CN111635960A - 用于稳态速效检测新型冠状病毒的保护序列、引物、探针、组合物、试剂盒及应用和方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于稳态速效检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的保护序列、引物、探针、组合物、试剂盒及应用和方法,过样本的有效处理释放出靶向基因,自主开发的新型裂解液/保护液能特异有效识别多个2019‑nCoV靶点基因位点并形成复合物试剂,稳定2019‑nCoV病毒RNA。本发明通过对病人样本采用裂解/保护液的有效处理,释放出2019‑nCoV病毒靶向基因,在裂解/保护液中多个靶点基因位点被有效识别形成复合物,使2019‑nCoV RNA更为稳定而无需提取纯化RNA,将富集后的2019‑nCoV RNA复合物一步逆转录为cDNA,产物在自行设计的2019‑nCoV特异性探针识别后经过40cycles信号被放大3.5×1012倍。
Description
技术领域
本发明涉及体外核酸检测技术领域,具体涉及一种用于稳态速效检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的保护序列、引物、探针、组合物、试剂盒及应用和方法。
背景技术
目前,欧洲和美国的新冠疫情还十分严峻,威胁着全人类健康和生命安全。据世界卫生组织公布数据,全球新型冠状病毒性肺炎COVID-19感染累计(截至4/27/2020)确诊超3百万人和死亡病例近19万例。但当前的临床诊断COVID-19核酸检测试剂盒由于较低的敏感性显示出较高的假阴性率和低敏感性(阳性检出率仅为30%-50%),导致临床高度疑似COVID-19感染患者或低病毒潜伏的“假痊愈患者”检测“假阴性”现象频发。高灵敏度和准确性的COVID-19检测试剂研发是疫情防控的重中之重,并非常紧迫。
时至今日,中国国家疾控中心采用“变温扩增技术”的检测试剂盒作为2019-nCoV的确诊标准,国家药监局已经审批15家2019-nCoV核酸检测产品生产机构:华大基因(试剂盒)、华大智造(测序仪)、上海之江生物、国药中国生物上海捷诺、达安基因、圣湘生物、伯杰医疗等。但这些企业很多企业采用国家疾控中心公布的一组2019-nCoV病毒的引物和探针,这组探针引物存在二聚体和发夹结构,可能会影响试剂盒的检出效率。基于我们前期开发针对癌症受检者脱落细胞RNA的检测试剂盒的发明专利技术,自主开发出一种稳态速效检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的核酸检测试剂盒。
2、2019-nCoV主要的诊断方法及其原理
2019-nCoV一般可以通过两种方法检测:
2.1.早期蛋白检测(胶体金试纸):胶体金试纸是氯金酸的水溶胶,氯金酸在还原剂的作用下,聚合成特定大小的金颗粒,这粒子可以吸附新型冠状病毒的蛋白质而实现检测。胶体金试纸检测方法简略步骤为:室温的样本直接滴加在胶体金试纸上,10-30min,观察试纸出现阳性条带。胶体金试纸对于样本类型及样本底物的浓度要求较高,灵敏度和特异都不强,可用于早期大规模筛查,但不能作为临床检验的确诊手段。
2.2.后期(恒温或变温两种扩增方法)核酸检测:目前核酸检测中主要采用“变温扩增技术”的检测试剂盒作为2019-nCoV的确诊标准。国家药监局审批7款试剂盒中,华大开发一款基于华大智造的DNBSEQ-T7测序仪的采用联合探针锚定聚合测序法的试剂盒的),而其他试剂盒均采用荧光PCR法。核酸检测2019新型冠状病毒试剂盒包含两个步骤:①病毒核酸提取。采集病人的体液样本(如咽拭子或鼻拭子)后,首先进行病毒RNA提取。②核酸扩增检测。将提取的病毒RNA进行实时定量PCR扩增检测,由PCR仪器检测到的“荧光信号曲线”,检验医生就能判断该样本是否存在“新型冠状病毒”的感染。
3、目前的2019-nCoV试剂盒均有众多不如人意处:
目前国家批准生产的2019-nCoV核酸检测试剂盒质量参差不齐,核酸检测稳定可靠性(灵敏度和特异性)尚存疑。集中反映在两方面:
(1)2019-nCoV核酸检出率低:2020-02-02 21世纪经济报道的消息《检测4次才确诊?!试剂盒产能上去了,为什么确诊还是那么难?》显示当前2019-nCoV防疫工作中需重复4次检测的等问题。提示目前在临床应用的试剂盒都存在检测灵敏度和特异性不佳的问题。(i)取材:我们目前用的试剂盒取材室咽拭子,取得是咽喉部的材料,这是上呼吸道,不一定能有效取得病毒,很多病人咽拭子阴性但肺细胞灌洗液里有病毒。造成假阴性。(ii)、病毒是RNA病毒,取材后保存时间稍长可能就变性降解了,所以也可能造成假阴性。(iii)、试剂盒灵敏度可能还是不够,低浓度的病毒可能就是可疑或者阴性结果。(iv)、检测机构水平参差不齐,我们医院送检出去不同的机构,阳性率有差异。目前我们送检的试剂盒阳性率不到百分之五十;(v).很多企业采用国家疾控中心公布的一组2019-nCoV病毒的引物和探针,防疫一线的检验医师反馈:国家疾控中心作为2019-nCoV的确诊标准试剂盒存在假阴性(有明确临床症状),我们也注意到这种组引物和探针存在潜在“发夹样”二级结构;(vi)由于这些新研发的试剂盒用人工合成的质粒片段或标准品来验证,没有真实的临床样本验证2019-nCoV试剂盒灵敏度和特异性。
(2)目前等待核酸检测人数大大超过检测能力:这反映两方面局限:(i)检测时间较长:目前可靠的2019-nCoV核酸检测试剂盒检测时间在3小时左右(包含国家标准上海“之江生物”试剂盒);绝大部分试剂盒需对样本提取RNA,操作步骤多耗时长,容易因RNA在操作过程的降解而导致实验失败。(ii)由于病毒的传染性和毒性,目前2019-nCoV试剂盒检测只限于CDC认证的实验室,如能在样本提取时有效处理灭活病毒,灭活病毒的标本的检测即扩展到众多医院检验实验室,可极大检测能力,缩短等待核酸检测的时间。
