CN111607572A - 一种猪流行性腹泻病毒重组疫苗株及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒重组疫苗株及其制备方法，该猪流行性腹泻病毒重组疫苗株是以PED经典毒株DR13为骨架，将抗原基因S基因替换成PED流行毒株S基因。其中PED流行毒株S基因来源于美国流行毒株KF650375。该重组疫苗株毒株生长特性良好，已传至60余代，遗传稳定性好，病毒滴度达107TCID50。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒重组疫苗株及其制备方法。
背景技术
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种接触性肠道传染病，其特征为呕吐、腹泻、脱水，死亡率很高，尤其是未断奶仔猪。2010年以来，因PED的大范围流行，我国养猪业遭受了重大经济损失，甚至威胁到了国家肉食品安全供应。2013年3月以后，PED首次在美国报道，并迅速蔓延至其他美洲、欧洲国家；亚洲其他国家也相继报道PED疫情的暴发。目前，PED已蔓延至全球，给全世界养猪业的疾病防控带来了严峻的挑战。该病近些年来呈现了新的流行特征，表现为死亡率极高(90-100％)、患病仔猪日龄更低、疫苗防控效果很差，这些现象与长期免疫压力下的PEDV基因变异导致免疫原性及毒力改变有关，因此急需研制针对新流行毒株的新一代PEDV疫苗。
近年来，国内外的研究者在PED疫苗方面已经做了大量的研究工作，但到目前为止，还没有研制出特别有效的PED疫苗用以控制PED的发生。韩国、日本等国家广泛使用的PED疫苗是传统的活苗和灭活苗，所有的灭活苗和传代致弱的减毒疫苗都能减少死亡率，但不能显著地减少发病率和病毒载量。2014年，美国批准两个疫苗上市，分别是RNA疫苗和灭活的全病毒疫苗，美国猪场使用这两种疫苗，均能减少猪的死亡率，然而缺乏临床使用的免疫相关性和免疫效率数据的相关报道。加拿大、欧洲商品化的PED疫苗主要是基于灭活的病毒与佐剂组成的灭活疫苗。国内市场已经商品化的PED疫苗都是联苗，主要是猪传染性胃肠炎(TGEV)与PEDV的二联灭活苗或者二联弱毒苗，目前已经有8个PED疫苗获得了新兽药证书，涉及的PED疫苗毒株有7个，分别为CV777株及其致弱毒株CV777，AJ1102株及其致弱毒株AJ1102-R，弱毒株ZJ08株，SCSZ株和LW/L株。近年来，随着PED疫情的流行，以CV777毒株为代表的经典毒株生产的疫苗起不到有效的保护，造成免疫失败的现象屡屡发生。流行毒株产生的疫苗针对性强，但免疫效果也良莠不齐。
发明内容
针对现有PEDV商品化疫苗保护效力在逐年降低问题，本发明提供了一种以PED经典毒株DR13为骨架的重组疫苗株，该重组疫苗株具有流行毒株的免疫原性，能有效地保护新生仔猪。
为了实现上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
一种猪流行性腹泻病毒重组疫苗株，是以PED经典毒株DR13为骨架，将抗原基因S基因替换成PED流行毒株S基因。
所述的PED流行毒株S基因来源于美国流行毒株KF650375。
根据NCBI中KF650375的S基因的序列，设计并合成引物SEQ ID NO.19～102，其中S-1(1-623bp)以pJET1.2/blunt.Q4(实验室保存质粒含KF294254 S基因1-1366bp)为模板，PED232 PED233为引物，扩增S-1片段，S-6(2654-3183bp)以pJET1.2/blunt.Q2(KF294254 S基因2845-3731bp)为模板，PED234 PED235为引物扩增S-6片段。其余片段通过引物长度59bp，相邻引物间重叠21bp，通过引物小片段PCR融合，从一级片段逐级放大至四级片段，合成出PED流行毒株S基因。
在本发明的另一方面，提供了上述重组疫苗株的制备方法，包括以下步骤：
1)以PED经典毒株DR13基因为模板，设计引物对B；
2)进行PCR扩增得到p-PEDV-ΔS DR13片段；
3)将PED流行毒株S基因用带有同源臂的引物对C扩增，在同源重组酶的作用下，PED流行毒株S基因就定向与p-PEDV-ΔS DR13片段连接，形成重组的转移载体。
进一步的，步骤(1)中引物对B为：
上游引物：ttttgaaaaggtccacgtgcagtga；
下游引物：tcatttgtttacgttgaccaaatga。
进一步的，步骤(3)中引物对C为：
上游引物：ctaatcatttggtcaacgtaaacaaatgaagtctttaacctactctggt；
下游引物：gtgtattgaaaaagtccaagaaacatcactgcacgtggaccttttcaaaa。
本发明的有益效果为：
本发明通过靶向RNA重组反向操作技术，以PED经典毒株DR13为骨架，将主要抗原基因S基因替换成PEDV流行毒株S基因，构建出一株重组疫苗毒株。PEDV流行毒株ISU13-22-38-IA属于G2型，目前国内新发pedv流行毒株大部分都属于G2型，而S蛋白是诱导机体产生中和抗体和提供粘膜免疫保护作用主要的结构蛋白，因此重组疫苗毒株具有流行毒株的免疫原性。目前该毒株生长特性良好，已传至60余代，遗传稳定性好，病毒滴度达107TCID50，并开展了仔猪攻毒保护试验，证明了该毒株具有良好的免疫原性，并能有效地保护新生仔猪。
附图说明
图1是本发明rPEDV D375F基因结构图；
图2是毒株rPEDV-D375F全基因组分段序列的PCR扩增；其中，M1.marker DL15000；1.4 000bp DNA序列；2.7 500bp DNA序列；3.7 500bp DNA序列；4.4 000bp DNA序列；5.3 700bp DNA序列；6.3 761bp DNA序列；
