JP2019515680A - B型肝炎ウイルスcccDNAの定量的測定 - Google Patents
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Abstract
B型肝炎ウイルス(HBV)感染は、ウイルスゲノムDNAの宿主肝細胞への侵入をもたらす。このウイルス弛緩型環状DNA(rcDNA)は、核に輸送され、共有結合閉環状DNA(cccDNA)に変換され、ウイルス転写のテンプレートとして働く。HBV感染を治療するためには、cccDNAの排除が必要であり、これは依然として主要な治療上の課題である。本明細書に記載されたcccDNAを測定するための堅牢で敏感な方法は、薬物開発を促進し、治療の有効性をモニターするのに有用である。ウイルスDNAの亜硫酸水素ナトリウム処理と組み合わせてプライマーのセットを設計し、rcDNAの増幅の干渉なしでcccDNAの特異的増幅を可能にした。この方法は、治療開発をさらに誘導し、抗ウイルス治療を受けているHBV感染患者のモニタリングのための非侵襲的代替手段を提供するために使用することができる。
Description
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、2016年2月15日に出願された米国特許仮出願第62/295,481号の優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2016年2月15日に出願された米国特許仮出願第62/295,481号の優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された配列リストへの参照
電子的に提出された配列リストの内容(ファイル名cccDNA_SeqListing_PCT.txt、サイズ11,609バイト;および作成日2017年2月15日、本明細書と共に提出)は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された配列リストの内容(ファイル名cccDNA_SeqListing_PCT.txt、サイズ11,609バイト;および作成日2017年2月15日、本明細書と共に提出)は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
技術分野
本開示は、概して共有結合閉環状DNA(cccDNA)(例えば、B型肝炎ウイルス(HBV))の検出または定量のための方法およびキットに関し、より詳細には、HBVに感染した生体サンプルにおける弛緩型環状DNA(rcDNAまたはRC−DNA)とは別にcccDNAを検出するまたは定量する方法に関する。
本開示は、概して共有結合閉環状DNA(cccDNA)(例えば、B型肝炎ウイルス(HBV))の検出または定量のための方法およびキットに関し、より詳細には、HBVに感染した生体サンプルにおける弛緩型環状DNA(rcDNAまたはRC−DNA)とは別にcccDNAを検出するまたは定量する方法に関する。
HBV感染は世界的な公衆衛生上の懸案事項である。世界中で2億4000万人がHBVに慢性的に感染している(Lavanchy and Kane 2016)。HBVの感染は、急性および慢性の肝炎を引き起こし、肝硬変および肝細胞癌へと至る(Kew MC 2010)。
HBV感染への現在の治療法は限られており、主にcccDNAの持続性のために、ウイルスを完全に排除することなくウイルス血症のみを抑制する(Tang,Yau et al.2014)。治療の中止は、ほとんどの患者へのリバウンドをもたらし、これは持続感染症の原因となるウイルス残留物の存在を示唆している(Abdelhamed,Kelley et al.2002)。抗ウイルス療法を受けている患者が治療を中止した場合、HBVはcccDNAから再活性化することができる(Petersen J 2007)。肝臓におけるcccDNAの持続性をモニターするためには、度重なる肝生検が必要であり、これは患者にとって危険であり、不快であり、高価である(Wu、Johnson et al.2014,Zhong,Hu et al.2014,Shi,Sun et al.2015)。cccDNAは血液中、特に肝臓損傷後にも見出されるので、血清または血漿中でのその検出は、肝生検に頼らずに抗ウイルス療法の有効性および肝臓損傷の程度を評価することを可能にする(Wong,Yuen et al.2004,Takkenberg,Zaaijer et al.2009)。
HBV感染後、ウイルスDNAは、感染した肝細胞の核に移され、rcDNAは宿主細胞質に放出される。ウイルスDNAは、最終的に核質に輸送され、cccDNAに変換される。ミニ染色体として偽装された宿主核内のcccDNAの存在は、肝細胞核質におけるメッセンジャーRNAの継続的なビリオン転写の鋳型として働く(Levrero,Pollicino et al.2009,Nassal 2015)。したがって、cccDNAの持続性は、進行した肝臓疾患を発症する危険性がある慢性的に感染した人々において、従来の抗ウイルス療法によってHBVを除去する上で障害となっている。興味深いことに、わずかな割合の患者が従来の抗ウイルス療法単独によってHBV S抗原(HBVsAg)を除去しており、cccDNAが排除できることが示されている(Tavis,JE et al.2013)。この「治癒した」集団は、もしそのcccDNAレベルを測定することができるならば、高価でありかつ未知の副作用を有する生涯にわたる抗ウイルス療法を中止することができる。したがって、肝生検または体液からのcccDNAレベルの定量化のための高感度かつ特異的な方法がこの「治癒した」集団を同定するためには大変望ましい。
cccDNAの排除は、HBV感染の治療法を見いだすHBV薬開発研究の最終目標である。cccDNAの定量化のための高感度かつ特異的な方法が非常に望ましい。
概要
本開示は、共有結合閉環状DNA(cccDNA)および非cccDNAを含有するDNAサンプル中のcccDNAを検出するまたは定量するための方法およびキットを提供する。
本開示は、共有結合閉環状DNA(cccDNA)および非cccDNAを含有するDNAサンプル中のcccDNAを検出するまたは定量するための方法およびキットを提供する。
第1の側面において、方法が開示される。前記方法は、以下の工程を含む:
i)前記DNAサンプルを処理して、処理されたDNAサンプル中の二本鎖DNA分子の相補的な特徴を破壊し、それによって前記二本鎖DNA分子の2つのストランドのリアニールを防止すること;および
ii)前記非cccDNAではなく前記cccDNAが増幅産物を生じることができるように、前記処理されたDNAサンプルで増幅分析を実施すること。
i)前記DNAサンプルを処理して、処理されたDNAサンプル中の二本鎖DNA分子の相補的な特徴を破壊し、それによって前記二本鎖DNA分子の2つのストランドのリアニールを防止すること;および
ii)前記非cccDNAではなく前記cccDNAが増幅産物を生じることができるように、前記処理されたDNAサンプルで増幅分析を実施すること。
本明細書中、DNAサンプルにおいて、non−cccDNAは、cccDNAと実質的に同じDNA配列のものであるが、cccDNAとは異なるフォーム(例えば、弛緩型環状フォームまたはrcDNA)である。
DNA配列は、HBVに由来してもよく、したがって、DNAサンプル中のHBV DNAは、HBVゲノムDNAのcccDNAフォームおよびnon−cccDNAフォーム(例えばrcDNAまたは他の中間フォーム)を含むことができる。DNA配列は、他の種から得ることもできるし、人工配列であってもよい。
本明細書中、DNAサンプルは、組織または体液などの生体サンプルから得ることができ、体液は、血清、血漿、血液、尿または唾液であり得る。本方法およびキットは、研究環境または臨床環境で使用することができる。
本方法およびキットは、DNAサンプル中のcccDNAを検出するまたは定量するなどの特性を明らかにするために使用することができる。HBVの診断、管理、および予後の分野における1つの用途において、本方法およびキットは、HBVに感染した患者における肝臓損傷の重篤度を評価するために使用することができ、または、HBVに感染した患者における抗ウイルス療法の効率をモニターするために使用することができる。
本開示のいくつかの実施形態によれば、方法は、工程i)の前に、生体サンプルからDNA試料を得る工程をさらに含むことができる。
本明細書中、DNAサンプルは、生体サンプルから得る、単離するまたは抽出することができ、これは、限定されないが、エタノール沈殿、フェノール−クロロホルム抽出、ミニカラム精製、または任意の関連する市販のキット(例えば、Thermo Fisher PureLink(登録商標) Genomic DNA kit)を含む任意の標準的な方法によって実施することができる。
本方法のいくつかの実施形態によれば、工程i)において、前記DNAサンプルを前記処理されたDNAサンプル中の二本鎖DNA分子の2つのストランドの配列を変更するように構成された化学試薬で処理し、それによって、前記2つのストランドの相補的な特徴を破壊することができる。
上記化学試薬は、脱アミノ化反応を引き起こすことによって作用することができ、特定のヌクレオチド(例えば、シトシン)に選択的であり得る、または非選択的(例えば、アデノシンおよびシトシン)であり得る。化学試薬は、亜硝酸、亜硝酸ナトリウム、ニトロソアミン類、または亜硫酸水素ナトリウムであり得る。化学試薬は、DNA分子のストランド上の他の反応を引き起こすことにより作用しうる。
本方法のいくつかの実施形態によれば、工程ii)における増幅分析が前記DNA配列上の2つの戦略的位置にそれぞれアニーリングするように構成され、同時に前記non−cccDNAではなく前記cccDNAから増幅産物を生成することができるように構成された一対のプライマーを用いて実施される。
いくつかの実施形態において、工程ii)の増幅分析は、増幅産物に基づいて、前記cccDNAを定量するように構成されたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含むことができる。
2つの戦略的位置は、それぞれnon−cccDNAにおける不連続なストランドの既知の不連続領域の2つのサイドにあってもよい。一対のプライマーは、処理されたDNAサンプル中の連続したストランドの2つの戦略的位置にそれぞれアニーリングして、それによって連続したストランドから増幅産物を生成するように構成することができる。
DNA配列がHBV DNAであるいくつかの実施形態において、2つの戦略的位置は、rcDNA中のHBV(−)ストランドの不連続領域の2つのサイド、またはrcDNA中のHBV(+)ストランドのギャップ領域のいずれか1つの2つのサイドにありうる。
HBV DNAをターゲットとする本方法のいくつかの実施形態によれば、一対のプライマーのフォワードプライマーは、配列番号1〜21(表1参照)のいずれか1つに記載の配列を含むことができ、一対のプライマーのリバースプライマーは、配列番号22〜28(表1参照)のいずれか1つに記載の配列を含むことができる。
本方法のいくつかの他の実施形態では、工程ii)における増幅分析は、処理されたDNAサンプルにおいて、不連続なストランドではなく連続したストランドにアニーリングするように構成され、cccDNAの定量を可能にするように構成されたプローブを用いてさらに行うことができる。プローブは、5’末端および3’末端それぞれに、蛍光強度を測定することによってcccDNAの定量を可能にするように構成された蛍光色素および蛍光消光剤で標識されていてもよい。
DNA配列がHBV DNAであるいくつかの実施形態において、プローブは、配列番号29〜31(表1参照)のいずれか1つに記載の配列を含むことができる。
第2の側面では、ccDNAおよび前記cccDNAと実質的に同じDNA配列であり、異なるフォームであるnon−cccDNAを含むDNAサンプル中の前記cccDNAを検出するまたは定量するためのキットを開示する。
キットは、化学試薬および一対のプライマーを含む。化学試薬は、それにより処理されたDNAサンプル中の二本鎖DNA分子の相補的な特徴を破壊し、それによって前記二本鎖DNA分子の2つのストランドのリアニールを防止するように構成される。一対のプライマーは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、DNA配列上の2つの戦略的位置にそれぞれアニーリングするように構成され、同時にnon−cccDNAではなくcccDNAから増幅産物を生成することができるように構成される。
本キットのいくつかの実施形態では、化学試薬は、以下の4つの試薬の少なくとも1つを含む:亜硝酸、亜硝酸ナトリウム、ニトロソアミン類、および亜硫酸水素ナトリウム。
本キットにおいて、2つの戦略的位置は、それぞれnon−cccDNAにおける不連続なストランドの既知の不連続領域の2つのサイドにあり、一対のプライマーは、処理されたDNAサンプル中の連続したストランドの2つの戦略的位置にそれぞれアニーリングして、それによって連続したストランドから増幅産物を生成するように構成されうる。
本開示のいくつかの実施形態によれば、キットは、さらにプローブを含んでもよく、プローブは、処理されたDNAサンプルにおいて、不連続なストランドではなく連続したストランドにアニーリングするように構成され、cccDNAの定量を可能にするように構成される。
プローブは、5’末端および3’末端それぞれに、蛍光色素および蛍光消光剤で標識されていてもよい。蛍光色素は、6−カルボキシフルオレセイン、ヘキサクロロ−6−カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ−6−カルボキシフルオレセイン、FAM(5−カルボキシフルオレセイン)、HEX(2’,4’,5’,7’−テトラクロロ−6−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン)、またはCy5(シアニン−5)の少なくとも1つを含むことができる。蛍光消光剤は、6−カルボキシテトラメチル−ローダミン、TAMRA(5−カルボキシテトラメチルローダミン)、BBQ(ブラックベリークエンチャー(BlackBerry Quencher))、またはBHQ3(ブラックホールクエンチャー3(black hole quencher 3))の少なくとも1つを含むことができる。
本キットは、DNAポリメラーゼ、ポリメラーゼバッファー、dNTP、またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。
本開示のいくつかの実施形態によれば、本キットは、HBVのためにカスタマイズすることができる。具体的には、cccDNAは、B型肝炎ウイルス(HBV)のccDNAフォームを含み、non−cccDNAは、B型肝炎ウイルス(HBV)の弛緩型環状DNA(rcDNA)フォームを含む。
そのようなものとして、フォワードプライマーは、配列番号1〜21(表1参照)のいずれか1つに記載の配列を含むことができ、リバースプライマーは、配列番号22〜28 (表1参照)のいずれか1つに記載の配列を含むことができる。
いくつかの好ましい実施形態において、リバースプライマーは、配列番号24に記載の配列を含み、フォワードプライマーは、配列番号11、配列番号12または配列番号17に記載の配列を含む。
別の側面において、本開示は、サンプルにおいて、cccDNAをrcDNAと識別可能に検出する方法を提供する。本方法は、(a)ヌクレオチドコンバーター(nucleotide converter)試薬で前記サンプルを処理すること;および(b)PCRプロシージャによって前記cccDNAを検出することを含む。本方法のいくつかの実施形態では、ヌクレオチドコンバーター試薬は、C残基をU残基に転換する。そのようなものとして、ヌクレオチドコンバーター試薬は、脱アミノ化剤(deaminator)でありうる(すなわち、ヌクレオチドに対する脱アミノ化反応を引き起こす化学試薬)。上記ヌクレオチドコンバーター試薬は、亜硝酸、亜硝酸ナトリウム、ニトロソアミン類、亜硫酸水素ナトリウム、およびそれらの組み合わせから選択することができる。
本開示のいくつかの実施形態によれば、PCRプロシージャは、不連続領域に及ぶ一対のプライマーを使用する。一対のプライマーは、不連続領域の2つのサイド上の2つの戦略的位置にそれぞれアニーリングするように構成することができ、同時にnon−cccDNAではなくcccDNAから増幅産物を生成することができるように構成することができる。
本開示のいくつかの実施形態によれば、PCRプロシージャは、プローブをさらに使用し、プローブは、不連続なストランドではなく連続したストランドにアニーリングするように構成される。
詳細な説明
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、記載される方法および組成物に関連する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語および語句は、他に特定されない限り、それらに帰する意味を有する。
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、記載される方法および組成物に関連する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語および語句は、他に特定されない限り、それらに帰する意味を有する。
様々な実施形態を、表示した図を用いて詳細に説明する。これらの実施形態への言及は、特許請求の範囲を限定するものではない。挙げられた例は、本明細書の方法および特許請求の範囲を限定することを意味するのではなく、特許請求の範囲の実施形態の例示的な使用を記載する。
本明細書および添付の特許請求の範囲では、単数形「a」、「an」および「the」は、内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞(a cell)」への言及は、2つ以上の細胞の組み合わせなどを含む。
本明細書で使用する「ヌクレオチド配列(nucleotide sequence)」および「オリゴヌクレオチド(oligonucleotide)」という用語は、ワトソン−クリック相互作用を介して相補的配列と塩基対合することができる核酸(アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル)の繰り返しポリマーを示す。このポリマーは、合成的に製造されてもよいし、生物源に由来してもよい。
「デオキシリボ核酸(deoxyribonucleic acid)」および「DNA」という用語は、デオキシリボ核酸の繰り返しポリマーを指す。
「リボ核酸(ribonucleic acid))」および「RNA」という用語は、リボ核酸の繰り返しポリマーを指す。
「疾患(disease)」または「障害(disorder)」という用語は、本明細書では互換的に使用され、機能パフォーマンスの中断または妨害、および/または苦しめられた人に不快感、機能不全、苦痛、またはさらに死などの症状または人と接触して症状を引き起こす、身体またはいくつかの器官の状態のいかなる変化を意味する。疾患または障害は、ジステンバー(distemper)、病的な状態(ailing)、軽い慢性の病気(ailment)、病気(malady)、障害(disorder)、病気(sickness)、病気(illness)、愁訴(complaint)、インダーディスポーション(inderdisposion)または疾患(affection)に関連しうる。
「遺伝子」は、当技術分野において周知であり、そして本明細書では、プロモーターまたは他の調節配列などのノンコーディング領域、または近位のノンコーディング領域を含む。
生体サンプルは、生検サンプルなどの組織全体を含むことができる。生体サンプルの他の例は、特に制限されないが、唾液、鼻咽頭、血液、血漿、血清、胃腸液、胆汁、脳脊髄液、心膜、膣液、***、前立腺液、腹水、胸膜液、尿、滑液、間質液、細胞内液もしくは細胞質およびリンパ液、気管支分泌物、粘液、または硝子体液もしくは房水を含む体液を含む。生体サンプルはまた、培養培地を含んでもよい。特定の実施形態では、好ましい体液は、尿である。
「プライマー(primer)」という用語は、相補的標的配列にアニーリングすることができ、それによって出発点としての部分的に二本鎖の領域を形成し、そこからポリメラーゼ酵素がDNA伸長を継続して相補的なストランドを生成することができるオリゴヌクレオチド配列を規定する。
「診断する(diagnosing)」という用語は、異常または疾患の状態もしくは表現型が存在する任意の方法、決定または兆候を意味する。診断するには、異常または疾患状態の存在または非存在を検出することが含まれ、定性的または定量的であり得る。
「ゲノム(genome)」および「ゲノムの(genomic)」という用語は、任意の生命体もしくは非生命体または単細胞に由来する任意の核酸配列(コーディングまたはノンコーディング)を意味する。これらの用語はまた、生物学的または人工的な影響を介して突然変異または組換えによって生じる可能性のある自然発生の変異にも適用される。一例はヒトゲノムであり、染色体にパッケージされた約3×109塩基対のDNAで構成され、22対の常染色体と1つの異質染色体対がある。
選択または標的核酸配列の増幅は、多くの適切な方法によって実施することができる。一般に、Kwoh et al.,1990,Am.Blotechnol.Lab.8:14−25参照。多数の増幅技術が記載されており、当業者の特定のニーズに適合するように容易に適合させることができる。増幅技術の非限定的な例には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)、転写に基づく増幅、QβレプリカーゼシステムおよびNASBAを含む(Kwoh et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,1173−1177;Lizardi et al.,1988,BioTechnology 6:1197−1202;Malek et;およびSambrook et al.,1989,supra)。好ましくは、増幅は、PCRを用いて行われる。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、既知の技術に従って行われる(例えば、米国特許第4,683,195号明細書;米国特許第4,683,202号明細書;米国特許第4,800,159号明細書;および米国特許第4,965,188号明細書、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる)。一般に、PCRは、ハイブリダイズする条件下で、検出すべき特定の配列の各ストランドのための1つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、核酸サンプル(例えば、熱安定性DNAポリメラーゼの存在下)を処理することを含む。合成される各プライマーの伸長産物は、2つの核酸ストランドのそれぞれに相補的であり、プライマーは、それとハイブリダイズする特定の配列の各ストランドに対して十分に相補的である。各プライマーから合成された伸長産物は、同じプライマーを用いた伸長産物のさらなる合成のための鋳型としても機能することができる。伸長産物の十分な数の合成のラウンドに続いて、サンプルを分析して、検出すべき配列または複数の配列が存在するかどうかを評価する。増幅された配列の検出は、ゲル電気泳動後のDNAのEtBr染色後の可視化、または既知の技術に従って検出可能な標識の使用などによって行うことができる。PCR技術に関する総説については、PCR Protocols,A Guide to Methods and Amplifications,Michael et al.Eds,Acad.Press,1990参照。
「発現する(express)」および「産生する(produce)」という用語は、本明細書中で同義的に使用され、遺伝子産物の生合成をいう。これらの用語は、遺伝子のRNAへの転写を包含する。これらの用語はまた、RNAの1つ以上のポリペプチドへの翻訳を包含し、さらに自然発生のすべての転写後および翻訳後修飾を包含する。
「rcDNA」、「RC−DNA」または「弛緩型環状DNA(relaxed−circular DNA)」という用語は、部分的に二本鎖であり、環状であるが共有結合ではないDNAのフォームに関する。(+)ストランドは、(−)ストランドと部分的に二本鎖DNAを形成し、分子間で長さが異なる3’末端にギャップを残している(Guo,Jiang et al.2007)。例えば、HBVゲノムは、rcDNAのフォームで存在しうる。HBVゲノムの場合、rcDNAの(−)ストランドの5’末端をウイルスPタンパク質に共有結合させることができる。
「cccDNA」または「共有結合閉環状DNA(covalently closed circular DNA)」は、非融合プラスミド様分子であるDNAのフォームに関する。(−)ストランドの不連続性を有さず、(+)ストランドギャップを有さないことによってrcDNAは異なる。例えば、HBVゲノムは、cccDNAのフォームで存在し得る。HBVゲノムの場合、cccDNAは、ウイルスRNAのテンプレートとなり、子孫ウイルス粒子の生成を担う(Guo,Jiang et al.2007,Nassal 2015)。
本開示で詳述する技術的アプローチは、HBV(−)ストランドおよび(+)ストランドの相補性を除去し、rcDNAではなくcccDNAによって提供される連続するHBV DNAを増幅することによって、本明細書で提供される手順が、患者サンプル中のcccDNAのみを検出および定量することができるという利点を有する。
任意のオリジンのサンプル中のcccDNAの検出および定量のための方法が本明細書にて開示される。いくつかの実施形態では、サンプルは、特に制限されないが、組織、血液、血清、血漿、または得られる任意の体液など、患者から得られた臨床サンプルであり得る。他の実施形態では、サンプルは、特に制限されないが、細胞培養および動物研究など、研究に基づくサンプルであり得る。
本開示は、cccDNAテンプレートの高度に特異的かつ高感度な定量および検出を可能にする方法を提供する。本細書に開示された方法を用いることにより、DNAの亜硫酸水素ナトリウム処理を行い、それによってHBVゲノムの相補的な(+)および(−)ストランドを非相補的なストランドに変換する。図1は、亜硫酸水素ナトリウムでの脱アミノ化によるシトシンヌクレオチドのウラシルヌクレオチドへの分子変換を示す。図1に示すように、シトシンとの相補的塩基対合は、グアニンであり、ウラシルとの相補的塩基対合は、アデニンである。
このようなHBV DNAの2つのストランドの分離は、プライマーがrcDNAの(+)ストランドおよび不連続な(−)ストランドにおけるギャップを含む領域(一方、この領域は、cccDNAにおいて連続である)に及ぶように選択されるストランド特異的なPCRの設計を可能にする。プライマーは、ヒトゲノムDNAと重複しないように設計されている。しかし、以前のアプローチとは異なり、処理され、お互いに非相補的にされた(+)および(−)ストランドは、互いにアニーリングすることができ、cccDNAからのものと同一の単位複製配列を生成することができ、短いが重複する産物を生成する個々のプライマーの線状伸長の課題を克服する。この戦略は、cccDNAと、rcDNAのような、このウイルスゲノムDNAの他のフォームと、を区別することができる、真にcccDNA特異的PCRである。
図2A〜2Gは、文献からの現在利用可能なcccDNA PCR分析と比較した、「BS−cccDNA PCRアッセイ」と表す前述のcccDNA PCR分析の動作原理を示す。
