CN111549062A - 家蚕基于CRISPR/Cas9***的全基因组敲除载体文库及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及家蚕基于CRISPR/Cas9***的全基因组敲除载体文库及构建方法，包含用于递送CRISPR/Cas9***的递送载体***piggyBac转座子载体***和家蚕全部编码蛋白的基因的打靶位点的sgRNA序列共同组成的载体文库pB‑CRISPR‑library。本发明基于piggyBac转座子***的强大的承载容量，可以将CRISPR/Cas9***的两个组成原件Cas9蛋白表达框和sgRNA表达框整合到一个载体上，同时该载体还包含筛选标记Zeocin抗性基因表达框，共同组成了一个用于家蚕的CRISPR/Cas9敲除的all‑in‑one载体pB‑CRISPR。

Description

家蚕基于CRISPR/Cas9***的全基因组敲除载体文库及构建 方法

技术领域

本发明属于真核生物基因敲除技术领域，涉及家蚕基于CRISPR/Cas9***的全基因组敲除载体文库及构建方法。

背景技术

家蚕不仅是重要的经济昆虫，也是鳞翅目模式生物。家蚕是最早完成全基因组测序的生物之一，家蚕基因组计划完成后，家蚕功能基因组研究就成为了家蚕研究领域的重要方向，目前已经建立了转基因、RNAi、基因编辑等遗传操作技术用于研究家蚕功能基因，但是，面对数以万计的家蚕编码蛋白基因的功能，传统的正向遗传学耗时耗力，迫切需要一种高通量研究手段来研究数量巨大的家蚕功能基因。

高通量RNAi是最早用于研究真核生物功能基因的高通量研究方法(PMID:25145850)，已经在人、鼠等物种取得了很多研究成果，但是RNAi天然存在的脱靶效应、无法完全敲除基因功能而只能敲低功能基因的mRNA表达水平等缺点，其高通量筛选研究受到限制。CRISPR/Cas9***是近年来开发出来的基因敲除技术，已经在包括人、鼠、果蝇、拟南芥、水稻等模式生物钟取得了显著成果，目前CRISPR/Cas9***在家蚕中的应用也已经取得了成功。

CRISPR/Cas9***是由两部分元件组成，用于执行核酸内切酶功能的Cas9蛋白和用于执行引导Cas9蛋白到打靶位点的功能的sgRNA。基于其设计和构建的简便性，CRISPR/Cas9***不仅能够实现单个基因的敲除，还可以非常方便地设计并构建用于全基因组敲除的sgRNA文库，从而实现全基因组编辑，目前，在真核生物中主要是运用慢病毒载体***来递送CRISPR/Cas9全基因组敲除文库。但是，慢病毒***有着固有的缺点，一、慢病毒载体承载容量有限，一般只能够携带几kbp的外源基因，而且随着***片段长度增加病毒滴度急剧降低，因此，慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因敲除***一般是先将Cas9表达框整合到宿主细胞的基因组上，然后再将sgRNA表达框整合到宿主细胞的基因组上，增加了构建CRISPR/Cas9基因敲除文库的周期、成本和难度；二、无法广泛应用于多种类型真核生物，主要应用在哺乳动物，慢病毒***无法在昆虫等物种中递送CRISPR/Cas9敲除文库。

piggyBac转座子是最初发现于鳞翅目昆虫，是真核生物的第二类转座子，以“剪切-黏贴”的模式来实现转座。piggyBac***的宿主范围广泛，从低昆虫哺乳动物均可实现高效转座，piggyBac转座子可以携带的外源基因片段极大，可达207kb。应用piggyBac***可以将Cas9蛋白表达框和sgRNA表达框构建到同一个piggyBac转座载体上，只需要一步转染就可以CRISPR***整合到宿主细胞的基因组上，极大缩短实验周期，降低实验成本和操作难度。由于piggyBac转座子是以“剪切-黏贴”的方式来实现来实现转座，因此可以通过控制转座子浓度等方式来控制piggyBac转座子***携带的外源基因整合到宿主细胞的拷贝数。

在家蚕中还没有任何高通量研究功能基因组的技术手段，构建家蚕基于piggyBac***和CRISPR/Cas9***的全基因组敲除的载体文库非常必要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种家蚕基于CRISPR/Cas9***的全基因组敲除载体文库及构建方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、家蚕基于CRISPR/Cas9***的全基因组敲除载体文库的构建方法，具体步骤如下：

(1)构建piggyBac转座子***介导的真核生物CRISPR/Cas9敲除载体，命名为pB-CRISPR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，将其作为骨架载体；

(2)设计敲除家蚕全部基因的sgRNA，其核苷酸序列是位于基因区符合NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG特征的序列；

