CN111587117A

CN111587117A - 用于预防或治疗类风湿性关节炎的、含线粒体的药物组合物

Info

Publication number: CN111587117A
Application number: CN201980008165.4A
Authority: CN
Inventors: 崔容秀; 黄晶煜; 韩圭范; 金天炯
Original assignee: Paean Biotechnology Inc
Current assignee: Paean Biotechnology Inc
Priority date: 2018-02-02
Filing date: 2019-02-07
Publication date: 2020-08-25
Also published as: KR102275822B1; US20210052659A1; JP2022095884A; EP3747449A1; WO2019151840A1; EP3747449A4; KR20190094124A; JP2021512874A

Abstract

本发明涉及一种用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物，特别是涉及一种含有线粒体作为活性成分，用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物。当向类风湿性关节炎患者给药本发明的含有外源性线粒体的药物组合物时，该患者可减轻水肿和浮肿症状。此外，本发明的药物组合物能降低患者体内炎性细胞因子IL‑6的表达水平，同时能提高抗炎性细胞因子IL‑10的表达水平。因此，本发明的药物组合物可以有效预防或治疗类风湿性关节炎。

Description

用于预防或治疗类风湿性关节炎的、含线粒体的药物组合物

技术领域

本发明涉及一种用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物，特别是涉及一种含有线粒体作为活性成分，用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物。

背景技术

类风湿性关节炎是一种慢性炎症疾病，其会导致关节滑膜增生，并破坏骨骼或软骨。在初始阶段，炎症会发生在连接关节的滑膜上，并逐渐扩散到周围的软骨和骨骼中，导致关节的破坏和变形。此外，类风湿关节炎还可能在各个器官和关节中引起炎症反应，并可能表现出诸如皮下结节、肺纤维化、血管炎、皮肤溃疡、皮疹、体重减轻等症状。目前已知免疫应答是类风湿关节炎病发的主要机制，但是确切病因还尚未发现。

目前已使用非甾体抗炎药、类固醇药、抗风湿药和肿瘤坏死因子抑制剂来进行类风湿关节炎治疗。非甾体抗炎药和类固醇药可缓解炎症以减轻病症，但却不能抑制疾病的发展。与非甾体类抗炎药或类固醇药相比，抗风湿药能从根本上改善疾病，但却需要一定的时间(predetermined time)才能显示出药效，且几乎没有直接的镇痛作用。目前，为了治疗类风湿关节炎，会将抗风湿药与非甾体抗炎药或类固醇药物一起使用，直到抗风湿药起效。

然而，在抗风湿药起效之前，使用非甾体抗炎药可能会引起胃肠道疾病等副作用，以及使用类固醇药可能会引起免疫力降低、耐受性增加和并发症等副作用。另外，抗风湿药侧重于关节炎的治疗，但也可能引起各种副作用。因此，还需要进行定期血液检查等后期观察。

肿瘤坏死因子抑制剂已经应用于治疗对抗风湿药无反应的类风湿关节炎患者，其原理是通过阻断肿瘤坏死因子来抑制炎症反应，而肿瘤坏死因子是引起类风湿性关节炎的介质。肿瘤坏死因子抑制剂的优点在于，能使对常规抗风湿药无反应的类风湿关节炎症状减轻70％甚至更多，且比常规治疗剂见效更快。但是，肿瘤坏死因子抑制剂的缺点在于其半衰期短，且并不是从根本原因上来进行治疗。另外，已经有报道指出其存在激活潜伏性结核等副作用。

线粒体是真核细胞中的细胞器，能够参与细胞内能源三磷酸腺苷(ATP)的合成和调控，与生物体内的各种代谢途径相关，例如细胞信息传递、细胞分化、细胞凋亡以及细胞周期和细胞生长的控制。关于类风湿性关节炎的发病机理，已有研究报道，关节的滑膜增生会引起线粒体功能障碍，进而增加活性氧的产生，从而诱导产生炎症反应(Fearon et al.,Nat Rev Rheomatoid.,2016,(12):385-397)。

发明内容

技术问题

目前对治疗风湿性关节炎进行的研究，还存在诸如治疗范围有限或有副作用发生等问题，且尚未开发出创新疗法。因此仍需对安全有效的类风湿性关节炎疗法进行持续的研究和开发。

本发明的目的是提供一种用于治疗类风湿性关节炎的药物组合物以及使用该药物治疗类风湿性关节炎的方法。

技术方案

为了解决上述问题，本发明提供了一种用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物，该药物组合物含有线粒体作为活性成分。

