CN111647610A - 一种互换ha和ns1缺失基因包装信号的h9n2亚型禽流感病毒及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种互换HA和NS1缺失基因包装信号的H9N2亚型禽流感病毒及其构建方法和应用，属于疫苗技术领域。一种互换HA和NS1缺失基因包装信号的H9N2亚型禽流感病毒，包括重组NS‑HAmut‑NS和HA‑NS1‑128mut‑HA基因。所述重组NS‑HAmut‑NS和HA‑NS1‑128mut‑HA基因的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。利用本发明所述基因构建得到的重组H9N2亚型禽流感病毒能有效避免HA和NS片段与野生毒株发生重配，且具有减毒特性和良好的攻毒保护效力。

Description

一种互换HA和NS1缺失基因包装信号的H9N2亚型禽流感病毒 及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种互换HA和NS1缺失基因包装信号的H9N2亚型禽流感病毒及其构建方法和应用。
背景技术
H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenzavirus,AIV)可感染多种家禽和野禽。虽然H9N2亚型AIV毒株对家禽的致病性较低，但给养禽业造成的经济损失巨大，主要造成呼吸道症状、免疫抑制和产蛋量下降。H9N2 AIV具有结合哺乳动物受体的特性，有研究证实其可通过气溶胶在雪貂之间进行传播。此外，H9N2 AIV可以提供部分或全部内部基因给H5N1、H7N9、H10N8和H5N6亚型的AIV发生重组，产生重配病毒，如2015～2016年，我国东部的活禽市场分离到含 H9N2亚型AIV内部基因盒的H5N6亚型AIV；2013年分离到6个内部基因片段全部来源于H9N2 AIV的新型H7N9流感病毒，因此，防控H9N2禽流感同样具有重要公共卫生学意义。
我国自1998年开始使用H9N2亚型禽流感灭活疫苗(Li CJ,et al. 2005)，对控制H9N2禽流感的流行起到了关键作用。然而，不同年代的H9N2 AIV存在毒力差异和抗原漂移，且灭活疫苗存在只能诱导体液免疫、佐剂价格高、有效抗体产生时间长，免疫鸡群虽能产生高水平抗体，但不能有效抑制鸡群排毒等缺点，因此有必要开发广谱的新型疫苗。
与灭活疫苗相比，活疫苗免疫效果更能有效产生体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫应答，降低临床上H9N2 AIV的感染率和排毒率，且可以采用比较方便的接种方式如滴鼻点眼、饮水、喷雾等，降低免疫的人工成本。活疫苗种类繁多，可以通过基因修饰的方法设计活疫苗，比如通过基因缺失和基因重排反向遗传拯救病毒的方式或通过鸡胚连续低温传代获得冷适应毒株等方式获得减毒的活疫苗。减毒活疫苗在预防人类季节性流感方面已经取得了初步成功，并已成功上市使用。人类流感减毒疫苗的成功案例，给家禽疫苗的研究提供了发展方向。目前已研究出了一系列针对H9N2亚型AIV的减毒活疫苗候选株，如通过梯度降温培育的冷适应减毒活疫苗株。这些减毒活疫苗可以更好的诱导粘膜免疫和细胞免疫、较小的剂量就可以在短时间内诱导产生有效的免疫应答。
近年来，本研究团队构建获得了一株NS1基因截短的H9N2减毒活疫苗株(公开号CN104830811，公开日2015.8.12)，经动物实验证明其在SPF鸡群及蛋鸡中均能对鸡群提供良好的保护，且不会排毒，是一株理想的减毒活疫苗候选株。避免流感病毒减毒活疫苗应用后重组的研究也逐渐成为减毒活疫苗的研究重点。但减毒活疫苗也存在一定的缺陷，例如疫苗毒株与环境中野生型AIV交换内部基因片段，造成新的流行毒株的出现，造成减毒活疫苗的毒力返强。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种互换HA和NS缺失基因包装信号的H9N2重组NS-HAmut-NS和HA-NS1-128mut-HA基因及其构建的重组病毒，有效防止H9N2亚型AIV减毒活疫苗的HA和NS片段发生重配，保证疫苗的安全性。
本发明提供了一种互换HA和NS缺失基因包装信号的H9N2重组NS-HAmut-NS和HA-NS1-128mut-HA基因，所述NS-HAmut-NS 的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述HA-NS1-128mut-HA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明提供了一种重组H9N2亚型禽流感病毒的构建方法，包括以下步骤：
(1)将所述重组NS-HAmut-NS和HA-NS1-128mut-HA基因分别构建到pHW2000质粒载体上，得到pHW-NS-HAmut-NS和 pHW-HA-NS1-128mut-HA；
(2)以H9N2亚型禽流感病毒TX株为亲本毒株，将步骤1)中所述pHW-NS-HAmut-NS和pHW-HA-NS1-128mut-HA与所述亲本毒株其余6片段质粒共转染真核细胞，得到重组H9N2亚型禽流感病毒 rTX-NS1-128(mut)。
优选的，步骤2)中所述真核细胞包括MDCK细胞和293T细胞。
优选的，步骤2)中所述共转染的方法包括脂质体共转染法。
优选的，所述亲本毒株的其余6片段为pHW291-PB2、 pHW292-PB1、pHW293-PA、pHW295-NP、pHW296-NA和 pHW297-M。
本发明提供了所述的构建方法构建得到的重组H9N2亚型禽流感病毒rTX-NS1-128(mut)，HA的效价为6log2。
优选的，与所述野生毒株的HA和NS片段不发生独立重配。
优选的，SPF鸡胚半数感染量为7.48～8.18log10EID50/0.1ml。
本发明提供了一种互换HA和NS缺失基因包装信号的H9N2减毒活疫苗，由所述重组H9N2亚型禽流感病毒rTX-NS1-128(mut)制备得到。
本发明提供了所述重组H9N2亚型禽流感病毒rTX-NS1-128(mut) 在H9N2减毒活疫苗中的应用。
本发明提供了一种互换HA和NS缺失基因包装信号的H9N2重组NS-HAmut-NS和HA-NS1-128mut-HA基因，所述NS-HAmut-NS 的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述HA-NS1-128mut-HA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明利用分子克隆的方法成功互换 HA和NS1缺失基因包装信号，具体为对HA和NS1-128片段包装信号区域中的ATG突变为TTG以及NS1-128片段G57C剪切位点突变；对HA和NS1-128开放阅读框内片段自身包装信号序列进行同义突变；利用无缝克隆方法将上述突变序列重组构建得到互换HA和NS 缺失基因包装信号的H9N2重组基因组。
