CN111110839B - 一种预防雏鹅痛风的鹅星状病毒二价灭活疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种鹅星状病毒二价灭活疫苗，包含有灭活的两种病毒株抗原和疫苗佐剂，其中抗原为新型鹅星状病毒GD株和保藏编号为CCTCC NO:V201976的鹅星状病毒变异毒SC‑3株。本发明所提供的二价灭活疫苗能够对当前我国流行的雏鹅痛风病起到很好的预防作用，从而减少养殖业的损失。

Description

一种预防雏鹅痛风的鹅星状病毒二价灭活疫苗

技术领域

本发明属于禽类疫苗制备技术领域，具体涉及一种预防雏鹅痛风的鹅星状病毒二价灭活疫苗。

背景技术

自2015年以来，我国广大养鹅地区出现了一种以痛风为主要特点的传染性疾病，该病主要发生于5-15日龄雏鹅，造成20％～30％的死亡率，饲养条件差的高达40％，发病日龄越小，死亡率越高，15日龄以后基本无死亡，死亡雏鹅主要表现为全身各脏器和关节的严重尿酸盐沉积，耐过鹅往往由于消化吸收障碍导致饲料转化率低下，机体发育不良，大群生长参差不齐，严重影响鹅群生产成绩，给我国的养鹅业造成了重大损失。

经病原分离与鉴定确诊了雏鹅痛风主要是由两种基因型的鹅星状病毒所引起。目前，我国没有针对鹅星状病毒的疫苗，因此，筛选鹅星状病毒并制备疫苗对于雏鹅痛风病的防控具有重大意义。

发明内容

本发明提供一种鹅星状病毒二价灭活疫苗，从而填补我国没有鹅星状病毒疫苗的空白。

本发明提供一种鹅星状病毒二价灭活疫苗，包含有灭活的两种病毒株抗原和疫苗佐剂，其中抗原为鹅星状病毒GD株(鹅星状病毒，购自中国兽医药品监察所)和保藏编号为CCTCC NO:V201976的鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株；

其中这两种病毒株的病毒含量不低于2×10^6.0TCID₅₀/0.1ml；

其中病毒株是使用甲醛溶液进行灭活。

所述的疫苗佐剂为油相佐剂，其一种组成是94份兽用白油，1份硬脂酸铝、5份司本-80。

本发明的二价灭活疫苗，其制备方法如下：

1)病毒增殖及收获：将GD株在LMH细胞上进行病毒增殖，将SC-3株在鹅胚绒毛***上进行病毒繁殖，获得病毒液；

2)病毒的浓缩：将收获的2种病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩2倍，浓缩的病毒液准备进行灭活；

3)病毒灭活：将浓缩的病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％；37℃摇床内，200rpm震荡灭活20小时后取出，放2～8℃保存；

4)油相制备：取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－80 5份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用；

5)水相制备将步骤3)灭活的鹅星状病毒GD株和SC-3株抗原液各96份分别与灭菌后的4份吐温-80混合，在水相制备罐中搅拌至吐温-80完全溶解；

6)乳化：取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min进行乳化制成疫苗。

本发明所提供的二价灭活疫苗能够对当前我国流行的雏鹅痛风病起到很好的预防作用，从而减少养殖业的损失。

附图说明

图1：不同方式攻毒后的解剖图；

图2：不同攻毒组鹅只的泄殖腔拭子病毒基因RT-PCR检测图，每组随机抽样检测了11只，M泳道：Marker，“N”代表阴性对照；

图3：不同免疫组攻毒后鹅泄殖腔拭子病毒基因RT-PCR检测图，其中1-20泳道分别代表鹅只编号，阳性目的条带切胶后测序鉴定均为鹅星状病毒序列；M泳道：Marker；攻毒后第2、4、6、8、10、12天的排毒情况与攻毒后第14天一致；

图4：免疫和非免疫种鹅所产种蛋孵化的雏鹅攻毒后解剖图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：

1、病毒株的分离及鉴定

本发明使用了2株鹅星状病毒，其中鹅星状病毒FLX变异病毒SC-3株，已于2019年10月29日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201976；

