CN113087802B - 一种核酸检测联合抗体检测癌症的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种核酸检测联合抗体检测癌症的试剂盒。该试剂盒中包含抗非小细胞肺癌的单克隆抗体，具有较好的亲和特性以及特异性，同时鉴定出了该抗体的轻链可变区和重链可变区的具体氨基酸序列。通过于设计的PCR检测一起配合使用，能够有效的保证样本检测的精确度和准确性，可以用于非小细胞肺癌的诊断，具有较好的临床应用前景。

Description

一种核酸检测联合抗体检测癌症的试剂盒
技术领域
本申请涉及检测领域，更具体的，涉及一种核酸检测联合抗体检测癌症的试剂盒。
发明内容
肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的健康，其发病率和死亡率均排在第一位。肺癌患者中非小细胞肺癌(NSCLC)大约占80％左右，NSCLC的5年存活率不到20％，而及时发现并治疗的1A期NSCLC患者，其5年生存率可达80％左右。由其可见，及时发现和治疗早期肺癌能够大大提高NSCLC患者的生存率。
目前，肺癌最常用的诊断方法主要有痰脱落细胞检查、支气管镜以及胸部X线等影像学检查。但是，支气管镜的检查方式为侵入性，对患者有较大的创伤性，并且每次未必能够刷检到癌细胞。痰脱落细胞和胸部X线检查对于肺癌辅助诊断的敏感性较低，不是理想的诊断方法。尽管目前有学者建议肺癌的常规筛查可以用低剂量螺旋CT的方法，但是低剂量螺旋CT用于肺癌的筛查无标准化的方案，其临床应用价值仍处于探讨阶段。血液肿瘤标志物在肿瘤筛查中有着重要的临床价值，并且具有取材方便、创伤性小、价格相对低廉、容易复检等优点。但是，目前临床上常用肿瘤标志物(CEA、NSE、Cyfra21-1等)的敏感性较低，尤其是在检测早期肺癌(Ⅰ期+Ⅱ期)中的敏感性只有15％左右，这些肿瘤标志物在NSCLC的辅助诊断中有较大的局限性。因此，目前临床非常需要特异性和敏感性都比较理想的肺癌肿瘤标志物，尤其是检测早期肺癌的肿瘤标志物。
研究发现，NSCLC中PGP的表达与其神经内分泌分化关系密切。有研究表明，利用免疫组化法检测转录因子SOX2在肺鳞癌组织中的表达率可达到69％，在腺癌组织中的表达率为4.5％，在SCLC中的表达可达70％。GBU4-5作为肺癌早期筛查的标志物之一，和CAGE与其他不同的肺癌标准物联合可明显提高肺癌的诊断效率。肿瘤－睾丸抗原(NY-ESO-1)、肿瘤蛋白P53(P53)、细胞周期素依赖性蛋白激酶2(CDK2)、膜联蛋白A2(annexinA2)、***mRNA结合蛋白1(IMPl)、泛素l(ubiquilinl)以及磷酸甘油酸变位酶(PGAMl)共7种自身抗体在NSCLC中检测的敏感性为68.7％，特异性为91.1％。
RT-PCR技术是近几年来用于诊断NSCLC微转移的最常用的技术，检测微转移灵敏度比传统的免疫细胞化学方法高出10—100倍，可在106—107个正常细胞中检出1-10个肿瘤细胞。目前由于缺乏可供检测的特异性肿瘤标志物，而组织特异性标志物常有假阳性的发生，故研究的结果不尽一致。筛选较好的肿瘤组织特异性标志物是提高微转移检测特异性和可靠性的关键。
对肺癌具有特异性反应性的单克隆抗体不仅可用于肿瘤诊断和研究，也成为目前肿瘤生物治疗方面药学研究的焦点。虽然有许多研究对于抗肺癌的单克隆抗体，很少进行筛选抗人非小细胞肺癌的单克隆抗体的研究。。
此外，就病原学诊断而言，抗体检测和病毒核酸检测是最重要诊断依据。目前，针对肺癌的诊断，联合核酸和抗体一起检测的发明还不多，研究也不足。
发明内容
本发明克服现有技术的缺陷，提供一种有效检测肺癌的试剂盒。所述试剂盒含有核酸检测试剂以及抗体检测试剂。
本发明一方面，提供一种特异性检测引物对，所述引物对的序列为CYP2A6 F1tcatgaagatcagtgagcgc和CYP2A6 R1 ggtggcgatggagaagcgcc。
本发明还提供一种检测试剂盒，其中含有上述的引物对以及其他检测试剂。
本发明提供了一种针对非小细胞肺癌的单克隆抗体，其重链可变区序列和轻链可变区序列分别如SEQ ID NO：1或2所示。
