CN113637648A - 同时表达pedv变异株s1基因cs区和猪il-18的重组猪伪狂犬病毒株及其应用 - Google Patents

同时表达pedv变异株s1基因cs区和猪il-18的重组猪伪狂犬病毒株及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113637648A
CN113637648A CN202110863467.9A CN202110863467A CN113637648A CN 113637648 A CN113637648 A CN 113637648A CN 202110863467 A CN202110863467 A CN 202110863467A CN 113637648 A CN113637648 A CN 113637648A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pedv
recombinant
strain
rprv
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110863467.9A
Other languages
English (en)
Inventor
郑兰兰
陈红英
崔建涛
韩昊莹
张远航
陈曦艋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan Agricultural University
Original Assignee
Henan Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan Agricultural University filed Critical Henan Agricultural University
Priority to CN202110863467.9A priority Critical patent/CN113637648A/zh
Publication of CN113637648A publication Critical patent/CN113637648A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2710/16052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于分子生物学领域，特别是指同时表达PEDV变异株S1基因CS区和猪IL‑18的重组猪伪狂犬病毒株及其应用。其分类名为rPRV‑PEDV S1‑IL18，保藏号为：CCTCC NO：V201740，保藏日期：2017年10月31日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学。本申请成功获得重组猪伪狂犬病毒株，其可诱导仔猪产生针对PEDV和PRV的特异性抗体，并且能够保护仔猪免于PEDV和PRV强毒致死性攻击。本申请的重组毒株组产生的PRV特异性抗体水平高于不含猪IL‑18的重组病毒rPRV‑PEDV S1组，有望成为一种新型猪流行性腹泻和猪伪狂犬病二联弱毒疫苗的候选毒株。

Description

同时表达PEDV变异株S1基因CS区和猪IL-18的重组猪伪狂犬 病毒株及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及重组猪伪狂犬病毒株，特别是指同时表达PEDV变异株S1基因CS区和猪IL-18的重组猪伪狂犬病毒株及其应用。
背景技术
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起猪的一种高度接触性肠道传染病，主要临床表现为呕吐、水样腹泻、脱水和哺乳仔猪死亡率高，多见于冬春寒冷季。该病在世界范围内均有发生，尤其以欧洲和亚洲最为严重。自我国猪场使用PEDV CV777疫苗以来，已很好地控制PED。然而，自2010年12月以来，包括中国在内的多个国家许多养猪场暴发流行新一轮PED疫情，各个年龄段的猪均发生腹泻，尤其2周龄内仔猪最为严重，其病死率高达90% -100%。2013年，美国首次暴发PED，并迅速蔓延到全美。新的疫情给全球养猪业造成了巨大的经济损失。基因序列分析结果显示，我国新发的PEDV流行毒株与2013年美国暴发的PEDV流行毒株基因序列高度相似，而与我国长期使用的PEDV CV777疫苗株在S基因存在较多变异，特别是S蛋白N段区域高度变异。本实验室从2016年采自河南省开封市某免疫过疫苗猪场病死猪肠道组织及内容物中分离到一株PEDV，命名为CH-HNKF-2016株（登录号KY649107），并对其进行全基因组测序和遗传进化分析。结果显示，该毒株与国内近年分离的PEDV变异株同源性最高，且在进化树中与国内近年来分离的PEDV变异毒株位于一个分支。
伪狂犬病（Pseudorabies, PR），即奥耶兹氏病（Aujeszky’s disease）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）引起牛、羊、猪等多种家畜及野生动物的一种急性高度接触性传染病。PR的主要症状为发热、奇痒、脑脊髓炎、神经及繁殖***障碍。目前尚无治疗PR的药物，只能采用接种如PRV Bartha K61等弱毒疫苗来防控PR，有效保护易感猪，PRV基因缺失疫苗和与其配套的鉴别诊断技术推动了PRV野毒株在猪场中的净化。然而，自2011年底以来，中国许多免疫Bartha K61的养猪场暴发新一轮PR。发病猪场中大约60% 的3-7日龄仔猪出现中枢神经***疾病，死亡率为100%，给养猪业造成巨大的经济损失。许多学者已从免疫过PR疫苗的死亡仔猪和流产胎儿中分离到PRV，并对其进行测序与遗传进化分析，以及仔猪的致病性试验。结果显示，PRV流行株处于一个相对独立分支，与以往国内外的PRV分离株及Bartha K61等常用疫苗株的遗传关系较远，且对仔猪的致病性更强。PRV流行株的抗原性已经发生了变异，Bartha K61等常用弱毒疫苗已不能完全保护PRV流行变异株的感染。
本实验室从2012年采自河南省南阳市某免疫过PRV Bartha K61疫苗猪场病死猪体内分离到一株PRV野毒株，命名为PRV/HN2012株(CCTCC NO.V201314)。基于gE、gB、gC基因的同源性和遗传进化分析结果显示，该分离株与国内近年分离的PRV流行变异株同源性最高，且在进化树中与国内近年来分离的PRV流行变异毒株处于同一个分支中，可作为疫苗开发的一个新方向。我们对PRV/HN2012株进行TK/gE/gI三基因缺失，获得PRV流行变异株三基因缺失突变株rPRV HN2012-TK-/gE-/gI-。试验证实，rPRV HN2012-TK-/gE-/gI-使小鼠机体产生了较高滴度的PRV特异性抗体，小鼠外周血T淋巴细胞亚群的测定也显示其成功激活了小鼠机体的细胞免疫，且对PRV/HN2012株的攻击具有100%的抵抗力，为我国根除PR创造条件。
猪白细胞介素18（Interleukin 18，IL-18）由单核巨噬细胞以及树突细胞产生的一种多效性细胞因子，Kayamuro等研究发现发现IL-1家族可同时促进Th1型和Th2型免疫应答，且巨噬细胞与DC一样是佐剂发挥作用的靶细胞，说明猪IL-18可以作为疫苗佐剂来发挥调节作用。因此，猪IL-18可以作为一种天然免疫调节剂和疫苗免疫增强剂。
PEDV和PRV是最重要的两种猪病毒，迄今尚无同时预防猪流行性腹泻和猪伪狂犬病的疫苗，因此研制这两种病毒的重组疫苗对生产实践具有重要意义，同时以猪IL-18作为分子佐剂，具有免疫增强作用。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出一种同时表达PEDV变异株S1基因CS区和猪IL-18的重组猪伪狂犬病毒株及其应用，以PEDV变异株CH-HNKF-2016株为研究对象，首先构建含有PEDV变异株CH-HNKF-2016的S1基因CS表位区和猪IL-18的重组转移质粒pG-CS-IL18（含有EGFP荧光标签），以表达绿色荧光蛋白的EGFP作为筛选标记，用当前流行的PRV变异株三基因缺失突变株rPRV HN2012-TK-/gE-/gI-感染ST细胞后，将重组转移质粒pG-CS-IL18转染ST细胞，发生同源重组，通过筛选带有绿色荧光蛋白的蚀斑，纯化获得表达绿色荧光的重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18-EGFP。再利用CRISPR/Cas9质粒敲除载体（PX459-gRNA1-EZ-gRNA3-EGFP）去除荧光标签EGFP基因，成功获得重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18。
本发明采用以下具体方案：
同时表达PEDV变异株S1基因CS区和猪IL-18的重组猪伪狂犬病毒株，其分类名为rPRV-PEDV S1-IL18，保藏号为：CCTCC NO：V201740，保藏日期：2017年10月31日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学。
所述猪伪狂犬病毒株包含有PEDV变异株CH-HNKF-2016的S1基因CS表位区和猪IL-18基因。
所述PEDV变异株CH-HNKF-2016的S1基因CS表位区序列如SEQ ID No.1所示。
所述重组猪伪狂犬病毒株选用变异株PRV/HN2012株，保藏号为：CCTCCNO.V201314，并将其gI、gE、TK基因缺失而获得的PRV流行变异株三基因缺失突变株rPRVHN2012-TK-/gE-/gI-，作为活病毒载体，保藏号为：CCTCC NO.V201748，保藏名称：重组猪伪狂犬病毒rPRV HN2012-TK-/gE-/gI-，保藏日期：2017年10月31日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学。
所述重组猪伪狂犬病毒株选用变异株PRV/HN2012株的gG糖蛋白作为***位点，通过先删除在gG基因上第23 bp-438bp的共计416 bp的片段，再利用gG启动子表达PEDV 的CS表位区。
