CN111642520B - 一种淡紫拟青霉可湿性粉剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种淡紫拟青霉可湿性粉剂及其应用，属于害虫生物防治技术领域，包括以下质量百分数的组分：淡紫拟青霉分生孢子纯孢粉10%，润湿剂3%，分散剂5%，紫外保护剂0.25%；孢子萌发促进剂0.1%；粘着剂0.05%；载体81.6%。本发明的淡紫拟青霉可湿性粉剂克服了化学农药产生的环境污染、农药残留和害虫抗药性等问题，是一种高效、安全、环境友好的生防菌制剂，为柑橘木虱、柑橘全爪螨和棉蚜的生物防治提供了一种新的材料。

Description

一种淡紫拟青霉可湿性粉剂及其应用

技术领域

本发明属于害虫生物防治技术领域，更具体的，涉及一种淡紫拟青霉可湿性粉剂及其应用。

背景技术

柑橘木虱、柑橘全爪螨和棉蚜是柑橘上的重要害虫。这些害虫通常聚集在柑橘的枝梢、叶片或果实上通过吸食汁液危害，造成柑橘枝梢枯死、落叶和落果，并可产生分泌物而诱发煤烟病。其中柑橘木虱更是当前柑橘生产上防治最难、威胁最大的毁灭性病害—柑橘黄龙病的唯一自然传播媒介，目前对于柑橘黄龙病仍缺乏理想的防治药剂，“治虫防病”通常是防控该病害的关键技术措施。目前对于这些害虫的防治仍以化学农药为主，然而化学农药的频繁使用带来的抗药性、环境污染和农药残留等问题日趋严重。随着人们对生态环境、食品安全等问题的关注，研制安全高效的防治药剂并建立新的病虫害防控措施成为当前农业生产中一项紧迫的任务，也是涉及柑橘业可持续发展的重要课题。而生物农药因具有无残留、特异性强、不易产生抗药性、环境相容性好、生产工艺简单等特点越来越引起人们的重视。

在利用生防菌防治柑橘害虫的研究方面，国内外学者相继开展了一些有益的探索。其中已报道的对柑橘木虱具致病力的真菌有玫烟色拟青霉、柑橘霉炱菌等，对柑橘全爪螨具致病力的真菌有汤普森多毛菌等，对橘蚜等柑橘蚜虫有致病力的真菌有砖红镰孢菌等。但现有研究多集中在实验室探索阶段，市场上鲜见商品化的微生物农药产品可供在柑橘害虫防治中应用。

淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）又名淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum），是一种重要的生防真菌。已有研究表明该菌对多种植物线虫都具有较强的寄生性和致病性，且对水稻纹枯病、玉米小斑病菌和柑橘绿霉病菌等多种植物病原菌具有一定的拮抗作用，其代谢产物还可促进种子萌发、促进植物根系和植株生长等，其产生的多种功能酶还具有一定的农药降解效应。淡紫拟青霉ZJPL08为本实验室从浙江台州地区的柑橘木虱虫体上分离的一株真菌。经致病性分析，确定该菌株对柑橘木虱具有强致病力；经生物学特性分析，确定该菌株对高低温和紫外线等具有较强的抗逆性，且具有生长速度快，产孢量大，孢子萌发率高等优良特性，因此该菌株具有良好的开发和应用前景。目前国内外尚未有关于利用淡紫拟青霉可湿性粉剂防治柑橘木虱等害虫的报道。为此，通过剂型的比较、辅料的筛选等制备出一种质量稳定、应用方便的淡紫拟青霉可湿性粉剂，为柑橘木虱、柑橘全爪螨和棉蚜等害虫的防治提供一种新的选择。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是弥补当前柑橘木虱、柑橘全爪螨和棉蚜等害虫防治中缺乏真菌生物制剂的不足，提供一种淡紫拟青霉可湿性粉剂。

本发明的第二个目的是提供上述可湿性粉剂的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述可湿性粉剂在防治害虫方面的应用，具体地，提供上述可湿性粉剂在防治柑橘木虱、柑橘全爪螨和棉蚜中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种淡紫拟青霉可湿性粉剂，包括以下各质量百分数的组分：淡紫拟青霉分生孢子纯孢粉10%，润湿剂3%，分散剂5%，紫外保护剂0.25%；孢子萌发促进剂0.1%；粘着剂0.05%；载体81.6%。

所述的淡紫拟青霉为淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）菌株ZJPL08（201310117537.1中已公开），于2013年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 7318。

