CN111620939B - 一种用于治疗或辅助治疗卵巢癌的多肽zyx36-58 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于治疗或辅助治疗卵巢癌的多肽ZYX36‑58。一种用于治疗或辅助治疗卵巢癌的多肽ZYX36‑58,氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。申请人利用串联质谱的方法筛选了在卵巢上皮癌患者血清及正常体检对照血清中差异表达的多肽,发现其中在正常体检对照血清中丰度较高,在卵巢上皮癌患者血清丰度显著降低的多肽ZYX36‑58可以显著抑制卵巢癌的侵袭和迁移,促进其凋亡,而不影响其增殖。由于ZYX36‑58本身具有分子量小,自身来源,毒性小等特点,可能成为卵巢癌治疗的一种重要的辅助药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及一种用于治疗或辅助治疗卵巢癌的多肽ZYX36-58。
背景技术
卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤,严重威胁女性生命。卵巢癌通常发病隐匿,转移较早,70%的患者发现时就已存在腹腔转移或/和***转移及远处转移,这也是卵巢癌死亡率居高不下的主要原因[1,2]。随着分子遗传学的发展,对卵巢癌的发病模式、分型、细胞来源各方面认识的加深,卵巢癌的靶向治疗也在不断发展中,但临床上卵巢癌的总生存率并没有明显改善[3]。因此,进一步剖析卵巢癌侵袭转移机制,寻找卵巢癌治疗新靶点,开发卵巢癌治疗新药物,已成为妇科肿瘤防治的当务之急。
近年来,多肽研究已成为医药研发的新热点。内源性多肽是一类从组织、细胞和体液中产生或获得的、大小在3-50个氨基酸的小肽[4]。研究发现多肽几乎参与了所有生命活动,与免疫调节、神经激素递质调节、肿瘤病变等密切相关[5-7]。多肽在肿瘤治疗的前景也充满了吸引力,既往研究已经发现多种可抑制肿瘤细胞黏着、侵袭和迁移的多肽,如抑制VEGF表达的肽 (peptide 1)[8],抑制ErbB2活性的肽(MTP-NeuNT)[9],抑制WASF3信号通路的肽(WAHM1和 WAHM2)[10]等。得益于质谱技术的进步,肿瘤多肽组学已初具雏形,已有研究鉴定了乳腺癌 [11]、卵巢癌[12]、胆管细胞癌[13]、肺癌[14]等肿瘤组织的内源性多肽组特征,并从中发现诸多有望成为肿瘤诊断标志物、肿瘤治疗靶标或药物的多肽,为肿瘤防治研究提供了新的思路。因此,我们认为从多肽的角度探讨卵巢癌的发生发展机制,寻找具有治疗前景的生物活性多肽已具备必要性。
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发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不组,提供一种用于治疗或辅助治疗卵巢癌的多肽 ZYX36-58。
本发明的另一目的是提供该该多肽的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现:
一种用于治疗或辅助治疗卵巢癌的多肽ZYX36-58,氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述的多肽ZYX36-58作为治疗靶点在制备治疗或辅助治疗卵巢癌的药物中的应用。
本发明所述的多肽ZYX36-58在制备治疗或辅助治疗卵巢癌的药物中的应用。
一种用于治疗或辅助治疗卵巢癌的药物组合物,其特征在于含有权利要求1所述的多肽 ZYX36-58。
本发明所述的多肽ZYX36-58作为检测靶点在制备诊断或辅助诊断卵巢癌的试剂中的应用。
检测本发明所述的多肽ZYX36-58的物质在制备诊断或辅助诊断卵巢癌的试剂中的应用。
一种诊断或辅助诊断卵巢癌的试剂,含有检测本发明所述的多肽ZYX36-58的物质。
有益效果:
本发明利用串联质谱的方法筛选了在卵巢上皮癌患者血清及正常体检对照血清中差异表达的多肽,发现其中在正常体检对照血清中丰度较高,在卵巢上皮癌患者血清丰度显著降低的多肽ZYX36-58可以显著抑制卵巢癌的侵袭和迁移,促进其凋亡。由于ZYX36-58本身具有分子量小,自身来源,毒性小等特点,可能成为卵巢癌治疗的一种重要的辅助药物。
附图说明
图1.多肽ZYX36-58在卵巢癌患者血清中丰度显著降低;
A、质谱结果显示,各个组织中多肽数量在1200-1400之间;B、93%的前体蛋白来源的多肽数量为1-4个,另外6%的前体蛋白来源的多肽数量大于8个;C、肽主要由5-26个氨基酸组成,分子大小主要集中在700-3199;D、相对于癌旁组织,在癌组织中差异性高表达的肽有12条、差异性低表达的肽有36条(fold change>2,p<0.05);
图2.多肽ZYX36-58对卵巢癌细胞的增殖和凋亡的影响结果;