所述gG基因序列如SEQ ID No.2所示。
所述的重组猪伪狂犬病毒株的构建方法，步骤如下：
（1）分别根据PEDV变异株S1基因CS区基因序列、猪IL-18基因序列、以及pBApo-EF1alpha_Pur_DNA质粒的序列设计引物对CS-F/CS-R，IL18-(BamH I)F/IL18-(Hind III)R，及pBApo(BstZ17I)-F/pBApo(BstZ17I)-R；
（2）以PEDV变异株的cDNA为模板，以步骤（1）的引物对CS-F/CS-R为引物，进行扩增、酶切并回收CS区目的片段；
（3）以pBApo-EF1alpha_Pur_DNA质粒为模板，以步骤（1）的引物对pBApo(BstZ17I)- F/pBApo(BstZ17I)-R为引物，进行扩增、酶切并回收pG载体；
（4）连接步骤（2）和步骤（3）回收的pG载体与CS区片段并转化，获得pBApo-EF1alpha_Pur_DNA真核表达质粒，并进行酶切回收载体片段即为pG-CS载体；
（5）从猪血中提取RNA，反转录成cDNA作为模板，以步骤（1）的引物对IL18-(BamHI)F/IL18-(Hind III)R为引物，进行扩增、转化、筛选阳性菌，再利用引物对pBApo(Bstz17I)-F/ pBApo(Bstz17I)-R扩增 IL-18基因的表达盒，并进行酶切回收；
（6）将步骤（4）回收的pG-CS载体与步骤（5）的IL-18基因的表达盒相连，并转化、鉴定，获得重组转移质粒pG-CS-IL18；
（7）将亲本株rPRV HN2012-TK-/gE-/gI-接种于ST细胞上，培养箱孵育2 h后吸弃培养基，经洗涤后将步骤（6）的重组转移质粒pG-CS-IL18转染ST细胞，待细胞全部病变脱落时，收集含病毒上清液；
（8）经步骤（7）转染、同源重组的重组转移质粒pG-CS-IL18，通过筛选带有绿色荧光蛋白的蚀斑，纯化获得表达绿色荧光的重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18-EGFP，再利用CRISPR/Cas9质粒敲除载体PX459-gRNA1-EZ-gRNA3-EGFP去除荧光标签EGFP基因，成功获得重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18，即为重组猪伪狂犬病毒株。
所述步骤（1）中引物CS-F序列为GA GGA TCC CTATGGTTACTTTG CATCA，引物CS-R序列为GC GGA TCC TCAAATACTCATACT；引物IL18- (BamH I)F序列为GA AGA TCT GCCACCATGGCTGCTGAACCGGAAG，引物IL18-(Hind III)R序列为GG GAA TTC GTTCTTGTTTTGAACAG；引物pBApo(BstZ17I)-F序列为 GTATAC TGA GGCTCCGGTGCCCGT，引物pBApo(BstZ17I)-R序列为 GTATAC TGA GGCTCCGGTGCCCGT。
上述的重组猪伪狂犬病毒株在制备同时抗新型猪流行性腹泻和猪伪狂犬病病毒的弱毒疫苗中的应用。
所述重组猪伪狂犬病毒株作为新型猪流行性腹泻和猪伪狂犬病二联弱毒疫苗的候选毒株。
本发明具有以下有益效果：
本申请对重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18的培养特性、生长特性、遗传稳定性、安全性以及在仔猪体内的免疫效力进行试验。结果显示，成功获得重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18，在ST细胞上测定的TCID50结果为107.875/mL，其生长特性与亲本株rPRV NY-gE-/gI-/TK-病毒滴度增长趋势相似，遗传稳定性较好，且对小鼠安全，可诱导仔猪产生针对PEDV和PRV的特异性抗体，并且能够保护仔猪免于PEDV和PRV强毒致死性攻击。此外，重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18组产生的PRV特异性抗体水平高于不含猪IL-18的重组病毒rPRV-PEDVS1组。重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18有望成为一种新型猪流行性腹泻和猪伪狂犬病二联弱毒疫苗的候选毒株。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为重组转移质粒pG-CS-IL18的构建。
图2为重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18构建。
图3为CS表位区片段检测结果，其中M. DNA Marker 2000+; 1. CS; 2. 阴性对照。
图4为猪IL-18基因和表达盒PCR扩增结果，其中M. DNA Marker 2000+; 1. 猪IL-18基因; 2. 猪IL-18表达盒; 3-4. 阴性对照。
图5为CS表位区片段和猪IL-18表达盒PCR扩增结果，其中M. DNA Marker 2000+;1. CS表位区; 2. 猪IL-18表达盒; 3-4. 阴性对照。
图6为重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18-EGFP纯化干净后的蚀斑（40×）。
图7为重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18病变后的蚀斑（20×）。
图8为10个重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18蚀斑的CS表位区片段的PCR检测结果，其中M. DNA Marker 2000+; 1-10. CS; 11. 阴性对照。
图9为10个重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18蚀斑的猪IL-18基因的PCR检测结果，其中M. DNA Marker 2000+; 1-10. 猪IL-18基因; 11. 阴性对照。
图10为重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18的CS表位区片段的转录检测结果，其中M.DNA Marker 2000+; 1. CS; 2. 阴性对照。
图11为重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18中猪IL-18的转录检测结果，M. DNA Marker2000+; 1. 猪IL-18基因; 2. 阴性对照。
图12为重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18中CS蛋白的Western blot鉴定，其中M.Protein marker; 1. CS蛋白; 2. 亲本株对照。
图13为重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18中猪IL-18的Western blot鉴定，M. Proteinmarker; 1. 猪IL-18; 2. 亲本株对照。
图14为rPRV-PEDV S1-IL18接种ST细胞不同时间形态变化（40×）。
图15为rPRV-PEDV S1-IL18接种PK-15细胞不同时间形态变化（40×）。
图16为rPRV-PEDV S1-IL18接种Vero细胞不同时间形态变化（40×）。
图17为rPRV-PEDV S1-IL18接种IPEC细胞不同时间形态变化（40×）。
图18为重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18和rPRV HN2012-TK-/gE-/gI-在ST细胞上的一步生长曲线。
图19为重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18的CS表位区同源性。
图20为重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18的猪IL-18基因同源性。
图21为免疫后血清中PEDV的ELISA抗体水平（OD值）。
图22为血清中PRV的中和抗体水平。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：PEDV变异株S1基因CS区和猪IL-18重组猪伪狂犬病毒株的拯救
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1质粒、细胞与病毒
PRV通用转移质粒pG、PRV流行变异株三基因缺失突变株rPRV HN2012-TK-/gE-/gI- (CCTCC NO.V201748)、PEDV变异株CH-HNKF-2016（登录号KY649107）cDNA、CRISPR/Cas9质粒敲除载体（PX459-gRNA1-EZ-gRNA3-EGFP）由郑州市猪重大疫病防控重点实验室构建并保存；猪睾丸细胞（ST细胞）、Vero细胞由郑州市猪重大疫病防控重点实验室传代并保存。
1.1.2主要试剂
cDNA Synthesis Kit（反转录试剂盒）购自南京诺唯赞公司；转染试剂ZLip2 000购自北京庄盟公司；BamH I、Hind III、BstZ17I限制性内切酶、碱性磷酸酶（CIAP）购自宝生物工程（大连）公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG、DAB试剂盒均购自武汉博士德生物公司；无内毒素质粒提取试剂盒（6948-01B）购自OMEGA公司。
1.1.3 主要仪器
Arktik型PCR仪、Alphalmager HP型紫外凝胶及CO2培养箱等购自美国Thermo公司；小型高速4 ℃离心机购自德国Sigma公司；尼康TS100荧光显微镜购自德国莱卡公司。
1.2 方法
1.2.1 重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18的构建技术路线图