优选地，所述淡紫拟青霉分生孢子纯孢粉含孢量为2.96~3.74×10¹¹个/g，活孢率为98.31~99.43%，含水量为6.06~6.44%。

优选地，所述的润湿剂为十二烷基硫酸钠，所述的分散剂为木质素磺酸钠，所述的紫外保护剂为腐殖酸，所述的孢子萌发促进剂为氯化钙，所述的粘着剂为黄原胶，所述的载体为硅藻土。

所述可湿性粉剂的制备方法：将载体、润湿剂、分散剂、紫外保护剂、孢子萌发促进剂和粘着剂等按比例混合，再加入淡紫拟青霉分生孢子粉，搅拌均匀，过325目标准筛，充分搅拌混匀即制得淡紫拟青霉可湿性粉剂。

所述淡紫拟青霉可湿性粉剂在柑橘木虱、柑橘全爪螨和棉蚜防治中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明的淡紫拟青霉可湿性粉剂产品性能指标优良，含孢量为2.98×10¹⁰个/g，活孢率为92.34%，含水量为3.59%，润湿时间为85.32 s，孢子悬浮率为84.76%，细度为96.52%通过325目筛，pH为6.85。

本发明的淡紫拟青霉可湿性粉剂可用于防治柑橘木虱、柑橘全爪螨和棉蚜。在室内条件下，在处理后7 d其对柑橘木虱的LC₅₀为1.39 × 10⁴个/mL，浓度为1.0× 10⁸个/mL的可湿性粉剂对柑橘木虱的LT₅₀为2.64 d；在以浓度为1.99 × 10⁷个/mL的可湿性粉剂处理后3 d，柑橘全爪螨和棉蚜的校正死亡率分别为66.67%和78.26%，在处理后7 d其校正死亡率分别达95.65%和100.00%。在田间条件下，以浓度为1.99 × 10⁷个/mL的可湿性粉剂处理后3 d，柑橘木虱的校正死亡率为42.83%，在处理后14 d，柑橘木虱的校正死亡率达100%。

本发明的淡紫拟青霉可湿性粉剂克服了化学农药产生的环境污染、农药残留和害虫抗药性等问题，是一种高效、安全、环境友好的生防菌制剂，为柑橘木虱、柑橘全爪螨和棉蚜的生物防治提供了一种新的材料。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步具体描述。下述所使用的实验方法若无特殊说明，均为本技术领域现有的常规方法。所使用的的配料、试剂或材料，如无特殊说明，均为可通过商业途径得到的配料、试剂或材料。本发明不应限制于实施例范围。

实施例1：淡紫拟青霉ZJPL08分生孢子纯孢粉的制备与质量测定

1. 菌种活化

将保存于4 ℃的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA，配方为：马铃薯200 g，葡萄糖20g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，自然pH）斜面中的菌种转接至PDA平板培养基中，于28 ℃培养箱中恒温培养7 d。

2. 种子液制备

用无菌接种环挑取上述活化后的菌株ZJPL08孢子至种子培养液马铃薯蔗糖液体培养基（PSB，配方为：马铃薯200 g，蔗糖20 g，蒸馏水1000 mL，自然pH）中，置于恒温振荡摇床中（28 ℃，120 rpm/min）培养3 d，作为种子液用于接种固体培养基扩大培养。

3. 固体发酵培养

将大米置于1000 mL烧杯中，用水浸泡过夜，沥干水分，于高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌21 min，将灭菌后的米料冷却至室温，在超净工作台中将培养好的种子液按10%接种量接到固体米料中，搅拌均匀后转入培养皿中，每皿约100 g，3个重复。置于28 ℃培养箱中恒温培养7 d。

4. 纯孢粉的收获

待培养7 d至大米培养基中长出深紫色孢子粉，将培养皿的皿盖用灭过菌的报纸代替，置于35 ℃鼓风干燥箱中干燥36 h后，取出培养皿于超净工作台中用325目标准分样筛筛分，获得菌株ZJPL08纯孢子粉。

5. 纯孢粉质量指标测定

含孢量测定：称取 0.01 g 孢子粉加入到 1 mL 含 0.5% OP-10的无菌水试管中，涡旋振荡 5 min使孢子分散成均匀的悬液，将孢子悬液稀释100倍后用血球计数板在显微镜下计数，重复 5次，计算平均值。所用血球计数板规格为25格×16格，计数时只需计算双线计数区内四角的四个中格和中央一中格的孢子总数。含孢量计算方法见下列公式：含孢量（个/g）=5个中方格孢子总数/5×25×10×10³×稀释倍数×100。结果见表1。