图3是本发明免疫组化检测结果；其中，A:感染rPEDV D375F的细胞；B:感染PEDVDR13的细胞；C:细胞对照；
图4是本发明骨架病毒PEDV DR13和重组病毒rPEDV-D375F的生长曲线；
图5是本发明实施例两组仔猪5天存活情况对比；
图6是本发明实施例母猪IgG抗体水平监测；
图7是本发明实施例仔猪IgG抗体水平监测。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1猪流行性腹泻病毒(PEDV)基因工程疫苗株rPEDV D375F的构建
通过靶向RNA重组反向操作技术(Li C,Li Z,Zou Y,et al.Manipulation of thePorcine Epidemic Diarrhea Virus Genome Using Targeted RNA Recombination[J].PLoS ONE,2013,8(8):e69997.)，以PED经典毒株DR13为骨架，将主要抗原基因S基因替换成PEDV流行毒株ISU13-22-38-IA的S基因,并在S基因内引入一个突变位点作为人工标记(S蛋白892引入突变V变成R)，构建出一株重组疫苗株(图1)。
1)将纯化后的病毒rPEDV D375F在细胞上连续传代，以P36代病毒为模板，用1-6号引物进行全基因组测序(表1)。如图2所示，PCR扩增出4条大小约为4000bp的DNA条带和2条大小约7500bp的DNA条带，分别与模板基因序列大小一致。测序结果显示，该毒株全基因组长为27960bp，如SEQ ID NO.1所示，共发生了15处碱基突变，主要分布在1a,1ab、S、M编码区，如表2所示。重组病毒rPEDV-D375F的S基因(4161bp)，源自美国流行毒株KF650375，测序结果中发生了4处氨基酸突变(第383氨基酸位点T突变为A，第469氨基酸位点S突变为G，第1049氨基酸位点L突变为S，第1050氨基酸位点T突变为I)，中和位点(499-638，748-755，764-711和1368-1374aa)处未发生突变。
表1引物序列名单
表2核苷酸的突变位点
实施例2重组病毒rPEDV D375F S基因的遗传稳定性
将纯化后的病毒在细胞上连续传代60代，使用指定的引物(引物7 S gene)通过RT-PCR评估S基因在重组病毒中的稳定性。引物组跨越全部s基因，RT-PCR方法检测了P1/p10/p25/p36/p40/p50/p60的重组病毒.测序结果显示，第一代重组病毒PEDV D375F的s基因与设计的PEDV D375F一致的。随着重组病毒PEDV D375F在Vero细胞上传代次数的增加，S基因也在发生突变，导致S蛋白的少数氨基酸发生改变。在60代时，氨基酸不同数目上升到8个，但在中和位点(499-638，748-755，764-711和1368-1374aa)处均未发生突变(如表3)。
表3 S蛋白中氨基酸的突变位点
实施例3重组病毒rPEDV D375F生长特性
2)免疫组化法检测重组病毒和骨架病毒
PEDV N蛋白是磷酸化的核衣壳蛋白，与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，是病毒颗粒必不可少的结构蛋白。以兔抗N蛋白单抗为一抗，HRP标记山羊抗兔IgG为二抗，采用免疫组化法分别检测重组病毒rPEDV D375F和经典疫苗株PEDV DR13的N蛋白抗原。结果如图3所示，在倒置显微镜下可观察到重组病毒rPEDV D375F和经典疫苗株PEDV DR13病毒液感染Vero细胞后，都出现深褐色阳性着色(N蛋白)，细胞对照中未见有阳性着色。说明两种病毒都在细胞中增殖。但两者深褐色(N蛋白)形成的位置有所不同，经典疫苗株PEDVDR13深褐色阳性着色(N蛋白)出现在单个的细胞，而重组病毒rPEDV D375F形成合胞体，深褐色阳性着色(N蛋白)出现在合胞体，这符合流行毒株的培养特性。
2)rPEDV D375F和PEDV DR13生长曲线测定
待检重组病毒rPEDV D375F以MOI＝0.1感染Vero细胞，分别于培养后8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h和26h观察CPE与测定重组病毒滴度。
待检骨架病毒PEDV DR13以MOI＝0.1感染Vero细胞，分别于培养后8h、16h、24h、32h、40h和48h观察CPE与测定重组病毒滴度。
结果如图4所示，重组病毒rPEDV D375F感染8h后，细胞开始出现病变合胞体，并且随着感染时间延长，合胞体逐渐扩大。感染后0-24h后病毒的滴度逐渐增加，24h达到峰值，随后滴度逐渐降低，24小时内细胞内合胞体达100％，细胞脱落，培养液浑浊。同样骨架病毒PEDV DR13以MOI 0.1感染Vero细胞，24小时后出现病变，零星的细胞开始裂解、破碎，随着感染时间延长，单个裂解的细胞逐渐增多，感染后0-32h病毒的滴度逐渐增加，32-40h达到峰值，随后滴度逐渐降低，40-48小时内细胞内全部裂解。综上，重组病毒相较于骨架毒株，病变时间快，且在相同的MOI感染情况下，病毒滴度更高。
实施例4猪流行性腹泻病毒(PEDV)基因工程疫苗毒株rPEDV D375F 15A佐剂灭活苗被动免疫效果
1实验材料与方法
1.1实验材料
实验动物：来自上海市庄行猪场。随机筛选8头母猪，免疫疫苗前利用间接ELISA方法检测血清PEDV、TGEV和PoRV等常见致腹泻病毒抗体为阴性，同时利用核酸技术检测PEDV为阴性。8头母猪分成未免疫组和免疫组，待生产后，随机从两组里各随机挑选一只母猪产的仔猪做攻毒实验。