(3)将步骤(2)的sgRNA整合到步骤(1)的骨架载体上，构建得到所述载体文库。

作为优选的技术方案之一，步骤(1)中，载体pB-CRISPR包括Hr3 CQ Enhancer-Hsp70启动子启动的spCas9蛋白编码序列，IE2启动子启动的Zeocin抗性蛋白编码序列，U6启动子启动的sgRNA表达框和piggyBac转座子的转座臂。

作为优选的技术方案之一，步骤(1)的具体方法是：

(1-1)合成包含Zeocin抗性基因表达框的载体PUC57-IE2-Zeocin-Ser1PA；

(1-2)将载体PUC57-IE2-Zeocin-Ser1PA上的Zeocin抗性基因表达框IE2-Zeocin-Ser1PA表达框连接到piggyBac转座子基础载体piggyBacModify上，构建成中间载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}；

(1-3)将hr3-hsp70-Cas9-sv40表达框从载体pUC57-hr3-hsp70-Cas9-sv40上扩增出来，然后用无缝克隆的方法连接到pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}上，构建成中间载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}{hr3-hsp70-Cas9-SV40}；

(1-4)将U6-gRNA从载体pUC57-U6-gRNA扩增出来，用酶切连接的方法连接到载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}{hr3-hsp70-Cas9-SV40}的AscI/NheI位点，构建成真核生物基因敲除基础载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}{U6-gRNA}{hr3-hsp70-Cas9-SV40}，命名为pB-CRISPR；

其中，载体PUC57-IE2-Zeocin-Ser1PA，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

piggyBac转座子基础载体piggyBacModify，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

中间载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

载体pUC57-hr3-hsp70-Cas9-sv40，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

载体PUC57-Hr3-Hsp70-Cas9-SV40，由pUC57-hA4-Cas9(PMID:24671069，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)将启动子A4更换为Hsp70得到；

中间载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}{hr3-hsp70-Cas9-SV40}，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

载体pUC57-U6-gRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

载体图谱如图1所示。

作为优选的技术方案之一，步骤(1)中，pB-CRISPR包含家蚕U6启动子和sgRNA的骨架，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

作为进一步优选的技术方案之一，基于家蚕U6启动子在第一个核苷酸为鸟嘌呤核苷酸“G”时的启动效率最高，全部sgRNA序列的5’端添加一个鸟嘌呤核苷酸“G”。

作为优选的技术方案之一，步骤(2)的具体方法是：基于spCas9作用规律，设计家蚕全部编码蛋白的基因的打靶位点，每个基因设计约6个打靶位点，总计94000个。

作为进一步优选的技术方案之一，所述打靶位点包括23个核苷酸，具有如下规律：

5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-NGG-3’，N表示碱基A、T、G或C，所有打靶位点尽量在CDS序列的前半部分，靠近PAM区的种子序列部分12bp核苷酸不能在基因组上有重复区域。

2、利用上述方法构建得到的家蚕基于CRISPR/Cas9***的全基因组敲除载体文库。

3、上述载体文库在家蚕基因组突变中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明包含用于递送CRISPR/Cas9***的递送载体***piggyBac转座子载体***和家蚕全部编码蛋白的基因的打靶位点的sgRNA序列共同组成的载体文库pB-CRISPR-library。

本发明基于piggyBac转座子***的强大的承载容量，可以将CRISPR/Cas9***的两个组成原件Cas9蛋白表达框和sgRNA表达框整合到一个载体上，同时该载体还包含筛选标记Zeocin抗性基因表达框，共同组成了一个用于家蚕的CRISPR/Cas9敲除的all-in-one载体pB-CRISPR。另外，基于piggyBac转座子***能够在家蚕中实现转座，本发明能够在家蚕中实现全基因组敲除。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为pB-CRISPR载体图谱，piggyBacL/piggyBacR，piggyBac转座臂；IE2，IE2启动子；Zeocin，Zeocin抗性基因；Ser1PA，家蚕丝胶1(Ser1)基因polyA；U6，家蚕U6启动子；Hr3-Hsp70，Hr3增强子和Hsp70启动子；spCas9，SpCas9蛋白；SV40PA，SV40 polyA。

图2为家蚕基于CRISPR/Cas9***的全基因组敲除的载体文库的建库流程。

图3为基于spCas9作用规律的家蚕全部编码蛋白的基因的打靶位点。表示设计不同数量sgRNA的基因的数量。

图4为筛选家蚕全部编码蛋白的基因的打靶位点，筛选标准是：1、所有打靶位点尽量在CDS序列的前半部分，2、靠近PAM区的种子序列部分12bp核苷酸不能在基因组上有重复区域。绝大多数蛋白的打靶位点为6个，总共设计94000个打靶位点。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例：

本实施例中所用到的家蚕胚胎细胞系(The Bombyx mori embryonic cell line,BmE)为生物实验中常用细胞系(PMID:17570024)。

1、本发明的目的是提供家蚕基于CRISPR/Cas9***的全基因组敲除的载体文库，建库流程如图2所示。

2、为了实现家蚕CRISPR/Cas9***的递送，本发明提供了一种基于piggyBac转座子***的递送载体pB-CRISPR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，载体图谱见图1。具体如下：

