CN111621486B

CN111621486B - 一种低温下高酶活的耐热木聚糖酶xynb及其突变体基因、应用和基因序列制备方法

Info

Publication number: CN111621486B
Application number: CN202010447957.6A
Authority: CN
Inventors: 熊海容; 王晶
Original assignee: South Central University for Nationalities
Current assignee: South Central Minzu University
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2020-05-25
Publication date: 2021-10-19
Anticipated expiration: 2040-05-25
Also published as: CN111621486A

Abstract

本发明属于蛋白质工程和基因工程领域，具体涉及一种低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB及其突变体基因、应用和基因序列制备方法，本发明提供了低温下高酶活的木聚糖酶XYNB，在80℃以下时的酶活力显著高于原始酶，同时又保留有原始酶的耐热性，适用于饲料添加剂、食品、酿造和医药等工业领域。

Description

一种低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB及其突变体基因、应用和基因序列制备方法

技术领域

本发明属于蛋白质工程和基因工程领域，具体涉及一种低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB及其突变体基因、应用和基因序列制备方法。

背景技术

木聚糖是植物细胞壁中最主要的半纤维素，约占植物细胞干重的35％左右，是自然界中出纤维素之外含量最丰富的多糖。木聚糖是由木糖通过β-1,4-糖苷键聚合而成的主链和一些侧链基团共同构成的一类杂合多聚糖，作为一种丰富的生物质资源，在木聚糖酶的作用下可被降解为国际市场上急需的低聚木糖和木糖。然而自然界中很大一部分木聚糖酶尚未被有效利用，造成了该资源的很大浪费。

微生物木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是重要的工业用酶，随机催化水解木聚糖内部的β-1,4-D-木糖苷键生成木寡糖。木寡糖作为底物可被其他木聚糖酶类进一步降解，如β-D-木糖苷酶、α-L-***呋喃糖苷酶和D-葡萄糖醛酸酶等(Khandeparker R,NumanMT.Bifunctionalxylanase and their potential use in biotechnology.J IndMicrobiol biotechnol 2008,35:635-644.)。基于功能上初级和三级结构和模型的显著差异，木聚糖酶主要分类为糖苷水解酶类第10和11家族，然而在糖苷水解酶类第5、7、8、16、26、30、43、52和62家族的酶中也发现了具有水解木聚糖的活性(http://www.cazy.org/fam/acc_GH.html)(Collins T,Gerday C,Feller G.Xylanase,xylanase families andextremophilic xylanases.FEMS Microbiol Rev 2005,29:3-23.)。其中GH 10家族木聚糖酶相对分子量较大(>30000)，结构复杂，通常有多个结构域组成，包含一个催化结构域(Catalysis Domain,CD)是木聚糖酶主要组成部分，承担着木聚糖酶的水解特性。虽然他们在氨基酸数量和组成方面差异很大，但其催化结构在大小上都很接近，主要以α-螺旋和α-折叠片重复出现的结构，因为与TIM结构相近，属于一个家族，称为(α/β)8折叠结构，其中特定位置的谷氨酸和天冬氨酸对催化特性影响很大。该酶还含有非催化活性的结构域，如多糖底物结合域，热稳定结构域，以及多个催化结构域等，赋予该酶分解可溶性木聚糖，不可溶性木聚糖酶和其他底物等功能。

木聚糖酶的应用起源于1980年在动物饲料加工中的使用，随之被逐渐应用于造纸、食品、制药、酿造、纺织和生物燃料等领域。目前该酶主要应用于制浆造纸，饲料和食品等行业，并在现代工业中的应用地位越来越明显。木聚糖酶是利用非淀粉质原料生产酒精过程中的关键酶之一。随着生物能源事业发展的需要，木聚糖酶势必应用于更广泛的领域(Fawzi EM.Highly thermostable purified xylanase from Rhizomucor miehei NRRL3169.Ann Microbiol 2010,60:363-368.)。在工业生产过程中，往往存在高温等极端环境，高温环境能加快酶促反应速度，提高液体物料的流动性能，防止有害微生物在过程中的生长繁殖等等。普通中温木聚糖酶在高温下会发生结构变化，从而大幅度地丧失活性。为防止这个热灭活过程，就需要添加一些化学物质等方法保护酶，这样不仅增加生产成本且对产品质量有不利影响。应用海栖热袍菌Thermotoga maritima MSB8所生产的耐热木聚糖酶进行水解，能从根本上解决高温环境使加入的酶很快失活的问题。