技术路线1重组转移质粒pG-CS-IL18的构建，如图1所示；技术路线2重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18构建，如图2所示。
1.2.2引物设计与合成
根据PEDV CH-HNKF-2016株（登录号KY649107）S1基因中CS中和表位区序列，利用Primer 5.0引物软件，设计了1对特异性引物（CS-F/CS-R），在其上下游引物的5'端均加入BamH I限制性酶切位点(下划线部分)，扩增长度为895 bp（表1）。基于GenBank中猪IL-18基因序列（AF191088），设计了1对包含BamH I和Hind III酶切位点(下划线部分)的特异性引物，扩增长度为613 bp。另外，根据pBApo-EF1alpha_Pur_DNA质粒，设计1对包含BstZ17I酶切位点(下划线部分)的引物，扩增长度为1 980 bp，用于扩增包含EF1α启动子的表达盒。引物由武汉奥科有限公司进行合成。
表1 引物序列
Figure DEST_PATH_IMAGE002
1.2.3 CS表位区的扩增与纯化
利用引物CS-F/R，以PEDV变异株CH-HNKF-2016株（登录号KY649107）cDNA为模板扩增CS表位区。反应体系为：2×Ftaq Master Mix 25 μL，上、下游引物各为1 μL，模板量为1μL，补加ddH2O 至50 μL。回收CS区目的片段，于-20 ℃冰箱保存。
1.2.4 重组转移质粒pG-CS的构建
1.2.4.1 CS表位区的BamH I 酶切与纯化：用BamH I对上述回收的CS区目的片段进行酶切，酶切体系如下：10× QuickCut Buffer 5 μL，CS区目的片段小于5 µg，QuickCutBamH I 5 μL，补加ddH2O 至50 μL。置30 ℃恒温水浴锅30 min后，加上样loading buffer终止反应，回收酶切后的CS区目的片段，并于-20 ℃冰箱保存。
1.2.4.2 重组转移质粒pG的BamH I 酶切与纯化：和上述酶切方法一样，对pG转移质粒进行酶切，然后去磷酸化处理，反应体系如下：酶切后的pG反应产物30 μL，CIAP 1 μL，AP buffer 5 μL，补加ddH2O 至50 μL。37 ℃水浴30 min后4 ℃过夜，用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后的pG载体，于-20 ℃冰箱保存备用。
1.2.4.3连接与转化：将上述回收的pG载体与CS区片段进行连接，体系如下：pG载体20 ng/μL，CS区片段40 ng/μL，T4 DNA连接酶1.0 μL，ligase Buffer 1.0 μL，补加ddH2O至10 μL，于16 ℃连接槽过夜。将连接产物转化至DH5α感受态。
1.2.4.4重组转移质粒pG-CS的鉴定：挑斑进行菌液PCR鉴定，将阳性菌液送测序进一步鉴定。
以重组转移质粒pG-CS的菌液为模板进行PCR扩增CS目的基因、电泳鉴定，结果显示，在约895 bp处出现一条特异性条带（图3），与预期扩增片段大小相符。
将PCR鉴定为阳性的重组菌液进行重组质粒的提取，并进行测序。结果显示，CS表位区片段成功***到重组转移载体pG的BamH I位点处。
1.2.5 真核表达质粒pBApo-IL18的构建
1.2.5.1 猪IL-18基因的RT-PCR扩增：从河南一猪场采集健康猪的血液，提取总RNA，反转录成cDNA作为模板，利用引物IL18-(BamH I)F/IL18-(Hind III)R，进行猪IL-18基因扩增，回收猪IL-18基因，于-20 ℃保存备用。
1.2.5.2 猪IL-18基因的酶切与回收：用BamH I和Hind III对上述回收的猪IL-18目的基因进行酶切，回收酶切后的猪IL-18基因，于-20 ℃冰箱保存。
1.2.5.3 pBApo-EF1alpha_Pur_DNA表达质粒的酶切与纯化：用限制性核酸内切酶BamH I和Hind III对pBApo-EF1alpha_Pur_DNA真核表达质粒进行酶切，回收载体片段，于-20 ℃冰箱保存备用。
1.2.5.4真核表达质粒pBApo-IL18的连接与鉴定：将上述回收的表达载体与猪IL-18基因连接，转化至DH5α感受态，挑斑进行菌液PCR鉴定，将阳性菌液送测序进一步鉴定。
1.2.6 重组转移质粒pG-CS-IL18的构建
1.2.6.1 猪IL-18表达盒的扩增与Bstz17I酶切纯化：利用引物pBApo(Bstz17I)-F/ pBApo(Bstz17I)-R进行IL-18的表达盒扩增。回收完整表达盒，用Bstz17I对其进行单酶切。
1.2.6.2 重组转移质粒pG-CS的Bstz17I 酶切与纯化：对pG-CS转移质粒进行Bstz17I酶切，去磷酸化处理然后回收pG-CS载体于-20 ℃冰箱保存备用。
1.2.6.3重组转移质粒pG-CS-IL18的连接：将上述回收的pG-CS载体与猪IL-18表达盒进行连接，将连接产物转化至DH5α感受态，挑斑进行菌液PCR鉴定，并将阳性菌液送测序进一步鉴定。
以真核表达质粒pBApo-IL18的菌液为模板，进行PCR扩增猪IL-18目的基因和表达盒。结果显示，分别在约613 bp、1 980 bp处出现特异性条带（图4），与预期扩增片段大小相符。表明成功构建猪IL-18基因表达盒。
1.2.7重组转移质粒pG-CS-IL18的去内毒素质粒提取
按照OMIGA去内毒素质粒提取说明书对阳性菌液提取重组转移质粒pG-CS-IL18。
以重组转移质粒pG-CS-IL18的菌液为模板，PCR扩增CS表位区和猪IL-18表达盒。结果显示，分别在约895 bp、1 980 bp处出现特异性条带（图5），与预期扩增片段大小相符。将阳性的重组菌液进行重组质粒的提取，并进行测序。测序结果显示，成功构建重组转移质粒pG-CS-IL18。
1.2.8 重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18-EGFP的拯救
将rPRV HN2012-TK-/gE-/gI-亲本株（10-4）接种于长至80%的ST细胞上，37 ℃ 5 %CO2培养箱孵育2 h后吸弃培养基。每孔细胞用2 mL D-hanks液洗涤三次。然后，按照细胞转染试剂ZLip 2 000的说明书，将重组转移质粒pG-CS-IL18转染ST细胞。待细胞全部病变脱落时，收集含病毒上清液于-80 ℃冰箱保存备用。设立了一个正常细胞孔和一个只转染无接毒的转染孔作为阴性对照。
1.2.9 重组病毒的蚀斑筛选与纯化
将上述收集的病毒上清液用DMEM进行10倍系列稀释（10-1-10-5），分别接种到长至80 %的单层ST细胞的6孔板中，37 ℃ 5 % CO2培养箱病毒吸附2 h后弃去，并用D-Hanks清洗3-5遍，然后加入含1.3 %低溶点营养琼脂糖的DMEM（含2 %的胎牛血清）培养基 2 mL。待细胞发生病变，即可观察绿色荧光情况，可看到有发出绿色荧光的病变灶。每次选取最大稀释度细胞孔中的绿色荧光蚀斑，于-80 ℃冰箱反复冻融三次后，进行增殖扩大培养，直到所有蚀斑毒株均发荧光。
将rPRV HN2012-TK-/gE-/gI-亲本株感染ST细胞后，将带荧光标签的重组转移质粒pG-CS-IL18转染ST细胞，将收集的病毒上清液接种细胞进行蚀斑纯化。经7轮绿色荧光蚀斑的筛选与纯化，所有蚀斑毒株均发绿色荧光（图6）。表明含有目的基因的重组病毒纯化干净，命名为rPRV-PEDV S1-IL18-EGFP，于-80 ℃保存备用。
1.2.10重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18的拯救
将CRISPR/Cas9 EGFP敲除质粒（PX459-gRNA1-EZ-gRNA3-EGFP）转染ST细胞。转染4h后，吸弃转染液，D-Hanks洗涤3遍，将rPRV-PEDV S1-IL18-EGFP毒株（10-4）接种于6孔板单层ST细胞上，37 ℃ 5 % CO2培养箱孵育2 h后吸弃病毒吸附液，加入2 %血清的DMEM细胞维持液，待细胞全部病变脱落时，即可收集含病毒上清液于-80 ℃冰箱保存备用。设立了一个正常细胞孔和一个只转染无接毒的转染孔作为阴性对照。
1.2.11重组病毒的蚀斑筛选与纯化
将上述收集的病毒上清液进行10倍系列稀释，接种ST细胞，进行蚀斑试验，筛选无绿色荧光的病变灶。每次选取最大稀释度细胞孔中的不发绿色荧光的蚀斑，进行增殖扩大培养，进行5-8轮的纯化筛选，直到所有蚀斑毒株均不发荧光。随机挑取无荧光蚀斑，提取其病毒DNA，PCR扩增其CS表位区和猪IL-18基因。
将CRISPR/Cas9 EGFP敲除质粒先转染ST细胞，然后将rPRV-PEDV S1-IL18-EGFP株感染，将收集的病毒上清液接种细胞进行蚀斑纯化。反向筛选成功敲除EGFP绿色荧光标签的目的毒株，经5轮无绿色荧光蚀斑的筛选与纯化，所有蚀斑毒株均不发荧光（图7，A、B分别为在白光和激发光下观察的图片）。然后随机挑取10个荧光蚀斑，提取其病毒DNA，PCR扩增其CS表位区和猪IL-18基因，结果显示分别在约895 bp和613 bp处出现特异性条带（图8和图9），与预期扩增片段大小相符，表明重组病毒纯化干净并命名为rPRV-PEDV S1-IL18，于-80 ℃保存备用。
1.2.12重组病毒的CS表位区和猪IL-18的转录及表达鉴定
将重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18接种长满单层的Vero细胞，待80%的细胞发生病变，将细胞刮下，并用TRlzon法提取其总RNA（并去除DNA基因组），按照反转录试剂盒（HiScript®Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit）的说明进行反转录成cDNA，PCR扩增CS目的基因和猪IL-18基因检测。另外，将重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18接种长满单层的ST细胞，待80 %的细胞发生病变，反复冻融，8 000 rpm离心5 min，取上清液，将上清蛋白进行浓缩，然后加入蛋白上样缓冲液，煮沸10 min，进行Western blot鉴定。分别用兔源抗PEDV的S蛋白和兔源抗猪IL-18血清作为一抗（1:200稀释），辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG作为二抗（1:5000稀释），用DAB试剂盒显色。