以piggyBac转座子***基础载体piggyBacModify(由金士瑞公司合成)为初始载体，构建一个piggyBac转座子***介导的家蚕CRISPR/Cas9基因敲除载体骨架，主要包含piggyBac转座臂(包含两个piggyBac转座子末端反向重复序列，inverted terminalrepeat,ITR)、筛选标记Zeocin抗性基因表达框、Cas9蛋白表达框、U6-gRNA表达框，命名为pB-CRISPR。

为了构建家蚕基于CRISPR/Cas9***的全基因组敲除的载体文库，本发明提供的递送载体pB-CRISPR包含家蚕U6启动子和sgRNA的骨架，序列如SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示。

3、构建两个载体用于后续建库实验。一个是含有U6启动子核苷酸序列的载体，命名为T-U6。其构建方法具体是设计一对引物：

U6-F，5’-AGCTGTCCAAGGAATGCGT-3’，如SEQ ID NO.11所示；

U6-R，5’-ATATACAAAATATCGTGCTCTACAAGT-3’，如SEQ ID NO.12所示；

以pB-CRISPR为模板扩增U6启动子序列，然后连接到T载体上，sanger测序验证正确性。第二个载体是含有sgRNA scaffold核苷酸序列的载体，命名为T-sgRNA scaffold。具体构建方法是设计一对引物：

sgRNA-scaffold-F，5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAA-3’，如SEQ ID NO.13所示；

sgRNA-scaffold-R，5’-GCTAAATCGATAAAGATCTTTCATT-3’，如SEQ ID NO.14所示；

以pB-CRISPR为模板扩增sgRNA scaffold序列，然后连接到T载体上，sanger测序验证正确性。PCR扩增酶是高保真热启动酶，反应总体系50μL，包括引物各1μL，模板1μL，2×酶预混液25μL，水22μL，反应条件如下：98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s；35个循环；72℃延伸10min；12℃保存。T载体选择全式金公司的Trans-T1载体，按照公式说明书操作，sanger测序由华大公司完成。

4、为了构建家蚕基于CRISPR/Cas9***的全基因组敲除的载体文库，本发明提供了基于spCas9作用规律的家蚕全部编码蛋白的基因的打靶位点的DNA序列，其特征在于，绝大多数蛋白的打靶位点为6个，包括23个核苷酸，其核苷酸具有如下规律：

5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-NGG-3’,所有打靶位点尽量在CDS序列的前半部分，靠近PAM区的种子序列部分12bp核苷酸不能在基因组上有重复区域，总共设计了94000个打靶位点。然后根据U6启动子的核苷酸序列和sgRNA scaffold的核苷酸序列，设计sgRNA的侧翼序列，其特征如下：5′-TACAA AATAT CGTGC TCTAC AAGTG NNNNN NNNNN NNNNN NNNNNGTTTT AGAGC TAGAA ATAGC AAGTT-3′，其中“N”为sgRNA序列，用基因芯片的方式合成全部sgRNA序列(包含侧翼区)，命名为单链寡核苷酸库(The pool of sgRNAoligonucleotides)，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.15。如图3和图4所示。

5、为了构建家蚕基于CRISPR/Cas9***的全基因组敲除的载体文库，基于家蚕U6启动子在第一个核苷酸为鸟嘌呤核苷酸“G”时的启动效率最高，本发明的载体库的全部sgRNA序列的5’端添加一个鸟嘌呤核苷酸“G”。

6、根据骨架载体pB-CRISPR载体序列、T-U6载体序列、T-sgRNA scaffold载体序列和The pool of sgRNA oligonucleotides序列，设计用于做搭桥PCR的引物，引物序列如下：

>KU-1R，5’-TCGATGATGATGATCAATTGTGGCGCGCCAAGCTGTCCAAGGAATGCGT-3’，如SEQID NO.16所示；

>DG-1R，5’-TTGTAGAGCACGATATTTTGTATAT-3’，如SEQ ID NO.17所示；

>DP-2F，5’-TCAATAGTTTAGTTTTTTTAGGTATATATACAAAATATCGTGCTCTACAA-3’，如SEQID NO.18所示；

>DP-2R，5’-AAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAA-3’，如SEQID NO.19所示；

>DG-3F，5’-TTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAA-3’，如SEQ ID NO.20所示；

>KU-1F，5’-ACCGATCGATCCTAGGCGCTAGCTAATGAAAGATCTTTATCGATTTAGC-3’如SEQID NO.21所示。

7、应用搭桥PCR方法，构建包含全部sgRNA库的U6-sgRNA文库片段。如图2所示。

1)以载体T-U6为模板，用引物KU-1R和DG-1R来扩增U6启动子片段，命名为DGP-1。PCR扩增酶是高保真热启动酶，反应总体系50μL，包括引物各1μL，模板1μL，2×酶预混液25μL，水22μL，反应条件如下：98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s；35个循环；72℃延伸10min；12℃保存，总共扩增30管。