図2に示すように、cccDNA測定の「偽陽性(false positive)」は、現在のcccDAN PCR分析(出典 Nassal,2015 M.)によるrcDNAテンプレートに由来した。最新のcccDNA PCR分析(またはnon−BS cccDNA PCR分析)は、矢印によって示されるように、DR1およびDR2領域のいずれかのサイドにプライマーを設計した。囲んだダイアグラムに示されるように、rc DNA から生成された偽陽性は、互いにアニーリングすることができ、その後増幅してcccDNAと同一の単位複製配列を形成することができる、より短いが重複する産物を生成する個々のプライマーの線状伸長に起因する。
図2Bは、C/T変換をもたらす亜硫酸水素塩処理(BS)の図である。右のパネルに示す一例は、亜硫酸水素塩処理後、CpG部位のシトシン「C」は、メチル化されていればCのままであることを示す。全ての非メチル化Cは、DNA配列におけるそれらの位置にかかわらず、Uへと変換され、Tと同様Aに相補的である。したがって、この結果は、DNAのプラス(+)ストランドおよびマイナス(−)ストランドの相補的な特徴を破壊するDNA配列の改変である。
図2Cは、BS−cccDNA PCR分析設計に使用したnt位置1556〜1628(GenBank accession # NC_003977)からのHBV DNA配列を示し、亜硫酸水素塩処理後のDNA配列の変化により、プラスおよびマイナスストランドは、もはや互いに相補的ではないことを示す。
図2Dは、BS−変換プラスストランド鎖配列を用いた「BS−cccDNA」PCR分析設計を示す。フォワードプライマー、リバースプライマーおよびTaqManプローブの位置(網掛け)と配列とを示す。
図2Eは、「BS−cccDNA」と従来の、現在の、または公開された「cccDNA」PCRアプローチとの概要の比較を示す。図は、たとえプライマー設計がrcDNAのプラスストランドにおいて不連続である領域であっても、PCRがプラスおよびマイナスストランドの相補性を、例えば亜硫酸水素塩処理によって破壊することなく行われた場合、生じる可能性のある偽陽性を示す。
図2Fは、亜硫酸水素塩処理なしで、cccDNA PCRによるrcDNAテンプレートから生成された偽陽性のDNA配列によるさらに詳細な図を提供する。
図2Gは、プラスストランド特異的でBS−特異的なプライマーおよびプローブを用いたPCR増幅の前にDNAの亜硫酸水素塩処理を含む「BS−cccDNA」PCR分析によって、cccDNAテンプレートおよびrcDNAテンプレートからそれぞれ生成された真陽性および真偽性のDNA配列による別の図を提供する。
図3は、本開示のいくつかの実施形態によるHBV cccDNAの検出を示す。図2E(および図2G)におけるPCR増幅戦略から生成された相補的な増幅ストランドは、プローブに結合する。相補的なプライマーがこの増幅ストランドをコピーし始めると、プローブに遭遇し、プローブを消化して、消光剤(BBQ)から色素(FAM)を放出する。蛍光におけるこの変化は、リアルタイムPCRによる定量的検出を可能にする。
図4Aおよび4Bは、PCRの標的であるDR2領域におけるHBVウイルス(A−H)の8遺伝子型のマルチシーケンス分析を示す。
図5は、目的の領域で亜硫酸水素塩変換HBV DNAに似ている2つの合成DNAテンプレートを示す。両方のストランドが使用されるが、相補的ではなく、一本鎖である。合成BS−cccDNAテンプレートは、2つのDNAオリゴから構成され、BS−rcDNAはマイナスストランドの不連続を模倣する3つのDNAオリゴから構成される。
この技術は、酵素によるプラスミドセーフDNase前処理(Singh,Dicaire et al.2004)に依存しないが、必要に応じて組み合わせることができる。この独立性は、rcDNAのほぼ完全な(+)ストランドがこの増幅反応の基質として作用できないためである。(+)ストランドのギャップと重複する亜硫酸水素塩処理領域のために設計されたTaqManプローブは、cccDNAの特異的定量を保証する。この方法はまた、DNaseまたはエキソヌクレアーゼを必要としないので、トータルのHBV DNAの定量化を可能にし、それによってnon−cccDNAバックグラウンドの完全性を保存する。
本明細書中に開示される方法は、肝臓損傷の重篤度を評価し、抗ウイルス療法の有効性を評価するため、制限されないが、B型肝炎患者由来の血清などの任意のオリジンのcccDNAの検出および/または定量に適している。
抗ウイルス療法を受けていて、治療を中止した患者では、HBVは、cccDNAから再活性化することができる(Petersen J 2007)。肝臓におけるcccDNAの持続性をモニターするためには、繰り返しの肝生検が必要であり、これは患者にとって危険で不快であり、高価である(Wu,Johnson et al.2014,Zhong,Hu et al.2014,Shi,Sun et al.2015)。cccDNAは、血液中、特に肝臓損傷後にも見出されるので、血清または血漿中でのその検出は、肝生検によらずに抗ウイルス療法の有効性および肝臓損傷の程度を評価することを可能にする(Wong,Yuen et al.2004,Takkenberg,Zaaijer et al.2009)。
cccDNAの定量のための高感度かつ特異的な方法が非常に望まれていたが、このようなアッセイの開発は、細胞あたりのcccDNAの低コピー数などの要因により困難であることが判明していた(Nassal 2015)。細胞あたりのcccDNAコピー数を増加させるための細胞株が生み出されており(Singh,Dicaire et al.2004)、サザンブロットによる検出を可能にする(Liu,Campagna et al.2013)。しかし、サザンブロットは、患者サンプルからのcccDNAの検出に適切な方法ではない。PCRに基づくアプローチも、HBV DNAの(−)ストランド重複および(+)ストランドギャップ領域を標的とするプライマーを設計することにより開発されている(He,Wu et al.2002)。このアプローチはHBV DNAに対して選択的に行うことができるが、HBVゲノムのcccDNAとrcDNAとのフォームを区別することはできない(Nassal 2015)。ローリングサークル増幅およびInvader技術のような他の技術が記載されているが、正確でクリーンな定量は、得られない(Wong,Yuen et al.2004,Zhong,Hu et al.2014,Nassal 2015)。
以前の研究は、血清HBV cccDNAレベルが慢性的に感染しているHBV患者における肝内cccDNA量と関連していることを示している(Li,Zhao et al.2014)。したがって、血清cccDNAの検出は、繰り返しの肝生検の必要なく、肝内cccDNAレベルの相対的かつ連続的なモニタリングとしての機能を果たす。血清中のcccDNAの定量的検出は、抗ウイルス療法の有効性および指針の評価を可能にする(Chen、Sze et al.2004)。HBV cccDNAの検出方法は報告されているが、現在、cccDNAの検出および定量のための市販のキットは存在しない。