本发明提供了所述的构建方法构建得到的重组H9N2亚型禽流感病毒rTX-NS1-128(mut)。pHW-NS-HAmut-NS和 pHW-HA-NS1-128mut-HA双互换入母本病毒骨架成功获得拯救病毒 rTX-NS1-128(mut)，而单互换pHW-NS-HAmut-NS或 pHW-HA-NS1-128mut-HA不能获得拯救病毒。病毒的血凝效价测定结果表明，互换包装信号的NS1基因缺失重组病毒的HA效价为 6log2，比亲本病毒和NS1基因缺失病毒的HA效价分别下降3个和 1个滴度。同时验证病毒的复制能力，以相同的MOI＝0.001的感染剂量接种rTX、NS基因缺失重组病毒以及包装信号互换病毒至MDCK 细胞上，经细胞培养，测定病毒组织半数感染量(TCID50)并绘制病毒的增殖曲线，rTX、rTX-NS1-128和rTX-NS1-128(mut)的复制水平在不同时间点存在显著性差异。三株病毒复制均在60小时到达高峰，在感染后的所有时间点，亲本病毒TX的繁殖滴度均显著高于 NS1基因缺失病毒(P<0.05)，NS1基因缺失病毒显著高于包装信号互换病毒rTX-NS1-128(mut)(P<0.05)。因此，与亲本病毒rTX及NS1 基因缺失病毒(rTX-NS1-128)相比，本发明所述互换HA和NS1缺失基因包装信号构建得到的重组H9N2亚型减毒活病毒在SPF鸡胚和 MDCK细胞上的复制能力及对SPF鸡胚的半数感染量略微有所降低。
本发明进一步限定了所述重组H9N2亚型禽流感病毒 rTX-NS1-128(mut)与所述野生毒株的HA和NS片段不发生独立重配。以MOI＝10的感染剂量同时接种rTX野毒株和rTX-NS1-128(mut)至 MDCK细胞上，经细胞培养和PCR鉴定，结果表明rTX-NS1-128(mut) 均不能发生HA和NS片段的独立重配，且检测到所有HA和NS片段均来自母本病毒rTX。
本发明提供了一种互换HA和NS缺失基因包装信号的H9N2减毒活疫苗，由所述重组H9N2亚型禽流感病毒rTX-NS1-128(mut)制备得到。动物试验结果表明，以106EID50/只的剂量滴鼻点眼免疫28日龄SPF鸡，与H9N2 NS1基因缺失减毒活病毒相比，同样具致病性降低，丧失了接触传播的能力，能诱导产生良好的免疫应答和提供对同源TX株以及异源F98株良好的保护效力。
附图说明
图1为本发明构建重组NS-HAmut-NS和HA-NS1-128mut-HA基因的构建策略；
图2为本发明提供的rTX-NS1-128(mut)病毒cDNA的PCR扩增结果；
图3为本发明提供的rTX-NS1-128(mut)病毒在MDCK细胞上的生长曲线结果；
图4为本发明提供的rTX-NS1-128(mut)病毒与亲本病毒HA和 NS片段重配检测结果；
图5为本发明提供的rTX-NS1-128(mut)病毒诱导动物产生免疫应答结果。
具体实施方式
本发明提供了一种互换HA和NS缺失基因包装信号的H9N2重组NS-HAmut-NS和HA-NS1-128mut-HA基因，所述NS-HAmut-NS 的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述HA-NS1-128mut-HA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明对H9N2重组NS-HAmut-NS和HA-NS1-128mut-HA基因的构建策略见图1。具体为对HA和NS1-128片段包装信号区域ATG 位点突变为TTG以及NS1-128片段G57C剪切位点突变；对HA和 NS1-128开放阅读框内片段自身包装信号序列进行同义突变；利用无缝克隆方法将上述突变序列重组构建NS-HAmut-NS和 HA-NS1-128mut-HA两条基因片段并克隆到pHW2000质粒载体。具体如下：基因定点突变为单点多次完成，分别以pHW294-HA和 pHW298-NS1-128为模板，所用引物如SEQ ID No.3～SEQ ID No.22 所示。最终突变完成质粒命名为pHW294-HAmut和 pHW298-NS1-128mut。同义突变HA ORF框分两步扩增：第一步以 pHW294-HA为模板，用HAOFRF/HAORF R1引物对扩增获得扩增产物，然后以第一步获得扩增产物为模板，用HA ORF F/HAORF R2 引物对扩增获得最终产物HAmut ORF基因。同义突变NS1-128ORF 框是以pHW298-NS1-128为模板，采用用NS ORF F/NS ORF R引物对扩增获得NS1-128mut ORF基因。所用引物如SEQ ID No.23～SEQ ID No.27所示。同义突变获得目的基因HAmut ORF和NS1-128mut ORF克隆到商品化Blunt3载体上作为中间质粒，命名为 Blunt3-HAmut ORF和Blunt3-NS1-128mut ORF。以上述 pHW294-HAmut、pHW298-NS1-128mut、Blunt3-HAmut ORF、 Blunt3-NS1-128mut ORF以及pHW2000空质粒为模板，使用无缝克隆方式构建重组质粒pHW-NS-HAmut-NS和 pHW-HA-NS1-128mut-HA。片段扩增引物按照无缝克隆要求设计，无缝克隆用引物如SEQ IDNo.28～SEQ ID No.40所示。所有片段扩增的PCR反应程序均为：95℃预变性30s；95℃变性15s，Tm退火15s， 72℃延伸30s～60s/kb，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
本发明提供了一种重组H9N2亚型禽流感病毒的构建方法，包括以下步骤：
(1)将所述重组NS-HAmut-NS和HA-NS1-128mut-HA基因分别构建到pHW2000质粒载体上，得到pHW-NS-HAmut-NS和 pHW-HA-NS1-128mut-HA；
(2)以H9N2亚型禽流感病毒TX株为亲本毒株，将步骤1)中所述pHW-NS-HAmut-NS和pHW-HA-NS1-128mut-HA与所述亲本毒株的其余6片段共转染真核细胞，得到重组H9N2亚型禽流感病毒 rTX-NS1-128(mut)。
本发明将所述重组NS-HAmut-NS和HA-NS1-128mut-HA基因分别构建到pHW2000质粒载体上，得到pHW-NS-HAmut-NS和 pHW-HA-NS1-128mut-HA。