活孢率测定：称取0.01 g分生孢子粉加入到1 mL马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB，配方为：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1000 mL，自然pH）中，混合均匀制得孢子悬浮液。用移液器吸取 0.1 mL孢子悬浮液滴于无菌载玻片中央，然后将玻片置于培养皿中的U型玻璃棒上，培养皿底部铺有无菌滤纸，滴加2 mL无菌水至滤纸上保湿，然后将培养皿置于微生物培养箱中28 ℃恒温培养，每处理做3个重复。培养一段时间后，取出玻片，置于显微镜下随机计数200~300个孢子，以视野中芽管长度大于孢子宽度的一半作为孢子萌发的标准。按照下列公式计算孢子萌发率：孢子萌发率（%）=计数区萌发的孢子数/计数区孢子总数×100。结果见表1。

含水量测定：准确称取 0.1 g 孢子粉于已恒重的 9 cm 培养皿中，于 100℃的数显鼓风干燥箱中干燥至恒重，将孢子粉与器皿一起称重，计算孢子含水量。试验做5个平行，取平均值。含水量计算方法见公式：含水量（%）=（恒重前皿孢总质量-恒重后皿孢总质量）/孢子总质量×100。结果见表1。

表1 淡紫拟青霉ZJPL08纯孢粉质量指标

实施例2：淡紫拟青霉ZJPL08可湿性粉剂载体和助剂的筛选

1. 载体的筛选

用于筛选的载体有：碳酸钙、高岭土、滑石粉、硅藻土和凹凸棒土，购自上海世泽生物科技有限公司；面粉，当地超市购买。

（1）载体对孢子萌发的影响：将上述载体粉末按以5%（w/v）的比例与融化的PDA培养基混合，灭菌后制成平板。取0.1 mL 孢子浓度约为 10³ 个/mL 的菌株ZJPL08分生孢子悬浮液，涂布在含不同载体的各平板上。以不含载体的 PDA 平板为对照。每处理设置 3 个重复。将所有处理的平板置于 28 ℃下培养2-3 d。观察各平板长出的淡紫拟青霉菌落形成单位数并计算孢子萌发率。

（2）载体对菌丝生长的影响：按上述方法制备含各种载体的平板。用直径5 mm打孔器取培养7 d的淡紫拟青霉边缘生长旺盛的菌丝块，接种到各培养基上，每处理设置3个重复，然后置于28 ℃恒温条件下培养，于培养不同时间测量各菌落的直径，记为d1。按下列公式计算菌落直径日增长量：菌落直径日增长量（mm/d）= d1/生长天数。

菌株ZJPL08与各载体的生物相容性测定结果如表2所示。从结果可知，除高岭土和滑石粉外，其他载体对菌株ZJPL08的孢子萌发均无不良影响，凹凸棒土和面粉甚至会促进孢子萌发；CaCO₃、硅藻土和面粉对菌丝生长有促进效果，凹凸棒土对菌丝生长影响较小。综合考虑各载体的性能和成本，选用硅藻土作为载体用于淡紫拟青霉可湿性粉剂ZJPL08的可湿性粉剂制备。

表2 不同载体与淡紫拟青霉的生物相容性

注：同列中数字后面标注不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著

2. 润湿剂筛选

用于筛选的润湿剂有：十二烷基硫酸钠SDS，为Amersco公司产品；十二烷基苯磺酸钠SDBS，为天津博迪化工股份有限公司产品。

（1）润湿力测定：将各润湿剂按1%，3%和5%（w/v）的比例和孢子粉10%比例加入到硅藻土中，混合均匀制成样品。准确称取样品0.1 g，从烧杯口齐平位置一次性均匀倒入盛有100 mL标准水的150 mL烧杯页面上，加样品时立即用秒表记时，直至样品全部润湿为止，记下润湿时间，每处理3个重复，以不加润湿剂的样品为对照。

