个体以及经历生理(如剧烈运动、劳动班次、睡眠剥夺)或心理(如考试压力、准备婚礼、亲人丧故、担忧长期患病的亲人)压力的个体。
本发明涉及需要调节免疫应答性的个体的预防。本发明特别地适合于增强对具有由年龄、饮食或生活方式相关的免疫功能受损而导致的(部分)次优免疫应答性的个体中的病原体或抗原的免疫应答。本发明所述的结构的应用可以用于使它们的免疫***上升为适当的应答，从而增加个体对普通感染的抵抗、增强他们对疫苗的应答、以及在其他应用中减少炎性和/或过敏状况。
优选地，本发明的多糖或者包含本发明第一方面的多糖的获得自物种茶树的植物的制品用作疫苗的佐剂。优选地，本发明的多糖用作疫苗的佐剂。目前使用的大部分疫苗利用死亡或减毒的微生物或微生物片段来刺激针对同源感染物质的保护性免疫应答。然而，利用化学和重组技术，与制备常规疫苗有关的问题使得开发更受限的合成抗原。这些自身受限的抗原具有较低的效力和免疫原性，并且通常需要与佐剂组合以形成有效的疫苗。佐剂是刺激免疫***并增强对抗原的应答但自身不具有特异性抗原效果的物质(M.Singh(ed.),Vaccine adjuvants and delivery systems,Wiley-Interscience 2007)。本发明的多糖可以与疫苗中的特异性抗原组合以增强针对所述抗原的免疫应答，从而改进所述疫苗的功能性。对于这种用途，疫苗的抗原性物质与一定量的本发明的多糖组合，所述多糖刺激引发针对特定抗原的特异的适应性免疫应答而不诱导明显的不良应答。可以向疫苗加入本领域确认的其他添加剂，例如充当载体、贮库或防腐剂。本发明的多糖可以用于兽医或人用的疫苗，或者用于不同施用途径的疫苗，包括注射的疫苗(如白喉、百日咳、破伤风、脊髓灰质炎、天花、流感和肺炎球菌多糖)、口服施用的疫苗(如脊髓灰质炎、轮状病毒)或者经鼻施用的疫苗(如流感)。
本发明表明，本发明的物质在免疫调节、优选免疫刺激方面活性很高。本发明表明，取决于所选的方法，以下浓度的新多糖对于人免疫细胞是有活性的(特别是在例如吞噬或NK细胞活化的情况下)：300微克/毫升或更低，更优选100微克/毫升或更低，更优选50微克/毫升或更低，更优选30微克/毫升或更低，甚至更优选10微克/毫升或更低，甚至更优选3.0微克/毫升或更低，甚至更优选1.0微克/毫升或更低，甚至更优选0.3微克/毫升或更低。
可食用产品或药物组合物
在第四方面，本发明提供一种可食用产品或药物组合物，其包含本发明第一方面的多糖或者包含本发明第一方面的多糖的获得自物种茶树的植物的制品。优选地，通过任何合适的方法摄入时，所述可食用产品或药物组合物适合于调节免疫应答，更优选地适合于刺激免疫应答。
取决于特定可食用产品或药物组合物，本发明的可食用产品或药物组合物优选包括本发明第四方面的可食用产品或药物组合物，其包含0.0001-25重量%的所述多糖，更优选0.0002-10重量%。优选地，本发明的组合物中多糖的浓度为0.5%-10重量%，优选1重量%-10重量%，更优选2重量%-10重量%，更优选3重量%-10重量%，更优选4重量%-10重量%，并且最优选5重量%-9重量%。本发明的多糖可以其天然形式存在于可食用产品或药物组合物中，这意味着作为用于所述可食用产品或药物组合物的组分。然而优选地，所述可食用产品或药物组合物富含本发明的多糖。这不仅表示所述多糖可能以其作为植物原料组分的天然形式存在，而且所述多糖可以作为成分加入所述可食用产品或药物组合物。所述多糖可以纯的形式或者作为富含所述多糖的提取物的一部分或者以任何其他合适的形式加入。因此，优选地本发明的可食用产品或药物组合物包含0.0001-25重量%的所述多糖，其中至少一部分所述多糖以富集形式加入所述可食用产品或药物组合物。优选地，本发明的组合物中多糖的浓度为0.5重量%-10重量%，优选1重量%-10重量%，更优选2重量%-10重量%，更优选3重量%-10重量%，更优选4重量%-10重量%，并且最优选5重量%-9重量%，其中至少一部分多糖以富集形式加入所述可食用产品或药物组合物。本发明的多糖可以特定的盐形式加入所述可食用产品或药物组合物。
本发明的可食用产品可采用任何物理形式。特别地，其可以为食品、饮料、膳食食品或临床食品。其还可以为饮料、片剂、胶囊或膳食补充剂的任何其他合适形式的膳食补充剂。本发明的多糖所加入的优选可食用产品为诸如汤或饮料的液体、酱(spread)、调料、甜点或面包的形式。如果优选的可食用产品为汤，则其可以为液体汤，或者可以由消费者加入热水的汤粉(dried汤)。可食用产品可以为液体或可涂抹形式，其可以为可用汤匙舀取(spoonable)的固体或软固体产品，或者其可以为食品补充剂。优选地，可食用产品为液体产品。可食用产品可以合适地采用例如汤、饮料、酱、调料、甜点、面包的形式。更优选地，可食用产品为饮料、甜点或酱。更优选地，可食用产品为饮料或酱，特别是水包油乳液或油包水乳液形式的酱。本文所用的术语“酱”涵盖可涂抹产品，如人造奶油、轻人造奶油、可涂抹的基于奶酪的产品、加工的奶酪、乳制品酱和乳制品替代(dairy-alternative)酱。本文所用的酱(水包油或油包水乳液)的油和/或脂肪的浓度可以为约5重量%-85重量%，优选10重量%-80重量%，更优选20重量%-70重量%。优选地，油和/或脂肪为植物来源(例如但不限于葵花油、棕榈油、油菜籽油)；所述组合物中还可以包含非植物来源的油和/或脂肪(例如但不限于乳脂肪、鱼油)。
最优选地，所述产品为饮料。这样的饮料通常包含至少60重量%的水和0-20重量%的分散的油或脂肪。优选地，这样的饮料包含至少70重量%的水和0-10重量%的分散的油或脂肪。
本发明语境中的调料通常为水包油乳液，其可以包含0.1-85%的油和/或脂肪。蛋黄酱是本发明语境中调料的实例。本文所用的调料(水包油乳液)的油和/或脂肪的浓度可以为约50.1-85重量%，优选5重量%-80重量%，更优选10重量%-70重量%。优选地，油和/或脂肪为植物来源(例如但不限于葵花油、棕榈油、油菜籽油)；所述组合物中还可以包含非植物来源的油和/或脂肪(例如但不限于乳脂肪、鱼油)。
