KR102273163B1 - 혈소판 유래 미토콘드리아의 수득 방법 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혈소판을 냉동 보관하여 활성 미토콘드리아를 수득하는 방법과 분리된 미토콘드리아의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 혈소판을 냉동 후 해동하여 미토콘드리아를 수득하는 방법 및 상기 방법에 의해 수득된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 보존용액에 냉동된 상태의 혈소판을 해동하여 미토콘드리아를 수득하는 방법을 제공함으로써 활성이 안정적으로 유지된 미토콘드리아를 손쉽게 얻을 수 있을 뿐만 아니라 짧은 시간 동안 냉장 보관 후 폐기되는 공여 혈소판에 대한 상업적 가치도 제공할 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 수득된 혈소판 유래 미토콘드리아를 포함하는 약학 조성물은 미토콘드리아 기능장애로 인해 유발되는 다양한 질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

혈소판 유래 미토콘드리아의 수득 방법 및 이의 용도{METHOD FOR OBTAINING PLATELET-DERIVED MITOCHONDRIA AND USE THEREOF}
본 발명은 냉동 보관된 혈소판에서 활성 미토콘드리아를 수득하는 방법과 분리된 미토콘드리아의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 냉동된 혈소판으로부터 미토콘드리아를 수득하는 방법 및 상기 방법에 의해 수득된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
미토콘드리아는 세포 내 에너지 공급원인 아데노신 트라이포스페이트(ATP)의 합성 및 조절에 관여하는 진핵세포의 세포 소기관이다. 미토콘드리아는 생체 내 다양한 대사 경로, 예를 들어, 세포 신호처리, 세포 분화, 세포 사멸뿐만 아니라, 세포 주기 및 세포 성장의 제어와 연관이 있다.
미토콘드리아의 기능 저하에 의한 에너지 생산 감소는 다양한 질병을 유발하는 것으로 보고된 바 있다. 미토콘드리아 유전체 및 단백체의 변이에 따라 전자전달연쇄반응의 기능이 저하될 경우, ATP 생산 감소, 활성산소 과다 생성, 칼슘 조절 기능의 저하 등이 일어나게 된다. 이러한 경우 미토콘드리아의 막 투과성에 변화가 일어나 세포사멸의 기능이 비정상적으로 일어나게 되고 이에 따른 암 및 난치성 질환이 야기될 수 있다.
이와 같이 미토콘드리아 기능 이상에 의해 발생하는 인간 질병으로는 미토콘드리아 관련 유전병, 류마티스 관절염과 같은 자가면역 염증성 질환, 허혈성 질환, 감염성 질환, 심장질환, 근질환, 파킨슨병이나 알츠하이머병 등과 같은 퇴행성질환, 그리고 각종 암의 발생과 암전이 등이 보고된 바 있다.
이러한 미토콘드리아 기능장애와 관련된 질환을 치료하기 위하여, 미토콘드리아를 보호하거나 미토콘드리아의 기능장애를 회복하는데 사용될 수 있는 물질 또는 이러한 물질을 효율적으로 표적 전달할 수 있는 방법 등에 대한 연구가 지속되고 있다. 그러나, 치료 범위가 다소 제한적이거나 부작용이 발생하는 문제가 있는 등 아직은 미토콘드리아 관련 질환에 대한 획기적인 치료법이 개발되지 않은 실정이다.
미토콘드리아의 세포막 투과성과 세포-세포간 이동성은 미토콘드리아의 기원과 신호전달의 수단으로서 검증되었다. 이러한 이동성을 이용하여, 정상 미토콘드리아로 손상된 부위의 미토콘드리아를 대체하려는 미토콘드리아 이식에 대한 연구들이 다양한 질병 모델에서 진행되고 있으며, 그 안정성과 유효성은 심장질환에서 임상 단계까지 검증되었다(McCully et al., Clin Trans Med., 5(16):1-13, 2016).
이러한 미토콘드리아 이식을 위한 미토콘드리아의 분리는 추가적 수술을 통한 자가 조직 및 근육 또는 대량 배양된 인간 세포로부터 이루어지고 있다. 그러나, 이와 같은 인체 자원들을 사용한 분리 방법은 수술적 부담감 및 세포의 배양 한계에 의한 한정된 자원으로 치료제로서 상용화가 어렵다는 문제에 봉착해 있다.
또한, 기증 및 이식이 용이한 인체자원인 혈액 내에는, 적혈구를 제외한 모든 혈구성분은 미토콘드리아가 존재하나 혈소판으로부터 분리된 미토콘드리아를 이용한 질환치료에 대한 시도는 지금까지 보고된 바가 없었다.
혈소판은 혈액 내에서 가장 작은 혈구 성분으로, 혈소판의 수는 정상인의 경우 혈액 1 ㎕당 150,000~400,000이다. 혈소판은 혈액의 손실 없이 혈류를 유지하기 위하여 혈관을 떠돌면서 출혈이 생기면 반응하여 응집, 지혈하는 역할을 한다. 또한, 수많은 단백질, 사이토카인 및 생물학적 활성 인자를 포함하고 있어 창상 치유를 개시하고 조절하는 것으로도 알려져 있다.
혈소판은 골수에서 생성되어 생체 내에서 약 7일간 생존하나 채혈 후에는 일반적으로 보관이 가능한 기간이 다른 혈액 산물보다 짧으며, 현재 상온의 교반기 내에서 최대 5일 정도의 보관만이 가능한 것으로 알려져 있다. 적혈구 등 다른 혈액 산물에 비해 혈소판의 보관 안정성이 더욱 저하되는 이유 중 하나는 혈소판에 존재하는 미토콘드리아에 의한 대사 작용이 계속적으로 일어나기 때문이며, 보존 시간이 경과함에 따라 pH 저하와 함께 ATP 감소를 보인다. 특히 대사를 억제하기 위해 저온에서 혈소판을 보존하게 되면 세포골격을 유지하지 못하고 변형되어 응집이 유발되고 냉동 후 해동 시 혈소판의 기능을 기대할 수 없다.
아울러, 혈액에서 혈소판을 분리하는 데 약 24~48시간이 소요되며, 상기 분리 시간을 제외하면 혈소판의 실질적인 저장 수명은 3~4일에 불과하다. 이러한 혈소판 제재는 급격한 혈소판의 감소가 유발된 환자의 출혈 예방이나 치료를 위해 사용되어 용도가 한정적이다. 따라서 혈액에서 채취한 혈소판 중 25%가 유효 기간을 넘겨 폐기되는 실정이다.
따라서, 자가조직 및 줄기세포 보다 수득이 용이하나 보관 및 용도가 한정적인 혈소판으로부터 질환 치료 목적으로 사용할 활성 미토콘드리아를 안정적으로 분리할 수 있는 기술 개발이 된다면 그 효과는 매우 클 것으로 기대된다.
US 2020-0246379 A1
McCully et al., Clin Trans Med., 5(16):1-13, 2016
이에 본 발명자들은 미토콘드리아 관련 질환 치료의 일환으로서 이식 치료를 위한 미토콘드리아의 안정적 수급을 위해 미토콘드리아의 획기적인 수득 방법을 연구한 결과, 혈소판을 확보하여 냉동 보관하고 이로부터 해동하여 수득한 미토콘드리아가 안정적으로 막전위를 유지하고 있을 뿐만 아니라, 미토콘드리아 기능장애 관련 질환, 구체적으로 염증성 질환을 우수하게 치료할 수 있는 활성을 가지고 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적 달성을 위해, 본 발명의 일 측면은, 혈액에서 분리된 혈소판을 냉동하거나 보관하는 단계; 냉동된 혈소판을 해동하는 단계; 및 해동된 혈소판을 파쇄하는 단계;를 포함하는 혈소판 유래 미토콘드리아의 수득 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 방법에 의해 수득된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능장애 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 냉동 혈소판으로부터 미토콘드리아를 수득하는 방법은 혈소판 파쇄를 용이하게 하여 활성이 안정적으로 유지된 미토콘드리아를 손쉽게 얻을 수 있을 뿐만 아니라 짧은 시간 동안 냉장 보관 후 폐기되는 공여 혈소판에 대한 상업적 가치를 제공할 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 수득된 혈소판 유래 미토콘드리아를 포함하는 약학 조성물은 미토콘드리아 기능장애로 인해 유발되는 다양한 질환 치료에 폭넓게 적용될 수 있으므로 상업적 이용가능성이 높을 것으로 기대된다.
도 1a는 본 발명에 따른 혈소판 유래 미토콘드리아의 수득 방법을 개략적으로 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 1b는 본 발명에 따라 수득된 혈소판 유래 미토콘드리아를 형광 염색한 사진이다. 이때, 사용된 표지자(Mitotracker Green)는 미토콘드리아에 축적되는 형광 염료이다.
도 2는 볼텍스(Vortex) 및 실린지(Syringe)를 이용한 기존 미토콘드리아 분리 방법 대비 냉동 및 해동을 추가로 실시한 본 발명에 따른 혈소판 유래 미토콘드리아의 수득 방법 결과를 비교하여 나타낸 도면이다. 여기에서, F는 냉동(freezing)이고, T는 해동(thawing)을 의미한다.
도 3은 혈소판의 분리 용액 및 냉동 조건에 따른 미토콘드리아 분리 수율을 나타낸 도면이다. 이때, LN2는 액체질소를 의미한다. 또한, SHE는 Sucrose-HEPES-EGTA 혼합 보존용액을 의미하며, TTG는 Trehalose-Tris-Glycine 혼합 보존용액을 의미한다.
도 4는 혈소판의 냉동 보관 기간에 따른 미토콘드리아 분리 수율 및 ATP 보존량을 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에 따라 수득된 혈소판 유래 미토콘드리아가 THP-1 인간 단핵구 세포에서 LPS (Lipopolysaccharide)에 의해 유발되는 활성산소의 발생을 억제하는 효과를 나타낸 도면이다.
도 6는 본 발명의 방법에 따라 수득된 혈소판 유래 미토콘드리아를 투여한 LPS 유발 염증 동물모델에서 개체 생존률을 확인한 도면이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하도록 한다.
미토콘드리아 보관 방법
본 발명의 일 측면은, 혈소판을 냉동하여 미토콘드리아를 안정적으로 보관하는 방법을 제공한다.
혈소판 유래 미토콘드리아의 수득 방법
본 발명의 일 측면은 냉동된 혈소판을 해동하는 단계; 및 해동된 혈소판을 파쇄하는 단계;를 포함하는 혈소판 유래 미토콘드리아의 수득 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "혈소판(platelet)"은 생체의 지혈기구에 있어서 중요한 역할을 하는 혈구 성분으로, 지름이 2 내지 3 ㎛이며, 정상인의 경우 혈소판의 수가 혈액 1 ㎕당 150,000~400,000이다. 또한, 혈소판은 점조성이 있으며, 형상은 조건에 따라 변하고, 손상 조직에 점착 및 응집하는 동시에 세포 내 성분을 방출시켜 일련의 응고 반응을 야기한다고 알려져 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "미토콘드리아(mitochondria)"는 세포 내 에너지 공급원인 아데노신 트라이포스페이트(ATP)의 합성 및 조절에 관여하는 진핵세포의 세포내 소기관으로, 생체 내 다양한 대사 경로, 예를 들어, 세포 신호처리, 세포 분화, 세포 사멸뿐만 아니라, 세포 주기 및 세포 성장의 제어와 연관이 있다.
상기 미토콘드리아는 포유동물로부터 수득된 것일 수 있으며, 인간으로부터 수득된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 미토콘드리아는 혈구 성분 중 혈소판으로부터 수득된 것일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 자가 또는 타가 혈소판에서 수득된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "혈구(blood corpuscle)"는 혈액 속에 함유되어 있는 적혈구, 백혈구, 혈소판 등의 세포 성분으로, 원심분리를 통하여 혈액에서 혈장과 혈구를 분리할 수 있으며, 적혈구와 백혈구, 혈소판 등의 혈구 성분은 원심분리관의 바닥으로 가라앉게 된다.
상기 혈구는 미토콘드리아를 보유하고 있는 혈구라면 모두 사용 가능하며, 특별히 제한되지 않는다.
또한, 상기 미토콘드리아 분리를 위한 혈소판이 함유된 혈액은 특별히 제한되지 않는 한 이식자(transplanter)와 동종 또는 이종의 혈액을 사용할 수 있으며, 자가 혈액을 사용할 수도 있다.
상기 혈소판 유래 미토콘드리아의 수득 방법은, 예를 들어, 특정 버퍼 용액을 사용하거나 전위차 및 자기장을 이용하는 등 공지된 다양한 방법을 통해 미토콘드리아를 수득할 수 있다.
구체적으로, 상기 미토콘드리아 수득 방법은 냉동된 혈소판을 해동하여 파쇄하고 원심분리하여 수득할 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아 수득 방법은 1) 혈소판을 냉동하는 단계; 2) 혈소판을 해동하는 단계; 및 3) 해동된 혈소판을 파쇄하는 단계로 수행될 수 있다.
일 구체예로, 전혈(whole blood) 시료를 제1차 원심분리하여 혈소판이 포함되어 있는 혈소판 풍부혈장(platelet-rich plasma, PRP)을 수득하는 단계; 상기 PRP를 제2차 원심분리하여 혈소판 펠렛(pellet)을 수득하는 단계; 상기 혈소판 펠렛을 버퍼 용액에 재현탁시켜 냉동하는 단계; 상기 냉동된 혈소판을 해동하는 단계; 상기 해동된 혈소판을 파쇄하는 단계; 미토콘드리아 외의 파쇄물을 제거하는 단계;로 수행될 수 있다. 이때, 제1차 원심분리에서 제2차 원심분리로 갈수록 원심분리 수행 시간을 늘리고 원심분리 속도를 높일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 미토콘드리아 외의 파쇄물을 제거하는 단계는 파쇄된 혈소판을 제3차 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 상기 수득한 상층액을 제4차 원심분리하여 미토콘드리아를 수득 및 정제하는 단계; 로 수행될 수 있다. 이때, 제3차 원심분리에서 제4차 원심분리로 갈수록 원심분리 수행 시간을 늘리고 원심분리 속도를 높일 수 있다.
상기 수득 방법에 의한 미토콘드리아의 분리는 해당 기술 분야에 공지된 분별원심 분리법(Differential centrifugation)에서 사용되는 다양한 원심력(g force) 및 시간의 변화를 통하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 제1차 원심분리는 100 내지 1,000×g, 또는 200 내지 700×g, 또는 300 내지 600×g의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제2차 원심분리는 100 내지 3,000×g, 또는 500 내지 2,800×g, 또는 800 내지 2,500×g의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제3차 원심분리는 800 내지 4,000×g, 또는 1,000 내지 3,000×g, 또는 1,200 내지 2,600×g의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제4차 원심분리는 100 내지 20,000×g, 또는 500 내지 18,000×g, 또는 800 내지 15,000×g의 속도로 수행될 수 있다.
또한, 상기 원심분리가 수행되는 시간은 1 내지 50분 동안 수행될 수 있으며, 원심분리 횟수 및 샘플의 함량 등에 따라 적절히 조정될 수 있다.
아울러, 상기 제3차 원심분리는 1 내지 30℃의 실온, 또는 2 내지 8℃의 냉장온도, 바람직하게는 3 내지 5℃의 온도에서 수행될 수 있으며, 제3차 원심분리를 통해 상층액을 수득함에 의해 파쇄된 혈소판으로부터 잔존세포 및 세포막 파쇄물 등, 즉 데브리(debris)를 제거할 수 있다.
또한, 상기 제4차 원심분리는 1 내지 30℃의 실온, 또는 2 내지 8℃의 냉장온도, 바람직하게는 3 내지 5℃의 온도에서 수행될 수 있으며, 제4차 원심분리를 통해 침전물(pellet)을 수득하고 이를 재현탁함에 의해 데브리(debris)가 제거된 혈소판 파쇄물로부터 미토콘드리아를 수득할 수 있다.
또한, 미토콘드리아는 혈소판 파쇄물을 제거하는 단계에서 원심분리, 필터(filter), 메시(mesh), 비드(bead)를 이용하여 수득 및 정제될 수 있다. 예컨대, 0.1 ㎛ 내지 40 ㎛ 기공 크기를 갖는 나일론 메시 필터, 항체가 부착된 마그네틱 비드(antibody conjugated magnetic bead)와 같이 면역학적방법으로 결합된 비드 등을 이용하여 미토콘드리아를 수득 및 정제할 수 있다.
한편, 상기 수득한 미토콘드리아를 제5차 원심분리하여 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 제5차 원심분리는 100 내지 20,000×g, 또는 500 내지 18,000×g, 또는 800 내지 15,000×g의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 1 내지 30℃의 실온, 또는 2 내지 8℃의 냉장온도, 바람직하게는 3 내지 5℃의 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 원심분리 수행 시간은 1 내지 50분 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
아울러, 상기 수득된 혈소판 유래 미토콘드리아의 안정화를 위하여 약학적으로 허용 가능한 당이 사용될 수 있다. 구체적으로, 수크로오스(sucrose), 만니톨(mannitol), 트리할로오스(trehalose) 등의 당일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, pH 완충제로서 이에 제한되지는 않으나, 약학적으로 혀용가능한 Tris, HEPES, phosphate 등이 사용될 수 있다.
한편, 상기 혈소판 유래 미토콘드리아 수득 후 이온(ion) 유출에 의한 손상을 제거하고, 산화 스트레스를 억제하기 위한, 킬레이터, 항산화제 등의 첨가제를 사용할 수 있으며, 이는 당업계에서 널리 알려진 시약을 제한없이 포함하여 사용할 수 있다. 예컨대, EDTA, EGTA, Citrate, Glycine, Taurine, ATP 등일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 미토콘드리아 수득 방법에 있어서, 냉동된 혈소판은 개체에서 수득한 혈소판을 냉동한 것일 수 있다.
상기 혈소판은 동일한 개체 또는 다른 개체로부터 수득하여 냉동한 것일 수 있다. 상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
또한, 상기 혈소판은 혈액, 배양혈액, 골수 또는 배양 거핵구 (megakaryocyte)로부터 분리된 혈소판을 냉동한 것일 수 있다. 미토콘드리아를 보유하고 있는 혈소판이라면 모두 사용 가능하며, 특별히 제한되지 않는다.
상기 냉동은 이에 제한되지는 않으나, -1℃이하 일 수 있다. 구체적으로, -5℃ 내지 -200℃, -15℃ 내지 -180℃, -25℃ 내지 -160℃, -40℃ 내지 -140℃, -55℃ 내지 -120℃, -60℃ 내지 -100℃, 또는 -70℃ 내지 -90℃의 온도 범위로 수행될 수 있다.
상기 냉동은 액체 질소(LN2) 또는 냉동 장치를 이용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 냉동(refrigeration) 또는 동결(freezing) 과정에서 LN2를 사용하여 급속 냉동하거나, 초저온냉동고(deep freezer), 냉동고, 냉동 컨테이너(freezing container) 등 냉동 장치를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 냉동은 혈소판을 냉동 또는 동결할 수 있는 방법인 한, 특별히 제한되지 않는다.
상기 냉동된 혈소판의 동결보존 기간은 급속 냉동 또는 냉동 직후부터, 냉동 상태를 유지할 수 있는 한계 기간까지 모두 포함한다. 즉, 냉동된 혈소판으로부터 정상적인 활성을 갖는 미토콘드리아가 분리될 수 있는 한, 동결보존 기간에 있어서 특별히 제한되지 않는다.
또한, 상기 혈소판의 동결보존 기간 또는 냉동보관 기간 동안 이에 제한되지는 않으나, 혈소판은 SHE(Sucrose-HEPES-EGTA) 용액, TTG(Trehalose-Tris-Glycine) 용액, TTGE(Trehalose-Tris-Glycine-EDTA) 용액 등의 혼합 보존용액 상에서 급속냉동 또는 냉동되어 보관될 수 있다. 소정의 기간 동안 냉동 보관된 혈소판에서 정상적인 활성을 갖는 미토콘드리아를 수득할 수 있는 한, 보존용액은 특별히 제한되지 않는다.
또한, 상기 보존용액에는 혈소판으로부터 수득하기 위한 미토콘드리아의 분리 수율을 증가시키고 기능 유지에 유효한 첨가제, 예컨대, 항산화제, ATP 등이 더 추가될 수 있다.
본 발명의 미토콘드리아 수득 방법에 있어서, 상기 냉동된 혈소판의 파쇄는 해동 단계를 거친 후 수행될 수 있다.
상기 해동은 상온에서 수행될 수 있다. 구체적으로, 0℃ 내지 37℃, 4℃ 내지 30℃, 8℃ 내지 28℃, 10℃ 내지 27℃, 12℃ 내지 26℃, 또는 15℃ 내지 25℃에서 수행될 수 있으나, 냉동된 혈소판이 융해(melting)되어 동결되어 있지 않은 상태로 되는 한, 특별히 제한되지 않는다.
또한, 상기 해동은 1분 내지 1시간, 1분 내지 50분, 1분 내지 40분, 1분 내지 30분, 1분 내지 20분, 1분 내지 10분, 또는 1분 내지 5분 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 미토콘드리아 수득 방법에 있어서, 상기 냉동 및 해동된 혈소판은 물리적 방법 또는 화학적 방법에 의해 추가로 파쇄될 수 있다. 구체적으로, 상기 파쇄는 볼텍스(vortex) 및/또는 실린지(syringe)를 통해 가해지는 전단응력(shear force)에 의한 물리적 방법으로 수행될 수 있다. 상기 실린지는 이에 제한되지는 않으나, 27G 또는 29G의 실린지를 사용할 수 있다. 또한, 초음파 파쇄기(sonicator), 균질기(homogenizer), 고압균질기(pressure homogenizer) 등 초음파 및 가압 방식 등을 이용한 장치에 의해 수행될 수 있다. 또한, 상기 파쇄는 단백질 분해 효소, 세제(detergent) 등을 이용한 화학적 방법으로 수행될 수도 있다. 상기 파쇄는 혈소판을 파쇄하여 미토콘드리아를 분리할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다.
상기 미토콘드리아 수득 방법에 있어서, 상기 혈소판은 파쇄 단계 전에 혈소판의 냉동 및 해동이 적어도 1회 더 수행될 수 있다. 상기 냉동 및 해동의 횟수는 혈소판으로부터 분리된 미토콘드리아가 정상적인 활성을 갖는 한, 특별히 제한되지 않는다.
혈소판 유래 미토콘드리아의 용도
본 발명의 다른 측면은 상기 수득 방법에 의해 수득된 혈소판 유래 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 이때, 약학 조성물의 용도는 미토콘드리아 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "미토콘드리아 관련 질환"은 유전적, 환경적 또는 원인 불명의 원인으로 인한 미토콘드리아 기능저하 또는 기능장애가 관련된 질환을 총체적으로 의미한다. 예컨대, 상기 질환에는 레버씨 선천성 시신경병증(Leber's Hereditary Optic Neuropathy; LHON), 레이 증후군(Leigh syndrome), 불균일 적색근육 섬유를 갖는 근간대성 간질(Myoclonic Epilepsy Associated with Ragged-Red Fibers; MERRF), 미토콘드리아 근병증, 뇌병증, 고젖산혈증, 뇌졸중(Mitochondrial Myopathy, Encephalopathy, Lactacidosis, Stroke; MELAS) 등의 유전 질환과 파킨슨, 알츠하이머와 같은 퇴행성 질환, 당뇨병, 비만과 같은 대사성 질환, 패혈증, 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환 등이 포함된다.
본 발명의 혈소판 유래 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 패혈증(KR 10-2019-0050017 A), 암(KR 10-2126199 B1), 심장질환, 류마티스 관절염(KR 10-2019-0094124 A), 허혈성 질환(KR 10-2019277 B1), 감염성 질환(KR 10-2018-0054523 A), 파킨슨병, 알츠하이머병 및 근질환(KR 10-2019-0090754 A)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나의 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
구체적으로, 상기 암은 이에 제한되지는 않으나, 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암, 림프종 등 일 수 있다.
또한, 상기 허혈성 질환은 이에 제한되지는 않으나, 중증하지허혈증, 허혈성 뇌졸중, 허혈성 심장질환, 허혈성 대장염 등 일 수 있다. 이때, 상기 허혈성 질환은 미토콘드리아 이상에 의해 발병하는 질환일 수 있으며, 미토콘드리아 기능 저하로 인해 발생하는 허혈성 세포 장애를 모두 포함한다.
또한, 상기 감염성 질환은 이에 제한되지는 않으나, B형 간염, C형 간염, 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus: HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 감염, 바이러스성 호흡기 질환, 인플루엔자 바이러스 감염 등일 수 있다.
또한, 상기 근질환은 이에 제한되지는 않으나, MELAS 증후군, MERRF 증후군, Kearns-Sayre 증후군, 근병증, 뇌근육병증, 근무력증, 중증 근무력증, 근위축성 측삭 경화증, 근육퇴행위축, 근위축증, 근긴장저하, 근력약화, 근경직증 등 일 수 있다. 이때, 상기 근질환은 미토콘드리아 기능 저하로 인해 발생하는 근육 세포 장애를 모두 포함할 수 있다.
뿐만 아니라, 상기 약학 조성물의 용도는 구체적으로 만성염증성질환, 급성염증성질환, 허혈성질환, 신경질환, 심장질환, 근질환, 퇴행성질환, 대사질환, 섬유화질환, 관절질환, 눈질환, 탈모, 면역관련질환의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있다.
본 발명의 혈소판 유래 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물에 있어서, 상기 미토콘드리아는 이에 제한되지는 않으나 0.1 내지 500 ㎍/㎖, 0.2 내지 450 ㎍/㎖ 또는 0.5 내지 400 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 범위로 미토콘드리아를 포함함으로써, 투여 시 미토콘드리아 용량 조절이 용이하고, 환자의 미토콘드리아 관련 질환, 구체적으로 염증성 질환의 증상 개선 정도가 보다 향상될 수 있다. 이때, 미토콘드리아의 용량은 상기 혈소판 유래 미토콘드리아의 막 단백질을 정량함으로써, 미토콘드리아를 정량할 수 있다. 구체적으로, 상기 분리된 미토콘드리아를 브래드포드 분석법(bradford protein assay)을 통해 정량할 수 있다[James D. McCully가 저술한 논문(J Vis Exp. 2014;(91): 51682)].
특히, 본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 투여할 개체의 체중을 기준으로 1회 0.01 내지 5 ㎎/㎏, 0.1 내지 4 ㎎/㎏ 또는 0.25 내지 2.5 ㎎/㎏ 양의 미토콘드리아를 투여할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 상기 약학 조성물이 미토콘드리아 관련 질환이 유발된 개체의 체중을 기준으로 상기 범위의 함량으로 미토콘드리아가 투여되는 것이 세포 활성 측면에서 가장 바람직하다.
또한, 상기 약학 조성물은 1회 내지 10회, 3회 내지 8회 또는 5회 내지 6회 투여할 수 있으며, 바람직하게는 5회 투여할 수 있다. 이때, 투여 간격은 1일 내지 7일 또는 2일 내지 5일 간격으로 할 수 있으며, 바람직하게는 3일 간격으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 미토콘드리아 관련 질환이 유발될 수 있거나, 그러한 질환 또는 질병을 앓고 있는 인간 또는 다른 포유동물에 대하여 투여될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 정맥 투여될 수 있는 주사제일 수 있고 또는 국소적으로 투여될 수 있는 주사제일 수 있으며, 바람직하게는 주사용 제제일 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 주사제 처방의 유통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여, 주사제로 사용 가능한 완충용액을 사용하여 pH를 조절함으로써, 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 주사용수를 포함할 수 있다. 상기 주사용수는 고형주사제의 용해나 수용성 주사제를 희석하기 위하여 만들어진 증류수로서, 글루코스 주사, 자일리톨 주사, D-만니톨 주사, 프룩토스 주사, 생리식염수, 덱스트란 40 주사, 덱스트란 70 주사, 아미노산 주사, 링거액, 락트산-링거액 또는 pH 3.5 내지 pH 8 범위의 트리스(Tris), HEPES, 구연산, 인산염 완충용액 또는 인산이수소나트륨-구연산 완충용액 등 일 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 안정화제 또는 용해보조제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 안정화제는 피로설파이트(pyrosulfite) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산(ethylene diaminetetraacetic acid)일 수 있고, 용해보조제는 염산, 아세트산, 인산수산화칼륨, 탄산수소칼륨, 탄산칼륨 또는 트리스(Tris)일 수 있다.
일 구체예로, 상기 약학 조성물은 TTG(Trehalose-Tris-glycine) 용액과 같은 혼합 보존용액을 포함할 수 있으며, 약학적으로 허용되는 약품제재에 통상적으로 이용될 수 있다. 상기 약학 조성물의 첨가제로서, 미토콘드리아의 기능 유지 및 활성에 유효한 항산화제, ATP, 마그네슘(magnesium) 등이 포함될 수도 있다.
또한, 본 발명은 전술한 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다. 여기서 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
상기 질환은 미토콘드리아 관련 질환으로, 구체적 질환은 전술한 바와 같다.
이때, 투여는 주사제를 통해 환부나 피하주사, 정맥 주사를 통해 투여될 수 있다. 이를 통해, 본 발명에 따른 약학 조성물은 질환이 발생한 환부에 직접적으로 정상적인 활성을 갖는 냉동된 혈소판 유래 미토콘드리아를 공급할 수 있어, 미토콘드리아 기능이 저하된 세포의 활성을 증가시키거나 미토콘드리아 기능 이상 세포 재생에 유용하며, 미토콘리아 관련 질환, 구체적으로 염증성 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
준비예 1. 혈소판 준비
K2-EDTA(dipotassium ethylenediaminetetraacetic acid)가 포함된 전혈을 500×g로 3분 동안 원심분리하여 혈소판 풍부혈장(platelet-rich plasma, PRP)이 포함된 상층액을 획득하였다. 획득한 상층액을 2,000×g로 5분 동안 원심분리하여 생성된 혈소판 침전물(pellet)을 수득하였다(도 1a). 상기 수득한 혈소판 침전물을 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)로 재현탁하였다.
수득한 DPBS로 재현탁된 혈소판 침전물에 대해 미토콘드리아 특이적 녹색 표지자인 Mitotracker Green으로 형광 염색하고, 이를 공초점 현미경을 이용하여 관찰하였다(도 1b).
실시예 1. 혈소판에서 미토콘드리아 수득
실시예 1.1. 혈소판의 냉동 및 해동 단계를 거치지 않은 미토콘드리아 분리
이후 혈소판에서 미토콘드리아를 분리하였다(도 1a). 구체적으로, 분리된 혈소판 침전물을 1분 동안 볼텍스(vortex) 및/또는 27G 또는 29G 실린지(syringe)만을 이용하여 물리적으로 파쇄하였다. 혈소판을 파쇄한 후, 5분 동안 2,000×g로 원심분리하였다. 이후 생성된 상층액을 12,000×g로 10분 동안 원심분리하였으며, 침전된 미토콘드리아를 수득하였다.
실시예 1.2. 혈소판의 냉동 및 해동 단계를 수행한 후 미토콘드리아 분리
실시예 1.1.과 같은 방법으로 혈소판에서 미토콘드리아를 분리하되, 혈소판 파쇄 전에 냉동 및 해동 단계를 추가적으로 수행하였다. 구체적으로, 상기 준비예 1의 방법으로 분리된 혈소판 침전물을 SHE 혼합 보존용액(0.25 M 수크로오스, 20 mM HEPES 완충액 (pH 7.4), 2 mM EGTA), TTG 혼합 보존용액(0.195 M 트리할로오스, 20 mM Tris, 65 mM 글라이신) 및 TTGE 혼합 보존용액(0.195 M 트리할로오스, 20 mM Tris 완충액, 65 mM 글라이신, 2 mM EDTA)으로 각각 재현탁하였다. 이후, LN2를 이용하여 급속냉동하거나, 냉동 컨테이너(freezing container, FC)를 사용 또는 사용하지 않는 조건으로 -80℃에서 냉동하였다.
상기 냉동된 혈소판을 상온에서 해동하고 분리된 혈소판 침전물을 1분 동안 볼텍스(vortex) 및/또는 27G 또는 29G 실린지(syringe)를 이용하여 물리적으로 파쇄하였다. 혈소판을 파쇄한 후, 5분 동안 2,000×g로 원심분리하였다. 이후 생성된 상층액을 12,000×g로 10분 동안 원심분리하였으며, 침전된 미토콘드리아를 수득하였다.
실시예 2. 혈소판의 냉동 및 해동 여부에 따른 미토콘드리아 기능 확인
실시예 2.1. 혈소판의 냉동 및 해동 단계를 거치지 않고 분리한 미토콘드리아의 특성 확인
실시예 1.1.에서 수득한 미토콘드리아를 BCA(Bicinchoninic Acid) 방법을 이용하여 미토콘드리아 단백질 농도를 측정하고, CellTiter-Glo luminescence kit(Promega, Madison, WI)를 이용하여 미토콘드리아 내 ATP의 양을 확인하였다. 또한, 수득한 미토콘드리아 특이적 황색 표지자인 Mitotracker Orange로 형광 염색하여 공초점 현미경으로 관찰하였으며, TMRE(Invitrogen, cat no. T669) 염료를 사용하여 미토콘드리아의 막전위를 측정하였다. 한편, CCK-8(Enzo Life science, cat no. ALX-850-039)를 이용하여 NADPH 탈수소효소(NADPH dehydrogenase; complex I)의 활성을 확인하였다(도 2).
실시예 2.2. 혈소판의 냉동 및 해동 단계를 수행한 후 분리한 미토콘드리아의 특성 확인
실시예 1.2.와 같은 방법을 통해 분리한 미토콘드리아를 실시예 2.1.에서 수행한 방법으로 미토콘드리아의 특성을 확인하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
실시예 3. 분리 용액 및 냉동 조건에 따른 미토콘드리아 기능 확인
상기 준비예 1.에서 수득한 혈소판 침전물을 SHE 혼합 보존용액 및 TTG 혼합 보존용액으로 각각 재현탁한 후, LN2를 이용하여 급속냉동하거나, 냉동 컨테이너(FC)를 사용 또는 사용하지 않는 조건으로 -80℃에서 냉동한 혈소판을 미토콘드리아 특이적 황색 표지자인 Mitotracker Orange로 형광 염색하고, 이를 공초점 현미경을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, SHE(Sucrose-HEPES-EGTA) 혼합 보존용액에서 냉동한 혈소판에 비해 TTG(Trehalose-Tris-Glycine) 혼합 보존용액에서 냉동한 혈소판의 미토콘드리아 분리 수율이 44% 증가함을 확인하였다. 또한, LN2를 이용한 급속냉동에 비해 냉동 컨테이너(FC)를 사용하여 -80℃에서 천천히 냉동한 경우에 혈소판의 미토콘드리아 분리 수율이 약 80% 증가함을 확인하였다(도 3).
또한, 혼합 보존용액(SHE 또는 TTG)에서 냉동 후 분리된 혈소판 유래 미토콘드리아는 주사기 파쇄법에 비해 높은 ATP 보존량을 보였고, 막전위 및 산화적인산화 1번 복합체(Complex 1)의 효소 활성도 높게 유지되었다.
실시예 4. 혈소판의 냉동 보관 기간에 따른 미토콘드리아 확인
혈소판의 냉동 보관 기간에 따른 미토콘드리아의 분리 수율, 농도를 확인하였다. 이때, 혈소판은 SHE 혼합 보존용액에서 냉동 컨테이너를 사용하여 -80℃에서 냉동한 조건의 혈소판을 사용하였다.
구체적으로, 5일 내지 109일간 냉동 보관한 혈소판을 미토콘드리아 특이적 황색 표지자인 Mitotracker Orange로 형광 염색하여 형광측정기로 측정하였다. 미토콘드리아 단백질 농도는 BCA 방법을 이용하여 측정하였다. 그 결과, 냉동 보관된 혈소판은 109일까지도 미토콘드리아의 분리 수율이 유지됨을 확인하였다(도 4).
실시예 5. 혈소판 유래 미토콘드리아의 활성산소 억제 효과 확인: In vitro
1% FBS (Fetal Bovine Serum)가 포함된 RPMI 1640 배지로 4×105개의 THP-1 인간 단핵구 세포를 배양하고, 16~24 시간 뒤에 상기 준비예 2.에서 수득한 혈소판 유래 미토콘드리아를 THP-1 세포에 처리하였다. 처리 30분 후 2 ㎍/㎖ 농도의 LPS(Lipopolysaccharid)를 처리하여 염증 세포모델을 구축하였다. 상기 LPS를 처리한 THP-1 세포는 24시간 뒤 세포막 투과성 활성산소 표시자인 DCF-DA(Dichlorofluorescin diacetate)로 염색하여 세포내 활성산소 측정하였다. 또한, 핵특이적 표시자인 Heochst 33432로 염색하여 세포수를 보정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
실시예 6. 혈소판 유래 미토콘드리아의 염증 억제 효과 확인: In vivo
청정구역(SPF Zone)에서 5주령 내지 8주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 1주일 간 적응시킨 후, 혈소판 유래 미토콘드리아 투여에 따른 염증 동물모델의 생존률 확인 실험을 진행하였다. 적응기간 동안 12시간 간격의 주야 주기로 마우스 서식 환경을 조성하고, 23±2℃의 실내 온도 및 40% 내지 60%의 습도가 유지되도록 하였다.
상기 적응기간을 거친 마우스에 LPS를 처리하여 염증 동물모델을 구축하였다. 이후, 실험군에 혈소판 유래 미토콘드리아 10 ㎍을 동시에, 30분 후에, 또는 3시간 후에 정맥주사로 투여하였다. 투여 후 생존률을 측정한 결과, 혈소판 유래 미토콘드리아의 투여에 의해 염증 동물모델의 개체 생존률이 크게 향상됨을 확인하였다. 특히, LPS와 미토콘드리아를 동시 투여한 경우 생존률이 80%로 가장 우수함을 확인하였다(도 6). 이때, 실험군에 투여한 미토콘드리아는 SHE 혼합 보존용액에서 냉동 컨테이너를 사용하여 -80℃에서 냉동한 혈소판으로부터 분리된 미토콘드리아를 사용하였다.

Claims (11)

  1. 삭제
  2. 냉동된 혈소판을 해동하는 단계; 및
    해동된 혈소판을 파쇄하는 단계;를 포함하는 혈소판 유래 미토콘드리아의 수득 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    미토콘드리아 외의 파쇄물을 제거하는 단계를 더 포함하는 것인, 혈소판 유래 미토콘드리아의 수득 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 해동은 0℃ 내지 37℃에서 수행하는 것인, 혈소판 유래 미토콘드리아의 수득 방법.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 해동은 1분 내지 1시간 수행하는 것인, 혈소판 유래 미토콘드리아의 수득 방법.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 파쇄물을 제거하는 단계는 원심분리, 필터, 메시(mesh), 비드(bead)를 이용하여 수행되는 것인, 혈소판 유래 미토콘드리아의 수득 방법.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 냉동된 혈소판은 개체에서 수득한 혈소판을 냉동한 것인, 혈소판 유래 미토콘드리아의 수득 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 냉동은 -1℃ 내지 -200℃의 온도 범위로 수행되는 것인, 혈소판 유래 미토콘드리아의 수득 방법.
  9. 제2항에 있어서,
    혈소판을 파쇄하는 단계 전에 혈소판의 냉동 및 해동이 적어도 1회 더 수행되는 것인, 혈소판 유래 미토콘드리아의 수득 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
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