在本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用培养杂交瘤细胞方法制备，也可以采用小鼠腹水的方法制备。杂交瘤的方法为，取杂交瘤细胞培养的上清液，经饱和硫酸铵沉淀法粗提出IgG,再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。
本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用Balb/C小鼠腹水生产单克隆抗体的方法制备。将约杂交瘤细胞接种到致敏的小鼠腹腔内，2-4周内可见腹部明显胀大。抽取腹水，经饱和硫酸铵沉淀法粗提后,再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。
在本发明的一个优选例中，所述单克隆抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体用荧光标记，得到荧光标记的单克隆抗体。
本发明的最后一个目的是提供一种检测或辅助待测样品中非小细胞肺癌细胞的酶联免疫试剂盒。
本发明提供的检测或辅助待测样品中非小细胞肺癌细胞的酶联免疫试剂盒包括独立包装的上述单克隆抗体和酶标记的二抗。
上述试剂盒中，所述酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶等任何适于标记酶联免疫吸附试验的酶；所述酶具体为辣根过氧化物酶。
上述试剂盒还包括底物，所述底物为邻苯二胺、联大茴香胺、5-氨基水杨酸、邻联甲苯胺或3,3’,5,5’-甲基联苯胺；所述底物具体为3,3’,5,5’-甲基联苯胺。
上述试剂盒在如下1)-5)中至少一种中的应用也属于本发明的保护范围：
1)检测或辅助检测待测样品中非小细胞肺癌；
2)筛查早期肺癌实体瘤和/或肺癌；
3)制备筛查早期肺癌实体瘤和/或肺癌的产品；
上述应用或上述试剂盒中，所述待测样品为尿液和/或血清和/或血浆和/或癌组织。
本发明的抗体可以单独使用，也可与PCR检测试剂一起联用。
所述抗体可以含有标记物。用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
有益效果
本发明所提供的抗非小细胞肺癌的单克隆抗体，具有较好的亲和特性以及特异性，同时鉴定出了该抗体的轻链可变区和重链可变区的具体氨基酸序列。通过于设计的PCR检测一起配合使用，能够有效的保证样本检测的精确度和准确性，可以用于非小细胞肺癌的诊断，具有较好的临床应用前景。
附图说明
图1单克隆抗体亚型测定结果图
图2抗体特异性识别蛋白结果图(A能够特异性结合，B不能特异性结合)
图3细胞分离率结果图
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1核酸检测试剂的制备
按照Trizol Reagent说明提取提取HOP-92人小细胞肺癌细胞的总RNA，-70℃保存，备用。
RNA-cDNA特异序列逆转录，实验条件：30℃10min，42℃35min，99℃5min，4℃5min；瞬间离心l0秒钟。将cDNA梯度稀释检验PCR检测精度；
特异性引物序列是申请人通过特异性的筛选及优化获得，具体序列如表1所示，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR条件为95℃1min；(95℃1min，56℃55s，72℃1min)进行40个循环；72℃10min，4℃降温保存。
表1引物列表
引物名称 引物序列
CYP2A6 F1 tcatgaagatcagtgagcgc
CYP2A6 R1 ggtggcgatggagaagcgcc
CYP2A6 F2对照 acaccaagtttcgggatttc
CYP2A6 R2对照 aacagtaccgctttccgatg
β-actin F ctcattgtcttctacgggctgttag
β-actin R ctttatgccgagagggatggt
2％琼脂糖凝胶电泳，在100V电压下电泳30min，用溴化乙锭染色30min，紫外分析仪下拍照记录。结果如表2所示。
表2 PCR检测精度结果(+表示PCR结果有条带，-表示无条带)
Figure BDA0003010183770000051