本发明语境中的药物组合物涵盖但不限于处方药、非处方药、柜台药品、膳食补充剂、膳食食品、临床食品、可食用产品、片剂、胶囊、丸剂和诸如饮料的食品或任何其他合适的食品，以及本领域技术人员通常公知的任何其他组合物。或者，药物可以为可注射物质，或者可吸入物质，如鼻喷剂。在药物组合物的情况下，所述组合物可以包含大于25重量%、优选大于30重量%、优选大于40重量%、或者优选大于大于50重量%、或者优选甚至大于75重量%的本发明的多糖。
适合于本发明的可食用产品可以为任何食品，包括饮料、膳食食品和临床食品。本发明的多糖的浓度应当为这样的，以规律的量消耗所述食品后发生免疫应答的调节。规律的量为平均消费者在特定的消耗时刻消耗此类食品的量。
上文已指出本发明第一方面的多糖的优选每日剂量，并且其还适用于本发明的第四方面。可食用产品中所需的多糖浓度取决于特定的可食用产品以及此类产品的通常消耗量。优选地，将本发明的多糖加入通常以预定量消耗的可食用产品。例如，压块干粮(cereal bar)通常为单块包装，并且也单块消耗。这样的块通常的重量为40-80克。类似地，小奶杯(dairy mini-drink)由小瓶消耗，体积为约100毫升。
通过在这样的食品中加入多糖，原则上可以控制多糖的每日摄入。优选地，以每天1或2个剂量向消费者递送多糖。本领域技术人员能够计算优选食品的可食用产品的单位量中多糖的所需浓度。
食品的单位量为通常以单份消耗的食品的量。这样的食品的单位量或份量取决于具体的产品。通常的份大小的一些非限制性实例为：
乳、酸奶：200mL
天然奶酪：43gram
加工的奶酪：57gram
果汁：177mL
软饮料：200mL
面包：1片，35gram
咖啡：125mL
茶：150mL
压块干粮，糖块：50gram
巧克力：30gram
冰淇淋：100mL
酱：15gram
汤：250mL
可可饮料：200mL
本发明语境中食品的单位量可以作为单个部分包装并销售。例如，冰淇淋可以包装为独立单位，从而使得这样的独立部分成为本发明语境中的单位量。这样的独立包装的产品的实际重量或体积可高于或低于上文给出的标准份大小。例如，益生乳饮料由小瓶消耗，独立包装，体积为约100mL。获得自各种物种的多糖的组合
此外，本发明的范围包括包含本发明第一方面的获得自物种茶树的植物的多糖的可食用产品或药物组合物或者包含本发明第一方面的多糖的获得自物种茶树的植物的制品，以及与获得自其他物种的一种或多种多糖的组合。因此，本发明提供一种可食用产品或药物组合物，其包含本发明第一方面的多糖，以及额外的获得自一种或多种其他植物原料的多糖。优选地，植物原料属于以下科：
-伞形科(Apiaceae)，优选选自物种香芹(Petroselinum crispum)、旱芹(Apium graveolens)、美国防风草(Pastinaca sativa)和胡萝卜(Daucus carota)组成的组；和/或
-蝶形花科(Fabaceae)，优选来自物种大豆(Glycine max)的植物；和/或
-蔷薇科(Rosaceae)，优选来自物种苹果(Malus domestica)的植物；和/或
-藜科(Chenopodiaceae)，优选来自物种甜菜(Beta vulgaris L.)的植物；和/或
-菊科(Asteraceae)，优选来自物种菊芋(Helianthus tuberosus)的植物。来自伞形科的多糖
除了本发明第一方面的多糖，优选地，本发明第四方面的可食用产品或药物组合物包含可获得自属于伞形科的一种或多种植物的多糖，优选可获得自物种胡萝卜的植物。或者，所述多糖可获得自由香芹、旱芹、美国防风草和胡萝卜组成的物种的组。这些物种的组合也是可以的。最优选地，所述多糖可获得自物种胡萝卜(Daucus carota subsp.sativus)。最优选地，所述多糖获得自物种胡萝卜的根。
伞形科的许多植物是可食用的。来自这个科的属的实例为胡萝卜属(Daucus)、白芷属(Angelica)和柴胡属(Bupleurum)。胡萝卜属广为人知的物种为栽培的胡萝卜、胡萝卜。白芷属为约60种两年生和多年生草本植物的属，并且目前主要在医药上用于支气管和消化问题。柴胡属为大属，包含约190种物种。
优选地，所述多糖可获得自物种香芹，其已知为草本植物西芹。这个物种属于伞形科。在一优选实施方案中，所述多糖可获得自物种根用香芹(Petroselinum crispum var.tuberosum)，其已知为传统食物一个实例的汉堡使用的西芹。
在另一优选实施方案中，所述多糖可获得自物种旱芹的植物。这个物种属于伞形科。特别优选的是可获得自已知为块芹菜的物种根芹菜(Apiumgraveolens var.rapaceum)的多糖。这种根用植物(root vegetable)也是传统食品的实例。特别优选地，所述多糖可获得自植物根芹菜的根。
在另一优选实施方案中，所述多糖可获得自物种美国防风草的植物。这个物种属于伞形科。特别优选的是可获得自已知为欧洲防风的物种美洲防风(Pastinaca sativa subsp.sativa)的多糖。这种根用植物也是传统食品的实例。特别优选地，所述多糖可获得自植物美洲防风的根。
在另一优选实施方案中，所述多糖可获得自物种胡萝卜的植物。这个物种属于伞形科，并且这个物种包括野胡萝卜，其根是可食用的。更优选地，所述多糖可获得自物种胡萝卜，其通常称为栽培的胡萝卜。胡萝卜是公知的根用植物，通常为橙色、红色、紫色、白色或黄色。
当本发明的可食用产品或药物组合物包含可获得自物种胡萝卜、更优选物种胡萝卜的根(来自胡萝卜)的多糖时，所述多糖的骨架中半乳糖醛酸残基与鼠李糖基残基的摩尔比为1.5:1-1:1，优选1.2:1-1:1。
优选地，所述多糖的分子量为至少110kDa，最优选110-2,000kDa。
优选地，本发明的多糖可获得自胡萝卜，包含连接至鼠李糖基残基的4-OH位置的侧链，其中所述侧链包含***糖基残基，并且其中所述多糖的***糖基残基与鼠李糖基残基的摩尔比为50:1-5:1，更优选30:1-5:1，最优选20:1-5:1。