2)以合成的单链寡核苷酸文库(The pool of sgRNA oligonucleotides)为模板用引物DP-2F和DP-2R来扩增sgRNA片段，命名为DGP-2。PCR扩增酶是高保真热启动酶，反应总体系50μL，包括引物各1μL，模板1μL，2×酶预混液25μL，水22μL，反应条件如下：98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s；35个循环；72℃延伸10min；12℃保存，总共扩增30管。

3)以载体T-sgRNA scaffold为模板，用引物DG-3F和KU-1F来扩增sgRNA scaffold片段，命名为DGP-3。PCR扩增酶是高保真热启动酶，反应总体系50μL，包括引物各1μL，模板1μL，2×酶预混液25μL，水22μL，反应条件如下：98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s；35个循环；72℃延伸10min；12℃保存，总共扩增30管。

4)以PCR片段DGP-1/DGP-2/DGP-3混合物为模板，用引物KU-1F和KU-1R来来进行搭桥PCR实验，扩增出包含sgRNA库的U6-sgRNA文库片段，命名为DGP-4。其中，DGP-1/DGP-2/DGP-3按照摩尔比1:1:1混合。PCR扩增酶是高保真热启动酶，反应总体系50μL，包括引物各1μL，模板1μL，2×酶预混液25μL，水22μL，反应条件如下：98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s；35个循环；72℃延伸10min；12℃保存，总共扩增50管。

8、将载体pB-CRISPR用AscI/NheI双酶切，回收12187bp的骨架用于下一步建库实验。其中，酶切条件为50μL体系，包含1μg载体，5μL的CutSmart缓冲液，AscI和NheI各1μL，酶切条件为37℃过夜。将片段DGP-4用AscI/NheI双酶切，其中，酶切条件为50μL体系，包含1μg的DGP-4片段，AscI和NheI各1μL，酶切条件为37℃过夜。

9、将步骤6描述的酶切完成的载体骨架和酶切完成的DGP-4片段按照摩尔比1:10混合后用DNA连接酶连接，然后要过柱方式纯化浓缩，用双蒸水溶解，溶解体积为30μL；然后通过电转方式建库，抽提质粒，完成建库，建库覆盖度大于100×。DNA连接酶为T4 DNA连接酶，连接总体系为50μL，其中骨架和片段按照摩尔比1:10添加，总质量为2μg，T4连接酶2.5μL，连接条件是16℃过夜连接。电转感受态为E.coli HST08 Premium Electro-Cells，电转仪器为Gene Pulser Xcell，电转50管。具体电转步骤按照公式提供说明书操作。

用梯度稀释的方法统计电转后单克隆的数量，保证单克隆数量能够满足建库最低要求，即单克隆数量>100×。

10、质粒抽提采用试剂盒抽提的方法，将抽提好的质粒全部混匀后取部分用设计好的引物扩增下来载体文库的sgRNA片段，建库后执行高通量测序，分析sgRNA丰度，检测文库质量。测序引物核苷酸序列如下：

正向引物>gD-F，5-NNNNNNNNNNNNTAAATCACGCTTTCAATA，N表示碱基A、T、G或C，如SEQ ID NO.22所示；

反向引物>gD-R，5-NNNNNNNNNNNNCGACTCGGTGCCACTTT，N表示碱基A、T、G或C，如SEQID NO.23所示。

载体文库质量分析如图3所示。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 家蚕基于CRISPR/Cas9***的全基因组敲除载体文库及构建方法

<130> 2020

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13408

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ggagatcggt acttcgcgaa 420

tgcgtcgaga taagagggtt aaaaaatata ttttacgcac catatacgca tcgggttgat 480

atcgttaata tggatcaatt tgaacagttg attaacgtgt ctctgctcaa gtctttgatc 540

aaaacgcaaa tcgacgaaaa tgtgtcggac aatatcaagt cgatgagcga aaaactaaaa 600

aggctagaat acgacaatct cacagacagc gttgagatat acggtattca cgacagcagg 660

ctgaataata aaaaaattag aaactattat ttaaccctag aaagataatc atattgtgac 720

gtacgttaaa gataatcatg cgtaaaattg acgcatgtgt tttatcggtc tgtatatcga 780

ggtttattta ttaatttgaa tagatattaa gttttattat atttacactt acatactaat 840

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tattttgtac tttaaaaaca gtcatgttgt attataaaat aagtaattag cttaacttat 1020