（2）生物相容性测定：将各种润湿剂分别以100、200、400、800、1500、3000 μg/mL的终质量浓度与PDB液体培养基混合，称取0.01 g分生孢子粉加入到1 mL配制的溶液中，混合均匀制得分子孢子悬浮液。然后用移液器吸取 0.1mL悬浮液滴于无菌载玻片中央，置于28℃培养箱中保湿培养，每处理设置3个重复，以不含润湿剂的孢子悬浮液为对照。培养一段时间后，取玻片置于光学显微镜下，以上述同样的方法观察孢子萌发情况并计算孢子萌发率，分析各润湿剂对菌株ZJPL08分生孢子萌发的影响。将各种润湿剂与PDA培养基混合配成100、200、400、800、1500、3000 μg/mL的质量浓度，高压灭菌后制成平板。以上述同样的方法，接种直径5 mm的淡紫拟青霉菌丝块，然后置于28 ℃恒温条件下培养，每处理设置3个重复，以菌丝块接种在不含润湿剂的PDA平板上为对照，于不同培养时间测量各菌落的直径并计算菌丝日生长量。

各润湿剂对菌株ZJPL08分生孢子的润湿效果如表3所示，与菌株ZJPL08的生物相容性如表4和表5所示。由表3可知，各润湿剂的润湿力因种类和浓度不同而异，十二烷基硫酸钠较十二烷基苯磺酸钠差异显著，且各润湿剂不同浓度的润湿力表现为显著差异。十二烷基硫酸钠的润湿力随浓度增加，润湿时间减少，浓度为5%时润湿时间最短，为11.24 s。十二烷基苯磺酸钠润湿力较差，在5%浓度时，润湿力还很低，为180.5 s。由表4可知，不同润湿剂对菌株孢子萌发率影响不同，十二烷基硫酸钠对孢子萌发率影响显著，浓度较高时对菌株ZJPL08的孢子萌发有明显的抑制作用，而浓度为100 μg/mL时几乎没有影响，而十二烷基苯磺酸钠对菌株孢子萌发率影响不大，即使浓度达到3000 μg/mL时，孢子萌发率仍可达78.70%。由表5可知，十二烷基硫酸钠对菌株ZJPL08的菌丝生长影响明显，较高浓度（>1500μg/mL）会完全抑制菌丝生长，而在100 μg/mL低浓度时对菌丝生长几乎无影响。相比之下，十二烷基苯磺酸钠对菌丝生长影响较小，在3000 μg/mL高浓度下菌丝日生长量仍可达2.78mm。综合考虑各润湿剂的润湿力及其生物相容性，选用低浓度的十二烷基硫酸钠作为润湿剂用于淡紫拟青霉ZJPL08的可湿性粉剂制备。

表3 各种润湿剂在不同浓度下对菌株ZJPL08分生孢子的润湿效果

注：同列中数字后面标注不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著

表4 不同润湿剂不同浓度对菌株ZJPL08孢子萌发率的影响

注：同行中数字后面标注不同大写字母表示在P<0.05水平差异显著，同列中数字后面标注不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著

表5 不同润湿剂不同浓度对菌株ZJPL08菌丝生长的影响

注：同行中数字后面标注不同大写字母表示在P<0.05水平差异显著，同列中数字后面标注不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著

3. 分散剂的筛选

用于筛选的分散剂有：木质素磺酸钠、木质素磺酸钙和蔗糖脂肪酸酯，均购自上海世泽生物科技有限公司。

（1）分散力测定：分散剂粗筛：将载体、润湿剂、孢子粉混合后，添加5%待选分散剂加工成样品，然后称0.05 g含1%的润湿剂的样品倒入盛有50 mL标准硬水的80 mL小烧杯中，目测样品的分散情况。粗筛分散情况分三个等级：优：在水中呈云雾状自动分散，无可见颗粒下沉，用“＋”表示。良：在水中自动分散，有颗粒下沉，下沉颗粒可慢慢分散或轻摇后分散，用“＋－”表示。劣：在水中不能自动分散，呈颗粒状下沉或絮凝状下沉，经强烈摇动后才能分散，用“－”表示。分散剂细筛：细筛以制剂有效成分的悬浮率为指标，操作步骤按 GB/T14825-2006 进行。以上操作每处理设置3个重复，孢子悬浮率计算方法见公式：孢子悬浮率（%）=（母液中孢子含量-下悬液中孢子含量）/母液中孢子含量×10/9×100。