在本发明中，所述pHW2000质粒载体参见现有技术中的报道 (Hoffmann,E.,Neumann,G.,Kawaoka,Y.,Hobom,G.,and Webster,R. G.(2000).A DNA transfectionsystem for generation ofinfluenza A virus from eight plasmids.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97,6108–6113.doi: 10.1073/pnas.100133697)。
在本发明中，重组NS-HAmut-NS和HA-NS1-128mut-HA基因分别***的pHW2000质粒载体，采用无缝克隆的方法***到多克隆位点BsmBⅠ中。本发明对所述构建重组载体的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的构建重组载体的方法即可。
得到重组载体pHW-NS-HAmut-NS和pHW-HA-NS1-128mut-HA 后，本发明以H9N2亚型禽流感病毒TX株为亲本毒株，将所述 pHW-NS-HAmut-NS和pHW-HA-NS1-128mut-HA与所述亲本毒株的其余6片段共转染真核细胞，得到重组H9N2亚型禽流感病毒 rTX-NS1-128(mut)。
在本发明中，所述H9N2亚型禽流感病毒TX株为 A/chicken/Taixing/10/2010(TX)株，该毒株已公开发表文章(参见 Zhu Y,Yang Y,Liu W,et al.Comparison ofbiologicalcharacteristics of H9N2 avian influenza viruses isolated from differenthosts,Archives of virology,2015,160:917-927)。该毒株8片段对应的Genebank序列号如下：PB2：JN653572；PB1：JN653588；PA：JN653604；HA：JN653620； NP：JN653636；NA：JN653652；M：JN653668；NS：JN653684。
本发明对所述真核细胞的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的常规病毒感染用真核细胞即可。所述真核细胞优选包括MDCK细胞和293T细胞。
本发明对所述共转染的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的共转染方法即可。在本发明实施例中，所述共转染的方法优选包括脂质体共转染法。所述亲本毒株的其余6片段为pHW291-PB2、 pHW292-PB1、pHW293-PA、pHW295-NP、pHW296-NA和 pHW297-M。6片段的构建方法参见现有技术(Chen S,ZhuY,Yang D, Yang Y,Shi S,Qin T,et al.EfficacyofLive-Attenuated H9N2 Influenza Vaccine Candidates Containing NS1Truncations against H9N2 Avian InfluenzaViruses[J].FrontMicrobiol.2017；8:1086.)。
所述共转染后，还包括细胞培养、细胞酶解及冻融。所述细胞培养的条件优选为37℃二氧化碳培养箱培养8～10h。所述细胞酶解的方法优选如下：含有终浓度为2μg/ml TPCK胰酶的无抗无血DMEM 1.5ml，37℃继续培养60h。所述冻融后收集细胞上清液，得到重组H9N2亚型禽流感病毒rTX-NS1-128(mut)。
本发明提供了所述的构建方法构建得到的重组H9N2亚型禽流感病毒rTX-NS1-128(mut)，HA的效价为6log2。经实验证明，所述 rTX-NS1-128(mut)与所述野生毒株的HA和NS片段不发生独立重配。所述rTX-NS1-128(mut)滴度优选为7.48～8.18log10EID50/0.1ml。与亲本病毒rTX及NS1基因缺失病毒rTX-NS1-128相比，所述 rTX-NS1-128(mut)在SPF鸡胚和MDCK细胞上的复制能力及对SPF 鸡胚的半数感染量略微有所降低；与亲本病毒rTX共感染MDCK细胞，共感染细胞上清进行空斑纯化后提取病毒RNA进行PCR鉴定，结果显示重组病毒不能与野生病毒发生HA和NS片段的独立重配。
本发明提供了一种互换HA和NS缺失基因包装信号的H9N2减毒活疫苗，由所述重组H9N2亚型禽流感病毒rTX-NS1-128(mut)制备得到。
本发明提供了所述重组H9N2亚型禽流感病毒rTX-NS1-128(mut) 在H9N2减毒活疫苗中的应用。
在本发明中，所述rTX-NS1-128(mut)作为H9N2减毒活疫苗应用时，动物试验结果表明，以106EID50/只的剂量滴鼻点眼免疫28日龄 SPF鸡，与H9N2 NS1基因缺失减毒活病毒相比，同样具致病性降低，丧失了接触传播的能力，能诱导产生良好的免疫应答和提供对同源 TX株以及异源F98株良好的保护效力。
下面结合实施例对本发明提供的一种互换HA和NS1缺失基因包装信号的H9N2亚型禽流感病毒及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)载体构建
本发明所用H9N2 TX株的8片段克隆至pHW2000质粒，同时构建 NS1基因缺失质粒(构建方法参见Chen S,ZhuY,Yang D,YangY,Shi S,Qin T,et al.Efficacy of Live-Attenuated H9N2 Influenza Vaccine Candidates Containing NS1 Truncationsagainst H9N2 Avian Influenza Viruses[J].Front Microbiol.2017；8:1086.)分别命名为pHW291-PB2、 pHW292-PB1、pHW293-PA、pHW294-HA、pHW295-NP、pHW296-NA、 pHW297-M、pHW298-NS、pHW298-NS1-128。互换HA和NS1缺失基因包装信号的NS-HAmut-NS和HA-NS1-128mut-HA基因的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。两个重组基因通过人工合成后连接到pHW2000质粒载体。定点突变及引物如表1所示，HA 及NS1-128 ORF框的头尾同义突变引物如表2所示，无缝克隆片段扩增引物按照无缝克隆要求设计，如表3所示。
表1 HA和NS1-128点突变引物
Figure RE-GDA0002610294350000071
Figure RE-GDA0002610294350000081
表2 HA和NS1-128 ORF同义突变引物
Figure RE-GDA0002610294350000082
表3无缝拼接引物
Figure RE-GDA0002610294350000083