母猪免疫用疫苗：rPEDV D375F作为疫苗用毒株，灭活前病毒含量为1*10^6.5TCID50/mL。与15A佐剂按照(8.5：1.5)的比例配制而成备用。
攻毒毒株：肠毒株PEDV-XS12，为2011年临床分离毒株，经实验室通过接种初生仔猪扩增，攻毒剂量为20倍的LD50(每毫升含有1000个病毒单位)(王剑等，用人工哺乳新生仔猪进行临床分离PEDV-XS12的LD50测定，待发表)。
试剂：DMEM培养基、RNA提取试剂和反转录试剂盒均购自Gibco。
1.2实验方法
1.2.1待产母猪的分组与免疫
将TGEV、PoRV抗体检测为阴性，PEDV抗原抗体双阴的8头母猪随机分成未免疫组和免疫组。免疫组在产前30d和产前15d经肌肉注射分别免疫15A灭活苗8ml，未免疫组注射DMEM8ml。
表4免疫与分组情况
1.2.2仔猪攻毒实验
妊娠母猪产仔后，分别从未免疫组和免疫组中随机挑选两只母猪所产仔猪作为攻毒实验猪，分为未免疫攻毒组，免疫攻毒组以及其他母猪产的仔猪留在圈内采食母乳作为抗体水平检测组。将自然哺乳4日龄的未免疫攻毒组和免疫攻毒组仔猪运送至动物房，于饲养笼内观察10h，晚上对4日龄仔猪进行攻毒，攻毒所用病毒为肠毒株PEDV-XS12，具体攻毒情况见表5。
表5仔猪分组与攻毒
整个实验过程中，免疫攻毒组和未免疫攻毒组均采用人工饲喂的方式，每隔3-4h喂奶一次，初始每次50ml，随着日龄增加逐渐加量至每次100ml。将抗体监测组仔猪放在猪场自由采食母乳，每隔一周采集一次血液，为期3周，监测其抗体水平的变化。
2.实验结果与分析
2.1攻毒后仔猪临床症状表现
攻毒前仔猪全部健康正常，按照表4对仔猪进行分组编号后，饲养于上海市农业科学院畜牧所动物房内。待仔猪适应环境后，对其称量体重，按照每公斤体重5ml的剂量口服病毒液。攻毒后每日观察实验猪精神状态，开始出现腹泻时间，对仔猪腹泻严重程度进行打分。在攻毒后的44h～72h里，两组仔猪均出现了发病情况，未免疫攻毒组仔猪发病后仔猪精神萎靡、体温迅速降低、站立不稳、食欲不振、呕吐、脱水、体重减轻、大多持续腹泻，所有实验猪在发病后(出现腹泻)20-60内全部死亡；免疫攻毒组发病后呕吐，脱水、体重减轻、体温略有降低、持续轻微腹泻，在攻毒后5d观察期内没有出现死亡。两组都出现腹泻发病情况，这说明该攻毒毒株具有极强致病性，但未免疫攻毒组发病后迅速全部死亡而免疫攻毒组仅发病不致死提示免疫母猪通过母乳为免疫攻毒组的仔猪提供了一定的保护力。
2.2攻毒后仔猪发病及死亡时间
两组实验猪在攻毒后都出现发病(腹泻)情况，免疫攻毒组比未免疫攻毒组平均发病时间还要提前1h左右见表6。
表6实验猪发病时间和发病至死亡所用时间
发病后未免疫攻毒组仔猪5d内全部死亡，而免疫攻毒组仔猪未出现死亡情况见图5。
2.4母猪IgG抗体检测结果
用15A灭活苗经肌肉注射两次免疫母猪。采集母猪免疫前、产仔当天、产后10d、产后20d四个时间点的血液样品并分离血清。利用商品化PEDV IgG抗体检测试剂盒对母猪血清进行检测，观察抗体水平变化(见图6)。从图中发现，在免前所有母猪抗体水平处于比较低的范围，在产仔当天未免疫组仍基本保持不变，免疫组中有3只母猪已经达到阳性，并在峰值持续了一段时间，说明免疫程序和前面疫苗佐剂和注射剂量的筛选是可靠的。
2.5仔猪IgG抗体水平监测结果
免疫攻毒组和未免疫攻毒采集攻毒前血液和攻毒5d后血液并分离血清(因为死亡过早，未免疫攻毒组缺失攻毒后5d血清样本)，利用商品化IgG抗体检测试剂盒对其进行检测，观察抗体水平变化(图7)。从结果来看，免疫攻毒组在攻毒前抗体水平较高，除8号外，全部是强阳性，5d后再次检测发现抗体水平均迅速下降；未免疫攻毒组则全部是阴性。该结果说明，母源抗体已通过哺乳被仔猪吸收，并在一定程度上发挥了中和病毒作用。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种猪流行性腹泻病毒重组疫苗株及其制备方法
<160> 102
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aaatcctcac ttagccacct tcgccatacc tttgggtgct acccaagtac cctattatt 59
<210> 29
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
acttacaact ccactgttta taaattcttg gctgttttac ctccaaccgt cagggaaat 59
<210> 30
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
acccattgac ataaacatca ccatacttgg tgatgacaat ttccctgacg gttggaggt 59
<210> 31
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gtgatgttta tgtcaatggg tttggatact tgcatctcgg tttgttggat gctgtcaca 59
<210> 32
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gaaacatcat cgtcagtgcc atgaccagtg aaattaattg tgacagcatc caacaaacc 59
<210> 33
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tggcactgac gatgatgttt ctggtttttg gaccatagca tcgactaatt ttgttgatg 59