来源于细菌的木聚糖酶普遍比来源于真菌的木聚糖酶具有更高的热稳定性，且毕赤酵母具有高效分泌、正确折叠蛋白和极高细胞浓度培养的潜能常作为大规模生产外源蛋白质的表达***，将来源于细菌的木聚糖酶基因经序列优化后应用于可高密度培养的毕赤酵母，更适宜于工业化生产。来源于海栖热袍菌Thermotoga maritima MSB8的木聚糖酶1VBR由具有较优良的酶学性质(Winterhalter C,Liebl W.Two extremely thermostablexylanases of the hyperthermophilic bacterium Thermoyoga maritima MSB8.ApplEnviron Microbiol.1995,61(5):1810-1815.)，具有极端热稳定性。

易错PCR技术是在正常PCR技术上演变而来的，它是一种使DNA在复制扩增过程中更容易出现错误配对的PCR技术，因此又称为错配PCR或者倾向错误PCR。易错PCR通常是利用低保真度的TaqDNA聚合酶和改变一些PCR反应体系等手段，来降低PCR过程中DNA复制的保真度，使错配率升高，从而得到与原来不同的DNA序列或基因。

将该酶基因序列通过易错PCR突变后，通过表达和酶特性鉴定后筛选，获得的低温下高酶活的木聚糖酶突变体XYNB，在80℃以下时的酶活力显著高于原始酶，同时又保留有原始酶的耐热性，适用于饲料、食品、酿造和医药等工业领域，例如饲料用酶希望同时满足高温制粒时酶失活少且在动物消化道常温时酶活力高的特别要求。

发明内容

本发明的目的是将木聚糖酶1VBR基因序列通过易错PCR突变后，通过表达和酶特性鉴定后筛选，获得低温下高酶活的木聚糖酶XYNB，在80℃以下时的酶活力显著高于原始酶，同时又保留有原始酶的耐热性，适用于饲料添加剂、食品、酿造和医药等工业领域，例如饲料用酶希望同时满足高温制粒时酶失活少且在动物消化道常温时酶活力高的特别要求。

本发明提供了一种低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

而且，所述低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB最适反应温度为90℃，所述低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB在pH 5.5、60℃条件时的酶活力能够维持50％以上。

一种低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB的突变体基因，该突变体基因编码所述的低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。

以及包含所述的低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB编码序列的表达载体。

其中，所述表达载体为pPIC9K-XYNB。

以及包含所述的低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB编码序列的重组菌株。

其中，所述菌株为重组大肠杆菌或重组酵母。

以及所述低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB在饲料添加剂、食品、酿造或医药中的应用。

一种低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB的基因序列制备方法，以pET-22b(+)-1VBR质粒作为模板，使用Taq酶并设置PCR体系中的Mg2+和Mn2+浓度分别为2.5mM和0.8mM，引物序列为5’-CGCCATGGATTCTCAGAATGTATC-3’和5’-TCGCGACTCGAGTTTTCTTTCTTC-3’，进行两轮易错PCR，筛选获得木聚糖酶XYNB的突变体基因序列，其突变位置为N562D，T568M，R575G，D592G，V632A，D643G，K789E，Q792L，I837M。

一种低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB的制备方法，利用上述的表达载体转化宿主细胞得到重组菌株，培养重组细胞表达出低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB。

本发明的有益效果在于提供了低温下高酶活的木聚糖酶XYNB，在80℃以下时的酶活力显著高于原始酶，同时又保留有原始酶的耐热性，适用于饲料添加剂、食品、酿造和医药等工业领域，例如饲料用酶希望同时满足高温制粒时酶失活少且在动物消化道常温时酶活力高的特别要求。

本发明首先全基因合成木聚糖酶1VBR基因KR078269，包括其终止子序列，及其两端酶切位点序列。对该基因序列进行易错PCR突变，获得木聚糖酶XYNB的基因序列。通过双酶切、连接将全基因合成木聚糖酶基因***表达载体pPIC9K中，构建重组表达质粒pPIC9K-XYNB。将该重组表达质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，以PCR验证法筛选出阳性克隆菌株。

本发明提供的产木聚糖酶XYNB的基因工程菌株GS115-XYNB，所分泌木聚糖酶XYNB在发酵液中的蛋白质含量可达电泳纯级别，几乎不需要纯化。

附图说明

图1木聚糖酶突变体XYNB的SDS-PAGE分析；

图2木聚糖酶突变体XYNB的最适温度(pH 5.5，10分钟)；

图3木聚糖酶突变体XYNB的热致死曲线(pH 5.5，100℃)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细具体说明。

实验材料：

1)菌株和质粒：大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α和毕赤酵母GS115获赠于中国农业科学院饲料研究所；pPIC9K分泌型表达载体购自Invitrogen公司。

2)酶和试剂盒：限制性内切酶、Taq酶、Pyrobest DNA聚合酶、T4 DNA连接酶等工具酶购TaKaRa公司；DNA纯化试剂盒购自爱思进生物技术有限公司。

3)生化试剂：G418购自Invitrogen公司；蛋白质分子量标准购自上海生物化学研究所；IPTG、X-Gal、SDS及角豆胶购自Sigma公司；TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺为国药试剂。

50mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：取7.10g磷酸氢二钠溶解于800mL双蒸水，用柠檬酸调节pH为4.0～7.5范围内任一值后，定容至1L。

50mM Tris-HCl缓冲液：取6.06g Tris溶解于800mL双蒸水，用1M HCl节pH至7.5～9.0范围内任一值后，定容至1L。

50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液：取7.50g甘氨酸溶解于800mL双蒸水，用1M氢氧化钠溶液调pH至9.0～12范围内任一值后，定容至1L。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1：木聚糖酶突变株XYNB基因序列的获得

依据序列比对，PDB中发表的来源于海栖热袍菌Thermotoga maritima MSB8的木聚糖酶1VBR氨基酸序列与Thermotoga maritima MSB8基因组序列(CP007013.1：1,869,644bp)中预测木聚糖酶(EHA58720.1)的氨基酸序列相似性为100％。该预测木聚糖酶基因序列是Thermotoga maritima MSB8基因组序列中一段基因序列(873,589→874,572bp)。

基于巴斯德毕赤酵母密码子使用偏好性，将其中稀有密码子转换为高频表达密码子，同时对照木聚糖酶1VBR的氨基酸序列，对预测木聚糖酶(EHA58720.1)基因序列进行密码子优化，获得优化后木聚糖酶1VBR基因序列(NCBI基因编号：KR078269)。以pET-22b(+)-1VBR质粒作为模板，使用Taq酶并设置PCR体系中的Mg2+和Mn2+浓度分别为2.5mM和0.8mM，引物序列为5’-CGCCATGGATTCTCAGAATGTATC-3’和5’-TCGCGACTCGAGTTTTCTTTCTTC-3’，进行两轮易错PCR，筛选获得木聚糖酶XYNB的突变体基因序列。图1为木聚糖酶突变体XYNB的SDS-PAGE分析。

实施例2：含有木聚糖酶突变株XYNB基因的重组表达质粒pPIC9K-XYNB的构建

在木聚糖酶XYNB基因3′端添加毕赤酵母偏好的终止子序列，并在5’端和3’端分别引入限制性内切酶EcoR I和Not I位点，将该基因序列交与武汉擎科创新生物科技有限公司完成全基因合成。采用限制性内切酶EcoR I和Not I完成优化的木聚糖酶XYNB基因和分泌型表达载体pPIC9K双酶切，再使用连接酶将两者连接，构建重组表达质粒pPIC9K-XYNB。将该重组表达质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，以PCR验证法筛选出阳性克隆菌株pPIC9K-XYNB-DH5α。

实施例3：高效分泌表达木聚糖酶XYNB的毕赤酵母基因工菌株的构建

采用LB液体培养基活化培养菌株pPIC9K-XYNB-DH5α，提取重组质粒pPIC9K-XYNB。采用限制性内切酶Bgl II线性化该重组质粒，并回收酶切产物。参考EasySelectTM PichiaExpression Kit制备毕赤酵母GS115感受态细胞。取约10μg线性化质粒与80μL的感受态细胞轻柔混匀后置于冰上15min，转移至预冷的0.2cm电转杯中，1500V电击完成后立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，在30℃培养箱中静置1h，涂布于MD平板上，于30℃倒置培养约48h至转化子出现。