优选地，本发明的多糖可获得自胡萝卜，包含连接至鼠李糖基残基的4-OH位置的侧链，其中所述侧链包含半乳糖基残基，并且其中所述多糖的半乳糖基残基与鼠李糖基残基的摩尔比为50:1-5:1，更优选30:1-5:1，最优选20:1-5:1。
优选地，侧链的数目是这样的：鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I核心的至少40摩尔%的鼠李糖基残基是被取代的，优选至少50摩尔%，并且优选最多90摩尔%，更优选最多80摩尔%。
在另一优选实施方案中，当本发明的可食用产品或药物组合物包含可获得自物种胡萝卜的根(来自胡萝卜)的多糖时，所述多糖的骨架中半乳糖醛酸残基与鼠李糖基残基的摩尔比可以为25:1-1:1，优选20:1-1:1，更优选20:1-10:1。
在这种情况下，优选地所述多糖的分子量为70-110kDa。
而且，所述可获得自胡萝卜的多糖包含连接至鼠李糖基残基的4-OH位置的侧链，其中所述侧链包含***糖基残基，并且所述多糖的***糖基残基与鼠李糖基残基的摩尔比为20:1-2:1，更优选15:1-3:1，最优选14:1-7:1。而且，所述可获得自胡萝卜的多糖优选地包含连接至鼠李糖基残基的4-OH位置的侧链，其中所述侧链包含半乳糖基残基，并且其中所述多糖的半乳糖基残基与鼠李糖基残基的摩尔比为20:1-2:1，优选15:1-3:1，最优选10:1-3:1。
优选地，侧链的数目是这样的：鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I核心的至少50摩尔%的鼠李糖基残基是被取代的，优选至少60摩尔%，并且优选最多90摩尔%，更优选最多80摩尔%。
来自蝶形花科的多糖
在另一优选实施方案中，本发明提供本发明第四方面的可食用产品或药物组合物，其包含本发明第一方面的多糖，以及额外的获得自属于蝶形花科的一种或多种植物的多糖，优选获得自物种大豆，其通常称为大豆(soya)。最优选地，所述多糖可获得自大豆(soyabean)。
当本发明的可食用产品或药物组合物包含可获得自大豆、更优选大豆(soyabean)的多糖时，所述多糖的骨架中半乳糖醛酸残基与鼠李糖基残基的摩尔比为1.5:1-1:1，更优选1.2:1-1:1。
优选地，所述多糖的分子量为70-2000kDa，更优选70-110kDa，更优选至少110kDa，最优选110-2,000kDa。
优选地，本发明的多糖可获得自大豆，包含连接至鼠李糖基残基的4-OH位置的侧链，其中所述侧链包含***糖基残基，并且其中所述多糖的***糖基残基与鼠李糖基残基的摩尔比为50:1-1:2，更优选40:1-1:1，并且更优选30:1-2:1，更优选25:1-3:1。
优选地，本发明的多糖获得自大豆，包含连接至鼠李糖基残基的4-OH位置的侧链，其中所述侧链包含半乳糖基残基，并且其中所述多糖的半乳糖基残基与鼠李糖基残基的摩尔比为70:1-1:2，更优选60:1-1:1，并且更优选50:1-2:1，更优选40:1-5:1。
优选地，侧链的数目是这样的：鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I核心的至少40摩尔%的鼠李糖基残基是被取代的，优选至少50摩尔%，并且优选最多90摩尔%，更优选最多80摩尔%。
来自蔷薇科的多糖
在另一优选实施方案中，本发明提供第四方面的可食用产品或药物组合物，其包含本发明第一方面的多糖，以及额外的获得自属于蔷薇科的一种或多种植物的多糖，优选地获得自物种苹果，其通常称为苹果(apple)。最优选地，所述多糖可获得自通常称为苹果(apple)的物种苹果的果实。
当本发明的可食用产品或药物组合物包含可获得自物种苹果、更优选苹果(apple)的多糖时，所述多糖的骨架中半乳糖醛酸残基与鼠李糖基残基的摩尔比为1.5:1-1:1，优选1.2:1-1:1。
优选地，所述多糖的分子量为70-2,000kDa，优选70-110kDa，优选110-2,000kDa。
优选地，本发明的多糖可获得自苹果，包含连接至鼠李糖基残基的4-OH位置的侧链，其中所述侧链包含***糖基残基，并且其中所述多糖的***糖基残基与鼠李糖基残基的摩尔比为10:1-1:2，优选5:1-1:2。
优选地，本发明的多糖可获得自苹果，包含连接至鼠李糖基残基的4-OH位置的侧链，其中所述侧链包含半乳糖基残基，并且所述多糖的半乳糖基残基与鼠李糖基残基的摩尔比为10:1-1:2，优选5:1-1:1。
优选地，侧链的数目是这样的：鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I核心的至少50摩尔%的鼠李糖基残基是被取代的，优选至少60摩尔%，并且优选最多90摩尔%，更优选最多80摩尔%。
来自藜科的多糖
在另一优选实施方案中，本发明提供本发明第四方面的可食用产品或药物组合物，其包含本发明第一方面的多糖，以及额外的获得自属于藜科的一种或多种植物的多糖，优选获得自物种甜菜。最优选地，所述多糖可获得自通常称为甜菜(sugar beet)物种甜菜的根。
当本发明的可食用产品或药物组合物包含可获得自物种甜菜、更优选甜菜(sugar beet)的根的多糖时，所述多糖的骨架中半乳糖醛酸残基与鼠李糖基残基的摩尔比为1.5:1-1:1，优选1.2:1-1:1。
优选地，所述多糖的分子量为至少110kDa，更优选110-2,000kDa。
优选地，本发明的多糖可以获得自甜菜，包含连接至鼠李糖基残基的4-OH位置的侧链，其中所述侧链包含***糖基残基，并且其中所述多糖的***糖基残基与鼠李糖基残基的摩尔比为50:1-1:2，优选40:1-1:1，更优选35:1-5:1。
优选地，本发明的多糖可获得自甜菜，包含连接至鼠李糖基残基的4-OH位置的侧链，其中所述侧链包含半乳糖基残基，并且其中所述多糖的半乳糖基残基与鼠李糖基残基的摩尔比为10:1-1:2，优选5:1-1:1。