<210> 34
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aatacgctga atggcggttc cttgaacttc gatgagtgca tcaacaaaat tagtcgatg 59
<210> 35
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ggaaccgcca ttcagcgtat tctttattgt gatgatcctg ttagccaact caagtgttc 59
<210> 36
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tagggtaaaa accatcgtca aggtcaaaag caacctgaga acacttgagt tggctaaca 59
<210> 37
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ttgacgatgg tttttaccct atttcttcta gaaaccttct gagtcatgaa cagccaatt 59
<210> 38
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
aaagaatgat cattaaatga tggcagagta acaaaagaaa ttggctgttc atgactcag 59
<210> 39
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
atcatttaat gatcattctt ttgttaacat tactgtatct gcttcctttg gtggtcata 59
<210> 40
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
attgatagta gtgtcagatg caataaggtt ggcaccacta tgaccaccaa aggaagcag 59
<210> 41
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gcatctgaca ctactatcaa tgggtttagt tctttctgtg ttgacactag acaatttac 59
<210> 42
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
aaccataact gtttgtaacg ttataaaaca gtgaaatggt aaattgtcta gtgtcaaca 59
<210> 43
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
acgttacaaa cagttatggt tatgtgtcta aatcacagga cagtaattgc cctttcacc 59
<210> 44
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
aatttgctaa aagacaggta atcattaaca gattgcaagg tgaaagggca attactgtc 59
<210> 45
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ttacctgtct tttagcaaat tttgtgtttc caccagcctt ttggctagtg cctgtacca 59
<210> 46
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
aacaccacta ccaaactcag ggtaaccaaa aagatctatg gtacaggcac tagccaaaa 59
<210> 47
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
cctgagtttg gtagtggtgt taagtttacg tccctttact ttcaattcac aaagggtga 59
<210> 48
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tgacaccttc aagtggttta ggcgtgccag taatcaactc accctttgtg aattgaaag 59
<210> 49
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
taaaggtgag ggtatcatta cccttacaaa ttctagcttt ttggcaggtg tttattaca 59
<210> 50
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gacattctta aaggctaaca actgtccaga atcagatgtg taataaacac ctgccaaaa 59
<210> 51
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ttgttagcct ttaagaatgt cactagtggt gctgtttatt ctgttacgcc atgttcttt 59
<210> 52