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aggccaccta ttcgtcctcc tactgcaggt catcacagaa cacatttggt ctagcgtgtc 1500

cactccgcct ttagtttgat tataatacat aaccatttgc ggtttaccgg tactttcgtt 1560

gatagaagca tcctcatcac aagatgataa taagtatacc atcttagctg gcttcggttt 1620

atatgagacg agagtaaggg gtccgtcaaa acaaaacatc gatgttccca ctggcctgga 1680

gcgactgttt ttcagtactt ccggtatctc gcgtttgttc ctgcaggatc atgatgataa 1740

acaatgtatg gtgctaatgt tgcttcaaca acaattctgt tgaactgtgt tttcatgttt 1800

gccaacaagc acctttatac tcggtggcct ccccaccacc aacttttttg cactgcaaaa 1860

aaacacgctt ttgcacgcgg gcccatacat agtacaaact ctacgtttcg tagactattt 1920

tacataaata gtctacaccg ttgtatacgc tccaaataca ctaccacaca ttgaaccttt 1980

ttgcagtgca aaaaagtacg tgtcggcagt cacgtaggcc ggccttatcg ggtcgcgtcc 2040

tgtcacgtac gaatcacatt atcggaccgg acgagtgttg tcttatcgtg acaggacgcc 2100

agcttcctgt gttgctaacc gcagccggac gcaactcctt atcggaacag gacgcgcctc 2160

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aatggccaag ttgaccagtg ccgttccggt gctcaccgcg cgcgacgtcg ccggagcggt 2340

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ggtcgtgtcc acgaacttcc gggacgcctc cgggccggcc atgaccgaga tcggcgagca 2580

gccgtggggg cgggagttcg ccctgcgcga cccggccggc aactgcgtgc acttcgtggc 2640

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aagattttaa atcttactta atgacttcga acgattttaa cgataacttt ctctttgttt 2760

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tttatttaat ttgttgcacc aaaactgata cattgacgaa acgcgtatgc tagcaatgaa 3060

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atgttaacat ttgataacga atcaaatata tttttaaact aattaaaaaa tccgatgtat 3240

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tgtgcggtat ttcacaccgc atcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct 3480

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atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 3600

gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc cacctgccat cacttgtaga gcacgatatt 3660

ttgtatatat acctaaaaaa actaaactat tgaaagcgtg atttacaaca acactcgact 3720

ttacaaagat tattcaaaaa gagcaaaaac tcttaacata ttctattaaa gatatataat 3780

ataattaaaa cgaaattaaa taataacaat aaaaccttta gaatttgtaa taaaatccat 3840

aaaaacaaat gaaaacagtt atggtttgta cagcgccatc tgttattact ttgacaaaat 3900

cactatgact atctgacctt gtcttacacg ttaacaattc ttattctgtc cttatctata 3960

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tatgtactta tttaatatta ataagtacta attgttaaaa tcatctaaaa caattcagtg 4080

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aagattgagg cgtttgaaat gtattgctgg agaaagctgc tacgcattcc ttggacagct 4260

tggcgcgccc agcgtcgtga aaagaggcaa tgacaaatac aaaacgacgt atgagcagac 4320

ccgtcgccaa gacgggtcta cctctaagat gatgtcattt gttttttaaa actaactcgc 4380

tttacgagta gaattctacg tgtaaaacat aatcaagaga tgatgtcatt tgtttttcaa 4440

aaccaaactc gctttacgag tagaattcta cgtgtaaaac acaatcaaaa gatgatgtca 4500

ttcgtttttc aaaaccgaat ttaagaaatg atgtcatttg tttttcaaaa ccaaactcgc 4560

tttacgagca gaattctacg tgtaaaacac aatcaagaga tgatgtcatt tgtttttcaa 4620

aactgaatga tgtcatttgt ttttcaaaac taaacttgct ttgcgagtag aattctacgt 4680

gtaaaacaca gtcaagagat gatgtcattt gtttttcaaa actgaaccgg ctttacgagt 4740

agaattctac ttgtaaaaca taatcaagag atgatgtcat ttgtttttca aaactgaact 4800

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ctgatgtcat ttgttttcga cataaaatgt ttatacaatg gaatcttctt gtaaattatc 5040

caaataatat aatttatccg attctacgtt acatttaaat tcgttgttat cgtacaattc 5100

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gggacgtcga ccgagaaatt tctctggccg ttattcgtta ttctctcttt tctttttggg 5280

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tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg 12960

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gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga 13200

atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg 13260

agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt 13320

ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa 13380

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<210> 2

<211> 1383

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

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tgttgaactg tgttttcatg tttgccaaca agcaccttta tactcggtgg cctccccacc 180

accaactttt ttgcactgca aaaaaacacg cttttgcacg cgggcccata catagtacaa 240

actctacgtt tcgtagacta ttttacataa atagtctaca ccgttgtata cgctccaaat 300

acactaccac acattgaacc tttttgcagt gcaaaaaagt acgtgtcggc agtcacgtag 360

gccggcctta tcgggtcgcg tcctgtcacg tacgaatcac attatcggac cggacgagtg 420

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cacgaggcgc ccgtcccgct tatcgcgcct ataaatacag cccgcaacga tctggtaaac 600