因此,克服上述2019-nCoV检测中存在严重问题,开发高准确性特异性的检测试剂盒对疫情防控具重大意义。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题,本发明提供了一种用于稳态速效检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的保护序列、引物、探针、组合物、试剂盒及应用和方法。通过对病人样本采用裂解/保护液的有效处理,释放出2019-nCoV病毒靶向基因,在裂解/保护液中多个靶点基因位点被有效识别形成复合物,使2019-nCoV RNA更为稳定而无需提取纯化RNA,将富集后的2019-nCoV RNA复合物一步逆转录为cDNA,产物在自行设计的2019-nCoV特异性探针识别后经过40cycles信号被放大3.5×1012倍。
本发明采用的技术解决方案是:一种稳态速效检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的保护序列,所述的保护序列包括下列核苷酸序列:
保护序列AP-WHN-1:cctcttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagttcaa;
保护序列AP-WHORF1ab-1:gtcctcactgccgtcttgttgaccaacagtttgttgact。
一种稳态速效检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的裂解保护液,所述的裂解保护液包括20nM权利要求1所述的保护序列AP-WHN-1和20nM保护序列AP-WHORF1ab-1,1mmol/L 2-(N-***啉)乙磺酸,100mmol/L NaCl,100mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl,5mol/L盐酸胍,1%Triton X-100,0.1mg/ml蛋白酶K,0.1mg/ml硅藻土。
一种用于稳态速效检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的扩增引物,所述的扩增引物包括下列核苷酸序列:
WHN1-F2:5’-CAAGCCTCTTCTCGTTCCT-3’;
WHN1-R2:5’-GCAGCAGATTTCTTAGTGACAG-3’
和
WHO1-F2:5’-GCCACTTCTGCTGCTCTTC-3’;
WHO1-R2:5’-tgattgtcctcactgccgtc-3’。
一种用于稳态速效检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的探针,所述探针包括下列核苷酸序列:
N探针:5’-FAM-ATTCAACTCCAGGCAGCAGTAG-BHQ1-3’;
ORF1ab探针:5’-VIC-CAACCTGAAGAAGAGCAAGAA-MGB-3’。
一种用于稳态速效检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的组合物,所述的组合物包括所述的保护序列、所述的扩增引物和所述的探针。
一种用于稳态速效检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括所述的保护序列、所述的裂解保护液、所述的扩增引物、所述的探针或所述的组合物中的一种或几种。
一种保护序列、扩增引物、探针或组合物作为检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测试剂的应用,检测试剂为所述的保护序列;所述的扩增引物;所述的探针;所述的组合物中的一种或几种。
一种稳态速效检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的方法,包括以下步骤:
(1)样本处理:裂解保护液500μl,于60℃条件下,10min,取上清上柱,12000rpm离心30s,弃流出液;
(2)漂洗:加600μl漂洗液,12000rpm,离心30s,弃流出液,再加400μl漂洗液,12000rpm,离心45s,弃流出液后;
(3)洗脱:吸附柱转移至新1.5ml离心管中,加45μl洗脱液,60℃保温3min,12000rpm离心2min:
(4)RT-PCR:取8μl离心后的洗脱样本溶液,加7μl NP反应液,再加15μl PCR反应液,上机检测;
(5)判断:将得到的CT值进行阳性判断得到最终的检测结果。
本发明的有益效果是:本发明提供了一种用于稳态速效检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的保护序列、引物对、探针、组合物、试剂盒及应用和方法,过样本的有效处理释放出靶向基因,自主开发的新型裂解液/保护液能特异有效识别多个2019-nCoV靶点基因位点并形成复合物试剂,稳定2019-nCoV病毒RNA。这一创新裂解液/保护液的开发和应用使本检测试剂盒具有四大特点:高灵敏度(初步检测较上海“之江生物”提高100倍)、高特异性、快速(从样本处理到出结果60-70分钟)和双重直接灭活病毒以避免检测人员感染,本发明通过对病人样本采用裂解/保护液的有效处理,释放出2019-nCoV病毒靶向基因,在裂解/保护液中多个靶点基因位点被有效识别形成复合物,使2019-nCoV RNA更为稳定而无需提取纯化RNA,将富集后的2019-nCoV RNA复合物一步逆转录为cDNA,产物在自行设计的2019-nCoV特异性探针识别后经过40cycles信号被放大3.5×1012倍。