本发明还提供了一种用于预防或治疗类风湿性关节炎的方法,该方法包含向个体施用所述药物组合物。

有益效果

当将本发明中含有外源性线粒体的药物组合物施用于类风湿性关节炎患者时，可以减轻该患者的肿胀和泛红症状。此外，本发明的药物组合物降低患者体内炎性细胞因子IL-6的表达水平，同时能提高抗炎性细胞因子IL-10的表达水平。因此，本发明的药物组合物可用于预防或治疗类风湿关节炎。

附图说明

图1是肉眼能观察到的，比较正常组、对照组以及使用过外源性线粒体的实验组小鼠足部肿胀和发红症状的图片。

图2是评估正常组、对照组以及使用过外源性线粒体的实验组小鼠的疾病症状程度的曲线图。

图3是正常组、对照组以及使用过外源性线粒体的实验组小鼠的背轴爪厚度测定结果的柱状图。

图4是比较正常组、对照组以及使用过外源性线粒体的实验组小鼠的IL-6基因表达水平的柱状图。

图5是比较正常组、对照组以及使用过外源性线粒体的实验组小鼠的IL-10基因表达水平的柱状图。

图6是在经过外源性线粒体给药的类风湿关节炎小鼠体内，其外源性线粒体的分布状态照片。

图7是根据外源性线粒体给药，评估类风湿性关节炎的严重性的组织状态照片。

图8显示在LPS存在的状态下，通过外源性线粒体给药使巨噬细胞增殖。

图9显示在LPS存在的状态下，通过外源性线粒体给药使TNF-α分泌水平降低。

图10显示在LPS存在的状态下，通过外源性线粒体给药使IL-6分泌水平降低。

本发明最佳实施方式

在下文中将详述本发明。

一方面本发明提供了一种用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物，其中含有线粒体作为活性成分。

在本文中，除非特别指出，术语“活性成分”是指单独或与自身不具有活性的辅助剂(载体)组合显示出活性的成分。

所述线粒体可以获取自哺乳动物或人。具体而言，所述线粒体可以分离自细胞或组织，例如体细胞、生殖细胞或干细胞。另外，还可以是从线粒体生物学活性正常的细胞中获得的正常线粒体。并且，也可以在体外培养所述线粒体。

另外，所述线粒体可以获取于自体、同种异体或异种。具体来讲，术语“自体线粒体”是指从同一个体的组织或细胞获得的线粒体。另外，术语“同种异体线粒体”是指，从与要应用线粒体的个体属于同一物种，但等位基因的基因型不同的个体中获得的线粒体。另外，术语“异种线粒体”是指从与要应用线粒体的个体属于不同物种的个体中获得的线粒体。

具体来讲，所述体细胞可以是肌肉细胞、肝细胞、神经元、成纤维细胞、上皮细胞、脂肪细胞、骨细胞、白细胞、淋巴细胞、血小板或粘膜细胞。

另外，所述生殖细胞是经历减数***和有丝***的细胞，可以是***或***。所述干细胞可以为选自由间充质干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、骨髓干细胞、神经干细胞、角膜缘干细胞和组织来源的干细胞中的任何一种。所述间充质干细胞可以选自脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜和胎盘构成的群组中的任何一种。

同时，在从特定细胞分离线粒体时，可以通过各种已知方法分离线粒体，例如使用特定的缓冲溶液或使用电势差和磁场。

考虑到维持线粒体活性，可以通过破碎和离心细胞的方式来实现线粒体的分离。在一个实施方案中，线粒体的分离可以通过以下方式进行：先进行细胞培养，然后对含有所培养细胞的药物组合物进行第一次离心以产生沉淀；在缓冲溶液中将沉淀重悬并均质化化沉淀；对均质溶液进行第二次离心以产生上清液；然后对上清液进行第三次离心以纯化线粒体。在此方案中，考虑到维持细胞活性，优选调整第二次离心时间，使其比第一次和第三次离心时间短，并且从第一次到第三次离心，可以提高离心速度。

具体来讲，第一至第三次离心可在0-10℃下进行，优选3-5℃的温度下进行。另外，离心时间可以在1-50分钟之间，并且可以根据离心分离次数、样品含量等适当地调节离心时间。

另外，第一次离心可以以100-1000g、200-700g或300-450g的速度进行；第二次离心可以以1-2000g、25-1800g或500-1600g的速度进行；第三离心可以以100-20000g、500-18000g或800-15000g的速度进行。

另外，在该药物组合物中线粒体浓度为0.1-500μg/ml、0.2-450μg/ml或0.5-400μg/ml。使线粒体浓度包含在上述范围内，可以在给药过程中很容易地控制线粒体的量，并且可以进一步改善患者的类风湿性关节炎的症状。

特别是，根据被给药者的体重，以按每次0.01-5mg/kg、0.1-4mg/kg或0.25-2.5mg/kg的量给药本发明中含有线粒体的药物组合物。即，就细胞活性而言，此为最优选方案，根据类风湿性关节炎患者体重给药，使得药物组合物中线粒体的量落入上述范围内。另外，该药物组合物可以施用1-10次、3-8次或5-6次，优选5次。在这种情况下，给药间隔可以是1-7天或2-5天，优选3天。

另外，本发明的药物组合物可以施用于易患类风湿性关节炎或患有与类风湿性关节炎相关疾病或病症的人或其他哺乳动物。另外，该药物组合物可作为静脉内可注射制剂，并且可优选作为注射制剂。

因此，根据本发明的药物组合物可以通过使用可注射用的缓冲溶液，如酸性水溶液或磷酸盐来调节组合物的pH，从而制备为物理或化学上高度稳定的注射用制剂，以确保在注射制剂分配过程中产品的稳定性。

具体而言，本发明的药物组合物可以含有注射用水。注射用水是为溶解固体注射剂或稀释水溶性注射剂而制备的蒸馏水，可以是葡萄糖注射剂、木糖醇注射剂、D-甘露醇注射剂、果糖注射剂、盐水、右旋糖酐40注射剂、右旋糖酐70注射剂、氨基酸注射液、林格氏溶液、乳酸-林格氏溶液、pH为3.5-7.5的磷酸盐缓冲溶液、磷酸二氢钠-柠檬酸盐缓冲溶液等。

另外，本发明的药物组合物可以含有稳定剂或溶解助剂。例如，稳定剂可以是焦亚硫酸钠或乙二胺四乙酸；溶解助剂可以是盐酸、乙酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠或氢氧化钾。

另外，本发明可以提供预防或治疗类风湿性关节炎的方法，该方法包括将上述药物组合物施用于个体。在此，个体可以是哺乳动物，且更加适用于人类。

在这种情况下，可以通过静脉内进行给药。因此，根据本发明的药物组合物可以向患有类风湿性关节炎的个体的静脉供应具有正常活性的外源性线粒体，从而可用于增加线粒体功能降低的细胞的活性，再生具有线粒体功能障碍的细胞，以用于预防或治疗类风湿关节炎。

具体实施方式

在下文中，将列出优选实施例以帮助理解本发明。然而，提供以下实施例仅是为了容易地理解本发明，且本发明并不限于以下实施例。

实施例1.制备含有线粒体的组合物的

将由CHA Bundang医学中心提供的脐带间充质干细胞接种到含有10％(v/v)胎牛血清(FBS，Gibco)、100μg/ml链霉素和100U/ml的氨苄青霉素的Alpha-最小必需培养基(Alpha-MEM)上，培养72小时。培养完成后，将细胞用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(DPBS，Gibco)洗涤两次，然后用0.25％(v/v)的胰蛋白酶-EDTA(TE，Gibco)处理以获得细胞。

为了提取线粒体，使用血细胞计数器以1×10⁷个/ml的细胞浓度收取得到的细胞。首先在约4℃的温度下以350×g的速度对细胞系进行第一次离心10分钟。收集获得的沉淀，重悬在缓冲溶液中，并均质化10至15分钟。然后，将含有沉淀的组合物在约4℃的温度下以1100×g的速度进行第二次离心3分钟，从而获得上清液。然后将上清液在约4℃的温度下以12000×g的速度进行第三次离心15分钟，以从细胞系中分离线粒体。将依此获得的5μg或50μg的线粒体分别与100μl注射用水混合，然后装入胰岛素注射器中。

制备实施例1.制备含有间充质干细胞的组合物

将由CHA Bundang医学中心提供的脐带间充质干细胞接种到含有10％(v/v)FBS、100μg/ml链霉素和100U/ml氨苄西林的Alpha-MEM中，然后培养72小时。培养完成后，将细胞用DPBS洗涤两次，然后用0.25％(v/v)胰蛋白酶-EDTA处理以获得细胞。将获得的细胞再次用DPBS洗涤两次，并按将1×10⁶个细胞与100μl注射用水混合，然后装入胰岛素注射器中

制备实施例2.制备含有肿瘤坏死因子抑制剂的组合物

将由CHA Bundang医学中心提供的肿瘤坏死因子抑制剂恩利(依那西普)稀释后，基于20g小鼠体重以8.3μg剂量给药，并与100μl注射用水混合，然后装入胰岛素注射器。该剂量对应基于60kg人体重量计算的25mg给药剂量。

实验实施例1.诱导类风湿性关节炎的小鼠的制备及组合物的施用

六到八周大的雌性DBA-1/j小鼠购自Orient Bio Co.，Ltd.(韩国首尔)。将购买的小鼠放置在CHA大学实验动物中心的清洁区中适应环境，然后进行实验。在适应期间，小鼠的生存环境保持在12小时的明/暗周期，23±2℃的室温和40％-60％的湿度。在7天的适应期后，对小鼠进行实验。

为了在适应期内诱发小鼠的类风湿性关节炎，首先在4℃下将4mg/ml的鸡Ⅱ型胶原蛋白溶解在0.05-0.1M的乙酸中，并将等量的弗氏完全佐剂(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)分别与之混合以制备初级免疫诱导悬浮液(CFA)和次级免疫诱导悬浮液(IFA)。然后将制备的0.1ml的初级免疫诱导悬浮液(CFA)在小鼠尾巴的底部皮下给药，三周后，再将0.1ml的次级免疫诱导悬浮液(IFA)进一步在小鼠尾巴的底部皮下给药，以产生类风湿性关节炎的动物模型。

然后，对已诱发关节炎的小鼠通过皮下注射(SC)的方式给药100μl在制备实施例2中制备的含恩利的组合物，给药间隔为三天，总共给药五次，以此作为实验组1。此外，通过静脉内注射(IV)的方式给药100μl在制备实施例1中制备的含有来自脐带的间充质干细胞的组合物和在实施例1中制备的含有线粒体的组合物，给药间隔为三天，总共给药五次，由此作为实验组2至4。将未进行给药的正常小鼠作为正常组。另外，对照组的制备方法与实验组2相同，只是通过静脉注射(IV)给药100μl注射用水，间隔3天，共5次(表1)。

[表一]

同时，对于成年人，恩利按每周两次、每次25mg的剂量给药。在使用恩利进行的动物实验中，根据剂量和给药时间表，通常按每周两次、每次25mg的剂量总共给药五次。

实验实施例2.根据外源性线粒体的给药确定肿胀和发红症状的减轻。

为了评估在实验实施例1中制备的每个实验组在30天后的肉眼观察到的症状情况，对正常组、对照组和实验组1-4中的小鼠的爪进行拍照，照片如图1所示。

如图1所示，在正常组的小鼠的爪中没有观察到肿胀和发红。另一方面，在对照组的小鼠的爪中，大关节和小关节严重肿胀，并且整体观察到发红症状。在经过恩利或间充质干细胞给药的实验组1和2小鼠的爪中，前爪的大小关节明显肿胀，总体上观察到发红症状；后爪肿胀情况相对良好，部分观察到发红症状。在经过线粒体给药的实验组3和4小鼠的爪中，前爪和后爪的肿胀情况相对良好，部分观察到发红症状。因此，肉眼观察后证实：与作为肿瘤坏死因子抑制剂的恩利相比，含有线粒体的组合物在减少肿胀和发红方面具有更优异的效果。

实验实施例3.证实外源性线粒体的给药具有改善类风湿性关节炎症状的效果

根据得分参考表(表2)，对实验实施例1中各实验组在30天后的类风湿性关节炎症状的程度进行打分，其结果如图2所示。

[表2]

得分	症状
		0	小或大关节无肿胀或发红
1	小或大关节有轻微肿胀和/或发红
		2	一个或几个小或大关节有中度肿胀和/或发红
3	大关节有严重肿胀和发红，小关节有中度肿胀和/或发红
		4	大关节有非常严重的肿胀和发红，小关节有严重肿胀及/或发红

如图2所示，正常组的小鼠的爪没有肿胀或发红，其得分根据疾病症状确定为0分。另一方面，在对照组小鼠的大关节和小关节处发生非常严重的肿胀和发红，其得分根据疾病症状确定为15-16分。此外，在经恩利或间充质干细胞给药的实验组1和实验组2小鼠的爪中，大关节出现严重肿胀和发红，小关节出现中度肿胀和发红，其得分根据疾病症状确定为11-12分。相反，在经过线粒体给药的实验组3和实验组4小鼠的爪中，大关节或小关节处出现中等程度的肿胀及/或发红，并且其得分根据疾病症状确定为8至10分。因此，证实了含有线粒体的组合物比作为肿瘤坏死因子抑制剂的恩利具有更好的治疗效果。

实验实施例4.证实外源性线粒体的给药具有减少肿胀的效果

为了定量表示在实验实施例1中每个实验组在30天之后，爪的肿胀程度，通过使用游标卡尺分析了其在背轴上的爪厚度，如图3所示。在此，测量并计算前爪和后爪的在背轴上的爪厚平均值，结果如柱状图所示。

如图3所示，确定对照组小鼠的背轴爪厚比正常组小鼠的爪厚约厚28％。另外，确定了经恩利给药的实验组1小鼠的背轴爪厚比正常组小鼠的爪厚约厚23％。经测定，经过间充质干细胞给药的实验组2小鼠的背轴爪厚比正常组小鼠的爪厚约厚6.8％。相反，测定了经线粒体给药的实验组3和4小鼠的背轴爪厚比正常组的小鼠的爪厚约厚0.7％-6％。因此，证实了在经含有线粒体的组合物给药的实验组中，肿胀程度降低。

实验实施例5.证实外源性线粒体的给药导致细胞因子表达水平的变化

为了评估正常组、对照组和实验实施例1中的实验组1-4的小鼠血清中存在的炎性细胞因子，从小鼠心脏中抽取0.4ml血液，然后将血液在室温下凝结20-30分钟。将凝结的血液以2500-3000rpm的速度离心以分离上清液血清。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)分析分离的血清，以检测炎性细胞因子IL-6和抗炎性细胞因子IL-10的表达水平。

如图4所示，正常组小鼠的IL-6表达水平约为29pg/ml，对照组小鼠的IL-6表达水平约为85pg/ml，比正常组高约2.9倍。另外，测定了经恩利给药的实验组1小鼠和间充质干细胞给药的实验组2小鼠的IL-6表达水平分别约为79pg/ml和81pg/ml，与对照组相似。相反，经含有线粒体的组合物给药的实验组3和4小鼠的IL-6表达水平分别约为42pg/ml和17pg/ml，这与正常组相似或比对照组低约两倍。这证明含有线粒体的组合物降低了炎性细胞因子IL-6的表达水平。

此外，如图5所示，正常组小鼠的IL-10表达水平约为19pg/ml。另一方面，对照组中小鼠的IL-6表达水平约为21pg/ml。另外，经恩利给药的实验组1小鼠的IL-10表达水平为约20pg/ml，与对照组相似。经间充质干细胞给药的实验组2小鼠的IL-10表达水平约为26pg/ml，高于正常组和对照组的小鼠。测定经含有线粒体的组合物给药的实验组3和4小鼠的IL-10表达水平分别约为23pg/ml和30pg/ml，高于正常组和对照组。这证明含有线粒体的组合物增加了抗炎性细胞因子IL-10的表达水平。

实验实施例6.证实经线粒体给药后类风湿性关节炎小鼠体内分布情况

为了确认类风湿性关节炎小鼠体内线粒体的分布，用近红外荧光试剂CellVue^TMNIR815荧光染料(Thermo Fisher Scientific，美国)标记线粒体，然后通过小鼠尾静脉给药。为了观察3小时后的线粒体分布，使用Impulse近红外设备拍摄线粒体的体内的分布情况，结果如图6所示。

如图6所示，观察到通过小鼠的尾静脉给药的线粒体沿着静脉血管分布于肝、肺和脾中，并且特别地存在于小鼠的爪中。

实验实施例7.通过组织学评估证实外源性线粒体的给药改善类风湿性关节炎的严重性

为了分析在实验实施例1中各实验组在30天后的类风湿性关节炎的严重性，将小鼠的爪移除并在4％多聚甲醛中固定两天。将固定过的爪组织在脱钙液(Sigma)中脱钙以制备石蜡块。将制备的爪组织的石蜡块切成10μm的切片并固定。然后，将切片用苏木精和曙红染色，并通过显微镜拍照，结果如图7所示。

如图7所示，正常组小鼠的爪组织保持关节形态，且未观察到由炎症反应引起的滑膜成纤维细胞的关节内浸润。另一方面，在对照组小鼠的爪组织中发生了由炎症反应引起的炎症细胞和滑膜成纤维细胞的关节内浸润，从而损害了关节形态。另外，在经恩利给药的实验组1和间充质干细胞给药的实验组2小鼠的爪组织中，观察到与对照组相似的炎性细胞和滑膜成纤维细胞的关节内浸润，这与对照组相似。