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taacgataac tttctctttg tttaacttta atcagcatac ataaaaagcc ccggttttgt 1140

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tggttttcct ttaccaaaga cccctttaag atgggcctaa tgggcttaag tcgagtcctt 1260

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tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

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gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 2940

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cttatcgata cgcgtacggc gcgcctaggc cggccgatct cggatctgac aatgttcagt 3060

gcagagactc ggctacgcct cgtggacttt gaagttgacc aacaatgttt attcttacct 3120

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<212> DNA

<213> Artificial

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tctcaagagt gatggtttcg ccaacagaaa ttttatgcaa ctcatacacg atgacagctt 6660

aacattcaag gaagatatcc aaaaagcaca ggtgtcggga cagggcgaca gtttgcacga 6720

acatattgct aacctcgccg gctccccggc gataaaaaag ggtatccttc agactgtgaa 6780

agtcgtagat gaactggtga aggttatggg tcgtcataaa cccgagaaca tagttatcga 6840

aatggctagg gagaatcaaa caactcagaa gggacagaaa aactcaagag aacgcatgaa 6900

gcgcattgaa gagggtatca aagagcttgg cagtcaaatc ctgaaggaac accctgtcga 6960

gaacacgcaa cttcagaacg aaaaattgta cctctactat ctgcagaatg gtagagatat 7020

gtacgtagac caagaattgg atattaaccg cctctcagat tacgacgtgg atcatatagt 7080

tccgcagtca ttcttgaagg atgactctat cgacaacaaa gtcctcacaa gatcagacaa 7140

gaaccgcgga aaatcagata atgtaccctc tgaagaggtg gttaaaaaga tgaaaaacta 7200

ctggagacag ttacttaacg ctaagttgat cacgcaaaga aagttcgata acctcacaaa 7260

ggctgaacgc ggcggtttaa gcgagcttga caaggccggt ttcataaaac gtcagttagt 7320

cgaaaccagg caaattacga aacacgtagc ccaaatattg gattcccgca tgaacactaa 7380

atacgatgaa aatgacaagc tcatccgtga ggtcaaagta attaccctga aaagcaagtt 7440

ggtgtccgac ttcagaaagg atttccagtt ctacaaagtt cgcgaaatca acaactacca 7500

ccatgcacat gacgcttacc tgaacgcagt cgtaggcact gcgttaatta aaaagtaccc 7560

taaactggaa tctgagttcg tgtacggtga ctataaagtg tacgatgtta gaaagatgat 7620

cgctaaaagc gaacaggaga ttggaaaggc taccgccaag tatttctttt actccaacat 7680

catgaatttc tttaagaccg aaatcacgtt agcaaatggc gagatacgta aaaggccact 7740

tatcgaaaca aacggagaaa ctggcgagat agtgtgggac aagggtagag attttgccac 7800

tgtccgcaaa gtactgtcga tgccgcaagt gaatatcgtt aaaaagaccg aagttcaaac 7860

gggaggcttc agcaaagagt ccatcctgcc caagcgtaac agtgataaat tgatagctag 7920

gaaaaaggac tgggatccta aaaagtatgg tggattcgac agcccaactg tcgcatactc 7980

cgtattggtg gttgcgaaag tcgaaaaagg aaagagcaaa aagctcaagt ccgtaaaaga 8040

gctgttgggc attaccataa tggaaagatc atctttcgag aagaatccta tcgattttct 8100

ggaagccaag ggatataaag aggtcaaaaa ggacctcata atcaagttac caaaatacag 8160

tctgttcgaa ttggagaacg gcagaaaacg catgcttgca tcagcgggtg aactgcaaaa 8220

gggaaatgag ttagcacttc cttctaaata cgtcaacttc ctgtatttgg cgtcacacta 8280

cgaaaaactg aagggctctc cagaagataa cgagcaaaag cagttatttg tggaacagca 8340

caaacattac cttgacgaaa ttatagagca aatctcggag ttcagtaaga gagtgatttt 8400

ggctgacgcc aatcttgata aagttctgtc tgcttacaac aagcaccgtg ataaaccgat 8460

tagggaacag gccgagaaca tcatacatct cttcacactc actaaccttg gtgcacccgc 8520

agcgttcaaa tattttgaca ccacgataga tcgtaagagg tacaccagca cgaaagaagt 8580

tttggacgcg acactcatcc atcaatcaat cacgggcctg tacgagacca gaatcgacct 8640

gtcccagctc ggtggcgact agcggccgcg actctagatc ataatcagcc atgcggccgc 8700

gactctagac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc 8760

tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata 8820

atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 8880

attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta aagcttatcg atacgcgtac 8940