（2）生物相容性测定：将各种分散剂分别以100、200、400、800、1500 μg/mL的终质量浓度与PDB液体培养基混合，称取0.01 g分生孢子粉加入到1 mL配制的溶液中，混合均匀制得分生孢子悬浮液。然后用移液器吸取 0.1mL悬浮液滴于无菌载玻片中央，置于28℃培养箱中保湿培养，每处理设置3个重复，以不含分散剂的孢子悬浮液为对照。培养一段时间后，取玻片置于光学显微镜下，以上述同样的方法观察孢子萌发情况并计算孢子萌发率，分析各分散剂对菌株ZJPL08分生孢子萌发的影响。将各种分散剂与PDA培养基混合配成200、400、800、1500、3000 、5000 μg/mL的质量浓度，高压灭菌后制成平板。以上述同样的方法，接种直径5 mm的淡紫拟青霉菌丝块，然后置于28 ℃恒温条件下培养，每处理设置3个重复，以菌丝块接种在不含分散剂的PDA平板上为对照，于不同培养时间测量各菌落的直径并计算菌丝日生长量。

各分散剂粗筛时的分散效果如表6所示，细筛时的分散效果如表7所示，各分散剂与菌株ZJPL08的生物相容性如表8所示。由表6可知，木质素磺酸钠和蔗糖脂肪酸酯对淡紫拟青霉孢子分散能力较好，且比较稳定，样品在水中呈云雾状自动分散，无可见颗粒下沉。由表7可知，加入分散剂后可显著提高菌株ZJPL08分生孢子悬浮率，木质素磺酸钠和蔗糖脂肪酸酯的效果无显著差异。由表8和表9可知，木质素磺酸钙与木质素磺酸钠对菌株ZJPL08的菌丝生长和孢子萌发基本不产生影响，甚至低浓度的木质素磺酸钠对菌丝生长还有促进作用，而蔗糖脂肪酸酯与对照相比差异显著，对菌株菌丝生长和孢子萌发有明显的抑制作用。综合考虑各分散剂的分散效果及其与菌株ZJPL08的生物相容性，选择木质素磺酸钠作为分散剂用于淡紫拟青霉ZJPL08可湿性粉剂制备。

表6分散剂粗筛时分散效果

表7 各分散剂加入后的分生孢子悬浮率

注：同列中数字后面标注不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著

表8不同分散剂不同浓度对菌株ZJPL08孢子萌发率的影响

表9 不同分散剂不同浓度对菌株ZJPL08菌丝生长的影响

注：同行中数字后面标注不同大写字母表示在P<0.05水平差异显著，同列中数字后面标注不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著

4. 紫外保护剂的筛选

用于筛选的紫外保护剂有：抗坏血酸，为Sigma公司产品；腐殖酸和荧光素钠，购自上海世泽生物科技有限公司。

（1）保护效能测定：将各供试的紫外保护剂分别以0.25%的终质量浓度与PDB液体培养基混合，称取0.01 g分生孢子粉加入到1 mL配制的溶液中，混合均匀制得分生孢子悬浮液。然后用移液器吸取 0.1mL悬浮液滴于无菌载玻片中央，置于紫外灯（30 w，120 Lux）下20 cm处照射10 min 后，将玻片平放在培养皿中的U型玻璃棒上，培养皿中用湿润的无菌滤纸保湿。之后置于28 ℃下培养，在显微镜下抽样计数萌发孢子数并计算出萌发率。每处理设置3个重复，以不加紫外保护剂的淡紫拟青霉孢子悬液进行紫外照射作为对照。

（2）生物相容性测定：将各供试的紫外保护剂分别以0.25%的终质量浓度与PDB液体培养基混合，称取0.01 g分生孢子粉加入到1 mL配制的溶液中，混合均匀制得分生孢子悬浮液。然后用移液器吸取 0.1mL悬浮液滴于无菌载玻片中央，将玻片平放在培养皿中的U型玻璃棒上，培养皿中用湿润的无菌滤纸保湿。之后置于28 ℃下培养，在显微镜下计数萌发孢子数并计算萌发率。每处理设置3个重复，以不加紫外保护剂的淡紫拟青霉孢子悬液作为对照。

各紫外保护剂对菌株ZJPL08的保护效能及生物相容性如表10所示。由表10可知，对菌株ZJPL08分生孢子的保护效能最佳的为腐殖酸和荧光素钠，分别添加此两种保护剂的情况下，菌株ZJPL08的分生孢子经紫外照射10 min后的萌发率仍可达93.73%和77.16%。从添加紫外保护剂不进行紫外照射测定的孢子萌发率结果可知，各紫外保护剂均不会对菌株ZJPL08的孢子萌发产生明显影响，均具有较好的生物相容性。因此，综合考虑各紫外保护剂的保护效能及其与菌株ZJPL08的生物相容性，选用腐殖酸作为紫外保护剂用于淡紫拟青霉ZJPL08的可湿性粉剂制备。