挑取单菌落按相应编号依次分别接种于含0.25，0.5，1.0，2.0，3.0和4.0mg/mLG418的MD平板上，于30℃倒置培养约48h至单菌落出现。筛选抗性最强的重组菌株，接种于相应编号的含有3mL BMGY培养基中，30℃，200rpm摇床培养约48h，至OD600达1.8～6.0。收集菌体，重悬于1mL BMMY培养基，0.5％甲醇诱导培养约48h。

收集上清液，采用DNS法检测酶活力以筛选产酶量较高的阳性重组菌株GS115-XYNB。

实施例4：木聚糖酶突变株XYNB的性质分析

图1为木聚糖酶突变体XYNB的SDS-PAGE分析，其中M是分子量标记。

1)木聚糖酶XYNB最适温度的测定：于pH 5.5下，该酶与0.5％木聚糖溶液分别在不同温度下反应15min，加入2.5mL DNS试剂，沸水浴5min，冷却至室温，加水定容至12.5mL。于分光光度计中检测OD540。以最高酶活力为100％，计算其他条件下的相对残余酶活力。结果显示，木聚糖酶XYNB最适反应温度为90℃，在60℃条件时木聚糖酶XYNB的酶活力能够维持50％以上，显著高于原始酶的相对酶活力，如图2所示，图2为木聚糖酶突变体XYNB的最适温度(pH 5.5，10分钟)，其中1VBR用●表示，XYNB用▲表示。

2)木聚糖酶XYNB热致死曲线的测定：将木聚糖酶溶液经pH 5.5缓冲液稀释后，置于100℃水浴中，分别处理不同时间后，于最适反应条件下检测木聚糖酶活力，据此计算出木聚糖酶的半衰期。结果显示，在最适pH条件下，突变酶XYNB耐热性较原始酶1VBR的耐热性稍差，但在1小时处理后仍能保持50％以上的相对酶活力。如图3所示，图3是木聚糖酶突变体XYNB的热致死曲线(pH 5.5，100℃)，其中1VBR用●表示，XYNB用▲表示。

序列表中SEQ ID NO.3是极端耐热木聚糖酶1VBR的原始氨基酸序列(PDB代码：1VBR，氨基酸序列517-840)；SEQ ID NO.1是易错PCR突变了9个氨基酸位点的突变体XYNB(氨基酸序列517-840，突变位点为N562D，T568M，R575G，D592G，V632A，D643G，K789E，Q792L，I837M)。

突变位置下方用下划线和加粗进行标记，SEQ ID NO.1：

SEQ ID NO.4是极端耐热木聚糖酶1VBR的原始基因序列信息(NCBI基因编号：KR078269，碱基序列9-981)；SEQ ID NO.2是易错PCR产生的突变体XYNA基因测序信息：其中突变位点下方用下划线标记了出来，其中有效突变位点采用了加粗用以标识(有9个有效突变位点)，无效突变位点采用了斜体且不加粗用以标识(有4个无效突变位点)。

SEQ ID NO.2：

序列表

<110> 中南民族大学

<120> 一种低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB及其突变体基因、应用和基因序列制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Val Ser Leu Arg Glu Leu Ala Glu Lys Leu Asn Ile Tyr Ile Gly Phe