提取重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18接种Vero细胞后的总RNA，去除病毒DNA基因组后反转录成cDNA，PCR扩增CS表位区，结果显示在约895 bp处出现特异性条带（图10），表明CS区片段成功转录。另外PCR扩增猪IL-18基因，结果显示在约613 bp处出现特异性条带（图11），表明猪IL-18成功转录。
重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18接种ST细胞发生病变后，反复冻融，将上清蛋白进行浓缩，兔源抗PEDV的S蛋白作为一抗进行Western blot鉴定，结果显示在32.2 kDa处有特异性带（图12），预期大小相符，表明重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18的CS蛋白能成功表达。
重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18接种Vero细胞发生病变后，反复冻融，将上清蛋白进行浓缩，兔源抗猪IL-18血清作为一抗进行Western blot鉴定，结果显示约在23 kDa处有特异性带（图13），与预期大小相符，表明重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18的猪IL-18蛋白在Vero细胞能成功表达。
本试验采用的亲本株是从2012年暴发PRV的猪场中分离到的一株变异株PRV/HN2012株(CCTCC NO.V201314)，并将其gI、gE、TK基因缺失而获得的伪狂犬病毒弱毒株作为活病毒载体，对当前流行的PRV防控具有重要意义。
PEDV的S蛋白是一种I型膜糖蛋白，它是病毒进入宿主细胞所必需的。研究表明，中和性表位主要位于S1，已经证实在PEDV S蛋白表面存在4个主要的中和表位(aa 499-638、748-755、764-771和1 368-1 374)。通过病毒作为载体表达的PEDV S蛋白或截断S基因，结果显示其在开发针对PEDV的亚单位疫苗方面具有潜力。本试验选用PEDV的CS表位区包含S基因前三个主要中和表位，用于重组活载体疫苗的构建。
在本试验中，我们首先从猪血液中提取总RNA，扩增猪IL-18基因，然后引物两端加BamH I和Hind III酶切位点，将其***到哺乳动物真核表达质粒pBApo-EF1alpha_Pur_DNA中，同时在猪IL-18序列前引入KozaK序列（GCCACC），增强猪IL-18蛋白的表达。再从该载体上扩增猪IL-18表达盒，该表达盒使用的是EF1alpha启动子，该启动子不易失活，稳定性好，不受细胞周期限制，有利于外源基因的稳定转录。
本试验选取PRV的gG糖蛋白作为***位点。gG基因编码病毒的非必需糖蛋白，该基因的缺失对病毒增殖没有影响。gG糖蛋白是一种早期病毒蛋白，表达自最强的PRV启动子之一。gG启动子常用来驱动外源蛋白的表达。因此，本研究通过在gG基因上删除416 bp，利用gG启动子表达PEDV 的CS表位区。本试验中所用的pG转移载体为本实验室构建的含有左同源臂gD基因和右同源臂PK基因，利用同源重组的方法将目的基因***到PRV的基因组中，同源重组发生原理与付朋飞的研究一致。经过多次试验优化，结果发现先将104/100 μL的PRV病毒接种ST细胞2 h，然后将构建的重组转移质粒pG-CS转染细胞4 h，待细胞病变完全后收获病毒液，同源重组达到最高效率，有利于病毒的筛选与纯化。在反挑过程中，即敲除EGFP荧光标签时，首先将CRISPR/Cas9 EGFP敲除质粒（PX459-gRNA1-EZ-gRNA3-EGFP）转染ST细胞，先表达Cas9蛋白，再将带绿色荧光标签的重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18-EGFP接种ST细胞，此时已表达Cas9蛋白即可对增殖的重组病毒的绿色荧光标签进行同步敲除，达到最大敲除效率。EGFP绿色荧光标签只是用作筛选标记，将目的基因重组到PRV基因组上之后，敲除该标签，避免该重组病毒免疫动物后引起食品安全等问题，提高该重组病毒的生物安全性。
PRV基因组容量大，可供外源基因***，因此，PRV 载体在基因表达、活载体疫苗研制、药物筛选等方面都显示了很好的优越性。本试验成功构建了表达PEDV中和表位区CS蛋白和猪IL-18的重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18。由于PRV 重组病毒免疫动物后，在动物体内会发生和自然感染方式很接近的免疫***递呈反应，免疫动物后不但可刺激机体产生体液免疫、细胞免疫，而且还能在一定程度上刺激机体的粘膜免疫，因此研究多种基因的重组PRV 疫苗可以更好的为养猪业服务，带来更好的经济效益。同时利用其对免疫***刺激接近自然感染的特点，结合现代免疫标记技术，重组PRV 未来将有可能在免疫机制等领域发挥越来越重要的作用。
实施例2：重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18的生物学特性
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞、毒株和质粒
ST传代细胞、PK-15传代细胞、IPEC传代细胞、Vero传代细胞、亲本株rPRV HN2012-TK-/gE-/gI-、PEDV变异株CH-HNKF-2016、PRV流行变异株PRV/HN2012均由郑州市猪重大疫病防控重点实验室保存；重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18由试验一构建纯化并保存。
1.1.2 主要试剂和仪器
试剂和仪器与试验一相同。
1.2 方法
1.2.1重组病毒在不同细胞上的培养特性
将重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18分别接种ST、PK-15、Vero、IPEC细胞，并在接毒后的6 h，12 h，24 h，36 h观察细胞病变。
重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18接种ST细胞后观察细胞病变情况。0 h至6 h时均未观察到明显的细胞病变。12 h时大量细胞已经变圆，细胞间隙不明显，细胞轮廓消失。24 h后细胞变圆皱缩。36 h后细胞病变明显，细胞变大变圆脱落至碎裂（图14）。
1.2.2重组病毒在不同细胞上的TCID50测定
将重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18分别接种至ST、PK-15、Vero、IPEC细胞，并连续传3代。待病毒稳定增殖后，在不同细胞上培养36 h，分别测定重组病毒的TCID50，使用Karber法计算病毒TCID50滴度。
重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18接种PK-15细胞后观察细胞病变情况。0 h至6 h时均未观察到细胞病变。12 h时所有细胞间隙不明显，细胞轮廓消失。24 h后细胞变圆皱缩。36h后细胞病变明显，细胞变大变圆脱落（图15）。
重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18接种Vero细胞后观察细胞病变情况。0 h至6 h时均未观察到细胞病变。12 h时细胞内部空泡状。24 h后细胞变圆皱缩，均有合胞体出现。36 h后细胞病变明显，细胞变大变圆脱落至破裂（图16）。
重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18接种IPEC细胞后观察细胞病变情况。0 h至6 h时均开始出现轻微细胞病变。12 h时细胞内部空泡状，变圆皱缩。24 h后细胞病变明显，细胞变大变圆脱落（图17）。
如表2，TCID50测定结果显示，重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18的最适增殖细胞为ST细胞，其次是PK-15细胞和Vero细胞，而在IPEC细胞上的敏感性最差。结果表明ST细胞更适合重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18的增殖培养。
表2重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18在不同细胞上的TCID50测定结果
Figure DEST_PATH_IMAGE003
1.2.3重组病毒的一步生长曲线
按照文献（Trapp, S. Mutagenesis of a bovine herpesvirus type 1 genomecloned as an infectious bacterial artificial chromosome: analysis ofglycoprotein E and G double deletion mutants [J]. Journal of GeneralVirology, 2003, 84(2): 301-306.）测定重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18的一步生长曲线。将rPRV-PEDV S1-IL18和rPRV HN2012-TK-/gE-/gI-分别以10 μL（106.0TCID50/100μL）接种12孔板，于接种后0 h、2 h、4h、6 h、8 h、12 h、18 h、24 h、30 h和36 h分别收集病毒液，分别测定重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18和亲本株rPRV HN2012-TK-/gE-/gI-的TCID50，绘制一步生长曲线图。