优选地，侧链的数目是这样的：鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I核心的至少40摩尔%的鼠李糖基残基是被取代的，优选至少50摩尔%，并且优选最多90摩尔%，更优选最多80摩尔%。
来自菊科的多糖
在另一优选实施方案中，本发明提供本发明第四方面的可食用产品或药物组合物，其包含本发明第一方面的多糖，以及额外的获得自属于菊科的一种或多种植物的多糖，优选获得自物种菊芋的植物。这种优选的物种又称为洋姜或菊芋(topinambur)。
本发明的优选食品可以是干燥的，并且包含小于组合物40重量%的水，优选小于25重量%，更优选1-15重量%。或者，食品可以是大量含水的，并且包含至少组合物40重量%的水，优选至少50重量%，更优选65-99.9重量%。
优选地，食品包含营养物，包括碳水化合物(包括糖和/或淀粉)、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质、植物营养物(包括萜、酚化合物、有机硫化合物或其混合物)或其混合物。蛋白质物质的来源不受限制，并且例如可以来自乳品来源(如酪蛋白、乳球蛋白)，或植物来源(如大豆、豌豆等)。食品可以是低热量的(例如能量含量小于100kCal/100克组合物)，或者可以具有高热量含量(例如能量含量大于100kCal/100克组合物，优选150-1000kCal)。食品还可以包含盐、调味剂、着色剂、防腐剂、抗氧化剂、非营养甜味剂或其混合物。合适的维生素和矿物质包括但不限于维生素A、维生素D、维生素E、维生素C、硫胺、核黄素、烟酸、维生素B6、叶酸、维生素B12(氰钴胺)、生物素、泛酸、钙、磷、钾、铁、锌、铜、碘、硒、钠、镁、锰、钼、维生素K、铬及其混合物。递送维生素和矿物质的优选成分包括但不限于硫酸钾、磷酸钙、氧化镁、磷酸抗坏血酸镁、抗坏血酸钠、乙酸维生素E、烟酰胺、正磷酸铁、泛酸钙、氧化锌、葡糖酸锌、棕榈酸维生素A、盐酸吡哆醇、核黄素、单硝酸硫胺、生物素、叶酸、氯化铬、碘化钾、钼酸钠、硒酸钠、叶绿醌(维生素K)、胆钙化醇(维生素D3)、硫酸锰及其混合物。优选地，本发明的产品包含至少10%或更多的每日推荐量(‘RDA’)的维生素和矿物质。
本发明的产品还可以包含肉、鱼、肉和鱼提取物、水果、干果、水果浓缩物、水果提取物、果汁、茶(如绿茶)、植物、植物提取物和浓缩物、坚果、坚果提取物、巧克力、面包、醋、盐、辣椒、可可粉、草本植物(如西芹)、草本植物提取物、香料(如桂皮)、香料提取物、乳化剂、酸度调节剂(如磷酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸及其盐)、类黄酮、防腐剂(如乳酸、EDTA、生育酚、苯甲酸钠)、着色剂(如β胡萝卜素、番茄红素、焦糖、胭脂红)、纤维(如大豆)、膨松剂(碳酸氢钠)、果胶、柠檬酸、酵母、盐、甘油及其混合物。
本发明的可食用产品或药物组合物可以通过本领域技术人员常见的任何方法来制备。因此，在第五方面，本发明提供一种制备可食用产品或药物组合物的方法，所述可食用产品或药物组合物包含本发明第一方面的多糖或者包含本发明第一方面的多糖的获得自物种茶树的植物的制品，其中使所述多糖与所述可食用产品或药物组合物的至少一种成分接触。
本发明的多糖或者包含本发明第一方面的多糖的获得自物种茶树的植物的制品可以通过使纯的形式的多糖与可食用产品或药物组合物的其他成分接触来加入所述可食用产品或药物组合物。另外或可选地，可以使包含本发明的多糖的植物原料与可食用产品或药物组合物的其他成分接触。这些步骤可以在生产过程的任何阶段进行。例如，可以将所述多糖混合入制备的或接近制备的可食用产品或药物组合物，或者可以使其与成分接触，随后将所述成分混合并制备可食用产品或药物组合物。
分离多糖的方法
最后，在第六方面，本发明提供以一种分离本发明第一方面的多糖或者包含本发明第一方面的多糖的获得自物种茶树的植物的制品的方法，所述方法包括以下步骤：
1.在20-100°C的温度下，在1-6小时的时间内，制备合适的植物原料的含水提取物以从所述植物原料释放本发明的多糖；
2.纯化提取的本发明的第一方面的多糖。
本发明的这个方面提供一种获得可以用于调节免疫应答的多糖的方法。
在本发明的第六方面的第一步骤中，在20-100°C的温度下，于1-6小时的时间内，制备合适的植物原料的含水提取物以从所述植物原料释放多糖。优选地，在此温度期间的压力为大气压，表示海平面约101,325巴。压力的自然变化可以由于天气条件而发生，海拔高度可以变化，并且在本发明的范围内。在大气压下，优选使用温度为20-100°C的至少三倍量的水(w/w)来用水提取植物原料以制备含水提取物。优选地，进行提取时的温度为至少60°C，优选至少70°C，更优选至少80°C，并且最优选至少90°C。提取可以在至少1小时、优选至少1.5小时、更优选至少2小时的时间内进行。提取时间最大为6小时，更优选最大5小时。优选地，提取在水的沸点温度下进行，这意味着大气压下约100°C。提取还可以在高于大气压的压力下进行，这可能使得减少提取时间。较高温度的优势在于比较低温度更快地提取多糖。在另一方面，为了避免不期望的副作用，进行反应的压力优选最大为大气压。此外，从约70°C的温度起，存在于植物原料中的内源酶通常是失活的，这意味着这些酶不再产生任何活性。
为了获得植物原料，本发明的方法优选还包含收获植物和/或植物器官的步骤，其中所述植物和/或植物器官包含本发明第一方面的多糖。在另一步骤中，优选将收获的植物或植物器官研磨或切成部分以优化提取过程。可以在提取前将植物原料干燥；其还可以天然形式(即未干燥)进行所述过程。
六种主要的植物部分(在植物学领域)为根、茎、叶、花、果实和种子。以下的植物器官是适合于本发明的器官的实例：叶(定义为植物特化为光合作用的器官)，包括针叶；花和头状花序；芽；种子；荚；果实；块状茎和根；以及茎。