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ccactatatc atcatcaaca tatgcagcct gctctgaaaa agaacatggc gtaacagaa 59
<210> 53
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
atgttgatga tgatatagtg ggtgttattt ctagtttgtc tagctccact tttaacagt 59
<210> 54
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tcattagaat ggtagaagaa accaggcaac tccctagtac tgttaaaagt ggagctaga 59
<210> 55
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tttcttctac cattctaatg atggctctaa ttgtacagag cctgtgttgg tgtatagta 59
<210> 56
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
tcatactaaa gttggtggga atactaatat tcccagtaac cgtgggtgca atcttgact 59
<210> 57
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ttcccaccaa ctttagtatg agtattagga cagaatattt acagctttac aacacgcct 59
<210> 58
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ttaccattac aaacatatgt ggcacaatca acactaacag gcgtgttgta aagctgtaa 59
<210> 59
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
cacatatgtt tgtaatggta actctcgttg taaacaatta ctcacccagt acactgcag 59
<210> 60
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
agcgctgagt tgtaatgctg actctatggt cttacatgct gcagtgtact gggtgagta 59
<210> 61
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
tcagcattac aactcagcgc taggcttgag tctgttgaag ttaactctat gcttactat 59
<210> 62
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
acgaactaat ggtagctaac tgtagagcct cttcagaaat agtaagcata gagttaact 59
<210> 63
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
agttagctac cattagttcg tttaatggtg atggatataa ttttactaat gtgctgggt 59
<210> 64
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
tgtaccaccc tgccacttgc aggatcatac acagaaacac ccagcacatt agtaaaatt 59
<210> 65
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
acagctgcaa cacaacttcc aagccatttc tagttctatt gatgacattt actctcgac 59
<210> 66
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
gagacggtca acctgaacat cggctgaaag aatgtccagt cgagagtaaa tgtcatcaa 59
<210> 67
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gatgttcagg ttgaccgtct catcaccggc agattatcag cacttaatgc ttttgttgc 59
<210> 68
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
tgctagcctg aacctcagta tacttagtga gggtttgagc aacaaaagca ttaagtgct 59
<210> 69
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
atactgaggt tcaggctagc aggaagttag cacagcaaaa ggttaatgag tgcgttaaa 59
<210> 70
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
ccatcaccac cacaaaaacc ataacgctga gattgcgatt taacgcactc attaacctt 59