Figure RE-GDA0002610294350000091
所述扩增体系(25μL)如表4所示：
表4基因扩增体系
Figure RE-GDA0002610294350000092
将上述体系混匀，瞬离后，本发明优选按以下步骤进行PCR扩增：95℃预变性30s；95℃变性15s，Tm退火15s，72℃延伸30s-60s/kb， 30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。反应结束，本发明优选用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收目的条带。将回收的目的片段与pHW2000进行连接，优选的连接体系如表5所示，连接转化后提取质粒。优选的转化步骤为：冰上溶解50μl Trans T1感受态细胞，加入4μl连接产物，冰上放置30min后42℃热激45s，放回冰上放置 2min，加入300μl LB培养液，37℃摇床震荡(220rpm)培养60min，取 100μl涂LBA+平板，37℃温箱倒置培养12h。PCR鉴定条带大小正确的基因质粒送南京金斯瑞公司测序。阳性重组质粒命名为 pHW-NS-HAmut-NS和pHW-HA-NS1-128mut-HA。
表5基因片段连接体系
Figure RE-GDA0002610294350000093
本发明优选通过测序证明所得的基因序列突变的正确性。
(2)病毒拯救
互换HA和NS1基因缺失包装信号的H9N2减毒病毒的构建方法，包括以下步骤：
得到pHW-NS-HAmut-NS和pHW-HA-NS1-128mut-HA后，分别单互换和双互换入母本病毒TX骨架。具体为以pHW291-PB2、 pHW292-PB1、pHW293-PA三个片段各600ng/孔，以 pHW-NS-HAmut-NS、pHW295-NP、pHW296-NA、pHW297-M、 pHW-HA-NS1-128mut-HA各300μl/孔的量加到100μl/孔不含抗生素和血清的DMEM中，并使用微量移液器轻微吹打以使质粒在DMEM中充分混匀。之后，加入3μl/孔polyjet转染试剂再次混匀，于室温中作用13min。在脂质体作用期间，将培养在35mm直径dish中的共培养的MDCK和293T细胞(个数比为1:3，融合度在60～80％) 用无抗生素无血的DMEM洗涤2遍，再加入1ml不含抗生素和血清的DMEM。脂质体作用完成后，将上述配好的8个片段重组质粒和转染试剂混合物逐滴加入到dish中。将培养皿在37℃二氧化碳培养箱培养8～10h后，换液为含有终浓度为2μg/ml TPCK胰酶的无抗无血DMEM 1.5ml，37℃继续培养60h左右后，用封口膜将整个培养皿封口，置于-70℃冰箱中反复冻融三次。收集经过冻融处理的细胞上清接种9日龄SPF鸡胚(0.3ml/胚)，于37℃孵化箱中培养。培养 72h后，常规方法测鸡胚HA效价，收集效价最高的尿囊液。
拯救结果显示，pHW-NS-HAmut-NS和pHW-HA-NS1-128mut-HA 双互换入母本病毒骨架成功获得拯救病毒rTX-NS1-128(mut)，单互换 pHW-NS-HAmut-NS或pHW-HA-NS1-128mut-HA不能获得拯救病毒。之后将接种9日龄鸡胚所收获的尿囊液再接种9日龄鸡胚进行连续传代，最后收获连续传代5次的病毒液，提取病毒RNA，反转录 cDNA进行PCR鉴定，HA片段鉴定引物为SEQ ID No.41～SEQ ID No.42，NS片段鉴定引物为SEQ ID No.43～SEQ ID No.44，具体如表 6所示，扩增体系如表7所示，所有片段扩增的PCR反应程序均为： 95℃预变性3min；95℃变性15s，Tm退火15s，72℃延伸15s/kb， 35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
表6 rTX-NS1-128(mut)HA和NS片段扩增引物
Figure RE-GDA0002610294350000101
所述扩增体系(25μL)如表7所示：
表7基因扩增体系
Figure RE-GDA0002610294350000102
鉴定结果如图2所示，其中，M：DL2000 marker；泳道1： NS-HAmut-NS片段大小(1835bp)；泳道2：HA-NS1-128mut-HA片段大小(990bp)。由图2可知，成功拯救得到互换包装信号的H9N2 NS1基因缺失病毒rTX-NS1-128(mut)。
实施例2
病毒的血凝效价、SPF鸡胚半数感染量测定及MDCK细胞上的生长曲线测定
取25μl鸡胚尿囊液加入25μl PBS中做21-211倍比稀释后加入25μl 1％鸡红细胞悬液，同时做阴性对照孔，37℃温箱放置10min，读取血凝效价，结果如表8所示，互换包装信号的NS1基因缺失重组病毒相比亲本病毒和NS1基因缺失病毒的HA效价分别下降3个和1个滴度。
表8病毒HA效价
Figure RE-GDA0002610294350000111
将病毒尿囊液原液以含抗生素的PBS作105～1010梯度稀释，接种5个9日龄SPF鸡胚，0.1ml/个，于37℃温箱孵育72h。收取尿囊液，测定尿囊液HA效价，并计算半数感染量，结果如表9所示。
表9重组病毒鸡胚半数感染量
Figure RE-GDA0002610294350000112
本发明所述rTX-NS1-128(mut)重组病毒对SPF鸡胚的半数感染量相较母本病毒及NS1基因缺失病毒都有不同程度的下降。
将1×106的MDCK细胞培养于6孔板中，以MOI＝0.001的感染剂量接种rTX、NS基因缺失重组病毒以及包装信号互换病毒。吸附 1h后，用PBS洗3遍，再加含有终浓度为2μg/mlTPCK胰酶的无抗无血DMEM进行细胞培养。分别在感染后的12、24、36、48、60 和72h收集细胞上清，测定病毒组织半数感染量(TCID50)并绘制病毒的增殖曲线。
结果如图3所示。在MDCK细胞上，rTX、rTX-NS1-128和 rTX-NS1-128(mut)的复制水平在不同时间点存在显著性差异。三株病毒复制均在60小时到达高峰，在感染后的所有时间点，亲本病毒 TX的繁殖滴度均显著高于NS1基因缺失病毒(P<0.05)，NS1基因缺失病毒显著高于包装信号互换病毒(P<0.05)。
实施例3
HA和NS片段重组测定
将1×106的MDCK细胞培养于6孔板中，以MOI＝10的感染剂量同时接种rTX野毒株和NS1-128(mut)包装信号互换的NS截短减毒病毒，吸附1h后，用PBS洗3遍，再加含有终浓度为2μg/ml TPCK 胰酶的无抗无血DMEM 1ml进行细胞培养。在感染后的12小时后冻融三次收集上清，离心后备用。