A、CCK8实验发现多肽ZYX36-58处理并不影响SKOV3细胞的增殖;B、CCK8实验发现多肽ZYX36-58处理并不影响HO8910细胞的增殖;C、代表性的SKOV3细胞在对照及ZYX36-58多肽处理后的流式细胞分析实验结果;D、代表性的HO8910细胞在对照及ZYX36-58多肽处理后的流式细胞;E、定量分析发现ZYX36-58处理可以显著促进SKOV3细胞的凋亡;F、定量分析发现ZYX36-58可以显著促进HO8910细胞的凋亡。
图3:多肽ZYX36-58对卵巢癌的侵袭和迁移的影响;
A、代表性的对照及ZYX36-58处理SKOV3细胞的侵袭结果;B、代表性的对照及ZYX36-58处理HO8910 细胞的侵袭结果;C、定量分析发现多肽ZYX36-58处理可以显著抑制SKOV3细胞的侵袭;D、定量分析发现多肽ZYX36-58处理可以显著抑制HO8910细胞的侵袭;E、代表性的对照及ZYX36-58处理 SKOV3细胞的划痕结果;F、对照及ZYX36-58处理HO8910细胞的划痕结果;G、定量分析发现多肽 ZYX36-58处理可以显著抑制SKOV3细胞的迁移;H、定量分析发现多肽ZYX36-58处理可以显著抑制 HO8910细胞的迁移。
具体实施方式
实验材料:SKOV3细胞株购自中国科学院细胞库,HO8910细胞购自江苏凯基生物生物技术股份有限公司。多肽ZYX36-58:由上海科肽生物科技有限公司合成。
细胞培养:SKOV3细胞用含10%胎牛血清、2200mg/L碳酸氢钠、L-谷氨酰胺、不含青链霉素的 McCoy’s 5A不完全培养液(1×)培养;HO8910细胞用含10%胎牛血清、4.5g/L D-葡萄糖、 0.584g/L L-谷氨酰胺、3.7g/L碳酸氢钠、110g/L丙酮酸钠、不含青链霉素的DMEM不完全高糖培养液(1×)培养,两种细胞均培养于37℃,5%的CO2的常规条件培养箱。
实施例1
1.1样本收集
我们从南京医科大学附属妇产医院(南京市妇幼保健院)收集了3例卵巢癌患者的血液和三例年龄匹配的体检对照健康人的血液。血液标本在3000g,4℃条件下离心10分钟,取上清加入蛋白酶抑制剂,然后放入-80度备用。所有实验都经过南京医科大学附属妇产医院(南京市妇幼保健院)伦理委员会批准并签署了患者知情同意书。
1.2多肽抽提与质谱分析
样本在冰上融化后,12000g,4℃离心15分钟,然后搜集上清,按照试剂盒说明书BCA 法测蛋白浓度(BCA,pierce,Rockford,IL),然后加入20%的乙腈(v/v),轻轻混匀后,室温放置30分钟,然后将样本稀释后加入用0.5mL millQ预处理过得10KDa分子截留管(Millipore,USA),离心后将10kDa以下的滤液冻干(Scan Speed Maxi Vac,Labogene,Denmark),然后按照TMT-6标试剂盒(Thermo Fisher Scientific,CA,USA)的说明书将多肽加上TMT标签,最后标记后的多肽利用nanoflow LC联合LTQ-Qrbitrap Velos质谱仪进行质谱检测。
1.3液相色谱-质谱分析
岛津LC-20AD液相***对样品肽段分离,分离采用自装C18柱(75微米内径,3.6微米柱料粒径,15厘米柱长)串联,以300nl/分钟流速通过如下有效梯度进行分离:0-8分钟,5%流动相B(98%ACN,0.1%FA);8-43分钟,流动相B从8%线性升至35%;43-48分钟,流动相B从35%升至60%;48-50分钟,流动相B从60%升至80%;50-55分钟,80%流动相B;55-56分钟,5%流动相B。经过液相分离后的肽段通过nanoESI源离子化后进入到串联质谱仪LTQOrbitrap Velos(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)进行DDA(data-dependentacquisition)模式检测。主要参数设置为:nano离子源电压设置为1.8V,一级质谱扫描范围350~1500m/z,分辨率设置为30,000;二级质谱起始m/z固定为100,分辨率设置为7,500。进行二级碎裂的母离子筛选条件为:电荷2+,3+和4+以上,峰强度超过1000的前度排在前 12的母离子。HCD碰撞能量设置为35,碎片离子在Orbitrap中进行检测。动态排除时间为15s。AGC设置为:一级1E6,二级5E4。最后将质谱检测过的数据与数据库模拟得到的理论质谱数据进行匹配,从而得到蛋白质鉴定结果。见图1,质谱结果显示,各个组织中多肽数量在1200-1400之间;93%的前体蛋白来源的多肽数量为1-4个,另外6%的前体蛋白来源的多肽数量大于8个;肽主要由5-26个氨基酸组成,分子大小主要集中在700-3199;相对于癌旁组织,在癌组织中差异性高表达的肽有12条、差异性低表达的肽有36条(fold change>2,p<0.05);选择差异性低表达的其中一条ZYX36-58;VNPFRPGDSEPPPAPGAQRAQMG(SEQ ID NO.1)进行研究。 1.4多肽合成
实验所用多肽均由上海科肽生物技术有限公司合成,并以适当的浓度溶于水中:ZYX36-58, VNPFRPGDSEPPPAPGAQRAQMG(SEQ ID NO.1),对照乱序肽,PPNMAVADERPQQPRSFPGGAGP。
实施例2
2.1细胞增殖实验
计数细胞,用含10%FBS培养基稀释至所需浓度,在细胞悬液中分别加入多肽至100μM,将细胞悬液加入96孔板中,每孔100μl悬液中约含1000个细胞,共分为0h、24h、48h、72h 四组,每组5-6个副孔,置于37℃,5%CO2培养箱中3-4h等待细胞贴壁。细胞贴壁后按照分组时间测量细胞活性:将培养基更换为加入10%CCK-8试剂的混合溶液,37℃,5%CO2培养箱中反应1h后上酶标仪检测,检测波长:450nm。每24h更换加有多肽的完全培养基。CCK8实验结果发现多肽ZYX36-58处理并不影响SKOV3细胞和HO8910细胞的增殖(图1-2)。
2.2凋亡实验
搜集与肽共培养24小时后的对照细胞和ZYX36-58处理的细胞,使用PE-膜联蛋白V凋亡检测试剂盒(BD Biosciences,San Diego,USA),用PE和膜联蛋白V对细胞染色。用流式细胞仪(Beckman,CA,USA)分析细胞凋亡情况。
代表性的SKOV3细胞和HO8910细胞在对照及ZYX36-58多肽处理后的流式细胞分析实验结果分别见图2C和D,定量分析发现ZYX36-58处理可以显著促进SKOV3细胞和HO8910细胞的凋亡(图 2E-F)。
实施例3细胞迁移、侵袭实验
1.侵袭实验特有步骤:
(1)分装Matrigel基质胶:基质胶冰上融化后,冰上分装进1.5ml EP管中,每管60μl,避免反复冻融;
(2)铺胶:与无血清培养基按1:6(v/v)配制,铺于Transwell小室上表面,60μl/孔,37℃培养箱中烘干;迁移实验无A、B步骤;
2.在Transwell小室上表面中加入200ul细胞悬液,内含5×104个细胞和100μM多肽,向小室所在24孔板中加入600-800μl含20%FBS的完全培养基,置入37℃,5%CO2培养箱中。培养箱中放置24h后收取迁移实验小室,48h后收取侵袭实验小室。将Transwell小室置于4%多聚甲醛中固定细胞60min。将小室转移至0.1%结晶紫染液中染色30min。ddH2O中洗涤 Transwell小室2次,用棉拭子将Transwell小室上表面残余Matrigel基质胶及染料轻轻擦拭掉。在倒置显微镜下(100×)每孔随机挑选3个区域拍照,结果见图3A-B。加入200μl 细胞裂解液将Transwell小室下表面膜上细胞裂解,后在562nm波长处检测光吸收值。定量分析发现多肽ZYX36-58处理可以显著抑制SKOV3细胞和HO8910细胞的侵袭(图3C-D)。
实施例4划痕实验
将HO8910和SKOV3细胞在六孔板中用含有10%FBS的培养基培养,并在37℃,5%CO2条件下维持24-36h直至细胞融合度达90-100%。将细胞维持在无血清培养基中6-8h后使用1000μL 移液管尖端在细胞层上产生线性划痕,换加有多肽的无血清培养基维持24-48h。在光学显微镜下观察划痕愈合过程并使用Image J(Bethesda,USA)软件分析。结果见图3E-F,定量分析发现多肽ZYX36-58处理可以显著抑制SKOV3细胞和HO8910细胞的迁移(图3G-H)。
序列表
<110> 南京市妇幼保健院
<120> 一种用于治疗或辅助治疗卵巢癌的多肽ZYX36-58
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> 人类(homines)
<400> 1
Val Asn Pro Phe Arg Pro Gly Asp Ser Glu Pro Pro Pro Ala Pro Gly
1 5 10 15
Ala Gln Arg Ala Gln Met Gly
20
<210> 2
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Pro Pro Asn Met Ala Val Ala Asp Glu Arg Pro Gln Gln Pro Arg Ser
1 5 10 15
Phe Pro Gly Gly Ala Gly Pro
20
Claims (5)
1.一种用于治疗或辅助治疗卵巢癌的多肽ZYX36-58,其特征在于氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
2.权利要求1所述的多肽ZYX36-58在制备治疗或辅助治疗卵巢癌的药物中的应用。
3.一种用于治疗或辅助治疗卵巢癌的药物组合物,其特征在于含有权利要求1所述的多肽ZYX36-58。
4.检测权利要求1所述的多肽ZYX36-58的物质在制备诊断或辅助诊断卵巢癌的试剂中的应用。
5.一种诊断卵巢癌的血清诊断或辅助试剂,其特征在于含有检测权利要求1所述的多肽ZYX36-58的物质。
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