将rPRV-PEDV S1-IL18和rPRV HN2012-TK-/gE-/gI-接种ST细胞，于接种后0 h、2h、4h、6 h、8 h、12 h、18 h、24 h、30 h和36 h分别收集病毒液，分别测定TCID50，绘制一步生长曲线图（图18）。结果显示，4-8 h期间，重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18与rPRV HN2012-TK-/gE-/gI-均呈指数增长，8-24 h期间缓慢增长，24 h病毒滴度达到最高。重组病毒rPRV-PEDVS1-IL18与rPRV HN2012-TK-/gE-/gI-病毒滴度增长趋势相似，表明外源基因的***，不影响病毒载体的增殖。
1.2.4重组病毒的理化特性检测
检测重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18的紫外敏感性，甲醛敏感性，高温敏感性，酸敏感性，碱敏感性，***敏感性以及氯仿敏感性。取100 μL的重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18病毒液8管，分别进行如下操作：紫外线照射30 min；加入甲醛终浓度为0.15 %，37 ℃放置24h；60 ℃水浴锅水浴1 h；pH调为3.0 37 ℃放置1 h后调为7.0；pH调为11.0 37 ℃放置1 h后调为7.0；加入终浓度为20 %的***，4 ℃放置24 h ；加入终浓度为4.8 %的氯仿放置30min。然后测定上述处理的重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18的TCID50。
重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18经过以下处理后失活失去感染力（表3）：加入甲醛终浓度为0.15 %，37 ℃放置24 h；60 ℃水浴锅水浴1 h；pH调为3.0 37 ℃放置1 h后调为7.0；pH调为11.0 37 ℃放置1 h后调为7.0；加入终浓度为20 %的***，4 ℃放置24 h。重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18经过紫外照射30 min处理后病毒部分失活，经过氯仿（4.8 %）处理30 min后，病毒大部分失活。
表3重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18的理化特性
Figure DEST_PATH_IMAGE004
1.2.5重组病毒的遗传稳定性
将重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18连续传代20代，并提取第5代、第10代、第15代、第20代的病毒DNA，对CS表位区和猪IL-18基因进行PCR扩增并送测序，从分子水平上检测重组病毒上的目的基因是否发生突变。
提取重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18的第5代、第10代、第15代、第20代的病毒DNA，对CS表位区和猪IL-18基因进行PCR扩增并测序，结果显示没有发生碱基突变、缺失和***（图19和图20）。
1.2.6重组病毒的安全性试验
将重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18接种5只6周龄雌性昆明小鼠，评价重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18对小鼠的安全性。
接种重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18后两周内的小鼠均未出现任何瘙痒症状，采食正常，无应激反应，表明重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18对小鼠是安全的。
在ST细胞、PK-15细胞、IPEC细胞、Vero细胞上对重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18的生长特性测定，在0 h至6 h时，病毒处于吸附、穿入、脱壳和复制初始阶段，未观察到明显的细胞病变。6-12 h时，病毒开始呈指数复制，大量细胞已经变圆，细胞间隙不明显，细胞轮廓消失，变圆皱缩。36 h后，病毒释放，细胞病变明显，细胞脱落至碎裂，符合伪狂犬病毒通性。一步生长曲线结果表明，重组病毒接种24 h后，病毒滴度即可达到最高，重组病毒rPRV-PEDVS1-IL18与亲本株rPRV HN2012-TK-/gE-/gI-病毒滴度增长趋势相似，表明外源基因的***，不影响病毒载体的增殖。
重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18在ST细胞上测定的TCID50结果为107.875/mL。亲本株rPRV HN2012-TK-/gE-/gI-的TCID50结果为107.375/mL，本试验的重组病毒TCID50结果比亲本株高的原因，可能是连续传代使病毒适应了细胞增殖，重组病毒的遗传性状稳定。重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18在ST细胞，Vero细胞，PK-15细胞，IPEC细胞上的增殖滴度逐渐降低，表明ST细胞更适合重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18的增殖培养，用于候选疫苗毒株的制备。
重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18的理化特性结果显示，对终浓度为0.15 %的甲醛，60℃高温，pH调为3.0 或7.0，终浓度为20 %的***，终浓度为4.8 %的氯仿均比较敏感，经过处理后，大部分病毒粒子失去感染力。重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18经过紫外照射30 min处理后病毒部分失活仍然存在感染性。这与文献提到的伪狂犬病毒的理化特性一致，表明重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18符合伪狂犬病毒的一般特性。
将重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18连续传代20代，提取第5、10、15、20代的病毒DNA，对CS表位区和猪IL-18基因进行测序，结果显示没有发生碱基突变、缺失和***，遗传稳定性良好。将该重组病毒进行动物安全性试验，免疫两周内的小鼠均未出现任何瘙痒症状，采食正常，无应激反应，小鼠健康，表明重组病毒的安全性良好，符合疫苗毒株的优良特性。
综上，重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18符合伪狂犬病毒的一般生物学特性，外源基因的***可以稳定表达，并且遗传稳定性良好，有望成为疫苗候选株。
实施例3：重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18在猪体内的免疫试验研究
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞、毒株和疫苗
ST细胞、Vero传代细胞、PEDV变异株CH-HNKF-2016、PRV变异株PRV/HN2012(CCTCCNO.V201314)、重组伪狂犬病毒rPRV-PEDV S1株，其分类名为rPRV-PEDVS1，保藏号为：CCTCCNO：V201750，保藏日期：2017年10月31日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学。rPRV-PEDV S1-IL18株由试验一构建；PEDV灭活疫苗 (PEDV-TGEV二联灭活疫苗，含PEDV AJ1102株）购自武汉科前公司。PRV BarthaK61弱毒疫苗购自浙江诺倍威生物技术有限公司。
1.1.2 实验动物
2周龄健康仔猪购自河南某猪场。
1.1.3 主要试剂和仪器
猪流行性腹泻ELISA抗体检测试剂盒（IgG）（间接法）购自武汉科前股份有限公司；DMEM购自武汉博士德生物工程有限公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1仔猪免疫试验
将24头2周龄健康仔猪随机分成5组，试验具体分组和接种情况见表4。接种途径为背部皮下分点注射，免疫后每天观察并记录仔猪临床反应情况。免疫前和免疫后每周对仔猪进行耳静脉采血，至第4周，分离血清，-20℃保存备用。
表4 仔猪分组及免疫情况
Figure DEST_PATH_IMAGE005
1.2.2 PEDV的血清ELISA试验
取每周的仔猪血清，采用猪流行性腹泻ELISA抗体检测试剂盒，根据试剂盒说明书进行猪血清抗PEDV抗体检测。
1.2.3 PRV的血清中和试验
取每周的仔猪血清，进行PRV血清中和试验，采用固定病毒稀释血清法，检测rPRV-PEDVS1组，rPRV-PEDV S1-IL18组，Bartha K61疫苗组和DMEM细胞培养基（阴性对照）组仔猪血清中抗PRV的抗体水平。具体如下：
先将血清于56 ℃水浴灭活处理30 min，进行2倍系列倍比稀释，得到1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256，1:512，1:1024的稀释液。将不同稀释度的血清与200TCID50 PRV强毒株1:1混合，37 ℃感作1 h。之后加到长至单层的96孔Vero细胞板中，吸附2h，然后换成病毒维持液，每个稀释度做4个重复。继续培养72 h，用Karber法判定和计算中和试验的半数保护量（PD50）。计算公式如下：Log50%中和效价=L+d（S-0.5），其中L=最低稀释度的对数，d=稀释度对数之间的差，S为各组保护率之和，然后计算中和效价。