cccDNAのための実現可能な検出方法は、HBVに対する新たな抗ウイルス剤の開発、ウイルス進行および抵抗のモニタリング、肝外の感染の発見のために重要であろう。HBV創薬努力の多くは、HBVを抑制するよりむしろ治療する改善した抗ウイルス剤の開発を目的としている(Ahmed,Wang et al.2015,Kumar,Perez−del−Pulgar et al.2016)。これは、感染した肝臓あたり、細胞あたり平均0.1〜1コピーの非常に低い濃度で存在するためcccDNAの非常に正確で高感度の検出方法を必要とする。今後何年も、抗ウイルス療法を受けるHBV感染者のかなりの割合が、cccDNAの検出のための容易な診断方法へのアクセスの恩恵を受けるであろう。
上述の実施形態は、本開示の原理の適用を構成するであろう多くの様々な他の実施形態を例示するだけであることを理解すべきである。そのような他の実施形態は、本開示の主旨および範囲から逸脱することなく、当業者によって容易に考案することができ、それらは、本開示の範囲であるとみなされるべきである。
本出願に引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示に記載の技術的なアプローチを以下の非限定的な例によってさらに説明する。
実施例1:PCRによって検出される亜硫酸水素塩処理後のDNAの回収
二本鎖DNAの相補的なストランドは、図2Bに示すように、シトシンヌクレオチドをウラシルに変換する、亜硫酸水素塩処理により非相補的にすることができる。
二本鎖DNAの相補的なストランドは、図2Bに示すように、シトシンヌクレオチドをウラシルに変換する、亜硫酸水素塩処理により非相補的にすることができる。
ここで、Qiagen Epitect Bisulfite conversion kits(Qiagen,CA)およびZymo Research EZ DNA Methylation Gold kits(Zymo Research,Zymo Research Corporation,CA)を亜硫酸水素塩処理のため、製造業者の仕様書に従って使用した。ヒトHCC組織サンプルからのDNAを亜硫酸水素塩処理し、亜硫酸水素塩処理の前後に特定のアッセイで試験した。構成遺伝子上の領域、アクチンを、亜硫酸水素塩未処理DNA領域および亜硫酸水素塩処理DNA領域を標的とするアッセイを実行することによって比較するために使用した(図8参照)。
図8は、亜硫酸水素塩処理(BS)がDNA標的領域のコピー検出を有意に減少させないことを示す。亜硫酸水素塩未処理および亜硫酸水素塩処理DNA両方のアクチン遺伝子における短い産物を増幅するプライマーを比較し、大きな差がないことを明らかにした。HBVに感染した患者由来の5つの組織サンプルおよび5つの血清サンプルをこの比較に使用した。アクチン遺伝子での亜硫酸水素塩処理前後の比較は、製造業者の仕様ごとの高さであり、本明細書に記載のBS−cccDNA分析における使用のための適性を明らかにする。
実施例2:リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によるDNA定量
全HBV DNAは、製造業者の仕様書に従い、LightCycler PCR instrument(Roche Biochemical,Germany)およびLightCycler Probe Master Mix(Roche Biochemical,Germany)を用いたリアルタイムPCRにより定量した。亜硫酸水素塩処理した全HBV DNAのプライマー(フォワード、5’−TTATGTTAATGTTAATATGGGTTTAA−3’;リバース、5’−TTCTCTTCCAAAAATAAAACAA−3’;プローブ、5’−6FAM−TTAGATAATTATTG+TGG+T+T+T+TA+TA+T−BBQ3’)および定量化の標準として段階希釈HBV DNAプラスミドを定量化のために使用した。
全HBV DNAは、製造業者の仕様書に従い、LightCycler PCR instrument(Roche Biochemical,Germany)およびLightCycler Probe Master Mix(Roche Biochemical,Germany)を用いたリアルタイムPCRにより定量した。亜硫酸水素塩処理した全HBV DNAのプライマー(フォワード、5’−TTATGTTAATGTTAATATGGGTTTAA−3’;リバース、5’−TTCTCTTCCAAAAATAAAACAA−3’;プローブ、5’−6FAM−TTAGATAATTATTG+TGG+T+T+T+TA+TA+T−BBQ3’)および定量化の標準として段階希釈HBV DNAプラスミドを定量化のために使用した。
亜硫酸水素塩変換cccDNAを定量するため、(+)ストランドギャップ領域内でのプライマー(フォワード、5’GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTTGTYGGATYGTGTGTATTT−3’;リバース、5’−AACRTTCACRATAATCTCCATAC−3’)をrcDNAの増幅を防止するために選択した。TaqMan probe 5’ 6FAM− TTTTAT+T+T+T+T+G+TAY+G+TA−BBQ−3’を増幅産物を検出するために使用した。
実施例3:リアルタイムPCRによるcccDNAの検出のための1ステップBS−cccDNA分析
図7は、100コピーの感度を示すBS−cccDNAのテンプレートワンステップcccDNA分析における100コピーのBS−cccDNAのテンプレートの感度、および105コピーのバックグランドにおける108から100コピーの合成BS−cccDNAの線形性を示す。図5に記載の合成HBVテンプレートの10倍段階希釈は、分析での100から108コピーの感度および線形性の範囲である。データは、増幅曲線(上)および標準曲線(下)として示される。
図7は、100コピーの感度を示すBS−cccDNAのテンプレートワンステップcccDNA分析における100コピーのBS−cccDNAのテンプレートの感度、および105コピーのバックグランドにおける108から100コピーの合成BS−cccDNAの線形性を示す。図5に記載の合成HBVテンプレートの10倍段階希釈は、分析での100から108コピーの感度および線形性の範囲である。データは、増幅曲線(上)および標準曲線(下)として示される。
1ステップリアルタイムPCRを配列番号11および配列番号24のプライマーセットを用いて行った。増幅産物の検出をプローブとして配列番号29を用いて行った。ヒトメチル化亜硫酸水素塩処理DNAをネガティブコントロールとして10,000コピーで使用すると、観察可能な増幅はなかった。104HMBSは、10コピーのcccDNAと同様のcp値で増幅されたので、1ステップBS−cccDNAの感度または検出限界は、104HMBSバックグラウンドの存在下で100コピーであることに注意されたい。
以下のプロトコルは、Roche DNA Master SYBR(登録商標) Green I systemとともに10μlの反応を用いたRoche LightCycler(登録商標) Real−time PCR装置を使用する。以下の試薬を添加した:順に、5μlの2X LC probes Master Mix(1X最終濃度)、1μlのPCRグレード水、1μlの10μMフォワードプライマー(配列番号11、5’−GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTTGTYGGATYGTGTGTATTT−3’;1μM最終濃度)、1μlの10μMリバースプライマー(配列番号24、5’−AACRTTCACRATAATCTCCATAC−3’;1μM最終濃度)、および1μlの2μMプローブ(配列番号29、5’−6FAM−TTTTAT+T+T+T+T+G+TAY+G+TA−BBQ−3’;0.2uM最終濃度)。よく混合し、このPCR反応9μlを、Roche 96−well LightCycler 480 plateにおいて合計10μlの最終量となるよう、それぞれのDNAテンプレートまたはサンプル1μlに添加する。RT−PCR反応を以下の条件で行う:95℃5分、その後95℃10秒、52℃10秒、72℃10秒を45サイクル、その後40℃30秒の冷却プログラム。
実施例4:RT−PCRによるcccDNAの検出のための2ステップBS−cccDNA分析
図6は、2ステップBS−cccDNA分析の結果を示す。図5に記載の合成HBVテンプレートの10倍段階希釈は、分析での10から108コピーの感度および線形性の範囲である。データは、増幅曲線(上)および標準曲線(下)として示される。第1ステップとして、配列番号17および配列番号24のプライマーセットを用いてPCR増幅を行った。第2ステップとして、第1ステップの産物と配列番号12および配列番号24のプライマーセットとを用いてPCRを行った。プローブとして配列番号29を用いて増幅産物を検出し、定量した。ヒトメチル化亜硫酸水素塩処理DNAをネガティブコントロールとして10,000コピーで使用すると、観察可能な増幅はなかった。
図6は、2ステップBS−cccDNA分析の結果を示す。図5に記載の合成HBVテンプレートの10倍段階希釈は、分析での10から108コピーの感度および線形性の範囲である。データは、増幅曲線(上)および標準曲線(下)として示される。第1ステップとして、配列番号17および配列番号24のプライマーセットを用いてPCR増幅を行った。第2ステップとして、第1ステップの産物と配列番号12および配列番号24のプライマーセットとを用いてPCRを行った。プローブとして配列番号29を用いて増幅産物を検出し、定量した。ヒトメチル化亜硫酸水素塩処理DNAをネガティブコントロールとして10,000コピーで使用すると、観察可能な増幅はなかった。
具体的には、以下のようにしてPCR反応を実施した:0.5mLのPCR微小遠心管内に15μlの全容量を含有するPCR反応のアセンブリ。QIAGEN HotStartPlus DNA Taq(登録商標) Polymerase system(QIAGEN,Valencia,Calif.)を用いて、順に7.9μlのPCRグレード水、1.5μlの10X PCRバッファー(1X最終濃度)、1.5μlの2.5mM dNTPs(0.25mM最終濃度)、1μlの10μMフォワードプライマー(配列番号17、5’−TTAYGYGGTT TTTTYGTTTG T−3’;1μM最終濃度)、1μlの10μMリバースプライマー(配列番号24、5’−AACRTTCACRATAATCTCCATAC−3’;1μM最終濃度)、および0.1μlのTaqポリメラーゼ(最終濃度0.033U)、ならびに1μlのそれぞれのDNAテンプレートまたはサンプル。以下のPCR増幅条件で反応を実施する:95℃5分、その後95℃30秒、52℃30秒、72℃30秒を20サイクル、その後40℃30秒伸長。使用の準備が整うまでPCR産物を4℃に保つ。
リアルタイム検出のために、ステップ2反応は、実施例3に記載のものと同じ手順を用いて行い、1μl DNAテンプレートインプットは、前のステップ1、20サイクル増幅産物からのものであり、プライマーは、1μlの10μMフォワードプライマー(配列番号12、5’−GCTCTTCGTGGTGTGGTGTTTGTYGGATYGTGTGTATTT−3’;1μM最終濃度)および1μlの10μMリバースプライマー(配列番号24、5’−AACRTTCACRATAATCTCCATAC−3’;1μM最終濃度)である。
実施例5:HBVに感染した患者の肝生検におけるcccDNAの検出
HCCの肝組織生検は、HBVに感染した患者から取得され、これらのサンプルからの単離DNAは、亜硫酸水素塩処理を受けた。次いで、亜硫酸水素塩処理DNAを総HBVのためのPCRによって分析し、2ステップBS−cccDNA分析によって検査した(図9参照)。
HCCの肝組織生検は、HBVに感染した患者から取得され、これらのサンプルからの単離DNAは、亜硫酸水素塩処理を受けた。次いで、亜硫酸水素塩処理DNAを総HBVのためのPCRによって分析し、2ステップBS−cccDNA分析によって検査した(図9参照)。
図9は、HBVに感染した患者の組織サンプルから検出されたHBV DNAの量を示す。2ステップBS−cccDNA分析を使用してcccDNAを検出し、個体におけるHBV DNAで変化したcccDNAの量を示す。患者1および2については、HBV DNAレベルは、HBV分析の検出限界(反応あたり100コピー)未満であったが、高感度cccDNA分析は、低レベルのcccDNAを検出することができた。
全HBV DNAインプットは、105コピー未満であり、non−cccDNA(rcDNA含む)は、2ステップcccDNA分析によって検出すべきではないことを示した。したがって、この分析からの増幅は、HBV感染肝組織サンプルにおける特異的なcccDNA検出の明らかな証拠である。
Claims (30)
- 共有結合閉環状DNA(cccDNA)および前記cccDNAと実質的に同じDNA配列であり、異なるフォームである非cccDNA(non−cccDNA)を含むDNAサンプル中の前記cccDNAを検出するまたは定量する方法であって、
i)前記DNAサンプルを処理して、処理されたDNAサンプル中の二本鎖DNA分子の相補的な特徴を破壊し、それによって前記二本鎖DNA分子の2つのストランドのリアニールを防止すること;および
ii)前記非cccDNAではなく前記cccDNAが増幅産物を生じることができるように、前記処理されたDNAサンプルで増幅分析を実施することを含む、方法。 - 工程i)において、前記DNAサンプルを前記処理されたDNAサンプル中の二本鎖DNA分子の2つのストランドの配列を変更するように構成された化学試薬で処理し、それによって、前記2つのストランドの相補的な特徴を破壊する、請求項1に記載の方法。