适合作为提取本发明额外的多糖的起始原料的植物包括任何植物，但是如通过通用术语“水果和蔬菜”所描述的，特别优选可食用的植物或植物器官。蔬菜是一种培养可食用部分的植物，例如甜菜的根、菠菜的叶或花椰菜或花菜的花芽。蔬菜通常视为任何可口或甜度较低的植物产品。通常，在烹饪语境中，术语蔬菜不包括甜果实、种子、坚果、谷物以及草本植物和香料。水果的定义取决于该术语用于烹饪或生物学(或植物学)领域。在烹饪领域，水果通常为甜味的植物生殖器官，如苹果或草莓。一些植物学含义的水果在烹饪领域视为蔬菜，因为它们不甜(或甜度较低)，例如黄瓜和番茄。
上文指出特别适合用作本发明额外的多糖的原料的植物和/或植物原料。可能包含本发明的多糖的植物的器官取决于作用所述多糖的来源的实际物种。这些器官可以是物种的任何部分，例如叶(定义为植物特化为光合作用的器官)，包括针叶；花和头状花序；芽；种子；荚；果实；浆果；块状茎和根；以及茎，包括树皮。例如，优选物种的以下器官优选作为本发明额外的多糖的来源：
-胡萝卜：根；
-大豆：豆，其为种子；
-苹果：果实，特别是果实的皮；
-甜菜：根；
-菊芋：块状茎。
通常，基于植物的多糖由大的不溶性聚合物，如细胞壁组分；小的可溶性寡糖，如单体(如葡萄糖)和二聚体(如纤维二糖)；以及大的可溶性多糖组成。因此，优选地在制备含水提取物之前，使植物原料与醇或任何其他合适的有机溶剂接触，其中所述醇优选包括乙醇。通过这个任选步骤，除去小的有机分子，如单糖和二糖；小的有机酸及它们的盐；氨基酸及寡肽；多酚；促成颜色的分子，如类胡萝卜素、花青素和叶绿素；以及脂肪物质，如甘油酯、胆碱、磷脂和类固醇，从而增加不溶于所述溶剂的植物中多糖的相对含量。
优选地，这个任选步骤在60°C-80°C的温度下，在15分钟-5小时(优选1-3小时)，优选在大气压下进行。在这个溶剂提取过程中不溶解的固体残留物通过任何合适的方法从液体分离，例如过滤或离心。这个分离步骤之后剩余的固体包含所关注的多糖。任选地，可以进行第二提取步骤，其中使第一醇提取后获得的固体原料与醇或任何其他合适的有机溶剂(优选包含乙醇)接触。这个任选的第二溶剂提取步骤的条件优选地与第一溶剂提取步骤类似。例如，这两个任选步骤通过使植物原料与水中的85%乙醇在80°C下，于2.5小时内在大气压下接触。
优选地将不溶于溶剂的植物原料从所述溶剂分离，例如通过过滤和/或离心。然后，将这种固体原料用作本发明方法含水提取步骤中的多糖原料。
含水提取后获得的提取物包含本发明的多糖。一些固体物质也可以存在于提取物中，并且这种固体物质可以通过任何合适的分离方法从所述提取物分离，例如过滤或离心。任选地，随后再次用水提取固体残留物。合适地，这个第二步骤的提取条件与第一含水提取步骤相同。
任选地，可以将两种或更多种含水提取物混合以获得包含本发明的多糖的单一提取物。任选地对提取物进行渗析步骤以除去分子量小于10kDa的小分子。第一步骤后获得的提取物适合用于调节免疫***。任选地，可以通过用活性炭处理提取物来吸收有色化合物从而除去所述有色化合物。
为了检查多糖的分离的成功，可以利用Dubois方法来测定碳水化合物的总含量(Dubois,Analytical Chemistry，vol.28,1956,p.350-356)。小寡糖除去的成功最初的判断可以通过聚合的平均程度(DP值)来获得，其通过比较碳水化合物还原末端基团的分析结果(DNSA方法)与通过Dubois方法测定的总碳水化合物含量来确定。成功除去小寡糖(例如单糖和二糖)获得高平均DP值(例如，至少高于2)。更准确的方式是通过尺寸排阻色谱测定富集的提取物的分子量分布。
在本发明第六方面的方法的第二步骤中，将提取的本发明第一方面的多糖纯化。优选地，此分离包括两个进一步的纯化步骤：首先分离提取物中的酸性化合物与非酸性化合物，以及将酸性化合物分离为具有不同分子量的组分的第二任选步骤，以获得分子量为至少70kDa、优选至少110kDa、优选最大2,000kDa的本发明第一方面的多糖。
在任选的第一纯化步骤中，首先分离酸性组分与非酸性化合物。本发明的多糖包含RG-I核心中的半乳糖醛酸残基，并且这些残基使得本发明的多糖为酸性。可以利用离子交换来分离酸性组分与非酸性组分。非酸性组分可以例如包含中性多糖，例如淀粉。随后，例如通过凝胶过滤，将酸性组分分离为具有不同分子量的化合物。分子量的分离截止值为70kDa，这表示仅保留分子量为至少70kDa的分子。优选地，截止为分子量为至少110kDa，优选最大2,000kDa。所得的物质为本发明第一方面的多糖。还可以制备其他组分，例如分子量为70-110kDa以及大于110kDa的化合物的组分。离子交换和凝胶过滤所要求的条件是本领域技术人员已知的。
优选地，对于离子交换，将阴离子交换材料用作固定相，例如强酸性树脂，如Amberlite、Dowex和Mitshubishi(DIAION)，作为凝胶或珠；或者弱酸性离子交换剂，如DEAE-琼脂糖或DIAION的WK10/WK40也用作珠或凝胶。通过应用pH、缓冲液(Tris，磷酸盐)或盐(NaCl)浓度梯度，将酸性果胶与中性多糖分离。合适地，首先洗去中性组分，随后收集酸性组分并浓缩和脱盐如通过10kDa膜的超滤，或者进行渗析，然后进行GPC。优选地，凝胶过滤使用尺寸排阻材料作为固定相，例如Sephacryl 100-HR &200-HR、Sephadex G-100、Superdex200。合适地，将样品在强度为0.01-0.2M的缓冲液中等溶剂(isocratically)地洗脱。尺寸排阻柱可以通过MW标准品，利用蛋白或多糖校准。对此优选使用一组葡聚糖。
提取物中多糖的总量可以通过本领域技术人员已知的任何分析技术来测定。对于离子交换和凝胶过滤，优选的检测方法为通过监测210-220nm的UV吸光度作为在该光谱区表现出吸光度的化合物的羧酸根基团。其他检测方法可以为通过折射率(RI)、脉冲安培检测(PAD)、质谱或者通过Dubois所述的硫酸/酚方法的特异性糖类检测方法来离线分析组分。
最后，可以利用任何合适的方法干燥获得的纯化的提取物，例如冷冻干燥或喷雾干燥。