采用PEDV ELISA抗体检测试剂盒（IgG）对每周采集的仔猪血清进行抗PEDV抗体的检测，评估rPRV-PEDVS1组，rPRV-PEDV S1-IL18组，PEDV灭活疫苗组和DMEM组仔猪血清中抗PEDV抗体水平。结果显示，rPRV-PEDV S1-IL18组，rPRV-PEDVS1组和PEDV灭活疫苗组，免疫后7 d即可产生抗体（图21），7-28 d产生的抗体逐渐升高。PEDV灭活疫苗组产生的抗体水平略高于试验组rPRV-PEDVS1和rPRV-PEDV S1-IL18，差异不显著(P>0. 05)。此外，试验组rPRV-PEDV S1-IL18产生的抗体水平略高于rPRV-PEDVS1组。
采用固定病毒稀释血清法对每周采集的猪血清进行PRV血清中和试验，评价rPRV-PEDVS1组，rPRV-PEDV S1-IL18组，Bartha K61疫苗组和DMEM组猪血清中抗PRV抗体水平。结果显示，rPRV-PEDV S1-IL18组，rPRV-PEDVS1组和Bartha K61疫苗组，免疫后7 d即可产生中和抗体（图22），14-21 d产生的中和抗体水平显著升高，21-28 d抗体水平缓慢升高。rPRV-PEDV S1-IL18组产生的中和抗体水平略高于rPRV-PEDVS1组和Bartha K61疫苗组。另外，rPRV-PEDVS1组和Bartha K61产生的抗体水平无显著差异(P>0. 05)。
1.2.4攻毒保护试验
免疫后4周，取rPRV-PEDV S1组、rPRV-PEDV S1-IL18组、PEDV灭活疫苗组和DMEM组仔猪各3头，用107.0 TCID50 PEDV变异株CH-HNKF-2016进行攻毒保护试验，每头仔猪口服4mL病毒培养物。对余下的猪用104 TCID50 PRV变异株PRV/HN2012进行攻毒保护试验，每头仔猪进行背部多点注射1 mL。攻毒后每天观察猪只的精神、体温变化、采食量、呕吐、腹泻、咳嗽等情况，以及死亡情况。
免疫4周后，用4 mL107.0 TCID50 PEDV变异株CH-HNKF-2016对重组病毒rPRV-PEDVS1组，rPRV-PEDV S1-IL18组，PEDV灭活疫苗组和DMEM组的仔猪，进行攻毒保护试验。口服4mL107.0 TCID50 PEDV CH-HNKF-2016 病毒培养物24 h后，DMEM组有2头仔猪出现轻微的腹泻、精神不振以及食欲减退等症状，随后该组另外一头仔猪开始发病，发病率为100%。随着时间的延长，临床症状加重，出现水样腹泻、***及后肢粪便污染严重、四肢无力、站立不稳以及被毛粗糙、没有光泽等症状。口服PEDV培养物14 d内，DMEM组有l头猪出现死亡，2头仔猪逐渐康复。对死亡猪进行解剖，发现肠壁变薄、变透亮、出血，肠道内充满气体并含大量黄色内容物。而rPRV-PEDV S1、rPRV-PEDV S1-IL18和PEDV灭活疫苗组免疫的仔猪食欲正常，精神状态良好。
免疫4周后，用1 mL 104 TCID50 PRV变异株PRV/HN2012对重组病毒rPRV-PEDV S1组，rPRV-PEDV S1-IL18组，BarthaK61疫苗组和DMEM组的仔猪，进行攻毒保护试验。在攻PRV/HN2012株96 h后，DMEM组有2头仔猪最先开始出现神经症状、拉稀、呕吐等，该组另外1头仔猪相继发病，发病率为100%。攻毒14d内，DMEM组有2头仔猪死亡，1头仔猪逐渐康复。BarthaK61疫苗组在攻PRV/HN2012株120 h后有一头仔猪开始出现神经症状、拉稀、呕吐等的PR临床症状，后来康复，其它2头仔猪在4周观察期内均健康成长，发病率25%。而rPRV-PEDV S1和rPRV-PEDV S1-IL18免疫的仔猪在PRV HN2012株攻毒2周内未见发病。
1.2.5统计学分析
用GraphPad Prism 7.0软件对上述数据进行统计学分析与作图，P值小于0.05为显著性，P值小于0.01为极显著性。
防控PED的有效策略是对猪只进行免疫疫苗，目前使用比较广泛的PEDV疫苗有灭活苗、弱毒苗、基因工程疫苗、联苗等，其中猪流行性腹泻－猪传染性胃肠炎二联苗，猪流行性腹泻－猪传染性胃肠炎－猪轮状病三联疫苗等联苗可以达到“一免多防”的目的。活疫苗可以诱导机体产生分泌性IgA，主要依赖黏膜免疫，提供对病毒强毒攻击的全面保护。新型基因工程疫苗如表达外源基因的活载体疫苗等已成为目前研究的热点。
本试验将前期纯化得到的表达PEDV S1中和表位区CS的重组病毒rPRV-PEDVS1和rPRV-PEDV S1-IL18，PEDV灭活疫苗，BarthaK61弱毒疫苗以及DMEM分别接种2周龄健康仔猪，然后进行抗PEDV的 ELISA抗体和抗PRV的中和抗体测定，以及分别用PEDV和PRV攻毒保护试验，评估重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18的安全性和免疫效力。结果显示，重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18对仔猪安全有效，可诱导仔猪产生针对PRV和PEDV的特异性免疫应答。
ELISA检测结果显示，试验组rPRV-PEDV S1-IL18产生的抗PEDV抗体水平略高于rPRV-PEDV S1组。中和试验结果表明，试验组rPRV-PEDV S1-IL18产生的抗PRV中和抗体水平高于重组病毒rPRV-PEDV S1组和BarthaK61弱毒疫苗-。表明猪IL-18细胞因子具有一定的增强免疫作用，可以作为疫苗佐剂，具有良好的应用前景。虽然针对PEDV产生的抗体水平比PEDV灭活疫苗组（PEDV-TGEV二联灭活疫苗）低，但是差异不显著(P>0. 05)，这与聂民财的研究结果一致。基于 PRV特异性抗体进行中和试验结果显示，所有试验组免疫后两周产生的抗体都处于较低水平，随后中和抗体水平显著升高，21-28 d抗体水平缓慢升高。试验组和BarthaK61弱毒疫苗组产生的抗体水平无显著差异 （P>0. 05），表明外源抗原CS表位区和猪IL-18的***并不影响PRV的免疫原性，这与Zheng等的研究结果一致。
攻毒保护结果显示，用4 mL107.0 TCID50 PEDV变异株CH-HNKF-2016口服后，DMEM组在24 h后出现轻微的腹泻、精神不振以及食欲减退等症状，14 d内有l头猪出现死亡，2头仔猪逐渐康复，而rPRV-PEDV S1、rPRV-PEDV S1-IL18和PEDV灭活疫苗组免疫的仔猪食欲正常，精神状态良好。用1 mL 104 TCID50 PRV变异株PRV/HN2012攻毒后，DMEM组仔猪在第4 d开始神经症状、拉稀、呕吐等，2周内有2头仔猪死亡，1头仔猪逐渐康复。BarthaK61弱毒疫苗组120 h后有一头仔猪发病，后来康复，其它2头仔猪未见发病。而rPRV-PEDV S1和rPRV-PEDV S1-IL18免疫的仔猪在PRV HN2012株攻毒2周内未见发病。表明rPRV HN2012-TK-/gE-/gI-作为活载体，对PRV变异株PRV/HN2012具有完全的保护力，外源基因的***，对亲本株没有影响。
综上，免疫过重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18的仔猪可获得与PEDV灭活疫苗、BarthaK61弱毒疫苗免疫相当的免疫力，且既可以保护自身免于PEDV变异株的攻击又可以保护自身免于PRV变异株的侵袭，对PEDV和PRV变异株均具有完全的保护力。因此，重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18有望成为防治PEDV和PRV 的二联弱毒疫苗候选株，为有效防净化PEDV和PRV 提供有力工具，也为基因工程活载体疫苗的研发奠定了理论和技术支持。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 河南农业大学
<120> 同时表达PEDV变异株S1基因CS区和猪IL-18的重组猪伪狂犬病毒株及其应用
<141> 2021-07-29
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 895
<212> DNA
<213> PEDV变异株CH-HNKF-2016(Sus)
<400> 1
gaggatccat ggttactttg ccatcattta atgatcattc ttttgttaac attactgtct 60
ctgcgtcctt tggtggtcat agtggtgcca accttattgc atctgacact actatcaatg 120
ggtttagttc tttctgtgtt cacactagac aatttaccat ttcactgttt tataacgtta 180
caaacagtta tggttatgtg tctaactcac aggacagtaa ttgccctttc accttgcaat 240
ctgttaatga ttacttgtct tttagtaaat tttgtgtttc caccagcctt ttggctagtg 300
cctgtaccat agatcttttt ggttaccctg agtttggtag tggtgttaag tttgcgtccc 360
tttactttca attcacaaag ggtgagttga ttactggcac gcctaaacca cttgaaggtg 420
tcacggacgt ttcttttatg actctggatg tgtgtaccaa gtataatatc tatggcttta 480
aaggtgaggg tattattacc cttacaaatt ctagcttttt ggcaggtgtt tattacacat 540
ctgattctgg acagttgtta gcctttaaga atgtcactag tggtgctgtt tattctgtta 600
cgccatgttc tttttcagag caggctgcat atgttgatga tgatatagtg ggtgttattt 660
ctagtttgtc taactccact tttaacagta ctagggagtt gcctggtttc ttctaccatt 720