- 前記化学試薬が脱アミノ化反応を起こすことによって作用する、請求項2に記載の方法。
- 前記脱アミノ化反応は、特定のヌクレオチドに対して選択的である、請求項3に記載の方法。
- 工程ii)における増幅分析が前記DNA配列上の2つの戦略的位置にそれぞれアニーリングするように構成され、同時に前記non−cccDNAではなく前記cccDNAから増幅産物を生成することができるように構成された一対のプライマーを用いて実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記2つの戦略的位置がそれぞれ前記non−cccDNAにおける不連続なストランドの既知の不連続領域の2つのサイドにある、請求項5に記載の方法。
- 前記一対のプライマーが前記処理されたDNAサンプル中の連続したストランドの前記2つの戦略的位置にそれぞれアニーリングして、それによって前記連続したストランドから増幅産物を生成するように構成される、請求項6に記載の方法。
- 工程ii)における増幅分析が前記増幅産物に基づいて、前記cccDNAを定量するように構成されたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、請求項7に記載の方法。
- 工程ii)における増幅分析が前記処理されたDNAサンプルにおいて、不連続なストランドではなく連続したストランドにアニーリングするように構成され、前記cccDNAの定量を可能にするように構成されたプローブを用いてさらに行われる、請求項7に記載の方法。
- 前記プローブが、5’末端および3’末端それぞれに、蛍光強度を測定することによって前記cccDNAの定量を可能にするように構成された蛍光色素および蛍光消光剤で標識されている、請求項9に記載の方法。
- 前記cccDNAがB型肝炎ウイルス(HBV)のDNAフォームを含む;および
前記non−cccDNAがHBVの弛緩型環状DNA(rcDNA)フォームを含む、請求項1に記載の方法。 - 工程i)の前に、生体サンプルからDNAサンプルを得ることをさらに含み、前記生体サンプルが組織または体液である、請求項11に記載の方法。
- 前記体液が血清、血漿、血液、尿、または唾液である、請求項12に記載の方法。
- 共有結合閉環状DNA(cccDNA)および前記cccDNAと実質的に同じDNA配列であり、異なるフォームである非cccDNA(non−cccDNA)を含むDNAサンプル中の前記cccDNAを検出するまたは定量するためのキットであって、
それにより処理されたDNAサンプル中の二本鎖DNA分子の相補的な特徴を破壊し、それによって前記二本鎖DNA分子の2つのストランドのリアニールを防止するように構成された、化学試薬;および
フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、前記DNA配列上の2つの戦略的位置にそれぞれアニーリングするように構成され、同時に前記non−cccDNAではなく前記cccDNAから増幅産物を生成することができるように構成された、一対のプライマー、を含む、キット。 - 前記化学試薬が亜硝酸、亜硝酸ナトリウム、ニトロソアミン類、または亜硫酸水素ナトリウムの少なくとも一つを含む、請求項14に記載のキット。
- 前記2つの戦略的位置がそれぞれ前記non−cccDNAにおける不連続なストランドの既知の不連続領域の2つのサイドにある;および
前記一対のプライマーが前記処理されたDNAサンプル中の連続したストランドの前記2つの戦略的位置にそれぞれアニーリングして、それによって前記連続したストランドから増幅産物を生成するように構成される、請求項14に記載のキット。 - さらにプローブを含み、
前記プローブは、前記処理されたDNAサンプルにおいて、不連続なストランドではなく連続したストランドにアニーリングするように構成され、前記cccDNAの定量を可能にするように構成される、請求項16に記載のキット。 - 前記プローブが5’末端および3’末端それぞれに、蛍光色素および蛍光消光剤で標識されている、請求項17に記載のキット。
- 前記蛍光色素が6−カルボキシフルオレセイン、ヘキサクロロ−6−カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ−6−カルボキシフルオレセイン、FAM(5−カルボキシフルオレセイン)、HEX(2’,4’,5’,7’−テトラクロロ−6−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン)、またはCy5(シアニン−5)の少なくとも1つを含む;および
前記蛍光消光剤が6−カルボキシテトラメチル−ローダミン、TAMRA(5−カルボキシテトラメチルローダミン)、BBQ(ブラックベリークエンチャー(BlackBerry Quencher))、またはBHQ3(ブラックホールクエンチャー3(black hole quencher 3))の少なくとも1つを含む、請求項18に記載のキット。 - 前記cccDNAがB型肝炎ウイルス(HBV)のcccDNAフォームを含む;および
前記non−cccDNAがHBVのrcDNAフォームを含む、請求項14に記載のキット。 - 前記フォワードプライマーが配列番号1〜21のいずれか1つに記載の配列を含む、請求項20に記載のキット。
- 前記リバースプライマーが配列番号22〜28のいずれか1つに記載の配列を含む、請求項20に記載のキット。
- 前記リバースプライマーが配列番号24である、請求項22に記載のキット。
- 前記フォワードプライマーが配列番号11、配列番号12または配列番号17である、請求項23に記載のキット。
- プローブをさらに含み、前記プローブが配列番号29〜31のいずれか1つに記載の配列を含む、請求項20に記載のキット。
- サンプルにおいて、cccDNAをrcDNAと識別可能に検出する方法であって、(a)ヌクレオチドコンバーター(nucleotide converter)試薬で前記サンプルを処理すること;および(b)PCRプロシージャによって前記cccDNAを検出すること、を有する方法。
- 前記ヌクレオチドコンバーター試薬が脱アミノ化剤(deaminator)である、請求項26に記載の方法。
- 前記PCRプロシージャが不連続領域に及ぶ一対のプライマーを使用する、請求項26に記載の方法。
- 前記一対のプライマーが前記不連続領域の2つのサイド上の2つの戦略的位置にそれぞれアニーリングするように構成され、同時にnon−cccDNAではなく前記cccDNAから増幅産物を生成することができるように構成される、請求項28に記載の方法。
- 前記PCRプロシージャがプローブをさらに使用し、前記プローブが不連続なストランドではなく連続したストランドにアニーリングするように構成される、請求項28に記載の方法。
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