表10 各紫外保护剂对菌株ZJPL08的保护效能及生物相容性

注：同列中数字后面标注不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著

5. 孢子萌发促进剂的筛选

用于筛选的孢子萌发促进剂有：硫酸锌、氯化钙和氯化钾，均为Amersco公司产品。将各供试的孢子萌发促进剂分别以0.1%、0.2%和 0.5%的终质量浓度与PDB液体培养基混合，称取0.01 g分生孢子粉加入到1 mL配制的溶液中，混合均匀制得分生孢子悬浮液。然后用移液器吸取 0.1mL悬浮液滴于无菌载玻片中央，将玻片平放在培养皿中的U型玻璃棒上，培养皿中用湿润的无菌滤纸保湿。之后将置于 28 ℃下培养，在显微镜下抽样计数萌发孢子数并计算出萌发率。每处理设3个重复，设不加促进剂的处理为对照。不同萌发促进剂对分生孢子萌发的影响如表11所示。由表11可知，氯化钙和氯化钾均可显著提高菌株ZJPL08的分生孢子萌发率，在0.1%浓度下，其孢子萌发率分别可达90.42%和85.34%，均显著高于未加促进剂的对照的萌发率76.38%。因此，选用氯化钙作为孢子萌发促进剂用于淡紫拟青霉ZJPL08的可湿性粉剂制备。

表11 各孢子萌发促进剂对菌株ZJPL08分生孢子萌发的影响

注：同行中数字后面标注不同大写字母表示在P<0.05水平差异显著，同列中数字后面标注不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著

6. 粘着剂筛选

用于筛选的粘着剂有：黄原胶，购自青岛优索化学科技有限公司；蔗糖，Amersco公司产品；可溶性淀粉，Sigma公司产品。

（1）粘着力测定：将供试粘着剂按终质量浓度0.05%比例分别加入到浓度为10⁵个/mL 的孢子悬浮液中，用喷壶对柑橘叶片进行喷雾，直至滴水为止。4 h后取同一高度的叶子（用打孔器打成小圆片）在30 mL无菌水中研磨，取0.1 mL液体均匀涂布在PDA培养基上，置于28℃下培养2-3 d，观察各平板长出的菌落形成单位数并计算孢子萌发率。设不加粘着剂的处理为对照，每处理重复4次。

（2）生物相容性测定：

将各供试粘着剂分别以0.05%的终质量浓度与PDB液体培养基混合，称取0.01 g分生孢子粉加入到1 mL配制的溶液中，混合均匀制得分生孢子悬浮液。然后用移液器吸取0.1mL悬浮液滴于无菌载玻片中央，将玻片平放在培养皿中的U型玻璃棒上，培养皿中用湿润的无菌滤纸保湿。之后将所有处理的平板置于 28 ℃下培养，在显微镜下抽样计数萌发孢子数并计算出萌发率。每处理设置3个重复，以不加粘着剂的孢子悬浮液为对照。

各粘着剂的粘着力及其与菌株ZJPL08的生物相容性如表12所示。由表12可知， 添加黄原胶的菌株ZJPL08的分生孢子悬浮液喷洒于柑橘叶片上后，在PDA培养基上生成的菌落个数为96.67个，显著高于不加粘着剂的对照，说明黄原胶可提高菌株ZJPL08分生孢子在柑橘叶片上的粘附能力。此3种粘着剂对菌株ZJPL08的分生孢子萌发均无显著影响。因此，选用黄原胶作为粘着剂用于淡紫拟青霉ZJPL08的可湿性粉剂制备。

表12 各粘着剂的粘着力及与菌株ZJPL08的生物相容性

注：同列中数字后面标注不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著

实施例3：淡紫拟青霉ZJPL08可湿性粉剂的配制及质量指标测定

1. 淡紫拟青霉ZJPL08可湿性粉剂的配制：经以上试验筛选出的载体、润湿剂、分散剂、紫外保护剂、孢子萌发促进剂和粘着剂等按比例混合，搅拌均匀，再加入淡紫拟青霉分生孢子粉，过325目标准筛，充分搅拌混匀即成淡紫拟青霉分生孢子可湿性粉剂。

所制得的淡紫拟青霉ZJPL08的分生孢子可湿性粉剂的配方为：有效成分为淡紫拟青霉分生孢子粉，含量10%；润湿剂为十二烷基硫酸钠，含量3%；分散剂为木质素磺酸钠，含量5%；紫外保护剂为腐殖酸，含量0.25%；孢子萌发促进剂为氯化钙，含量0.1%；粘着剂为黄原胶，含量0.05%；载体为硅藻土，含量81.6%。