<210> 71
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
tggtttttgt ggtggtgatg gcgagcacat tttctctctg gtacaggcag cacctcagg 59
<210> 72
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
atcactcggt acaagtactg tatgtaaaaa cagcaggccc tgaggtgctg cctgtacca 59
<210> 73
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
cagtacttgt accgagtgat tttgtagatg ttattgccat cgctggctta tgcgttaa 58
<210> 74
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
ctaagccagg ctcacgtaga gtcaaggcaa tttcatcgtt aacgcataag ccagcgatg 59
<210> 75
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
ctctacgtga gcctggctta gtcttgttta cgcatgaact tcaaaatcat actgcgacg 59
<210> 76
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
ctaggttcaa acatacgtcg cgatgaaaca aaatattccg tcgcagtatg attttgaag 59
<210> 77
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
gcgacgtatg tttgaaccta gaaaacctac cgttagtgat tttgttcaaa ttgagagtt 59
<210> 78
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
tagttggtct ctagtcaaat tgacataggt gaccacacaa ctctcaattt gaacaaaat 59
<210> 79
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
aatttgacta gagaccaact accagatgta atcccagatt acatcgatgt taacaaaac 59
<210> 80
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
cagttctatt gggcagagaa gctaaaatct catcaagtgt tttgttaaca tcgatgtaa 59
<210> 81
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
cttctctgcc caatagaact ggtccaagtc ttcctttaga tgtttttaat gccacttat 59
<210> 82
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
cgctgctcta aatctgcaat ttcaccagtg agattaagat aagtggcatt aaaaacatc 59
<210> 83
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
aattgcagat ttagagcagc gttcagagtc tctccgtaat actacagagg agctccaaa 59
<210> 84
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
aaggtcaact agtgtgttgt tgatattata tataagactt tggagctcct ctgtagtat 59
<210> 85
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
aacaacacac tagttgacct tgagtggctc aaccgagttg agacatatat caagtggcc 59
<210> 86
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
agatgagaac aatgaaaata atcaaccaaa cccaccacgg ccacttgata tatgtctca 59
<210> 87
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
ttattttcat tgttctcatc tttgttgtgt cattactagt gttctgctgc atttccacg 59
<210> 88
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
aaacaagcac agcagcagcc gcagcatcca caacaacccg tggaaatgca gcagaacac 59
<210> 89
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
cggctgctgc tgtgcttgtt tctcaggttg ttgtaggggt cctagacttc aaccttacg 59
<210> 90
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
tcactgcacg tggacctttt caaaaacttc gtaaggttga agtctaggac 50
<210> 91
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
ttgtgctatg caatatgttt acgaacccat ctattacatg cttaatgtta ctagtgctg 59
<210> 92
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
tatcaaccct gtacagctaa ttgcattggt tatgctgcca atgcatttgc tactgagcc 59
<210> 93
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
aattattaaa actaaaacct tctggtatgt ggccattggg ctcagtagca aatgcattg 59
<210> 94
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
ataaacagtg gagttgtaag tatccacttt aagaaaacaa taatagggta cttgggtag 59
<210> 95
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
ctaaaccact tgaaggtgtc acggacgttt cttttatgac tctggatgtg tgtaccacg 59
<210> 96
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
gtaatgatac cctcaccttt aaagccatag atagtatacg tggtacacac atccagagt 59
<210> 97
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
gacgtagcca atgctgccag atttacaaac acctatgtta ctatacacca acacaggct 59
<210> 98
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
tctggcagca ttggctacgt cccatctcag tctggccaag tcaagattgc acccacggt 59
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
atgaagtctt taacctactt 20
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
taaacatatt gcatagcaca 20
<210> 101
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
ctgcaagtgg cagggtggta ca 22
<210> 102
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
tggaagttgt gttgcagctg ta 22
Claims (7)
1.一种猪流行性腹泻病毒重组疫苗株，其特征在于，是以PED经典毒株DR13为骨架，将抗原基因S基因替换成PED流行毒株S基因。
2.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒重组疫苗株，其特征在于，所述的PED流行毒株S基因来源于美国流行毒株KF650375。
3.权利要求2所述的PED流行毒株S基因的制备方法，其特征在于，根据NCBI中KF650375的S基因的序列，设计并合成引物，通过引物小片段PCR融合，从一级片段逐级放大至四级片段，合成出PED流行毒株S基因。
4.根据权利要求3所述的PED流行毒株S基因的制备方法，其特征在于，所述的引物具体如SEQ ID NO.19～102所示。
5.权利要求1所述的重组疫苗株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以PED经典毒株DR13基因为模板，设计引物对B；
2)进行PCR扩增得到p-PEDV-ΔSDR13片段；
3)将PED流行毒株S基因用带有同源臂的引物对C扩增，在同源重组酶的作用下，PED流行毒株S基因就定向与p-PEDV-ΔSDR13片段连接，形成重组的转移载体。
6.根据权利要求5所述的重组疫苗株的制备方法，其特征在于，进一步的，步骤(1)中引物对B为：
上游引物：ttttgaaaaggtccacgtgcagtga；
下游引物：tcatttgtttacgttgaccaaatga。
7.根据权利要求5所述的重组疫苗株的制备方法，其特征在于，进一步的，步骤(3)中引物对C为：
上游引物：ctaatcatttggtcaacgtaaacaaatgaagtctttaacctactctggt；
下游引物：gtgtattgaaaaagtccaagaaacatcactgcacgtggaccttttcaaaa。
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