长满单层的MDCK细胞培养于12孔板中，弃去培养基后PBS 洗平板三次。以无抗无血MEM培养基梯度稀释病毒至10-5，沿孔壁加入200μl病毒稀释液，摇晃平板混匀。将12孔板置于37℃孵育1h，期间每隔15分钟摇晃平板混匀一次。然后去除接种物，PBS洗平板三次，加入含有终浓度为1μg/ml TPCK胰酶的2×EMEM培养基与 1.6％琼脂糖水1:1混合物1mL/孔，在室温下固化。37℃倒置孵育72h，期间每天观察空斑形成。72h后，用PBS 1：20倍比稀释0.33％的中性红溶液，然后与1.6％琼脂糖水1:1混匀加入12孔板中，1mL/孔， 37℃避光倒置孵育24h，挑取单个空斑装入含400μl MEM的指形管中。空斑样品冻融三次后取200μl上清接种铺MDCK细胞的24孔板中，孵育1h后换液为终浓度2μg/ml TPCK胰酶的MEM培养基。37℃孵育72h后测定上清HA效价，收取有效价的上清液，提取病毒RNA，反转录获得cDNA，设计引物进行PCR鉴定。
表10 HA和NS片段鉴定引物
Figure RE-GDA0002610294350000121
HAJD F与HA/NS JD R引物对用以鉴定HA片段来源，母本株 HA片段扩增大小为1217bp，重组病毒HA片段扩增大小为1321bp。 NS JD F与HA/NS JD R引物对用以鉴定NS片段来源，母本株NS片段扩增大小为408bp，重组病毒NS片段扩增大小为532bp。对共感染样品进行空斑纯化，共获得了48株有效样品。对其进行PCR检测，结果如图3所示，所有空斑样品均不能发生HA和NS片段的独立重配，且检测到所有HA和NS片段均来自母本病毒rTX。
实施例4
为了测定包装信号互换病毒对鸡的致病性。以106EID50/200μl 的病毒量以滴鼻点眼方式接种4周龄SPF鸡，11只鸡/组。攻毒后连续观察21d。
为了测定病毒在组织中的复制能力，攻毒后第3d和第5d分别麻醉处死3只鸡收集气管和肺脏组织。取一部分收集的组织，按1g/0.3 ml的比例加入PBS后电动匀浆组织，8,000r×10min离心后收集上清。将上清接种SPF鸡胚测定EID50，结果如表11。NS截短致弱病毒rTX-NS1-128组有两只鸡可以在感染病毒后第3天和第5天在气管中检测到，滴度分别为2.05±0.28log10EID50/0.1ml和0.81±0.2 log10EID50/0.1ml。包装信号互换的NS截短致弱病毒 rTX-NS1-128(mut)组仅有一只鸡可以在感染病毒后第3天和第5天在气管中检测到，滴度分别为2.77log10EID50/0.1ml和2.33 log10EID50/0.1ml。在感染后第3天和第5天均不能在肺组织中检测到病毒。母本毒组rTX在气管和肺中均能检测到复制滴度较高的病毒，第3天分别可达2.41±1.08log10EID50/0.1ml和1.67log10EID50/0.1ml。 rTX-NS1-128与rTX-NS1-128(mut)组差异不显著(p>0.05)。
表11病毒在鸡气管和肺组织中的复制滴度
Figure RE-GDA0002610294350000131
注：表中a阳性拭子/全部拭子；b未分离到病毒。
实施例5
为了检测病毒在鸡中的排毒情况，攻毒后第3d、5d和7d分别采集喉拭子和泄殖腔棉拭子，以常规方法对棉拭子进行处理后接种鸡胚，结果如表12。rTX-NS1-128组能从喉头排毒，第3天的排毒率为 10/10，第5天的排毒率为8/10，第7天会降低到3/10；该毒株感染鸡后不能从泄殖腔排毒；rTX-NS1-128(mut)组也能从喉头排毒，第3 天的排毒率为8/10，低于对照组，第5天的排毒率为8/10，第7天会降低到2/10；该毒株感染鸡后也不能从泄殖腔排毒；母本毒rTX组喉头排毒与rTX-NS1-128组相似，但这组鸡在第3天可以通过泄殖腔排毒(3/10)。rTX-NS1-128(mut)与rTX-NS1-128差异不显著(p>0.05)。
表12病毒感染鸡排毒情况
Figure RE-GDA0002610294350000132
Figure RE-GDA0002610294350000141
注：表中a喉拭子；b泄殖腔拭子。
实施例6
病毒在鸡中的传播试验
在传播试验中，每组包含15只SPF鸡，10只接种106EID50/200μl 的病毒0.2ml作为供体组；接种24h后在同一笼中放入5只鸡作为接触组。接种及暴露后的第3d、5d和7d分别采集接种组和接触组中鸡的喉拭子和泄殖腔拭子，对棉拭子进行处理后接种鸡胚测定排毒情况。接种或暴露后14d，采集鸡血，分离血清并测定HI值以观察血清转阳现象。
病毒分离结果如表13。rTX-NS1-128组仅在接种后第3天和第5 天从喉拭子中检测到排毒，排毒率分别为80％和50％。rTX-NS1-128 (mut)组相应的排毒率分别为60％和40％，两组差异不显著(p> 0.05)。在第14天时，所有接种鸡均发生了血清转阳。接触组的鸡均未检测到病毒，也未发生血清转阳现象。
表13病毒的传播特性实验
Figure RE-GDA0002610294350000142
注：表中a喉拭子；b泄殖腔拭子。
实施例7
重组病毒诱导抗体水平及持续时间
为了检查抗体水平及持续时间，将包装信号互换病毒以106 EID50/200μl的剂量以滴鼻方式接种4周龄SPF鸡后，每隔7d分离血清并测定HI值，持续11周。免疫后一周可达接近4log2的HI抗体水平，第二周抗体水平开始上升，免疫后三周HI达到峰值，平均可达7.89±0.87log2，然后开始缓慢下降，免疫后11周还可达3.85±0.25 log2(图5)。
实施例8
攻毒保护试验
以106EID50/200μl的剂量以滴鼻点眼方式免疫4周龄SPF鸡，接种PBS的鸡作为对照。免疫21d后，以106EID50/200μl剂量的同源病毒TX和异源病毒F98(参见Liu JH,OkazakiK,Shi WM,Wu QM, Mweene AS,Kida H(2003)Phylogenetic analysis ofneuraminidasegene of H9N2 influenza viruses prevalent in chickens in China during 1995–2002.Virus Genes 27:197–202.)通过滴鼻方式攻击试验鸡。攻毒后第3d、5d和7d分别采集喉拭子和泄殖腔棉拭子以测定排毒情况。免疫鸡群攻毒结果显示(表14)，对于母本毒rTX，疫苗株可以提供100％的保护；对于异源毒株F98可以提供80％的保护，在攻毒后第3天可以在喉拭子中检测到排毒(2/10)。对于同源病毒TX和异源病毒F98攻毒对照组，在攻毒后第3天均能检测到喉头排毒，排毒率为100％，泄殖腔排毒率分别为40％和30％，是排毒高峰；攻毒后第5天排毒率开始下降。
表14 SPF鸡疫苗候选株免疫保护实验
Figure RE-GDA0002610294350000151
注：表中a喉拭子；b泄殖腔拭子。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 扬州大学
青岛易邦生物工程有限公司
<120> 一种互换HA和NS1缺失基因包装信号的H9N2亚型禽流感病毒及其构建方法和应用
<160> 47
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1917
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcaaaagca gggtgacaaa aacatattgg attccaacac tgtgtcaagc ttccagctag 60
actgctttct ttggcttgtc cgcaaacgat ttgcagacca agaaatggaa accatctccc 120
tcatcaccat cctgctggtc gtcacggtct cgaatgcaga caaaatctgc atcggctatc 180
aatcaacaaa ctccacagaa actgtagaca cactaacaga aaacaatgtc cctgtgacac 240
atgccaaaga attgctccac acagagcata atgggatgct gtgtgcaaca ggcttgggac 300
atcctcttat tctagacacc tgtaccattg aaggactaat ctatggcaat ccttcttgtg 360
atctactgct gggaggaaga gaatggtcct atatcgtcga gagaccatca gctgttaacg 420
gactgtgtta ccccgggaat gtagagaatc tagaagagct aaggtcactt tttagttctg 480
ctagttctta tcaaaggatc cagatttttc cagacacaat ctggaatgtg acttacagtg 540
ggacaagcaa agcatgttca gattcattct acagaagcat gagatggttg acccaaaaga 600
acaacgctta ccctattcaa gacgcccaat acacaaataa tcaagaaaag aacattcttt 660
tcatgtgggg cataaatcat ccccccaccg atactgtgca gacaaatctg tacacaagaa 720
ccgacacaac aacgagtgtg gcaacagaag aaataaatag gaccttcaaa ccattgatag 780
gaccaaggcc tcttgttaat ggtatgcagg gaagaatcga ctattattgg tcggtattga 840
aaccgggtca aacgctgcga ataagatcca atggaaatct aatagctcca tggtatggac 900
acattctttc tggagagagc cacggaagaa tcctgaagac tgatttaaaa aggggtagct 960
gcacagtgca atgtcagacc gaaaaaggtg gcttaaacac aacattgcca ttccaaaacg 1020
taagtaagta tgcatttgga aactgctcga aatacattgg aataaagagt ctcaaactcg 1080
cagttggtct gaggaatgtg ccttctagat ctagtagagg actattcggg gccatagcag 1140
gattcataga gggaggctgg tcaggactag ttgctggttg gtatggattc cagcattcaa 1200
atgaccaagg ggttggtatg gcagctgata gagactcaac ccaaaaggca attggcaaaa 1260
taacatccaa agtgaataat atagtcaaca aaatgaacaa gcagtatgaa attattgatc 1320
atgaattcag cgaggttgaa gctagactta acatgatcaa taataagatt gatgatcaaa 1380
tccaagacat atgggcatat aatgcagaat tactagttct gcttgaaaac cagaaaacac 1440
tagatgagca tgatgcaaat gtaaacaatc tatataataa agtgaagagg gcattgggtt 1500
ccaatgcaat ggaagatggg aaaggatgtt tcgagctata ccacaaatgt gataaccagt 1560
gcatggagac gattcggaac gggacctaca acaggaggaa atatcaagag gaatcaaaat 1620
tagaaagaca gaaaatagag ggggtcaagc tggaatctga aggaacttac aaaatcctca 1680
ccatttattc gactgtcgca agcagcctcg taatcgccat gggattcgcc gcttttctat 1740
tttgggcgat gagcaacggc agctgtaggt gtaatatctg catctgaaaa ttacggaaaa 1800
tagctttgag caaataactt ttatgcaagc cttacaacta ttgcttgaag tggaacaaga 1860
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<210> 2
<211> 1019
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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ttctttccag gtagattgct ttctttggca tgtccgcaaa cgatttgcag accaagaaat 180
gggtgatgcc ccatttctag accggcttcg ccgagatcag aagtccctga gaggaagaag 240
cagcactctt ggtctggaca tcagaactgc tactcgtgaa ggaaagcata tagtggaacg 300
gattttagag gacgagtcag atgaagcatt taaaatgagt attgcttcag tgccagcccc 360
acgctaccta actgacatga ctcttgaaga aatgtcaaga gattggttaa tgctcattcc 420