2. 淡紫拟青霉ZJPL08可湿性粉剂的质量指标测定：

（1）含孢量测定：方法同实施例1。

（2）活孢率测定：方法同实施例1。

（3）含水量测定：方法同实施例1。

（4）润湿时间测定：按GB/T 5451-2001进行。

（5）悬浮率测定：按GB/T 14825-2006 进行。

（6）细度的测定：按GB/T 16150-1995 中“湿筛法”进行。

（7）pH值测定：按GB/T 1601-1993进行。

淡紫拟青霉ZJPL08可湿性粉剂的质量指标测定结果如表13所示。由表13可知，所制得的分生孢子可湿性粉剂含孢量为2.98×10¹⁰个/g，活孢率为92.34%，含水量为3.59%，润湿时间为85.32 s，孢子悬浮率为84.76%，细度96.52%过325目筛。所配制的可湿性粉剂的性能指标符合农药制剂产品要求。

表13 淡紫拟青霉ZJPL08可湿性粉剂质量指标

实施例4：淡紫拟青霉ZJPL08可湿性粉剂的防效测定

1. 菌株ZJPL08可湿性粉剂对柑橘木虱的防效

（1）室内毒力测定：称取1 g菌株ZJPL08可湿性粉剂加入到298 mL无菌水中混合均匀，制备成孢子浓度为1.0 × 10⁸ 个/mL的分生孢子悬浮液。然后再用无菌水梯度稀释成浓度为1.0 × 10⁷、1.0 × 10⁶、1.0 × 10⁵ 和 1.0 × 10⁴孢子悬浮液，将其装入小型喷雾器中，然后对柑橘木虱成虫均匀喷雾。将处理后的柑橘木虱用毛笔挑至玻璃培养皿中的离体九里香叶片上，以60目防虫网覆盖后，将玻璃皿放入人工气候箱中，于温度28℃、光照L:D=14:10和相对湿度>90%条件下培养。每个处理设3个重复，每个重复30头柑橘木虱，以无菌水处理为阴性对照。培养不同时间后，统计柑橘木虱死亡虫数，按下列公式计算死亡率：校正死亡率（%）=（处理死亡率-对照死亡率）/（1-对照死亡率）×100。利用软件SAS v9.2制作线性回归方程，计算致死中浓度（LC₅₀）和致死中时间（LT₅₀）。

在室内条件下，菌株ZJPL08可湿性粉剂对柑橘木虱的致病效果如表14和15所示。从中可知，菌株ZJPL08可湿性粉剂对柑橘木虱具有强致病性，孢子浓度越高，对柑橘木虱的致病效果越好。在同一浓度条件下，接种后培养时间越长，柑橘木虱的死亡率越高。在处理后3 d，其LC₅₀为9.67 × 10⁷个/mL，而在处理后7 d，其LC₅₀仅为1.39 × 10⁴个/mL。分生孢子浓度越高，对柑橘木虱的LT₅₀也越短。浓度为1.0× 10⁴个/mL的可湿性粉剂对柑橘木虱的LT₅₀为6.17 d，而浓度为1.0× 10⁸个/mL的可湿性粉剂对柑橘木虱的LT₅₀仅为2.64 d。

表14 淡紫拟青霉ZJPL08可湿性粉剂对柑橘木虱的致死中浓度（LC₅₀）

表15 淡紫拟青霉ZJPL08可湿性粉剂对柑橘木虱的致死中时间（LT₅₀）

（2）田间防效测定：称取适量的菌株ZJPL08可湿性粉剂按1:1500的比例加入到清水中配制成孢子浓度为1.99 × 10⁷个/ml的药液，另外称取适量的菌株ZJPL08纯孢子粉加入到清水中配制成浓度为1.99 × 10⁷个/ml的菌株ZJPL08纯孢子悬浮液，将10%的吡虫啉可湿性粉剂按1:2000的比例加入清水制备药液，将30%烯啶虫胺可溶液剂按1:4500的比例加入清水制备药液。将上述药液置于喷雾器中分别对饲养于养虫笼中九里香植株上的柑橘木虱均匀喷雾，以只喷清水为对照，每个处理设5个重复，每个重复60头柑橘木虱成虫，重复3次试验。将处理后的柑橘木虱置于自然条件下（平均温度25℃，相对湿度71%）饲养，在不同时间观察并记录柑橘木虱死亡虫数，并按上述公式计算死亡率。利用SAS v9.2软件的邓肯氏新复极差法对各处理的数据进行差异显著性检验。