从表2的结果可以看出，重新设计的CYP2A6引物具有较好的检测精度，比现有技术的引物对提高了数量级水平上的检测优势，具有较好的效果。
将所述的CYP2A6 F1和CYP2A6 R1引物按照本领域常规的方法制备成为试剂盒后备用。
实施例2肺癌特异性单克隆抗体的筛选及制备
将肺癌细胞HOP-92作为免疫原与等体积的佐剂(弗氏完全/不完全)进行混匀后，放入三通阀玻璃乳化器中进行乳化，直至滴一滴于水中油滴成团不扩散，完成乳化。
将乳化好的免疫原对3只6周龄左右的BALB/c小鼠进行免疫。首次免疫抗原量为50ug，采用皮下注射进行免疫。14d后，进行二次免疫，抗原量同第一次，但是佐剂为弗氏不完全佐剂；第28d进行第三次免疫，免疫方法及抗原量同第二次。在三免后七天左右采集尾部血，利用间接ELISA法检测其血清抗体效价，并且选择效价高的BALB/c小鼠进行加强免疫。加强免疫抗原量为100ug，不加佐剂进行免疫。
取抗体效价较高的免疫的2号小鼠，进行眼球采血之后脱颈致死，放入75％酒精中浸泡10min进行消毒。将小鼠固定在解剖板上，用无菌剪剪开皮肤及腹膜，使脾脏暴露。剥离脾脏周围组织，将取出的脾脏用无血清的1640进行冲洗后，放入已置于平皿的200目灭菌铜网中，边碾碎脾脏边用无血清的1640将脾细胞冲洗至平皿中，将收集的脾细胞悬液加入到离心管中，1000rpm离心10min。用无血清的1640重悬沉淀并进行细胞计数。
按照脾细胞和SP2/0细胞10:1的比例，放入50mL离心管内，1000rpm离心10min。弃上清，将离心管底部细胞沉淀轻轻弹起，并将离心管放入37℃水浴中，对细胞融合剂进行预热，吸取1mL细胞融合剂以1mL/min的速度缓慢加入，边加边轻轻摇动离心管，使细胞与融合剂得到充分接触混匀，放在37℃水浴中静置90s。加入1mL无血清的1640，以1mL/min的速度边滴加边轻轻摇动离心管，此过程再重复一次。然后加入1mL无血清的1640，以1mL/30s的速度进行滴加，最后在2min内加完7mL无血清的1640，边滴加边轻轻摇动离心管。1000rpm离心10min，弃上清。加入预热的HAT培养基进行细胞重悬，以100μL/孔加入到铺有饲养层细胞的96孔细胞板中，于37℃5％CO2细胞培养箱中培养。融合后第7天，用预热的HT培养基进行半换液。每天观察细胞状态，待杂交瘤细胞长到96孔细胞板孔底的1/2时，利用间接-ELISA方法对细胞上清进行检测，并设阴、阳性对照孔，在亚克隆之前进行三次检测，并对三次检测均为阳性的杂交瘤细胞孔进行亚克隆。亚克隆四次，达到100％的阳性率。选择ELISA阳性反应最强的二株杂交瘤细胞株4F5和5D2进行腹水的的制备。
用灭菌的液体石蜡注射到8周龄的BALB/c小鼠腹腔，0.5mL/只。10d后，用无血清的1640重悬杂交瘤细胞，并进行计数，以1×106个杂交瘤细胞/mL，0.5mL/只的量注射到小鼠腹腔内。接种后，观察小鼠状态，约一周后小鼠腹部开始出现***，待小鼠腹围胀大、行动迟缓时，开始收集腹水。用注射器对小鼠腹腔内液体进行2-3次抽取。将腹水2000rpm离心10min，吸取上清，去掉油脂和细胞，采用纯化柱进行纯化，分别获得4F5和5D2单克隆抗体，调整浓度为1mg/mL备用。
实施例3 4F5单克隆抗体效价测定
取4F5腹水利用间接ELISA检测方法抗体效价，并设阴阳性对照，将腹水进行倍比稀释检测，经鉴定4F5株单抗的小鼠腹水效价是1:81920，具有较好的效价水平。
实施例4 4F5单克隆抗体亚型测定、解离常数鉴定及可变区序列鉴定
利用单克隆Ig类/亚类鉴定试剂盒进行鉴定，按说明书进行具体实验操作。结果如图1所示。本发明的抗体为IgG1亚型。
抗体的测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，其步骤为：杂交瘤细胞采用RPMI1640加20％血清培养24h，离心，弃去上清，采用TriZol重悬细胞，106个细胞/mL。提取DNA后，采用RT-PCR扩增重链和轻链基因，克隆至T载体后进行DNA测序。得到抗体的轻链和重链可变区如下所示。
SEQ ID NO：1：重链可变区序列