ctaggccggc cgatctcgga tctgacaatg ttcagtgcag agactcggct acgcctcgtg 9000

gactttgaag ttgaccaaca atgtttattc ttacctctaa tagtcctctg tggcaaggtc 9060

aagattctgt tagaagccaa tgaagaacct ggttgttcaa taacattttg ttcgtctaat 9120

atttcactac cgcttgacgt tggctgcact tcatgtacct catctataaa cgcttcttct 9180

gtatcgctct ggacgtcatc ttcacttacg tgatctgata tttcactgtc agaatcctca 9240

ccaacaagct cgtcatcgct ttgcagaaga gcagagagga tatgctcatc gtctaaagaa 9300

ctacccattt tattatatat tagtcacgat atctataaca agaaaatata tatataataa 9360

gttatcacgt aagtagaaca tgaaataaca atataattat cgtatgagtt aaatcttaaa 9420

agtcacgtaa aagataatca tgcgtcattt tgactcacgc ggtcgttata gttcaaaatc 9480

agtgacactt accgcattga caagcacgcc tcacgggagc tccaagcggc gactgagatg 9540

tcctaaatgc acagcgacgg attcgcgcta tttagaaaga gagagcaata tttcaagaat 9600

gcatgcgtca attttacgca gactatcttt ctagggttaa aaaagatttg cgctttactc 9660

gacctaaact ttaaacacgt catagaatct tcgtttgaca aaaaccacat tgtggccaag 9720

ctgtgtgacg cgacgcgcgc taaagaatgg caaaccaagt cgcgcgagcg tcgactctag 9780

aggatccccg ggtaccgagc tcgaattcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa 9840

attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct 9900

ggggtgccta atgagtgagc taactcacat cggatgccgg gaccgacgag tgcagaggcg 9960

tgcaagcgag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc 10020

tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat 10080

gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc 10140

tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 10200

ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 10260

cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 10320

gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 10380

tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 10440

agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 10500

tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 10560

cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 10620

ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 10680

ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 10740

ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 10800

ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 10860

cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 10920

gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 10980

atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 11040

ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 11100

gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 11160

tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 11220

ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 11280

taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 11340

gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 11400

gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 11460

ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 11520

aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 11580

gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 11640

cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 11700

actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 11760

caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 11820

gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 11880

ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 11940

caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 12000

tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 12060

gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 12120

cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 12180

ataggcgtat cacgaggccc tttcgtc 12207

<210> 8

<211> 3947

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 8

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgccaagctc gcttgcacgc ctctgcactc gtcggtcccg gcatccgatg 2280