田间防效测定结果如表16所示。结果表明，菌株ZJPL08可湿性粉剂在自然条件下对柑橘木虱也具有良好的防效。在处理后3 d，菌株ZJPL08可湿性粉剂对柑橘木虱的致死率为42.83%，低于10%吡虫啉可湿性粉剂的防效，但与30%烯啶虫胺可溶液剂的防效相当，且显著高于菌株ZJPL08纯孢子悬浮液。随着时间的延长，各处理的柑橘木虱死亡率均呈上升趋势。其中菌株ZJPL08可湿性粉剂处理后的柑橘木虱死亡率上升尤为显著，至处理后14 d，其对柑橘木虱的致死率达到100%，显著高于10%吡虫啉可湿性粉剂和30%烯啶虫胺可溶液剂等两种化学杀虫剂，且高于菌株ZJPL08的纯孢子悬浮液。由此可知，淡紫拟青霉ZJPL08的剂型化有助于分生孢子药效的充分发挥，提高了菌株对柑橘木虱的防效。就速效性而言，菌株ZJPL08的可湿性粉剂低于10%吡虫啉可湿性粉剂，但其持效性更强，且在感染菌株ZJPL08的柑橘木虱虫体上，会再产生新的分生孢子，形成新的侵染循环。因此，从以上结果可知，菌株ZJPL08可湿性粉剂可单独使用或与其他杀虫剂混合使用，用于对柑橘木虱的防治。

表16 自然条件下菌株ZJPL08可湿性粉剂对柑橘木虱的防效

注：同列中数字后面标注不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著。

2. 菌株ZJPL08可湿性粉剂对柑橘全爪螨和棉蚜的防效

分别于田间橘园中采集带有柑橘全爪螨或棉蚜的柑橘枝条，将菌株ZJPL08可湿性粉剂按1:1500的比例加入清水配制成孢子浓度为1.99 × 10⁷个/mL的悬浮液后，分别对柑橘全爪螨和棉蚜均匀喷雾，将处理后的柑橘枝条***到含水的口径约1 cm的塑料管中并用棉花塞紧管口，之后放入一顶端覆有防虫网的大塑料瓶内，然后置于人工气候箱内，于温度28℃、光照L:D=14:10和相对湿度>90%条件下培养。每个处理设6个重复，以无菌水处理为阴性对照。培养不同时间后，在体视显微镜下观察并统计柑橘全爪螨和棉蚜的死亡虫数，计算校正死亡率。

菌株ZJPL08可湿性粉剂对柑橘全爪螨和棉蚜的防效如表17所示。从中可知，菌株ZJPL08可湿性粉剂对柑橘全爪螨和棉蚜均具有较好的防治效果。在处理后3 d，柑橘全爪螨的校正死亡率为66.67%，而棉蚜的校正死亡率更高，为78.26%。在处理后7 d，柑橘全爪螨和棉蚜的校正死亡率分别可达95.65%和100.00%。表明菌株ZJPL08可湿性粉剂可用于对柑橘全爪螨和棉蚜的防治。

表17菌株ZJPL08可湿性粉剂对柑橘全爪螨和棉蚜的防效

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.一种淡紫拟青霉可湿性粉剂，其特征在于，包括以下质量百分数的组分：淡紫拟青霉分生孢子纯孢粉10%，润湿剂3%，分散剂5%，紫外保护剂0.25%；孢子萌发促进剂0.1%；粘着剂0.05%；载体81.6%；

所述淡紫拟青霉为淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）菌株ZJPL08；

所述的润湿剂为十二烷基硫酸钠，所述的分散剂为木质素磺酸钠，所述的紫外保护剂为腐殖酸，所述的孢子萌发促进剂为氯化钙，所述的粘着剂为黄原胶，所述的载体为硅藻土。

2.根据权利要求1所述的淡紫拟青霉可湿性粉剂，其特征在于，所述的淡紫拟青霉分生孢子纯孢粉含孢量为2.96~3.69×10¹¹个/g，活孢率为98.31~99.43%，含水量为6.06~6.44%。

3.权利要求1或2所述的淡紫拟青霉可湿性粉剂在柑橘木虱、柑橘全爪螨和棉蚜防治中的应用。