获得本发明的多糖的优选方法如下。将干燥或新鲜植物原料的样品用85%乙醇水溶液在80°C下洗涤两次，保持2.5小时；并用85%乙醇水溶液在80°C下洗涤一次，保持1.5小时。倒出乙醇后，将沉淀干燥。通过加入去矿物质的水并煮沸(大气压下约100°C)三小时来从沉淀提取多糖。通过例如离心从水相分离分散物质后，将沉淀重悬浮于去除矿物质的水中，并再次煮沸3小时。收集第一和第二次提取的上清，冷冻干燥并在室温下保存。
在优选的后续步骤中，将多糖富集的冷冻干燥的提取物以2%(w/w)的浓度悬浮于磷酸缓冲盐水(PBS)中，过滤澄清，并通过0.2微米滤器灭菌。由于本发明的多糖溶于水，因此滤液包含本发明的多糖。
优选地，利用pH 7.5Tris-HCl缓冲液并应用盐梯度，通过使用弱离子交换固定相DEAE-琼脂糖来进行有效的分离。通过在10kDa膜上超滤将酸性组分脱盐，然后进行GPC和冷冻干燥。然后，将组分再溶于挥发性缓冲液(如0.1M碳酸铵)，并通过尺寸排阻色谱，在Superdex 200上利用5ml/min流速来进行分子量分布。通过UV 214nm吸光度进行检测，并通过葡聚糖MW标准品来校准Superdex柱。
对于一些作物如胡萝卜和苹果，最优的选择是忽略第一柱色谱步骤，而仅通过凝胶过滤进行尺寸排阻色谱(分子量分布)。将多糖富集的提取物溶于挥发性缓冲液(如0.1M碳酸铵)，并通过尺寸排阻色谱，在Superdex 200上利用5ml/min流速来进行分子量分布。通过UV 214nm吸光度进行检测，并通过葡聚糖MW标准品来校准Superdex柱。
由于本发明的多糖所来源的原料的性质多变，所以进行任选的提取步骤的条件也可以变化。例如，每克起始原料的溶剂和水的量对于各种来源可以不同。这些改变在本领域技术人员的范围内。
多糖的制备
除了从天然植物原料的提取方法，本发明的多糖还可以通过化学和/或生物技术方法制备。通过常用的合成化学转化，从简单的多糖开始从头合成是可以的，通常包括酶促转化。或者，从天然来源的原料通过常用的化学制备，包括酶促操作。还可以通过生物分子技术制备，其中通过重组生物体(如细菌、真菌)合成多糖，其中表达并激活合成多糖的细胞部分以表达本专利所指的多糖。
生物技术生产可以包括植物细胞培养或胼胝体培养。植物细胞培养物固有地包含多糖生产所需的鼠李糖基转移酶和半乳糖醛酸转移酶，以及产生转移酶的激活的单糖供体(如UDP-鼠李糖和UDP-半乳糖醛酸)的***装置(machinery)。
生产还可以通过利用代表单细胞原始植物的微藻类的生物技术方法实现。微藻生物技术在过去的十年中迅速发展(Walker et al.,2005,Plant CellRep.,vol.24,p.629-41)，并且这些物种的遗传改造允许生产食品和药用的各种产品。鼠李糖半乳糖醛酸聚糖不是典型的微藻多糖，因此必须将细胞转化以表达关键的酶鼠李糖基转移酶和半乳糖醛酸转移酶。
酵母和真菌是许多生物技术产品确立的生产宿主，并且可以通过这些宿主来很好地生产鼠李糖半乳糖醛酸聚糖。除了构建多糖的酶，必须将单糖供体生产***装置转入细胞。
目前还未描述高-MW鼠李糖半乳糖醛酸聚糖的纯化学合成。然而，已经合成了RG-1四糖构建模块，并且开发的化学允许链延长至更大的结构(Rich et al.,1999,Tetrahedron:Asymmetry,vol.10,p.17–20)。
附图说明
图1：本发明的优选多糖的示意图：
1：RG-I核心中的半乳糖醛酸残基
2：RG-I核心中的鼠李糖基残基
3：侧链中的半乳糖基残基，连接至鼠李糖基残基的4-OH位置
4：侧链***糖基残基，连接至鼠李糖基残基的4-OH位置。
图2：获得自物种苹果的果实的多糖的免疫调节效果；全血细胞测定。
微克/毫升的提取物浓度(x轴)比百分比吞噬作用(y轴)。
图3：获得自物种大豆的豆的多糖的免疫调节效果；HL60细胞测定。
微克/毫升的提取物浓度(x轴)比百分比吞噬作用(y轴)。
实施例
以下非限制性实施例示例本发明。
方法
通过分子量分离多糖
在Superdex 200柱上(1×30cm;GE Healthcare)，通过凝胶过滤色谱分离获得自沸水提取的多糖。将多糖样品溶于0.1M碳酸氢铵，并将5-15mg的等分试样于相同缓冲液中在柱上运行。通过214nm处的吸收来检测洗脱的组分。
多糖聚集(pool)为三种组分：MW>110kDa、70-110kDa和40-70kDa。聚集限制通过比较葡聚糖标准品40kDa、70kDa和110kDa(ex GEHealthcare)的洗脱位置来确定。
多糖的取代和组成分析
获得自提取方法的多糖组分的组成利用NMR分析来确定。在NMR分析之前，将干多糖样品(1-10mg)溶于氧化氘(D2O)，并且在真空离心机中干燥。然后将样品溶于600微升D2O。在Varian Unity 500NMR分光计上，收集296K的光谱，并与内部丙酮标准品(2.225ppm)比较。
参见表1，通过利用如下的NMR数据分析多糖取代水平和构建单元的摩尔组成：
-鼠李糖半乳糖醛酸聚糖取代水平
通过积分***的鼠李糖-CH3信号来估计4-取代的鼠李糖基单元与未取代的单元的比例。4-取代的鼠李糖基单元中的-CH3质子在1.32ppm附近共振，而未取代的鼠李糖基单元的-CH3质子在1.25ppm附近共振。
-半乳聚糖与***聚糖的摩尔比
通过积分观察到的β1,4-半乳聚糖H-1信号(4.64ppm)和***聚糖H-1信号(-5Ara H-1,5.09ppm;-3,5Ara H-15.12ppm;末端Araα1-35.15ppm;末端Araα1-25.18ppm;-2,3,5Ara H-15.26ppm)来分析半乳聚糖和***聚糖的摩尔量。将这些积分值与积分的鼠李糖-CH3比较。
-聚半乳糖醛酸/RG-I比例
聚半乳糖醛酸与RG-I的比例如下分析：在4.42-4.47ppm积分半乳糖醛酸H-4信号的总量，并且鼠李糖的量通过-CH3信号的积分(1.25-1.32ppm)获得。
RG-I特异性GalAα1-2单元的H-4信号位于相同的4.42-4.47信号中，并且其部分必须从总H-4信号减去。这个值与鼠李糖量相同，因为RG-I为Rha和GalA的1:1聚合物。剩余的H-4表示聚半乳糖醛酸类型GalAα1-4H-4信号的份额。
体外测定
两个测定用于确定多糖的体外免疫调节应答，均基于吞噬作用活性。这些测定是：
全血细胞测定
全血中的吞噬作用活性使用Orpegen Pharma(Heidelberg,Germany)的试剂盒，利用调整的方案进行评价。肝素钠vacutainer(BDBiosciences)中的新鲜血液获得自健康人志愿者。在37°C水浴中，将30微升全血和5微升所述成分一式两份地在聚丙烯96孔板中温育30分钟。对照温育由一式三份测量的PBS(＝基础吞噬作用活性)或100ng/mL大肠杆菌-脂多糖(LPS)(=阳性对照样品)组成。温育步骤后，加入10微升FITC标记的大肠杆菌(白细胞比大肠杆菌比例为25:1)。6.5分钟后，通过加入50微升冰冷的终止溶液停止37°C下的温育。通过加入230微升冰冷的洗涤缓冲液将细胞洗涤三次，并在300g(4°C)下离心3min。利用290微升裂解缓冲液将红细胞裂解。室温下避光温育20分钟后，将细胞在300g(4°C)下离心5min。将细胞重悬浮于150微升洗涤缓冲液中，并用碘化丙啶染色。通过流式细胞术(Coulter FC500MPL flow cytometer,Beckman Coulter NederlandBV，Mijdrecht)进行分析。在白细胞中，根据FSC/SSC谱门控粒细胞。测定粒细胞群体中测定吞噬细胞的百分比。结果归一化为基线与LPS刺激的吞噬作用之间的动态范围，并且表示为相对百分比吞噬作用活性。大于40%的归一化百分比视为阳性。
HL60细胞测定
将人早幼粒细胞性白血病细胞系HL60用于测定所述成分的吞噬作用增强能力。这种细胞系可以用维生素D3分化为单核细胞谱系，并且该细胞随后获得吞噬能力。开始测定前48小时，通过向培养基加入1α,25-二羟基维生素D3(VitD3)使HL60细胞沿单核细胞谱系分化。分化时，一式三份将200微升HL60细胞(8x105细胞/ml)转移至96孔平底板。加入荧光标记的微球(珠：细胞比例19:1)，并在37°C下温育24hr。对照温育由一式三份测量的PBS中的分化的HL60细胞(=基础吞噬作用水平)或100ng/mL大肠杆菌-脂多糖(LPS)(=阳性对照样品)组成。温育时间段后，将细胞转移至96孔V底板，洗涤三次并用甲醛固定。对于分析，将细胞转移至96孔透明底板，并利用Flex Station II荧光计分析荧光强度。利用阳性对照将数据归一化，并表示为相对百分比吞噬作用活性。大于40%的归一化百分比视为阳性。
实施例1：多糖的分离和表征
将各种植物原料用于提取多糖。从以下原料获得多糖：
-物种茶树的叶，确定来自几个样品的多糖组成；
-物种胡萝卜的根；
-物种苹果的果实；
-物种甜菜的根；
-物种大豆的豆，多糖的来源是水溶性大豆多糖ex Fuji Oil(Japan)。
获得原料的方法如下。
将25g不溶于甲醇的植物原料用200ml水中的85%乙醇(VWR Prolabo)在80°C下洗涤两次，保持2.5小时，并用200ml水中的85%乙醇在80°C下洗涤一次，保持1.5小时。倒出乙醇后，将沉淀在熏柜(fuming cabinet)中干燥过夜。通过加入200ml去除矿物质的水(MilliQ)并在大气压下煮沸3小时来提取多糖。室温(RT)下以2,000g离心20min后，将沉淀重悬浮于200ml去除矿物质的水(MilliQ)中，并再次煮沸3小时。收集第一和第二次提取的上清，冷冻干燥并在室温下保存。
从多糖富集的冷冻干燥提取物，制备去除矿物质的水中2%(w/w)的悬浮液，并在约121°C的温度下高压灭菌约15分钟。将悬浮液在室温下以2,000g离心30分钟。将上清通过0.2微米滤器过滤纯化，分成小的部分并保存在-20°C下。
然后，将约650mg提取物溶于30ml的20mM Tris-HCl,pH 7.5，并持续混合溶解1小时。通过离心除去不溶性物质，并将澄清上清在用20mMTris-HCl,pH 7.5平衡的DEAE-琼脂糖(50x 150mm,ca.290ml)柱上进行阴离子交换色谱，流速为10ml/min。加样后，将柱用平衡缓冲液等溶剂运行30min，然后用0-1M NaCl的梯度运行30min，并且用1M NaCl运行额外的40min。记录214nm的吸光度，并收集25ml的组分。将酸组分浓缩，并通过在10kDa膜上超滤脱盐，然后进行GPC。在这个点上未测量收率。
将上文获得的酸组分合并(来自多个运行)，然后在Superdex 200(5cm直径，95cm长度)柱上进行凝胶过滤色谱。Superloop由于大样品体积而用于进样。将柱用100mM碳酸氢铵以5ml/min的流速洗脱，并记录214nm的吸光度。收集25ml的组分。
通过以下方式获得来自苹果的多糖。将新鲜的苹果磨碎，并用实验果胶溶解酶制品Rapidase C600(0.02%w/w，4h at 45°C;酶获得自GistBrocades,Delft,the Netherlands)处理。将可溶性部分通过离心回收，并在60kDa分子量截止膜上进行超滤，然后冷冻干燥。将这个组分进一步皂化以除去不稳定的甲基和乙酰基酯：将50.4mg苹果RG的样品溶于5ml的0.2M碳酸钠，pH 10，并在室温下反应18h。然后在MWCO 6000-8000渗析管中，将反应混合物对50mM碳酸氢铵渗析24h，更换3次溶液。最后将样品在C-18二氧化硅中进行SPE。
确定从各种来源获得的多糖的以下组成。
表1从各种来源获得的多糖的取代和组成分析；多糖组分在Superdex200上分离。
Figure BDA00001992654200341
图例：
(1)Rha 4-OH取代：RG-I核心中Rha的摩尔分数，其在C-4位置由侧链取代，从Rha CH3信号偏移测量；
(2)β1-4Gal：β(1,4)-连接的Gal与Rha的摩尔比(mol/mol)；涉及包含β(1,4)-连接的半乳聚糖残基的侧链的长度；