另一方面，在经含线粒体的组合物给药的实验组3和4小鼠的爪组织中，炎症细胞和滑膜成纤维细胞的关节内浸润减少，并且关节形态与正常组相似。这表明含有线粒体的组合物通过炎症反应抑制炎症细胞浸润和滑膜成纤维细胞的异常增殖。

实验实施例8.证实线粒体转移使巨噬细胞增殖

用LPS(2μg/ml；L4391，Sigma)处理来源于小鼠的Raw 264.7细胞(巨噬细胞)6小时，以诱导炎症反应。然后，将从人UC-MSC中提取的健康线粒体以不同的浓度(0.1、0.5、0.75、1、5μg)转移到其中，并接种到24孔板上，并在37℃的CO₂培养箱中进行培养。24小时后，收集样品的上清液并以1500rpm的速度离心5分钟，仅将离心上清液转移至新试管中。为了比较细胞增殖能力，使用EZ-cytoX试剂盒(EZ-3000，Dogen)进行测试。将测试试剂盒中包含的反应溶液与所获得的每个样品以10：1的比例混合(反应溶液的体积＝1/10样品的体积)，在37℃的CO₂培养箱中反应2小时，然后测量在450nm处的吸光度。结果如图8所示，线粒体脱氢酶活性随着样品中活细胞数量的增加而增加。

实验实施例9.证实线粒体转移具有抑制巨噬细胞促炎性细胞因子分泌的效果

以与实验实施例8中相同的方式，将源于小鼠的Raw 264.7细胞(巨噬细胞)用LPS(2μg/ml)处理6小时，以诱导炎症反应。然后，将从人UC-MSC中提取的健康线粒体以不同的浓度(0.1、0.5、0.75、1、5μg)转移到其中，并接种到24孔板上，并在37℃的CO₂培养箱中进行培养。24小时后，收集样品的上清液，以1500rpm的速度离心5分钟，仅将离心上清液转移至新试管中。为了确定巨噬细胞中炎性细胞因子TNF-α和IL-6的表达水平，分别使用小鼠TNF-αELISA试剂盒(Sigma，#RAB0477)和小鼠IL-6ELISA试剂盒(Sigma，#RAB0308)对表达水平进行了分析。

通过使用ELISA试剂盒中包含的稀释溶液以1：10的比例稀释样品，可以制备每种条件的上清液样品。将制备的样品和标准溶液分别放入预涂有抗体的96孔板中，并将板在4℃下孵育过夜。第二天，使用测试试剂盒中包含的洗涤液除去残留在96孔测试板上的溶液。随后，将所制备的生物素标记的检测抗体添加到每个孔中，并在室温下反应1小时。反应完成后，使用洗涤液除去残留在96孔测试板上的溶液。接下来，将制备的链霉亲和素溶液添加到每个孔中，使用搅拌器在室温下反应45分钟，然后使用洗涤液除去残留在96孔测试板上的溶液。最后，向其中加入底物试剂溶液，并使用搅拌器在室温和遮光条件下反应30分钟。反应完成后，向每个孔中加入终止溶液，并测量在450nm处的吸光度。

结果如图9和10所示，证实了尽管用LPS处理细胞，但是通过线粒体处理有效地降低了TNF-α和IL-6的表达水平。

Claims

1.用于预防或治疗类风湿性关节炎的药物组合物，所述组合物含有线粒体作为活性成分。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述线粒体是从细胞或组织中分离得到。

3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述细胞为选自由体细胞、生殖细胞、干细胞及其组合构成的群组中的任意一种。

4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述体细胞为选自由肌肉细胞、肝细胞、神经元、成纤维细胞、上皮细胞、脂肪细胞、骨细胞、白细胞、淋巴细胞、血小板、粘膜细胞及其组合构成的群组中的任意一种。

5.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述生殖细胞为选自由***、***及其组合构成的群组中的任意一种。

6.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述干细胞为选自由间充质干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、骨髓干细胞、神经干细胞、角膜缘干细胞、组织来源的干细胞及其组合构成的群组中的任意一种。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述间充质干细胞是选自由脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜、胎盘、滑液、睾丸、骨膜及其组合构成的群组中的任意一种。

8.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述线粒体在所述药物组合物中浓度为0.1～500μg/ml。

9.用于预防或治疗类风湿性关节炎的方法，所述方法包括向个体施用如权利要求1-8中任一项所述的药物组合物。