caaacagaaa gtaacagggt ccctttgcat tagaatggac caagcaatag tggacaaaaa 480
catctaggaa ggagcaattg tgggcgaaat ctcaccatta ccttctcttc caggacatac 540
tgacaaggat gtcaaaaatg caattgaggt cctcatcgga ggatttgaat ggaatgataa 600
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<212> DNA
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<400> 3
ctcaagttgg agacaatatc actaataact atactactag tag 43
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatattgtct ccaacttgag tgttgtgaaa ttcccctgct tt 42
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acagtaagca ttgcagacaa aatctgcatc ggct 34
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttgtctgca atgcttactg ttactactag tagtatag 38
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgtgattgca ttggggtttg ctgccttctt gtt 33
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcaaacccca atgcaatcac aagggatgag gcg 33
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gttctgggcc ttgtccattg ggtcttgc 28
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acccaatgga caaggcccag aacaagaag 29
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggtcttgcag ttgcaacatt tgtatttgat tggcaaaaac 40
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caaatgttgc aactgcaaga cccaatggac aagg 34
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
catattggat tccaacactg tgtcaagctt c 31
<210> 14
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cagtgttgga atccaatatg tttttgtcac cctgcttttg ct 42
<210> 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aagcttccag ctagactgct ttctttggct tgtccg 36
<210> 16
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aagcagtcta gctggaagct tgacacagtg ttgg 34
<210> 17
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<400> 17
tttctttggc ttgtccgcaa acgatttgca g 31
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tttgcggaca agccaaagaa agcagtctac ctgg 34
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<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aataactttt ttgcaagcct tacaactatt gcttgaag 38
<210> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcttgcaaaa aagttatttg ctcaaagcta ttttccgtaa ttt 43
<210> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agcttattta ttgataaaaa acacccttgt ttctact 37
<210> 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttttttatca ataaataagc tgaaacgaga aagttc 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atggaaacca tctccctcat caccatcctg ctggtcgtca cggtctcgaa tgcagacaaa 60
atctgcat 68
<210> 24
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ccaaaataga aaagcggcga atcccatggc gattacgagg ctgcttgcga cagtcgaata 60
aatggtg 67
<210> 25
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tcagatgcag atattacacc tacagctgcc gttgctcatc gcccaaaata gaaaagcggc 60
gaatc 65
<210> 26
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
atggacagca ataccgtcag ttctttccag gtagattgct ttctttggca tgtcc 55
<210> 27
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ttagatcaat tggaagctaa aggtccggat ttcctgctcc acttcaagc 49