(3)Ara：α(1,5)-连接的***聚糖与Rha的摩尔比(mol/mol)；涉及包含α(1,5)-连接的***糖基残基的侧链的长度；
(4)α1-4GalA：α-1,4-半乳糖醛酸残基比鼠李糖基残基(mol/mol)；即这个数目表示多糖中α(1,4)-连接的聚半乳糖醛酸或α(1,4)-连接的低聚半乳糖醛酸核心中的GalA残基与多糖中RG-I核心中的Rha残基的摩尔比；
(5)低于可测量水平：即存在于多糖中的来自α(1,4)-连接的聚半乳糖醛酸或α(1,4)-连接的低聚半乳糖醛酸核心的α(1,4)-连接的GalA残基的量低至不可检测。如果如此，则比例GalA:Rha为1。
实施例2：来自各种来源的多糖的免疫调节效果
利用上文所述的两种测定，以各种浓度测定各种样品的免疫调节效果。结果示于下表中。
多糖获得自以下原料：
-物种茶树的叶；茶#7、茶#15、茶#218、茶#244(见表1)的样品的混合物的免疫调节效果如下表所示；
-物种胡萝卜的根；
-物种苹果的果实；
-物种甜菜的根；
-物种大豆的豆。
表2各种样品的体外免疫调节活性，利用全血细胞测定和/或HL60细胞测试。根据上文的方法获得的提取物浓度(微克/毫升)比测定的吞噬作用活性。
Figure BDA00001992654200361
图例：
++非常积极的效果(%吞噬作用>80%)
+积极的效果(%吞噬作用40%-80%)
-无效果
空白：未测试
图2和3表示对于一些多糖样品的测量的吞噬作用百分比：
图2：苹果(如表1和2)，全血细胞测定。
图3：大豆；HL60细胞测定；这个样品不在表2中，大豆多糖：鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(大豆)ex Megazyme International Ireland Ltd.(Wicklow，Ireland)
在两个测试中测试了获得自茶植物(茶树)的两个样品，此时以较低浓度进行。这些样品为茶#7和茶#15。还测试来自胡萝卜和苹果的样品。这些原料的结构特征已经在表1给出。这些测试的结果如下：
表3获得自植物茶树的两个样品以及获得自胡萝卜和苹果的样品的体外免疫调节活性，利用全血细胞测定和/或HL60细胞测定测试。根据上文的方法获得的提取物浓度(微克/毫升)比测定的吞噬作用活性。
Figure BDA00001992654200371
图例：
++非常积极的效果(%吞噬作用>80%)
+积极的效果(%吞噬作用40%-80%)
-无效果
空白：未测试
这个实施例表明，获得自植物茶树的提取物表现出非常高的体外免疫刺激活性。与获得自其他植物原料的各种其他多糖相比，在低达0.003微克/毫升的浓度，在全血细胞测定中测量了非常高的免疫刺激活性。获得自苹果或胡萝卜的多糖在0.03和0.3微克/毫升的浓度下在全血细胞测定中未表现出免疫刺激效果。
实施例3：多糖的性质
在从胡萝卜分离多糖的过程中，观察到这些多糖不导致其所溶解的流体的增稠。这与普通果胶相反，其中类似浓度的聚合物导致流体的增稠。

Claims (15)

1.一种获得自植物物种茶树(Camellia sinensis)的多糖，其中所述多糖的骨架包含交替的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I核心和α(1,4)-连接的聚半乳糖醛酸或α(1,4)-连接的低聚半乳糖醛酸核心，其中所述多糖的骨架中半乳糖醛酸残基与鼠李糖基残基的摩尔比为2.5:1-1:1，并且其中所述多糖的分子量为至少70kDa。
2.如权利要求1所述的多糖，其中所述多糖的骨架中半乳糖醛酸残基与鼠李糖基残基的摩尔比为2:1-1:1，优选1.5:1-1:1。
3.如权利要求1或2所述的多糖，其中所述多糖的分子量为70-2,000kDa，优选110-2,000kDa。
4.如权利要求1-3中任一项所述的多糖，其中所述鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I核心包含一个或多个侧链，其中所述一个或多个侧链包含至少一个或多个α(1,5)-连接的***糖基残基的骨架，并且其中所述一个或多个侧链在鼠李糖基残基的4-OH位处进行取代。
5.如权利要求4所述的多糖，其中所述***糖基残基与所述鼠李糖基残基的摩尔比为50:1-1:2。
6.如权利要求1-5中任一项所述的多糖，其中所述鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I核心包含一个或多个侧链，其中所述一个或多个侧链包含至少一个或多个β(1,4)-连接的半乳糖基残基的骨架，并且其中所述一个或多个侧链在鼠李糖基残基的4-OH处进行取代。
7.如权利要求6所述的多糖，其中所述半乳糖基残基与所述鼠李糖基残基的摩尔比为80:1-1:1。
8.一种获得自植物物种茶树的制品，其包含权利要求1-7中任一项所述的多糖。
9.如权利要求1-7中任一项所述的多糖或者如权利要求8所述的制品，其用作药物。
10.如权利要求1-7中任一项所述的多糖或者如权利要求8所述的制品，其用作调节优选人的免疫应答的药物。
11.如权利要求10所述的多糖或制品，其中所述多糖用作疫苗的佐剂。
12.一种可食用产品或药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项所述的多糖或者权利要求8所述的制品。
13.如权利要求12所述的可食用产品或药物组合物，其包含0.0001重量%-25重量%的所述多糖。
14.如权利要求12或13所述的可食用产品，其为液体形式，例如汤或饮料，酱、调料、甜点或面包。
15.一种制备包含权利要求1-7中任一项所述的多糖或者权利要求8所述的制品的可食用产品或药物组合物的方法，其中使所述多糖与所述可食用产品或药物组合物的至少一种成分接触。
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