其中鹅星状病毒FLX变异病毒SC-3株是从2017年10月至2019年5月期间从广东、四川、河北、山东、安徽、辽宁等地送检的5-15日龄病、死雏鹅样品中分离的，该分离株对鹅胚是有较强致病力的，因此使得病鹅出现了不同于经典株引起的临床表现，主要表现为全身各脏器的严重尿酸盐沉积现象，这说明本发明分离到的鹅星状病毒的生物学特性较经典株发生了明显改变，尤其是对鹅胚的致病力以及对鹅引起的临床症状上，差异明显。

鹅星状病毒FLX变异病毒SC-3株的基因组全长7288bp，而经典鹅星状病毒基因组全长7299bp(序列号：KY271027)，两株病毒全基因组、ORF1a基因、ORF1b基因以及ORF2基因序列均出现了不同程度的碱基突变或缺失，其中ORF1a基因高度保守，ORF1b基因相对保守，但编码病毒保护性抗原的衣壳蛋白ORF2基因(4869-6992)变化较大，发生了较大的碱基突变或缺失，进而造成翻译的氨基酸改变。

中和实验表明，SC-3株阳性血清与YB-1株阳性血清对自身的中和能力较强，但对彼此的中和能力较差，两者的抗原相关性R值只有0.22(表4)，属于不同的血清型。

本发明另一株鹅星状病毒购自中国兽医药品监察所，为方便叙述，说明书中将购自中国兽医药品监察所的鹅星状病毒命名为鹅星状病毒GD株。

2、动物回归试验

将本发明所使用的鹅星状病毒(新型鹅星状病毒GD株、鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株)分别在LMH细胞和鹅胚上进行病毒繁殖(繁殖方法见疫苗制备1.1病毒增殖及收获)，获得的病毒液用于动物回归试验，将健康的120只1日龄扬州白鹅均分为4组，30只/组，饲养在动物隔离器中，每日添加饲料和饮水，分别用新型鹅星状病毒GD株、鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株和新型鹅星状病毒GD株+鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株攻毒，攻毒剂量GD为10^6.0TCID₅₀/0.1ml，SC-3为10^6.0ELD₅₀/0.1ml，同时设立不攻毒的空白对照组，每日观察鹅群精神状态、采食及发病情况，并在攻毒后第2、4、6、8、10、12、14天采集每只鹅泄殖腔拭子，用RT-PCR的方法检测排毒情况，并记录试验数据。

表1：雏鹅攻毒后的试验记录表

动物回归试验结果表明，用单一的鹅星状病毒GD株或SC-3株攻毒，仅仅造成动物腹泻，但均不能复制出与临床发病一致的雏鹅痛风病，而用鹅星状病毒GD株和SC-3株联合攻毒成功复制出与临床发病一致的典型鹅痛风病(图1)，攻毒鹅的临床表现和排毒情况见表1和图2，因此，根据柯赫氏法则的定义，确定了引起雏鹅痛风病的病原为鹅星状病毒GD株和鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株两株病毒。

实施例2：疫苗的制备及检测

1、疫苗的制备

1.1病毒增殖及收获

将鹅星状病毒GD株、鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株分别在LMH细胞和鹅胚上进行病毒繁殖，以获得足量滴度高且纯净的病毒液。

鹅星状病毒GD株：将LMH细胞在T25细胞瓶中传代培养，待细胞密度达到95％左右，倒掉瓶内细胞培养液，用无血清的DMEM培养基洗涤三次，按照1％剂量接种病毒，37℃吸附1h，期间每隔10min轻轻摇摆细胞瓶，以使病毒吸附完全，吸附完毕后倒掉接毒液，加入1％胎牛血清的DMEM培养基连续培养并观察，96h后细胞病变达到80％左右进行收毒，将细胞瓶放入-80℃超低温冰箱，反复冻融三次，使病毒完全从细胞内释放出来，4℃离心机内5000rpm离心30min，小心的将上清液转移至无菌瓶内。

鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株：将病毒原液进行100倍稀释，然后经绒毛***途径接种10日龄鹅胚，0.2ml/枚，37℃培养箱中培养，每天照胚2次，将48h内死亡的鹅胚弃去，并作好记录，5天后将鹅胚置于2～8℃冷却24小时。将冷却的鹅胚取出，收获鹅胚绒毛***和尿囊液，吸取胚液放于1L灭菌瓶内，用剪刀和镊子剥离鹅胚绒毛***于研钵内充分研磨(加石英砂)，而后将研磨液转移至盛放胚液的灭菌瓶内，于-80℃冰箱反复冻融三次，4℃离心机内5000rpm离心30min，小心的将上清液转移至无菌瓶内。将上述两种病毒液同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验。标记好编号GD株、SC-3株，4℃保存备用。

1.2病毒的浓缩：将收获的2种病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，浓缩2倍，留样，进行半成品检验，其余病毒液随即进行灭活。

1.3病毒灭活将鹅星状病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％。37℃摇床内，200rpm震荡灭活20小时后取出，放2～8℃保存。

1.4半成品检验

(1)无菌检验按现行的《中国兽药典》附录中的方法进行无菌检验，确定制备的病毒液无细菌感染。

(2)病毒含量测定将收获的病毒液(灭活前取样)用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7 4个稀释度，将稀释好的GD样品加到制备好的已长成LMH细胞单层(一般24h即可)的96孔细胞板上，每个稀释度6孔，100μl/孔。同时设立正常细胞对照6孔。加样顺序应按照先加正常细胞对照，再由高稀释度到低稀释度加入细胞板。细胞培养板置37℃、5％CO₂培养箱中吸附1h后，补加1％胎牛血清的DMEM细胞培养液100μl，置37℃、5％CO₂培养箱中培养，连续观察至第7日，判定结果。记录每块96孔细胞培养板中细胞的病变情况，并计算TCID₅₀，病毒含量不低于2×10^6.0TCID₅₀/0.1ml。将收获的病毒液(灭活前取样)SC-3株用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7 4个稀释度，分别经绒毛***途径接种10日龄鹅胚，每胚0.1ml，同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.1ml。置37℃继续孵育，每日照胚2次，观察144h。观察并记录每枚胚死亡情况，并计算ELD₅₀,确定病毒含量不低于2×10^6.0ELD₅₀/0.1ml。

(3)灭活检验准备好6瓶LMH细胞，每瓶接种0.2ml灭活的病毒液GD株，每日观察细胞2次，连续观察6日，同时收取细胞液按同样的方法再盲传2代，观察并记录细胞病变情况，结果灭活彻底，无细胞病变。；取10日龄鹅胚6个,每个绒毛***内接种灭活的病毒液0.2ml，每日照胚2次，观察7日，同时收取胚液和绒毛***再照上述方法盲传2代，观察并记录鹅胚死亡情况，结果灭活彻底，无死胚。

1.5灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计)。

(1)油相制备取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－80 5份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。

(2)水相制备将灭活的鹅星状病毒GD株、SC-3株抗原液各96份分别与灭菌后的吐温-80 4份混合，在水相制备罐中搅拌至吐温-80完全溶解。

(3)乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相不超过0.5ml。

(4)配苗将经过以上步骤制成鹅星状病毒GD株、SC-3株单品油苗按照1：1的比例进行再次乳化，乳化过程中要少量多次混合乳化，以使两种抗原乳滴分布均匀。

1.6疫苗成品检验

1.6.1性状

外观：制备的疫苗为乳白色乳剂，无杂质。

剂型：为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均不扩散。

稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相不超过0.5ml。

黏度：按现行《中国兽药典》附录进行检测，符合相应的规定。

1.6.2无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行，结果符合规定。

1.6.3安全检验：不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。分别用用7日龄SPF鸡10只和7日龄雏鹅10只，每只颈部皮下注射二联疫苗1.0ml，同时分别设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡和鹅采食、饮水及临床情况。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

结果表明，试验组和对照组鸡和鹅发育正常，精神状态良好，剖检试验组发现注射部位疫苗吸收良好，无红肿、组织坏死等炎症反应。说明试制疫苗安全无害，对动物生长无影响。

1.6.4效力检验

用21日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射鹅星状病毒疫苗，0.3ml/只，另取5只同日龄鸡不免疫作对照，免后21日，采血分离血清，分别测定抗体。

免疫组的抗体效价不低于6.0log₂VN抗体。对照组应均为阴性。

2、病毒中和试验

将鹅星状病毒GD株、SC-3株，经继代和纯化按上述方法制成灭活疫苗，分别免疫21日龄SPF鸡，免疫剂量0.5ml/只，每隔2周免疫一次，共免疫3次，三免后2周进行采血分离血清。采用固定病毒稀释血清法，将GD株、SC-3株的阳性血清进行交叉中和效价测定，具体为：将GD株、SC-3株病毒液分别稀释至200TCID₅₀/0.1ml、200ELD₅₀/0.1ml，逐一与GD株、SC-3株的各稀释度阳性血清等体积混合，37℃震荡中和1小时后，每个中和组接种LMH细胞5孔，0.2ml/孔或10日龄鹅胚5枚，0.2ml/枚，每隔24h观察一次，弃掉24h以内死亡的鹅胚，连续观察至7天。结果表明，鹅星状病毒GD株和SC-3株血清-病毒之间无中和作用，两者的抗原相关性R值为0(表2)。这表明新型鹅星状病毒GD株与鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株之间的无交叉中和能力，它们的抗体只能对本毒产生很好的中和能力，而对非本毒完全没有中和能力。从血清学结果来看，鹅星状病毒GD株和SC-3株是没有血清学关系的两个毒。

表2：鹅星状病毒GD株、SC-3株的血清交叉中和试验结果

注：*表示病毒；**表示血清

3攻毒保护试验

将鹅星状病毒GD株、SC-3株分别在LMH细胞、10日龄鹅胚上进行培养，并进行TCID₅₀、ELD₅₀的测定，各毒株抗原含量分别为10^-6.0TCID50/0.1ml、10^-6.0TCID50/0.1ml，收获抗原后用超滤浓缩机浓缩2倍，用终浓度1.0‰的甲醛37℃灭活20h，按照油相：水相＝2:1的比例制备成鹅星状病毒GD株、鹅星状病毒SC-3株和鹅星状病毒GD株+SC-3株二价灭活疫苗。将100只1日龄雏鹅分为5组(表3)，20只/组，免疫组雏鹅分别颈部皮下注射鹅星状病毒GD株、鹅星状病毒SC-3株、鹅星状病毒GD株+SC-3株二价灭活疫苗，0.5ml/只，攻毒对照组雏鹅分别颈部皮下注射生理盐水，0.5ml/只。

免疫后14天用鹅星状病毒GD株+SC-3株(1：1)联合攻毒，剂量为1ml/只(GD＝10^{- 7.0}TCID₅₀，SC-3＝10^-7.0ELD₅₀)，另设空白对照组鹅，不免疫，不攻毒。每日观察鹅群精神状态、采食及发病情况，并在攻毒后第2、4、6、8、10、12、14天采集每只鹅泄殖腔拭子，用RT-PCR的方法检测排毒情况，并记录试验数据。

表3：试验分组设计表

表4：不同免疫组用鹅星状病毒GD株+SC-3株攻毒后的排毒情况表

攻毒保护试验结果表明，雏鹅免疫鹅星状病毒GD株+SC-3株二价灭活疫苗能对鹅星状病毒GD株和SC-3株联合攻毒提供完全的保护，免疫组雏鹅不排毒，不表现任何临床症状，也无死亡现象，而免疫鹅星状病毒GD株疫苗组、鹅星状病毒SC-3株疫苗组和攻毒对照组雏鹅均出现排毒现象(图3，列举攻毒后第14天的排毒检测，目的条带切胶后送上海生工生物工程有限公司测序鉴定正确)，并且雏鹅精神萎靡、排灰白色稀粪、后期鹅极度消瘦，其中免疫鹅星状病毒GD株疫苗组有2只鹅在攻毒后12天(28日龄)出现死亡，剖检无典型的痛风症状，可能与攻毒鹅日龄(15日龄)偏大有关，随着日龄增加，鹅对该病毒的抵抗力增强有关，空白对照组雏鹅一切均正常。这说明鹅星状病毒GD株+SC-3株二价灭活疫苗能够阻止雏鹅排毒，并能很好的预防鹅星状病毒引起的疾病。

4、种鹅疫苗的免疫及雏鹅攻毒保护试验

雏鹅痛风病虽然是由鹅星状病毒所引起，但主要发生在5～15日龄，20日龄以后极少发病，即使发病，也无明显的死亡，临床症状表现轻微。因此，临床上对于雏鹅痛风病的防控主要是雏鹅阶段，但是在这个时候1日龄疫苗免疫，雏鹅体内的鹅星状病毒抗体至少要在14天以后才能起到保护作用，14日龄之前的免疫空白期是最容易发生雏鹅痛风病的。因此，鹅星状病毒GD株+SC-3株二价灭活疫苗主要应用在种鹅上，种鹅免疫该疫苗，所产的种蛋里只要有足够的母源抗体，孵化出壳后雏鹅就能在母源抗体的保护下安全度过5～15日龄的疾病高发期。所以，非常有必要将这个灭活疫苗在种鹅上免疫后，收集鹅种蛋，用孵化出壳的雏鹅做攻毒保护试验来验证该苗的有效_性。

将健康(实验室检测无鹅星状病毒感染)的扬州白鹅父母代种鹅随机分为两组，一组(A组)种鹅在150日龄和180日龄各免疫鹅星状病毒GD株+SC-3株二价灭活疫苗一针，1.0ml/次，另一组(B组)种鹅不做鹅星状病毒疫苗的免疫，收集两组种鹅210日龄后所产的种蛋各500枚，在孵化箱中孵化出雏后立即转到隔离器中饲养，用鹅星状病毒GD株+SC-3株1:1混合攻毒，攻毒剂量为1ml(GD＝10^-7.0TCID₅₀/0.1ml，SC-3＝10^-7.0ELD₅₀/0.1ml)，将B组种鹅所产种蛋100枚孵化出壳后设为空白对照(C组)，不攻毒。每日观察鹅群精神状态、采食及发病情况，并在攻毒后第2、4、6、8、10、12、14天采集每只鹅泄殖腔拭子，用RT-PCR的方法检测排毒情况，并记录试验数据。

攻毒后，A组商品代雏鹅生长发育正常，未见异常；而B组商品代雏鹅在攻毒后第3天开始出现精神萎靡不振、打蔫、厌食，蹲伏不愿走动，第4天开始出现死亡，一直持续到第10天，死亡雏鹅剖检出现严重的内脏痛风，有的病例还同时患有关节痛风，死亡率为138/500＝27.6％，耐过的雏鹅生长发育不良，消瘦，参差不齐；空白对照组雏鹅一切正常，无任何异常(如图4)。说明鹅星状病毒GD株+SC-3株二价灭活疫苗能够对商品代雏鹅提供完全的保护作用，在商品代雏鹅不免疫疫苗的情况下，通过种鹅母源抗体的作用完全可以使雏鹅安全度过1～14日龄免疫空白期。所以，鹅星状病毒GD株+SC-3株二价灭活疫苗在种鹅上推广免疫，能够对当前我国流行的雏鹅痛风起到很好的防控，该二价疫苗是国内首个针对鹅星状病毒引起的“痛风病”疫苗，对我国的养鹅业具有重大意义。

Claims (5)

1.一种鹅星状病毒二价灭活疫苗，其特征在于，所述的二价灭活疫苗包含有灭活的两种病毒株抗原和疫苗佐剂，其中抗原为鹅星状病毒GD株和保藏编号为CCTCC NO:V201976的鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株。

2.如权利要求1所述的二价灭活疫苗，其特征在于，所述的病毒株的病毒含量不低于2×10^6.0TCID₅₀/0.1ml。

3.如权利要求1或2所述的二价灭活疫苗，其特征在于，所述的病毒株使用甲醛溶液进行灭活。

4.如权利要求1所述的二价灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗佐剂为油相佐剂。

5.如权利要求4所述的二价灭活疫苗，其特征在于，所述的油相佐剂，其一种组成是94份兽用白油，1份硬脂酸铝、5份司本-80。

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