acccaatctc gagttgctag caatgaaaga tctttatcga tttagccaaa agcaaaagct 2340

tgaccaaaaa taggataata tttgtttttt tatttaaaaa aataaacaat tttttataca 2400

taaactgttt atctagtatt aatatttatg ttaacatttg ataacgaatc aaatatattt 2460

ttaaactaat taaaaaatcc gatgtatgtt ataaaattgt tctagaaaaa aagcaccgac 2520

tcggtgccac tttttcaagt tgataacgga ctagccttat tttaacttgc tatttctagc 2580

tctaaaacac tggcaggtgt cttgacgagt tcttctgaat tattaacgct tacaatttcc 2640

tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcatc aggtggcact 2700

tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg 2760

tatccgctca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga 2820

agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgccac 2880

ctgccatcac ttgtagagca cgatattttg tatatatacc taaaaaaact aaactattga 2940

aagcgtgatt tacaacaaca ctcgacttta caaagattat tcaaaaagag caaaaactct 3000

taacatattc tattaaagat atataatata attaaaacga aattaaataa taacaataaa 3060

acctttagaa tttgtaataa aatccataaa aacaaatgaa aacagttatg gtttgtacag 3120

cgccatctgt tattactttg acaaaatcac tatgactatc tgaccttgtc ttacacgtta 3180

acaattctta ttctgtcctt atctataagc caagtaccaa gcttaaattc gtatggctta 3240

tagttgacga tttttaaatt ctcaaggtat gtacttattt aatattaata agtactaatt 3300

gttaaaatca tctaaaacaa ttcagtgatt tacaacaatg tgtactacat aacctaatac 3360

ttataaattt attaaactgt attgattctt ttaggtcaat catcatgact ttaggagact 3420

tggtgtctca ggaaaaagga acgcaaaaag attgaggcgt ttgaaatgta ttgctggaga 3480

aagctgctac gcattccttg gacagcttgg cgcgccatct cgacgcattc gcgaagtacc 3540

gatctccaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac 3600

ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc 3660

ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg 3720

gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac 3780

aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc 3840

gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg 3900

gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcga 3947

<210> 9

<211> 619

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 9

agctgtccaa ggaatgcgta gcagctttct ccagcaatac atttcaaacg cctcaatctt 60

tttgcgttcc tttttcctga gacaccaagt ctcctaaagt catgatgatt gacctaaaag 120

aatcaataca gtttaataaa tttataagta ttaggttatg tagtacacat tgttgtaaat 180

cactgaattg ttttagatga ttttaacaat tagtacttat taatattaaa taagtacata 240

ccttgagaat ttaaaaatcg tcaactataa gccatacgaa tttaagcttg gtacttggct 300

tatagataag gacagaataa gaattgttaa cgtgtaagac aaggtcagat agtcatagtg 360

attttgtcaa agtaataaca gatggcgctg tacaaaccat aactgttttc atttgttttt 420

atggatttta ttacaaattc taaaggtttt attgttatta tttaatttcg ttttaattat 480

attatatatc tttaatagaa tatgttaaga gtttttgctc tttttgaata atctttgtaa 540

agtcgagtgt tgttgtaaat cacgctttca atagtttagt ttttttaggt atatatacaa 600

aatatcgtgc tctacaagt 619

<210> 10

<211> 82

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 10

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgctttt tt 82

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 11

agctgtccaa ggaatgcgt 19

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 12

atatacaaaa tatcgtgctc tacaagt 27

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 13

gttttagagc tagaaatagc aagttaaa 28

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 14

gctaaatcga taaagatctt tcatt 25

<210> 15

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(45)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 15

tacaaaatat cgtgctctac aagtgnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngtttt agagctagaa 60

atagcaagtt 70

<210> 16

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 16

tcgatgatga tgatcaattg tggcgcgcca agctgtccaa ggaatgcgt 49

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 17

ttgtagagca cgatattttg tatat 25

<210> 18

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 18

tcaatagttt agttttttta ggtatatata caaaatatcg tgctctacaa 50

<210> 19

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 19

aagttgataa cggactagcc ttattttaac ttgctatttc tagctctaa 49

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 20

ttagagctag aaatagcaag ttaaa 25

<210> 21

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 21

accgatcgat cctaggcgct agctaatgaa agatctttat cgatttagc 49

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 22

nnnnnnnnnn nntaaatcac gctttcaata 30

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 23

nnnnnnnnnn nncgactcgg tgccacttt 29

Claims (9)

1.家蚕基于CRISPR/Cas9***的全基因组敲除载体文库的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)构建piggyBac转座子***介导的真核生物CRISPR/Cas9敲除载体，命名为pB-CRISPR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，将其作为骨架载体；

(2)设计敲除家蚕全部基因的sgRNA，其核苷酸序列是位于基因区符合NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG特征的序列；

(3)将步骤(2)的sgRNA整合到步骤(1)的骨架载体上，构建得到所述载体文库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，载体pB-CRISPR包括Hr3CQ Enhancer-Hsp70启动子启动的spCas9蛋白编码序列，IE2启动子启动的Zeocin抗性蛋白编码序列，U6启动子启动的sgRNA表达框和piggyBac转座子的转座臂。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法是：

(1-1)合成包含Zeocin抗性基因表达框的载体PUC57-IE2-Zeocin-Ser1PA；

(1-2)将载体PUC57-IE2-Zeocin-Ser1PA上的Zeocin抗性基因表达框IE2-Zeocin-Ser1PA表达框连接到piggyBac转座子基础载体piggyBacModify上，构建成中间载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}；

(1-3)将hr3-hsp70-Cas9-sv40表达框从载体pUC57-hr3-hsp70-Cas9-sv40上扩增出来，然后用无缝克隆的方法连接到pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}上，构建成中间载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}{hr3-hsp70-Cas9-SV40}；

(1-4)将U6-gRNA从载体pUC57-U6-gRNA扩增出来，用酶切连接的方法连接到载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}{hr3-hsp70-Cas9-SV40}的AscI/NheI位点，构建成真核生物基因敲除基础载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}{U6-gRNA}{hr3-hsp70-Cas9-SV40}，命名为pB-CRISPR；

其中，载体PUC57-IE2-Zeocin-Ser1PA，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

piggyBac转座子基础载体piggyBacModify，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

中间载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

载体pUC57-hr3-hsp70-Cas9-sv40，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

中间载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}{hr3-hsp70-Cas9-SV40}，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

载体pUC57-U6-gRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，pB-CRISPR包含家蚕U6启动子和sgRNA的骨架，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，基于家蚕U6启动子在第一个核苷酸为鸟嘌呤核苷酸“G”时的启动效率最高，全部sgRNA序列的5’端添加一个鸟嘌呤核苷酸“G”。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)的具体方法是：基于spCas9作用规律，设计家蚕全部编码蛋白的基因的打靶位点，每个基因设计约6个打靶位点，总计94000个。

7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述打靶位点包括23个核苷酸，具有如下规律：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-NGG-3’，N表示碱基A、T、G或C，所有打靶位点尽量在CDS序列的前半部分，靠近PAM区的种子序列部分12bp核苷酸不能在基因组上有重复区域。

8.利用权利要求1～7中任一项所述方法构建得到的家蚕基于CRISPR/Cas9***的全基因组敲除载体文库。

9.权利要求8所述载体文库在家蚕基因组突变中的应用。

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