附图说明
图1为不同浓度的质粒cDNA的荧光定量检测,最低检出拷贝数1ag(15拷贝)/μl。
图2为病毒cDNA:RT-PCR(15拷贝/ml)检出的重复性,1ag质粒cDNA重复10次和阴性对照重复10次,Q-PCR扩增50个循环未见假阳性。
图3为病毒RNA标准品RT-PCR检测最低拷贝数为80拷贝/ml。
图4为在唾液的模拟样本中加入病毒RNA标准品检测最低拷贝数为80拷贝/ml。
图5为比较“温医大”与“之江生物”试剂盒在病毒RNA标准品在唾液样本中的检测效果。
图6为常见细菌对COVID-19病毒RNA检测无干扰作用。
图7为温医大”提取液检出的ORF基因的CT值显著低于“之江生物”提取液。
图8为N基因500nt片段在AP结合前后的二级结构的示意图。
图9为ORF1ab基因500nt片段在AP结合前后的二级结构的示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
(一)新型裂解液/保护液对2019-nCoV病毒的有效识别和对病毒RNA的保护作用及机制。
针对新型冠状病毒的目标靶点基因,设计新的RNA保护位点的引物序列。并优化样本处理液中裂解/保护各组分配比,复合试剂浓度,盐离子浓度,PH等,完善新型裂解液反应体系,进一步提高裂解液/保护液对病毒RNA的保护效应。明确加入有效保护剂后,目标保护的RNA的三维结构以及RNA的结构变构特性,研究本项目试剂盒中样本处理液对2019-nCoV病毒的有效识别和对病毒RNA的保护作用及机制。
1.样品处理液的组分配比:1mmol/L 2-(N-***啉)乙磺酸,100mmol/L NaCl,100mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl,5mol/L盐酸胍,1%Triton X-100,0.1mg/ml蛋白酶K,0.1mg/ml硅藻土,特定设计的20nM的N基因保护序列1(anchor primer,AP,保护序列信息详见第二部分AP-WHN-1,)和特定设计的20nM的ORF1ab1ab保护序列2(AP-WHORF1ab-1,保护序列信息详见第二部分)。
2.作用机制:首先,AP与SARS-CoV-2病毒RNA结合后,引起RNA的局部结构改变,使得RNA酶与RNA结合的效率降低或结合位置改变,使得RNA酶不能对RNA进行切割降解。其次,AP首先与SARS-CoV-2病毒RNA的高效结合后形成RNA:DNA复合物,这样的竞争结合使得RNA暴露区域减少,RNA酶不能有效切割。最后,AP可能与RAN酶结合形成复合物,这样的结合竞争抑制了与RNA结合的能力,影响了RNA的活性。
(二)引物/探针的特异性优化,提高试剂盒的特异性,有效减少假阳率,提高检出率;参照新型冠状病毒的结构,设计新型特异性引物/探针应对当前病毒可能出现变异的情况。
通过设计有针对2019-nCoV病毒的ORF1ab1ab和N基因双重基因靶点的探针,同时检测,实现对靶向癌症RNA的检测的特异性。增加对ORF1ab其他区域的引物设计,实现多基因、多位点的检测,有效提高试剂盒的检出率。同时,详细分析不同类型冠状病毒同源性,结合针对2019新型冠状病毒结构生物学和生物信息学的最新研究结果,针对其高度保守区域设计新的引物探针,应对2019新型冠状病毒可能发生的变异,实现检测试剂盒的即时更新换代,确保检测准确性。
通过生物信息学分析,我们首先针对SARS-CoV-2的N基因(基因坐标2889-2997,图9A)和ORF1ab1ab基因(基因坐标28548-28763,图8A),设计了特定的保护序列,如表1所示AP-WHORF1ab-1,AP-WHN-1。
表1、
1.RNA与AP结合后,SARS-CoV-2病毒RNA的生物信息学的结构预测(图8B和图8B),SARS-CoV-2病毒RNA与RNA酶的结合预测研究(图1C和图2C)。
1)首先我们调用RPIseq随机森林和支持向量机算法,对保护序列与人类RNA酶的结合特性进行评价。通过对RNA酶RNASE1-7与N基因(ORF1ab基因)核心序列的亲合力打分结果,发现RNASE1、RNASE3、RNASE7与N基因(ORF1ab基因)核心序列有较强的结合概率,可能是其潜在的作用靶点,调用catRAPID对RNA酶RNASE1-7与N基因(ORF1ab基因)核心序列可能的结合位置进行预测,发现保护序列位置可以与RNA酶进行互作。
进一步采用最小自由能预测算法,利用RNAstructure分别实现病毒N基因(ORF1ab基因)核心序列保护序列结合前后的RNA二级结构预测。进一步使用RNA二级结构局部比对算法RNAsmc进行结构相似度比较。结果显示,保护序列结合前后的N基因(ORF1ab基因)核心序列RNA结构相似性得分N基因为7.70(1-10分制)(ORF1ab基因,9.12),表明保护序列对N基因(ORF1ab基因)核心序列整体结构状态影响较大,为进一步验证引物对N基因(ORF1ab基因)的作用,使用PSMAlign结构比对工具量化结合区域对N基因(ORF1ab基因)核心序列RNA结构的影响(图8B和图9B)。PSMAlign结果分值0代表结构无变化,相反,分值越高,差异越明显。经计算,保护序列结合前后的N基因核心序列RNA结构相似性打分为N基因148(ORF1ab基因,18),表明保护序列对N基因结构有较大影响,且这一结果与RNAsmc评价结果一致,N基因(ORF1ab基因)核心序列RNA的结构变化可能引起分子互作异常。
2)进一步利用RNAComposer对N基因(ORF1ab基因)核心区域进行3D结构预测,使用HDOCK SERVER进行RNA酶RNASE1-7与N基因(ORF1ab基因)核心序列的互作区域进行预测(图8C和图9C),结果表明在结合保护序列后,N基因(ORF1ab基因)核心序列与RNA酶的最优互作位置都发生了明显的改变,进一步表明N基因(ORF1ab基因)核心序列RNA的结构变化可能引起分子互作异常。结果表明RNA酶1-7与N基因(ORF1ab基因)核心区域与存在较强结合概率,可以在保护序列处与N基因(ORF1ab基因)进行结合,在保护序列与N基因(ORF1ab基因)结合后,对N基因(ORF1ab基因)结构有较大影响,并且与RNA酶的最优互作位置都发生了明显的改变,表明N基因(ORF1ab基因)核心序列RNA的结构变化可能引起分子互作异常。
(三)实现试剂盒样本处理液对2019-nCoV病毒的灭活处理,研究试剂盒中样本处理液中成分和配比工艺,将其开发成为一种新型的RNA保存液;并探讨其在临床检验过程中生物安全性问题。
通过对试剂盒的样本处理液与试剂盒的兼容性进行改善,使用特定的试剂直接对病毒进行灭活,研究其最低和最佳浓度对试剂盒检测的灵敏性和特异性的影响。比较分析本试剂盒样本处理液和目前RNA保存液之间的优劣性,如保存时间,保存条件,保存效果等。拟将本试剂盒样本处理液用于临床有害生物标本(病毒,细菌等)的保存,必须明确其对病毒的灭活作用;针对2019新型冠状病毒,用通过60℃孵育5,10,20,30分钟不同温度条件下病毒灭活效果,避免检测人员的感染问题。
本试剂盒样本处理液含有5mol/L盐酸胍,胍盐在常温下会破坏SARS-CoV-2病毒的糖衣壳蛋白的结构,具有SARS-CoV-2病毒灭活作用。本试剂盒在对标准品RNA进行60℃孵育5,10,20,30分钟时,RNA无降解。此外,本试剂盒在临床测试中发现,60℃孵育30分钟仍能提取到SARS-CoV-2病毒的RNA。这样本试剂盒具有胍盐和60℃温浴(国家卫健委指南明确56℃,30min可灭活SARS-CoV-2病毒)的双重灭和作用。
本试剂盒在唾液中加入SARS-CoV-2病毒质粒DNA和病毒RNA标准品分别获得最低检测灵敏性为15拷贝/ml(cDNA)和80拷贝/ml(RNA标准品;目前临床试剂盒为~500拷贝/ml),具有较高的检测灵敏性。
本试剂盒在252例临床确证的COVID-19阳性病例中测试结果中表明温医大试剂盒在单个基因(N基因)的AP作用下,对RNA完整性有较好的保护作用,实现一次性扩增即能得到高水平的检出率(80%)。
本试剂盒检测常见菌群(包括肺炎链球菌,化脓性链球菌,肺炎克雷伯菌,白色念珠菌,金黄色葡萄球,流感嗜血杆菌和烟曲霉菌)对检测体系的干扰作用。发现常见细菌对SARS-CoV-2病毒RNA检测无干扰作用。
(四)进一步改进试剂盒样本处理工艺,实现对复杂样本的检测。
本试剂盒样本处理液对多种样本进行处理,增加样本处理液对复杂样本中病毒裂解及RNA释放能力,提高对RNA的保护功效;同时,对本试剂盒的适配条件做优化处理,改进洗涤液相应成分,有效去除复杂样本中其他成分的干扰,确保对病毒RNA的高效富集,为后续逆转录和PCR扩增提供保障。
1.本试剂盒可以处理多种SARS-CoV-2样本,如鼻拭子,咽拭子,痰液,尿液,粪便,结膜囊拭子及泪液等。临床测试发现
2.特殊样本的处理:
1)粪便:挑取微量样本放入样本处理液中,60℃孵育30分钟,12000rpm离心1分钟,取上清液上柱提取。本试剂盒在此步骤一方面可以灭活病毒;另外一方面可以有效的裂解病毒释放SARS-CoV-2病毒RNA,样本处理液中的AP立即发挥其保护作用。
2)尿液:首先对收集到的临床尿液标本进行离心处理,12000rpm离心2分钟,取下层200-300ul尿液,加入500ul样本处理液。此步骤将进一步浓缩尿液中的上皮细胞,降解全部进行样本处理。这对于微量样本处理异常关键。
(五)试剂盒的引物及探针。
本试剂盒针对保护序列区域设定特定保护区域,SARS-CoV-2。
N保护序列 | cctcttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagttcaa |
WHN1-F2 | 5’-CAAGCCTCTTCTCGTTCCT-3’ |
WHN1-R2 | 5’-GCAGCAGATTTCTTAGTGACAG-3’ |
N探针 | 5’-FAM-ATTCAACTCCAGGCAGCAGTAG-BHQ1-3’ |
ORF1ab保护序列 | gtcctcactgccgtcttgttgaccaacagtttgttgact |
WHO1-F2 | 5’-GCCACTTCTGCTGCTCTTC-3’ |
WHO1-R2 | 5’-tgattgtcctcactgccgtc-3’ |
ORF1ab探针 | 5’-VIC-CAACCTGAAGAAGAGCAAGAA-MGB-3’ |
检测步骤:
1.实验前准备:需确保实验设施器材具备,金属浴、水浴锅等温度务必经过校准验证。
2.样本处理
ddH2O;
阳性对照:3μl(N基因全长质粒);
均按上述处理流程第4和第5步操作。
*粪便标本需要先12000rpm离心1min,取上清液进行60℃孵育10min后续实验。
**洗脱液在使用前需在60℃温浴10~15分钟。
3.PCR扩增
在荧光定量PCR仪上进行如下程序:循环参数设定(请参考仪器操作说明进行设置)
*阈值设定原则以阈值线超过阴性对照的最高点,并且处于阳性对照的指数扩增期初始阶段为准。
质量控制
质量控制程序为同时进行阴性对照和阳性对照检测监控。在阴性对照和阳性对照结果均符合检验结果的解释所规定的情况下,检测结果方为有效。
检验结果的解释:
阴性(-):无Ct值或Ct值≥45
阳性(+):Ct值≤40。
需复查:40<Ct值<45,若再次复查Ct值<45,判断为阳性结果。
(1)病毒样本灭活处理
高精准新型冠状病毒(2019-nCoV)检测试剂盒基于前身癌症早期检测试剂盒(RNA检测)开发技术,前期对采集样本的生物安全性风险已做了技术上的优化和改进,在此基础上将现有的技术在咽拭子、鼻腔分泌物及粪便等中进行兼容性研究。试剂采用胍盐对样本进行处理,样本600℃,30分钟孵育可完全将病毒灭活,后续研究会将时间缩短至10分钟。
(2)试剂盒检测的稳定性
通过对裂解释放出的RNA样本进行多个位点有效识别并形成复合物,采用三重PCR或多重PCR方法同时对冠状病毒(2019-nCoV)的开放阅读框、N基因等多段基因片段进行检测,避免病毒因变异导致的假阴性存在。对多位点RNA序列识别保护RNA完整性,避免样本处理过程导致RNA降解问题,通过对引物探针的优化解决假阳性问题,使体系针对新冠状病毒任何一个基因位点检出阳性都可以判定为初筛阳性。采取多靶点基因进行保护,多个基因序列进行检测同时需考虑病毒的变异问题防止因变异导致的漏检。
RNA易降解问题:本试剂盒在样本获取的同时已将RNA释放在样本处理液中,样本处理液可非常高效的对RNA的完整性进行保护,同时对释放的RNA样本进行多个位点有效识别并形成复合物,在后续的检测操作中也均进行了RNA有效保护的设计,并在多个研发的产品中得以验证。
试剂盒的灵敏度及特异性:在样本处理过程中RNA样本已被特异有效识别多个靶点基因位点并与之形成复合物,稳定靶向新冠病毒RNA,通过选择性逆转录富集后特异的RNA复合物,实现对多靶点RNA扩增;自行设计的引物、探针明显优于国家疾病控制中心公布了的探针和引物序列(生物信息学分析发现没有发夹等二级结构存在);通过设计ORF1ab和N基因双重基因靶点的引物及探针,同时对这两个位点进行检测,试剂盒的敏感性和特异性会大大的增加。
本发明的优点:
(1)创新裂解液与试剂盒独特的反应体系:样本处理液可直接保存采集的病毒样本,样本处理液中包含了胍盐可有效快速灭活病毒。同时在样本处理液中加入可有自行设计的材料,目标保护的RNA的三维结构以及RNA的结构变构特性,使目的基因被特异识别及保护,增加检出的灵敏度及特异性。
(2)试剂盒独特的反应体系:创新裂解液与试剂配套使用使本检测试剂盒具有四大特点:高灵敏度(较上海“之江生物”提高100倍)、高特异性、快速(从样本制备到出结果40-45分钟)和双重直接灭活病毒以避免检测人员感染。。
(3)独特样本处理液可对复杂性样本(粪便和痰液)有效处理:在技术开发中已对痰液样本进行验证,技术开发初期在临床样本上处理效果非常理想,并采用优化前的试剂开发出一款产品:肺癌早期检测试剂盒(国械注准20173403247)。我们可将现有的样本处理方式在粪便等样品检测中临床应用。
(4)快速样本制备到检测(40分钟):本我们团队目前开发的试剂盒检测步骤有四步:释放、识别(5分钟)-洗涤(1分钟)-洗脱(2分钟)-信号放大(35分钟)。对咽拭子样本检测时间可实现45分钟出结果。如果配套使用核酸自动提取仪使用可将时间缩短至40分钟。
结论:
(1)在唾液中加入COVID-19病毒质粒DNA和病毒RNA标准品分别获得最低检测灵敏性为15拷贝/ml(cDNA)和80拷贝/ml(RNA标准品;目前临床试剂盒为~500拷贝/ml);
(2)临床252例COVID-19阳性病人标本检测结果表明温医大试剂盒对RNA完整性(N基因位点)有较好的保护作用,实现一次性扩增即能得到高水平的检出率(80%)。
(i)台州恩泽医疗中心(57例)(CT值有待重新统计分析):“温医大”提取液检出的ORF基因的CT值显著低于“之江生物”提取液,ORF基因检出CT值平均降低2.27个循环,提示灵敏度提高~10倍(p=0.0001配对t-test,n=33),而N基因与E基因也有所降低(p=0.0074和p=0.6894);
(ii)温州CDC(59例):“温医大”提取液+扩增液检出的N和E基因的CT值显著低于其他临床试剂盒(N基因降低3.74个循环,p=0.0001,E基因降低2.0个循环,p=0.002,n=59);
(iii)浙江省CDC(54例):“温医大”提取液+扩增液检出的N和E基因的CT值显著低于其他临床试剂盒(N基因降低3.79个循环,p<0.0001,E基因降低XX个循环,p=0.002,n=59);
(iv)温医大附一院附二院(54例轻症):“温医大”提取液+之江扩增液检出的,以及转阴后复阳4例7.4%(4/54)。
(ⅴ)温医大附一院(11例尿液):尿液检出率36.36%(4/11)。
(ⅵ)本试剂盒一次检出COVID-19(N基因)阳性率:台州70.18%(40/57);温州CDC:N基因80.87%(97/115),;浙江省CDC:N基因78.67%(59/75)。温医大附二院:54例临床轻症/普通型(恢复期转阳):4例7.4%(4/54)。
(3)因此,本试剂盒可以处理各种类型的样本,如鼻/咽拭子,痰液,唾液,粪便和尿液等,另泪液,结膜囊拭子等可能存在的微量病毒标本正在验证中。
详细进展汇报如下:
(一)伦理:获得温州医科大学附属眼视光医院伦理委员通过。
(二)COVID-19假病毒cDNA/RNA试验得出温医大试剂盒检测最低拷贝数约15拷贝/ml(cDNA标准品)和80拷贝/ml(RNA标准品),显示其较目前临床试剂盒较高的灵敏性,可检测出病人样本中较低的病毒滴度,有效降低假阴性率。
2.1.COVID-19假病毒质粒cDNA检出最低拷贝数:在痰液/唾液的模拟样本中,加入假病毒质粒cDNA(厦门致善生物科技股份有限公司提供),经过整个裂解/提取和RT-PCR反应步骤,我们得出本试剂盒的质粒cDNA的最低拷贝数约1ag(15拷贝)/μl(图一)(目前临床试剂盒为~500拷贝/ml)。
2.2.COVID-19假病毒质粒cDNA最低拷贝数检出的重复性:在痰液/唾液的模拟样本中,加入最低检出假病毒质粒cDNA15拷贝/ml(10个重复管),经过整个裂解/提取和RT-PCR反应步骤,本试剂盒在最低拷贝数时有良好重复性(图二)
2.3.用COVID-19病毒RNA标准品验证RT-PCR反应步骤的最低检出拷贝数:在RT-PCR反应体系(图三)和唾液的模拟样本中(图四),加入新冠病毒RNA标准品(中国计量研究研究提供)验证RT-PCR反应步骤的最低检出拷贝数为80拷贝/ml(目前临床试剂盒为~500拷贝/ml)
2.4.平行比较研究发现:在痰液/唾液的模拟样本中加入新冠病毒RNA标准品(中国计量研究研究提供)8380拷贝/ul,比较“温医大”和“之江生物”试剂盒RT-PCR反应步骤,“温医大”检出CT值为20,荧光信号强度强;而“之江生物”检出CT值为26,并且荧光信号强度弱。
2.5.常见细菌对COVID-19病毒RNA检测无干扰作用
应用温医大提取液+之江RT-PCR扩增体系,检测常见菌群(包括肺炎链球菌,化脓性链球菌,肺炎克雷伯菌,白色念珠菌,金黄色葡萄球,流感嗜血杆菌和烟曲霉菌)对检测体系的干扰作用。实验结果(菌提取核酸重复3次)表明:强阳和弱性对照(红色)出现预计的扩增,而干扰菌均显示无扩增(绿色)。
(三)临床COVID-19病人样本收集统计:
3.2.温医大裂解液/保护液稳定保护COVID-19病毒RNA的效果研究为检测创新裂解液/保护液能特异有效识别多个COVID-19靶点基因位点并形成复合物,稳定保护COVID-19病毒RNA,合作单位(台州恩泽医院)对33例阳性标本比较“温医大“和“之江生物”试剂盒裂解液/保护液提取的RNA,都用之江核酸检测试剂盒进行RT-PCR扩增检测,临床实验结果表明:
(1)临床实验结果表明:COVID-19N基因检出阳性率(95%),E基因检出阳性率(100%),ORF/RDRP基因检出阳性率(100%)。这表明本试剂盒对RNA完整性(多个基因位点)有较好的保护作用,为实现一次性扩增来检测多种基因,以提高样本的检出率和准确性(表1)。
住院号/门诊号 | 性别 | 年龄 | 标本类型 | 检测结果 | 之江提取/之江检测 | 温医大提取/之江检测 |
50151329 | 男 | 56岁 | 痰液 | 阳性(+) | RDRP26.2932/E25.83/N26.29 | RDRP 25.79/E 25.85/N 26.7 |
50151142 | 男 | 75岁 | 痰液 | 阳性(+) | RDRP35.21/34.45/34.91 | RDRP 37.35/E 0/N 39.57 |
50151377 | 女 | 67岁 | 咽拭子 | 阳性(+) | RDRP38.05/E37.48/39.02 | RDRP 35.74/E 37.03/N 34.96 |
50151088 | 男 | 55岁 | 粪便 | 阳性(+) | RDRP37.68/E37.09/N38.70 | RDRP 37.65/E 36.94/N 36.8 |
50151536 | 女 | 77岁 | 鼻咽拭子 | 阳性(+) | rdrp33.3/E35/N33.07 | RDRP 28.11/E 29.25/N 27.32 |
50151345 | 男 | 64岁 | 痰液 | 阳性(+) | rdrp32.9/E30.3/N38.6 | RDRP 32.87/E 32.7/N 31.86 |
50151329 | 男 | 56岁 | 痰液 | 阳性(+) | RDRP30.38/E29.53/N30.21 | RDRP 29.47/E 29.12/N 28.46 |
50151379 | 男 | 55岁 | 鼻咽拭子 | 阳性 | RdRP 38.97/E 38.9/N 37 | RDRP 0/E 39.71/N 37.71 |
50151118 | 女 | 65岁 | 鼻咽拭子 | 阳性 | RdRP 35.25/E 35.21/N 33.51 | RDRP 35.15/E 3433/N 33.95 |
50151406 | 男 | 33岁 | 痰液 | 阳性(+) | rdrp35.6/E34.6/N33.5 | RDRP 31.58/E 32.11/N 30.69 |
50150887 | 男 | 34岁 | 痰液 | 阳性 | RDRP33.9/E29.9/N30.8 | RDRP 32.81/E 32.58/N 32.3 |
50151409 | 女 | 51岁 | 痰液 | 待复查 | E36、N35.9 | RDRP 0/E 36.29/N 43.69 |
50150812 | 男 | 50岁 | 痰液 | 阳性(+) | rdrp37.4/E35.5/N35 | RDRP 35.07/E 34.2/N 33.9 |
50151541 | 女 | 48岁 | 痰液 | 阳性(+) | rdrp36.99/E35.6/N35.6 | RDRP 0/E 0/N 35.14 |
50151270 | 女 | 44岁 | 咽拭子 | 阳性 | RDRP 35.22/E 31.68/N 32.97 | RDRP 35.15/E 32.35/N 31.75 |
50151536 | 女 | 77岁 | 痰液 | 阳性(+) | RDRP29.8/E28.0/E29.2 | RDRP 21.43/E 22.17/N 23.09 |
50151307 | 女 | 68岁 | 痰液 | 待复查 | E37.9/N38.7 | RDRP 31.38/E 31.94/N 31.83 |
50150765 | 女 | 56岁 | 痰液 | 阳性(+) | RDRP35.6/E32.7/N33.3 | RDRP 35.26/E 34.32/N 33.9 |
50151436 | 女 | 30岁 | 痰液 | 阳性(+) | RDRP37.46/E34.5/N36.36 | RDRP 35.25/E 34.54/N 34.06 |
50150798 | 男 | 43岁 | 痰液 | 阳性(+) | rdrp36.34/E33.1/N33.03 | RDRP 37.03/E 34.43/N 35.89 |
50151142 | 男 | 75岁 | 痰液 | 阳性(+) | RDRP38.66/E35.7/N37.5 | RDRP 38.95/E 39.82/N 28.03 |
50151345 | 男 | 64岁 | 痰液 | 阳性(+) | rdrp34.91/E33.9/N32.53 | RDRP 37.08/E 37.22/N 36.98 |
9000548489 | 女 | 43岁 | 咽拭子 | 阴性 | RdRP 41.7/E36.56/N 36.9 | RDRP 35.91/E 35.84/N 36.04 |
50150798 | 男 | 43岁 | 咽拭子 | 阳性 | RdRP 38.30/E 38.14/N 35.78 | 非标准曲线 |
50151020 | 女 | 26岁 | 咽拭子 | 阳性(+) | RdRP 38.79/E 37.07/N 37.71 | RDRP 33.87/E 34.02/N 34.27 |
50150887 | 男 | 34岁 | 咽拭子 | 阳性(+) | RdRP 31.61/E28.56/N28.78 | RDRP 28.86/E 28.92/N 28.44 |
50151237 | 男 | 70岁 | 咽拭子 | 阳性 | RDRP38.01/E35.94/N35.38 | RDRP 33.6/E 35.07/N 34.09 |
50151166 | 男 | 44岁 | 咽拭子 | 阳性 | RdRP 32.53/E 31.16/N 35.41 | RDRP 33.74/E 33.65/N 33.64 |
50151065 | 男 | 51岁 | 痰液 | 阳性(+) | RDRP37.70/E37.12/N37.94 | RDRP 29.08/E 28.45/N 28.47 |
50150954 | 女 | 41岁 | 咽拭子 | 阳性 | RdRP 33.77/E 32.98/N 39.01 | RDRP 32.3/E 32.56/N 32.68 |
50151017 | 男 | 38岁 | 咽拭子 | 阳性 | RdRP 39.91/E 39.93/N 38.21 | 非标准曲线 |
50151406 | 男 | 33岁 | 粪便 | 阳性 | RDRP33.12/E30.88/N32.29 | RDRP 23.98/E 25.39/N 24.04 |
50151406 | 男 | 33岁 | 痰液 | 阳性 | RDRP35.53/E32.72/N34.12 | 非标准曲线 |
(2)比较“温医大”和“之江生物”提取液得到COV工D-19三个基因片段
(ORF,E和N)检测的CT值,结果表明:“温医大”提取液检出的ORF基因的CT值显著低于“之江生物”提取液(p=0.0067,N基因,p=0.057;E基因,p=0.761,配对t-test,n=33,图七),ORF基因的CT值平均降低3个循环,经由假病毒标准曲线换算,检出COVID-19RNA拷贝数提高了~10倍。
3.4.临床符合率
本试剂盒一次检出COV工D-19(N基因)阳性率:台州70.18%(40/57);温州CDC:N基因80.87%(97/115),;浙江省CDC:N基因78.67%(59/75)。温医大附二院:54例临床轻症/普通型(恢复期转阳):4例7.4%(4/54)。3.5.“温医大”提取液可处理多种,复杂COVID-19病人样本:
3.6.COVID-19病毒灭活与安全性
本试剂盒样本处理液中含有胍盐,胍盐具有灭活病毒作用(已有报道证实)。此外,样本处理阶段可实现60℃,30min对病毒的灭活作用。病毒灭活可以有效的减少检测人员的暴露风险,保护操作人员的安全性,降低检验实验室感染风险。
3.7.快速样本制备到检测(40分钟):
本试剂盒检测步骤有四步:释放、识别(5分钟)-洗涤(2分钟)-洗脱(1分钟)-信号放大(35分钟)。对咽拭子样本检测时间可实现45分钟出结果。如果配套使用核酸自动提取仪使用可将时间缩短至40分钟。
3.8.检测敏感性
本试剂盒离体实验中发现COVID-19病毒质粒DNA和病毒RNA标准品分别获得最低检测灵敏性为15拷贝/ml(cDNA)和80拷贝/ml,具有较低的检测线。此外,在温州医科大学附属第一、二医院的临床检测发现,在54例COVID-19恢复期病人中,发现临床转阴病人检测为阳性。说明本试剂盒具有较高的检测灵敏性。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
各位技术人员须知:虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述,但是本发明的发明思想并不仅限于此发明,任何运用本发明思想的改装,都将纳入本专利专利权保护范围内。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例,凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 温州医科大学附属眼视光医院、温州瓯佳生物科技责任公司
<120> 用于稳态速效检测新型冠状病毒的保护序列、引物、探针、组合物、试剂盒及应用和方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctcttctcg ttcctcatca cgtagtcgca acagttcaa 39
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcctcactg ccgtcttgtt gaccaacagt ttgttgact 39
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caagcctctt ctcgttcct 19
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcagcagatt tcttagtgac ag 22
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccacttctg ctgctcttc 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgattgtcct cactgccgtc 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
attcaactcc aggcagcagt ag 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caacctgaag aagagcaaga a 21
Claims (8)
1.一种稳态速效检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的保护序列,其特征在于,所述的保护序列包括下列核苷酸序列:
保护序列AP-WHN-1:cctcttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagttcaa;
保护序列AP-WHORF1ab-1:gtcctcactgccgtcttgttgaccaacagtttgttgact。
2.一种稳态速效检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的裂解保护液,其特征在于,所述的裂解保护液包括20nM权利要求1所述的保护序列AP-WHN-1和20nM保护序列AP-WHORF1ab-1,1mmol/L 2-(N-***啉)乙磺酸,100mmol/L NaCl,100mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl,5mol/L盐酸胍,1%Triton X-100,0.1mg/ml蛋白酶K,0.1mg/ml硅藻土。
3.一种用于稳态速效检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的扩增引物,其特征在于,所述的扩增引物包括下列核苷酸序列:
WHN1-F2:5’-CAAGCCTCTTCTCGTTCCT-3’;
WHN1-R2:5’-GCAGCAGATTTCTTAGTGACAG-3’
和
WHO1-F2:5’-GCCACTTCTGCTGCTCTTC-3’;
WHO1-R2:5’-tgattgtcctcactgccgtc-3’。
4.一种用于稳态速效检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的探针,其特征在于,所述探针包括下列核苷酸序列:
N探针:5’-FAM-ATTCAACTCCAGGCAGCAGTAG-BHQ1-3’;
ORF1ab探针:5’-VIC-CAACCTGAAGAAGAGCAAGAA-MGB-3’。
5.一种用于稳态速效检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的组合物,其特征在于,所述的组合物包括权利要求1所述的保护序列、权利要求3所述的扩增引物和权利要求4所述的探针。
6.一种用于稳态速效检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1所述的保护序列、权利要求2所述的裂解保护液、权利要求3所述的扩增引物、权利要求4所述的探针或权利要求5所述的组合物中的一种或几种。
7.一种保护序列、扩增引物、探针或组合物作为检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测试剂的应用,其特征在于,所述的检测试剂为权利要求1所述的保护序列;权利要求3所述的扩增引物;权利要求4所述的探针;权利要求5所述的组合物中的一种或几种。
8.一种稳态速效检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)样本处理:裂解保护液500μl,于60℃条件下,10min,取上清上柱,12000rpm离心30s,弃流出液;
(2)漂洗:加600μl漂洗液,12000rpm,离心30s,弃流出液,再加400μl漂洗液,12000rpm,离心45s,弃流出液后;
(3)洗脱:吸附柱转移至新1.5ml离心管中,加45μl洗脱液,60℃保温3min,12000rpm离心2min:
(4)RT-PCR:取8μl离心后的洗脱样本溶液,加7μl NP反应液,再加15μl PCR反应液,上机检测;
(5)判断:将得到的CT值进行阳性判断得到最终的检测结果。
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