1 5 10 15

Ala Ala Ile Asn Asn Phe Trp Ser Leu Ser Asp Ala Glu Lys Tyr Met

20 25 30

Glu Val Ala Arg Arg Glu Phe Asn Ile Leu Thr Pro Glu Asp Gln Met

35 40 45

Lys Trp Asp Met Ile His Pro Glu Arg Asp Gly Tyr Asn Phe Thr Pro

50 55 60

Ala Glu Lys His Val Glu Phe Ala Glu Glu Asn Gly Met Ile Val His

65 70 75 80

Gly His Thr Leu Val Trp His Asn Gln Leu Pro Gly Trp Ile Thr Gly

85 90 95

Arg Glu Trp Thr Lys Glu Glu Leu Leu Asn Val Leu Glu Asp His Ile

100 105 110

Lys Thr Ala Val Ser His Phe Lys Gly Arg Val Lys Ile Trp Gly Val

115 120 125

Val Asn Glu Ala Val Ser Asp Ser Gly Thr Tyr Arg Glu Ser Val Trp

130 135 140

Tyr Lys Thr Ile Gly Pro Glu Tyr Ile Glu Lys Ala Phe Arg Trp Ala

145 150 155 160

Lys Glu Ala Asp Pro Asp Ala Ile Leu Ile Tyr Asn Asp Tyr Ser Ile

165 170 175

Glu Glu Ile Asn Ala Lys Ser Asn Phe Val Tyr Asn Met Ile Lys Glu

180 185 190

Leu Lys Glu Lys Gly Val Pro Val Asp Gly Ile Gly Phe Gln Met His

195 200 205

Ile Asp Tyr Arg Gly Leu Asn Tyr Asp Ser Phe Arg Arg Asn Leu Glu

210 215 220

Arg Phe Ala Lys Leu Gly Leu Gln Ile Tyr Ile Thr Glu Met Asp Val

225 230 235 240

Arg Ile Pro Leu Ser Gly Ser Glu Glu Tyr Tyr Leu Lys Lys Gln Ala

245 250 255

Glu Val Cys Ala Lys Ile Phe Asp Ile Cys Leu Asp Asn Pro Ala Val

260 265 270

Glu Ala Ile Leu Phe Trp Gly Phe Thr Asp Lys Tyr Ser Trp Val Pro

275 280 285

Gly Phe Phe Lys Gly Tyr Gly Lys Ala Leu Leu Phe Asp Glu Asn Tyr

290 295 300

Asn Pro Lys Pro Cys Tyr Tyr Ala Ile Lys Glu Val Leu Glu Lys Lys

305 310 315 320

Met Glu Glu Arg

<210> 2

<211> 972

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtatctctga gagaactcgc agaaaagctg aacatctata ttggttttgc cgcaatcaac 60

aacttttggt ctctttccga cgcagaaaag tacatggaag ttgcaagaag agagttcaac 120

atcctgaccc ctgaggacca gatgaagtgg gatatgattc atccagaaag agacggatac 180

aatttcactc ccgctgaaaa acacgttgag tttgcggaag aaaacggcat gatcgtgcat 240

ggacacactc ttgtctggca caaccagctt cctggatgga tcactggtag agaatggaca 300

aaggaagaac ttttgaacgt tcttgaagac cacataaaaa cggtggcgtc tcatttcaaa 360

ggtagagtga agatttgggg tgtggtgaac gaagcggtga gcgattctgg aacctacagg 420

gaaagcgtgt ggtacaagac gatcggtcct gaatacattg aaaaagcgtt cagatgggca 480

aaagaagccg atccagatgc gattctcatc tacaacgact acagcataga agaaatcaac 540

gcaaagtcga acttcgtcta caacatgata aaagagctga aagaaaaggg agtacctgtt 600

gatggaatag gatttcagat gcacatagac tacagagggc tcaactatga cagtttcaga 660

aggaatttgg agagatttgc gaaactcggt cttcaaatat acatcactga gatggatgtg 720

agaatccctc tcagtggttc ggaggagtat tatttgaaaa aacaggctga agtttgtgcg 780

aagattttcg atatatgctt ggacaaccct gcagttgaag cgatcctatt ttggggattc 840

acagacaaat actcctgggt tcccggcttt ttcaaagggt acgggaaagc gttgctcttc 900

gatgagaatt acaaccccaa gccttgttat tacgcgataa aagaggtgct ggagaaaaag 960

atggaagaaa ga 972

<210> 3

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Val Ser Leu Arg Glu Leu Ala Glu Lys Leu Asn Ile Tyr Ile Gly Phe