ctaatgatgg ctctaattgt acagagcctg tgttggtgta tagtaacata ggtgtttgta 780
aatctggcag tattggctac gtcccatctc agtctggcca agtcaagatt gcacccacgg 840
ttactgggaa tattagtatt cccaccaact ttagtatgag tatttgagga tccgc 895
<210> 2
<211> 1500
<212> DNA
<213> 变异株PRV/HN2012株(Sus)
<400> 2
atgaagtggg caacgtggat cctcgccctc gggctcctcg tggtccgcac cgtcgtggcc 60
agagaggccc ctcgggagct ctgctacggc caccccgtcc acgacgaccg gcggcccgtc 120
gggcccgcga ccgacgccca gcccgtgaac ccgctcgccc ccgccaacgc caccgggacg 180
gactactctc gcggctgcga gatgcgcctc ctggatccgc ctctcgacgt atcgtcccgc 240
tcctcggacc ccgtcaacgt gaccgtcgcc tggttctttg acggcggcca ctgcaaggtg 300
cccctcgtcc accgcgagta ctacggctgc cccggggacg ccatgccctc cgtcgagacg 360
tgcaccggcg ggtactcgta cacccgcacg cgcatcgaca ccctgatgga gtacgccctc 420
gtgaacgcca gcctcgtgct gcagcccggg ctgtacgacg ccggcctgta catcgtcgtg 480
ctcgtctttg gcgacgacgc ctacctcggc accgtctccc tgtcggtgga ggccaacctg 540
gactacccct gcggcatgaa gcacgggctc acgatcaccc gccccggggc caccctccca 600
cccatcgccc ccacggccgg cgaccaccag cgctggcgcg ggtgcttccc ctcgaccgac 660
gagggcgcct gggagaacgt gaccgccgcc gagaagggcc tgtccgacga ctacgccgac 720
tactacgacg tgcacatctt ccgcctggag tctgacgacg aggtcgtcca cggcgatgcc 780
cccgaggccc ccgagggcga ggaggtgacc gaggaggagg ccgagctgac ctccagcgac 840
ctcgacaaca tcgagatcga ggtcgtgggc tctcccgccg ctcccgtcga gggcgccggc 900
gacggcgagg aggggcacgg ggacgaggag gacgaggagc tgacctccag cgacctcgac 960
aacatcgaga tcgaggtcgt gggctcgccc gcggccgccc gcttcttcgc cgcctccacc 1020
accccccgcg cccccacccg cgcggccgag atcacgacca tgaccacggt caccaccgtg 1080
cggacgaccg aggaccccag cggcatcacc gactgccgcc ggagcgactt cgtctcgccc 1140
tctgacatct tcgtgacccc caccggcagc cccgccctgc tcctgggctt cctgggcagc 1200
gcgctcgcct cgcgccccct gcacctgacg gccggggaga cggcccagca cgtgcgcgag 1260
gcccagcaga agagccgcca cgcccgctcc ctcggcggcc tccagctctc ggtcgagacc 1320
gagaccacca acaccaccac cacccagacg ggcctgtcgg gcgacatccg cacctcgatc 1380
tacatctgcg tcgccctcgc cggcctggtc gtcgtgggca tcgtcatcat gtgcctccac 1440
atggcgatca tcagggcccg ggcccggaac gacggctacc gccacgtggc ctccgcctga 1500

Claims (10)

1.同时表达PEDV变异株S1基因CS区和猪IL-18的重组猪伪狂犬病毒株，其分类名为rPRV-PEDV S1-IL18，保藏号为：CCTCC NO：V201740，保藏日期：2017年10月31日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学。
2.根据权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒株，其特征在于：所述猪伪狂犬病毒株包含有PEDV变异株CH-HNKF-2016的S1基因CS表位区和猪IL-18基因。
3.根据权利要求2所述的重组猪伪狂犬病毒株，其特征在于：所述PEDV变异株CH-HNKF-2016的S1基因CS表位区序列如SEQ ID No.1所示。
4.根据权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒株，其特征在于：所述重组猪伪狂犬病毒株选用变异株PRV/HN2012株，保藏号为：CCTCC NO.V201314，并将其gI、gE、TK基因缺失而获得的PRV流行变异株三基因缺失突变株rPRV HN2012-TK-/gE-/gI-，保藏号为：CCTCCNO.V201748，作为活病毒载体。
5.根据权利要求4所述的重组猪伪狂犬病毒株，其特征在于：所述重组猪伪狂犬病毒株选用变异株PRV/HN2012株的gG糖蛋白作为***位点，通过先删除在gG基因上第23bp-438bp的共计416 bp的片段，再利用gG启动子表达PEDV 的CS表位区。
6.根据权利要求5所述的重组猪伪狂犬病毒株，其特征在于：所述gG基因序列如SEQ IDNo.2所示。
7.权利要求1-6任一项所述的重组猪伪狂犬病毒株的构建方法，其特征在于，步骤如下：
（1）分别根据PEDV变异株S1基因CS区基因序列、猪IL-18基因序列、以及pBApo-EF1alpha_Pur_DNA质粒的序列设计引物对CS-F/CS-R，IL18- (BamH I)F/IL18-(Hind III)R，及pBApo(BstZ17I)-F/pBApo(BstZ17I)-R；
（2）以PEDV变异株的cDNA为模板，以步骤（1）的引物对CS-F/CS-R为引物，进行扩增、酶切并回收CS区目的片段；
（3）以pBApo-EF1alpha_Pur_DNA质粒为模板，以步骤（1）的引物对pBApo(BstZ17I)-F/pBApo(BstZ17I)-R为引物，进行扩增、酶切并回收pG载体；
（4）连接步骤（2）和步骤（3）回收的pG载体与CS区片段并转化简单，获得pBApo-EF1alpha_Pur_DNA真核表达质粒，并进行酶切回收载体片段即为pG-CS载体；
（5）从猪血中提取RNA，反转录成cDNA作为模板，以步骤（1）的引物对IL18-(BamH I)F/IL18-(Hind III)R为引物，进行扩增、转化、筛选阳性菌，在利用引物对pBApo(Bstz17I)-F/pBApo(Bstz17I)-R扩增 IL-18基因的表达盒，并进行酶切回收；
（6）将步骤（4）回收的pG-CS载体与步骤（5）的IL-18基因的表达盒相连，并转化、鉴定，获得重组转移质粒pG-CS-IL18；
（7）将亲本株rPRV HN2012-TK-/gE-/gI-接种于ST细胞上，培养箱孵育2 h后吸弃培养基，经洗涤后将步骤（6）的重组转移质粒pG-CS-IL18转染ST细胞，待细胞全部病变脱落时，收集含病毒上清液；
（8）经步骤（7）转染、同源重组的重组转移质粒pG-CS-IL18，通过筛选带有绿色荧光蛋白的蚀斑，纯化获得表达绿色荧光的重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18-EGFP，再利用CRISPR/Cas9质粒敲除载体PX459-gRNA1-EZ-gRNA3-EGFP去除荧光标签EGFP基因，成功获得重组病毒rPRV-PEDV S1-IL18，即为重组猪伪狂犬病毒株。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中引物CS-F序列为GA GGA TCC CTATGGTTACTTTG CATCA，引物CS-R序列为GC GGA TCC TCAAATACTCATACT；引物IL18- (BamH I)F序列为GA AGA TCT GCCACCATGGCTGCTGAACCGGAAG，引物IL18-(Hind III)R序列为GG GAA TTC GTTCTTGTTTTGAACAG；引物pBApo(BstZ17I)-F序列为 GTATAC TGAGGCTCCGGTGCCCGT，引物pBApo(BstZ17I)-R序列为 GTATAC TGA GGCTCCGGTGCCCGT。
9.权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒株在制备同时抗新型猪流行性腹泻和猪伪狂犬病病毒的弱毒疫苗中的应用。
10.根据权利要求9的应用，其特征在于：所述重组猪伪狂犬病毒株作为新型猪流行性腹泻和猪伪狂犬病二联弱毒疫苗的候选毒株。