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLYCAASGFTFSGYSMSWVRQIPEKRLEWVAEISPFQSLYFSSRVTTRFTISRDNARNICYLQMNSLRSDATAMYYCARAVQVDSQYASRWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：2：轻链可变区序列
DIVLTQSPASLAVQLGQRATISCAAQQSVENDGTSLDRWYQQKPGQPPKLLIYARSNVCRGVPARFSGSGSGTDFSRNIHPVEEDDIAMYFCSKSRKGPKLFGAGTKLELK
表明等离子共振分析利用Biacore 8K进行，具体步骤如下：选用proteinA芯片，通过proteinA与抗体Fc的亲和力将前述的抗体固定在芯片上，用10mM HEPES，150mM NaClpH7.4溶液倍比稀释免疫原细胞，从低到高浓度逐一上样。利用相应的软件计算相应的结合利用常数，结果如表3所示。
表3抗体的动力学常数
抗体名称 KD(M)
4F5 4.52E-10
实施例5抗体检测与核酸检测在肝癌细胞中的实验
取1x106个HOP-92人小细胞肺癌细胞、正常人肺细胞分别加入0.5ml含有1％Triton X-100,1mM EDTA，50mM NaCl，0.1(m/v)SDS，1％Sodium deoxycholate，1mM PMSF，2μg/ml Aprotinin，1μg/ml Leupeptin和1μg/ml Pepstain的细胞裂解液，细胞置于冰上裂解30min后，10000rpm，4℃离心15min，收集上清，即为目的蛋白提取物。
在细胞裂解上清中分别加入2μg单克隆抗体4F5，4℃孵育两小时，再加入15μlprotein A/G beads 4℃孵育过夜。第二天，采用不含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液洗beads两遍后，加入1xSDS上样buffer，进行免疫印迹检测，采用NC膜，100V电压，转膜35min。5％脱脂奶粉封闭2h后，加入5％脱脂奶粉稀释的抗体，抗体使用浓度为2μg/ml，4℃孵育过夜，采用含0.1％Tween的TBS洗涤4次后，加入Anti-Mouse IgG(Fc specific)-peroxidaseantibody(1：1000)，室温孵育1h，DAB显色，结果如图2所示。
从图2可以看出，4F5抗体特异的识别肺癌细胞表面蛋白(A)，而不与肺细胞蛋白(B)进行结合。
实施例6荧光标记抗体在模拟血液环境中进行的肿瘤细胞检测试验
对照抗体为非小细胞肺癌单克隆抗体,克隆号TFS-4，MAB4337，艾美捷Abnova。
荧光抗体的标记：采用FITC抗体标记试剂盒进行标记，包括取20μl单克隆抗体(5μg/μl)加入反应柱中，14000rpm/min，4℃，离心3min，弃去离出液体；取90μl抗体与10μl的10×反应液混匀；将上述液体全部移至荧光染料管中混匀，室温避光反应30min；再将反应后的全部液体移至储存液管中混匀，分装，-20℃保存。
分别取HOP-92人小细胞肺癌细胞、胰腺癌细胞PANC-1、BEAS-2B人正常肺上皮细胞(1×104/ml)，分别与健康人外周血(WBC：6×109/mL)按1:10的比例混合后，在试管中加入1ml混合细胞，分别加入5μl单克隆荧光抗体，室温避光反应20min；加入2mlPBS，1500rpm/min，离心5min，重复2次；加入1mlPBS重悬的前述外周血混合细胞，经溶血洗涤后，用流式细胞仪进行分选检测，通过以混合液中细胞数被鉴定的比例作为结果见图3。
从图3可以看出，本发明的抗体能够以(98.45±1.1)％的分离效率来分离非小细胞肺癌细胞HOP-92，比对照抗体的(89.66±2.0)％分离效率要高。而且二个抗体均不能有效的用于分离PANC-1细胞和BEAS-2B细胞具有较好的特异性。
另外，采用实施例1的PCR方法，分别针对三种细胞进行PCR扩增，结果如表4所示。
表4非小细胞肺癌与其他细胞中CYP2A6mRNA的表达
组别 CYP2A6 mRNA(△△CT)
HOP-92人小细胞肺癌细胞 18.46±0.64
胰腺癌细胞PANC-1 16.16±0.47
BEAS-2B细胞 15.86±0.52