1 5 10 15

Ala Ala Ile Asn Asn Phe Trp Ser Leu Ser Asp Ala Glu Lys Tyr Met

20 25 30

Glu Val Ala Arg Arg Glu Phe Asn Ile Leu Thr Pro Glu Asn Gln Met

35 40 45

Lys Trp Asp Thr Ile His Pro Glu Arg Asp Arg Tyr Asn Phe Thr Pro

50 55 60

Ala Glu Lys His Val Glu Phe Ala Glu Glu Asn Asp Met Ile Val His

65 70 75 80

Gly His Thr Leu Val Trp His Asn Gln Leu Pro Gly Trp Ile Thr Gly

85 90 95

Arg Glu Trp Thr Lys Glu Glu Leu Leu Asn Val Leu Glu Asp His Ile

100 105 110

Lys Thr Val Val Ser His Phe Lys Gly Arg Val Lys Ile Trp Asp Val

115 120 125

Val Asn Glu Ala Val Ser Asp Ser Gly Thr Tyr Arg Glu Ser Val Trp

130 135 140

Tyr Lys Thr Ile Gly Pro Glu Tyr Ile Glu Lys Ala Phe Arg Trp Ala

145 150 155 160

Lys Glu Ala Asp Pro Asp Ala Ile Leu Ile Tyr Asn Asp Tyr Ser Ile

165 170 175

Glu Glu Ile Asn Ala Lys Ser Asn Phe Val Tyr Asn Met Ile Lys Glu

180 185 190

Leu Lys Glu Lys Gly Val Pro Val Asp Gly Ile Gly Phe Gln Met His

195 200 205

Ile Asp Tyr Arg Gly Leu Asn Tyr Asp Ser Phe Arg Arg Asn Leu Glu

210 215 220

Arg Phe Ala Lys Leu Gly Leu Gln Ile Tyr Ile Thr Glu Met Asp Val

225 230 235 240

Arg Ile Pro Leu Ser Gly Ser Glu Glu Tyr Tyr Leu Lys Lys Gln Ala

245 250 255

Glu Val Cys Ala Lys Ile Phe Asp Ile Cys Leu Asp Asn Pro Ala Val

260 265 270

Lys Ala Ile Gln Phe Trp Gly Phe Thr Asp Lys Tyr Ser Trp Val Pro

275 280 285

Gly Phe Phe Lys Gly Tyr Gly Lys Ala Leu Leu Phe Asp Glu Asn Tyr

290 295 300

Asn Pro Lys Pro Cys Tyr Tyr Ala Ile Lys Glu Val Leu Glu Lys Lys

305 310 315 320

Ile Glu Glu Arg

<210> 4

<211> 972

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtatctctga gagaactcgc agaaaagctg aacatctata ttggttttgc cgcaatcaac 60

aacttttggt ctctttccga cgcagaaaag tacatggaag ttgcaagaag agagttcaac 120

atcctgaccc ctgagaacca gatgaagtgg gatacgattc atccagaaag agacagatac 180

aatttcactc ccgctgaaaa acacgttgag tttgcagaag aaaacgacat gatcgtgcat 240

ggacacactc ttgtctggca caaccagctt cctggatgga tcactggtag agaatggaca 300

aaggaagaac ttttgaacgt tcttgaagac cacataaaaa cggtggtgtc tcatttcaaa 360

ggtagagtga agatttggga tgtggtgaac gaagcggtga gcgattctgg aacctacagg 420

gaaagcgtgt ggtacaagac gatcggtcct gaatacattg aaaaagcgtt cagatgggca 480

aaagaagccg atccagatgc gattctcatc tacaacgact acagcataga agaaatcaac 540

gcaaaatcga acttcgtcta caacatgata aaagagctga aagaaaaggg agtacctgtt 600

gatggaatag gatttcagat gcacatagac tacagagggc tcaattatga cagtttcaga 660

aggaatttgg agagatttgc gaaactcggt cttcaaatat acatcacaga gatggatgtg 720

agaatccctc tcagtggttc ggaggagtat tatttgaaaa aacaggctga agtttgtgcg 780

aagattttcg atatatgctt ggacaaccct gcagttaaag cgatccagtt ttggggattc 840

acagacaaat actcctgggt tcccggcttt ttcaaagggt acgggaaagc gttgctcttc 900

gatgagaatt acaaccccaa gccttgttat tacgcgataa aagaggtgct ggagaaaaag 960

atagaagaaa ga 972

Claims

1.一种低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB，其特征在于：所述低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB最适反应温度为90℃，所述低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB在pH 5.5、60℃条件时的酶活力能够维持50％以上。

3.一种低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB的突变体基因，其特征在于：该突变体基因编码权利要求1所述的低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求1所述的低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB编码序列的表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体为pPIC9K-XYNB。

6.包含权利要求1所述的低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB编码序列的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株为重组大肠杆菌或重组酵母。

8.根据权利要求1所述低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB在饲料添加剂、食品、酿造或医药中的应用。

9.一种低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB的制备方法，其特征在于：利用权利要求4所述的表达载体转化宿主细胞得到重组菌株，培养重组细胞表达出低温下高酶活的耐热木聚糖酶XYNB。