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aataacccgg cggcccaa 18
<210> 29
<211> 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cccccccaac ttcggag 17
<210> 30
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ctccgaagtt gggggggagc aaaagcaggg tg 32
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ggagatggtt tccatttctt ggtctgcaaa 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tttgcagacc aagaaatgga aaccatctcc 30
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
attttccgta attttcagat gcagatat 28
<210> 34
<211> 28
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atatctgcat ctgaaaatta cggaaaat 28
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ctccgaagtt gggggggagc gaaagcaggg g 31
<210> 36
<211> 28
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gtattgctgt ccatatgcag attttgtc 28
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gacaaaatct gcatatggac agcaatac 28
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ggattttgta agttttagat caattgga 28
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tccaattgat ctaaaactta caaaatcc 28
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ttgggccgcc gggttattag tagaaacaag ggt 33
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<211> 18
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tccagctaga ctgctttc 18
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taagctgaaa cgagaaag 18
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gggaatttca caacactc 18
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tttgccaatc aaatacaaat 20
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aagaacaacg cttaccct 18
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gaaggagcaa ttgtgggcga 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
agtagaaaca agggtgtttt t 21

Claims (10)

1.一种互换HA和NS缺失基因包装信号的H9N2重组NS-HAmut-NS和HA-NS1-128mut-HA基因，其特征在于，所述NS-HAmut-NS的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述HA-NS1-128mut-HA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种重组H9N2亚型禽流感病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述重组NS-HAmut-NS和HA-NS1-128mut-HA基因分别构建到pHW2000质粒载体上，得到pHW-NS-HAmut-NS和pHW-HA-NS1-128mut-HA；
(2)以H9N2亚型禽流感病毒TX株为亲本毒株，将步骤1)中所述pHW-NS-HAmut-NS和pHW-HA-NS1-128mut-HA与所述亲本毒株的其余6片段共转染真核细胞，得到重组H9N2亚型禽流感病毒rTX-NS1-128(mut)。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤2)中所述真核细胞包括MDCK细胞和293T细胞。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤2)中所述共转染的方法包括脂质体共转染法。
5.根据权利要求2～4任意一项所述的构建方法，其特征在于，步骤2)中所述亲本毒株的其余6片段为pHW291-PB2、pHW292-PB1、pHW293-PA、pHW295-NP、pHW296-NA和pHW297-M。
6.权利要求2～5任意一项所述的构建方法构建得到的重组H9N2亚型禽流感病毒rTX-NS1-128(mut)，其特征在于，HA的效价为6log2。
7.根据权利要求6所述重组H9N2亚型禽流感病毒rTX-NS1-128(mut)，其特征在于，与所述野生毒株的HA和NS片段不发生独立重配。
8.根据权利要求6所述重组H9N2亚型禽流感病毒rTX-NS1-128(mut)，其特征在于，滴度为7.48～8.18log10EID50/0.1ml。
9.一种互换HA和NS缺失基因包装信号的H9N2减毒活疫苗，其特征在于，由权利要求6～8任意一项所述重组H9N2亚型禽流感病毒rTX-NS1-128(mut)制备得到。
10.权利要求6～8任意一项所述重组H9N2亚型禽流感病毒rTX-NS1-128(mut)在H9N2减毒活疫苗中的应用。
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