从表4的结果可以看出，针对非小细胞肺癌的表达量明显高于非小细胞肺癌细胞，具有极显著差异，可以用于有效的协同区分非小细胞肺癌，在检测中△△CT大于17即可有效的用于区分人小细胞肺癌与其他细胞。
虽然已描述并详细举例说明本发明至足以使本领域技术人员制备和使用它，但是在不背离本发明的精神和范围的情况应清楚各种替代方案、修改和改进。本文所提供的实施例代表优选的实施方案，为示例性的，并且不旨在为对本发明的范围的限制。其中的修改和其他用途将是本领域技术人员能够想到的。在本发明的精神内涵盖这些修改并且由权利要求书的范围限定这些修改。
序列表
<110> 北京欣颂生物科技有限公司
<120> 一种核酸检测联合抗体检测癌症的试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Tyr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ile Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Pro Phe Gln Ser Leu Tyr Phe Ser Ser Arg Val Thr
50 55 60
Thr Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Cys Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Asp Ala Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Val Gln Val Asp Ser Gln Tyr Ala Ser Arg Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Gln Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Ala Ala Gln Gln Ser Val Glu Asn Asp
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Asp Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Arg Ser Asn Val Cys Arg Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Arg Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Ser Lys Ser Arg
85 90 95
Lys Gly Pro Lys Leu Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcatgaagat cagtgagcgc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtggcgatg gagaagcgcc 20

Claims (8)

1.一种4F5单克隆抗体，其特征在于：其重链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。
2.权利要求1所述的抗体在制备检测非小细胞肺癌细胞的试剂盒中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述非小细胞肺癌细胞为HOP-92细胞。
4.权利要求1所述的抗体以及PCR检测试剂一起在制备检测非小细胞肺癌细胞的试剂盒中的用途，其中PCR检测试剂含有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物对。
5.如权利要求2或4所述的用途，其特征在于所述抗体含有可检测的标记。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于所述可检测标记为发光标记物、放射性标记物、MRI或CT造影剂。
7.如权利要求5所述的用途，其特征在于所述可检测标记为可检测产物的酶。
8.如权利要求4的用途，其特征在于含有用于PCR反应的相应PCR试剂。
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