CN202110863467.9A 2021-07-29 2021-07-29 同时表达pedv变异株s1基因cs区和猪il-18的重组猪伪狂犬病毒株及其应用 Pending CN113637648A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110863467.9A CN113637648A (zh) 2021-07-29 2021-07-29 同时表达pedv变异株s1基因cs区和猪il-18的重组猪伪狂犬病毒株及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110863467.9A CN113637648A (zh) 2021-07-29 2021-07-29 同时表达pedv变异株s1基因cs区和猪il-18的重组猪伪狂犬病毒株及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113637648A true CN113637648A (zh) 2021-11-12

Family

ID=78418844

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110863467.9A Pending CN113637648A (zh) 2021-07-29 2021-07-29 同时表达pedv变异株s1基因cs区和猪il-18的重组猪伪狂犬病毒株及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113637648A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113373119A (zh) * 2021-06-02 2021-09-10 江西农业大学 一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株、构建方法及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106834236A (zh) * 2016-02-23 2017-06-13 南京农业大学 猪伪狂犬病毒变异株TK、gE和gI基因缺失毒株及其应用
CN107345222A (zh) * 2017-06-27 2017-11-14 浙江省农业科学院 表达猪流行性腹泻病毒s1蛋白的重组伪狂犬病毒及其构建方法和应用
US10117929B1 (en) * 2017-11-23 2018-11-06 National Pingtung University Of Science And Technology Nucleic acid-based adjuvant and porcine vaccine composition including the same
CN110257345A (zh) * 2019-07-18 2019-09-20 河南农业大学 一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株及其构建方法
CN110305852A (zh) * 2019-06-18 2019-10-08 扬州大学 表达猪流行性腹泻病毒s1基因重组伪狂犬病病毒的构建
CN112481223A (zh) * 2020-12-01 2021-03-12 江苏省农业科学院 猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒、制备方法及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106834236A (zh) * 2016-02-23 2017-06-13 南京农业大学 猪伪狂犬病毒变异株TK、gE和gI基因缺失毒株及其应用
CN107345222A (zh) * 2017-06-27 2017-11-14 浙江省农业科学院 表达猪流行性腹泻病毒s1蛋白的重组伪狂犬病毒及其构建方法和应用
US10117929B1 (en) * 2017-11-23 2018-11-06 National Pingtung University Of Science And Technology Nucleic acid-based adjuvant and porcine vaccine composition including the same
CN110305852A (zh) * 2019-06-18 2019-10-08 扬州大学 表达猪流行性腹泻病毒s1基因重组伪狂犬病病毒的构建
CN110257345A (zh) * 2019-07-18 2019-09-20 河南农业大学 一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株及其构建方法
CN112481223A (zh) * 2020-12-01 2021-03-12 江苏省农业科学院 猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒、制备方法及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LAN-LAN ZHENG ET AL.: "Construction and immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus co-expressing porcine circovirus type 2 capsid protein and interleukin 18", 《VIRUS RESEARCH》, vol. 201, pages 8 - 15, XP055442769, DOI: 10.1016/j.virusres.2015.02.010 *
XIAOMIN YUAN ET AL.: "Effcacy and immunogenicity of recombinant swinepox virus expressing the truncated S protein of a novel isolate of porcine epidemic diarrhea virus", 《ARCH VIROL》, vol. 162, pages 3779 - 3789 *
崔建涛: "PEDV S1基因的CS区和猪IL-6重组PRV毒株的构建及免疫效力初步探究", 《中国知网硕士电子期刊》, no. 4, pages 1 - 59 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113373119A (zh) * 2021-06-02 2021-09-10 江西农业大学 一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株、构建方法及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107815441B (zh) 一种ⅱ型伪狂犬病毒减毒株及其制备方法和应用
CN109439634B (zh) 伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株及其应用
WO2016026264A1 (zh) 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
CN102250843B (zh) 猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程标记弱毒疫苗株及应用
CN110257345B (zh) 一种猪伪狂犬病双基因缺失变异突变病毒毒株及其构建方法
CN109136198B (zh) 一种表达鸡传染性贫血病毒vp1、vp2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗
CN111876391A (zh) 猫泛白细胞减少症病毒fpv bj05株及其应用
CN1800374A (zh) 一种重组伪狂犬病－猪繁殖与呼吸综合征基因工程毒株及应用
CN113061587A (zh) 一种抗原谱拓展o型***病毒株及其构建方法和应用
CN106939320B (zh) 一种伪狂犬病毒js-2012株感染性克隆质粒、构建方法与应用
CN116426487A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒株及其在疫苗制备中的应用
CN117417904A (zh) 表达C型aMPV F蛋白和G蛋白的新城疫病毒载体疫苗株及其应用
CN109402065B (zh) 一种番鸭c亚型禽偏肺病毒弱毒株及其制备和应用
CN112500458B (zh) 鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株亚单位疫苗、其制备方法及应用
CN107828741B (zh) 伪狂犬病病毒双基因缺失弱毒株及其应用
CN113637648A (zh) 同时表达pedv变异株s1基因cs区和猪il-18的重组猪伪狂犬病毒株及其应用
CN113521271A (zh) 一种猪繁殖与呼吸综合征二价灭活疫苗及制备方法
CN105802921B (zh) 表达猪瘟病毒e2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株及其构建方法和应用
CN110016457B (zh) 一株重组细粒棘球蚴Eg95基因的粗糙型布鲁氏菌及其疫苗生产方法
CN112891528B (zh) 一种鸡传染性支气管炎疫苗株
CN110484515B (zh) 一种预防FAdV-4和NDV的疫苗载体及其制备方法及应用
CN110974951B (zh) 一种二联灭活疫苗及其制备方法
CN112481223A (zh) 猪流行性腹泻病毒伪狂犬病病毒载体重组病毒、制备方法及其应用
CN112501133B (zh) 一种伪狂犬病毒qd株三基因缺失致弱株
CN114908065B (zh) 猪伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株及其建立方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination