CN107043782A - 一种基因敲除方法及其sgRNA片段与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基因敲除方法及其sgRNA片段与应用，该基因敲除方法包括分别获得表达Cas9和sgRNA的转基因生物，再将两种转基因生物杂交，获得共表达阳性个体。本发明简化了载体构建技术，提高了注射效率，对靶标序列的编辑可以在受精完成后持续进行，因而保证了编辑效率。

Description

一种基因敲除方法及其sgRNA片段与应用
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，特别是涉及一种基因敲除方法及其sgRNA片段与应用。
背景技术
CRISPR/Cas9基因编辑技术是细菌和古细菌在噬菌体长期选择压力下进化出来的一种有效抵御外源DNA和病毒入侵的免疫机制，是由一段RNA通过碱基互补配对识别DNA，指导Cas9核酸内切酶切割识别的外源双链DNA，诱发同源重组或非同源末端连接，进而实现在目的DNA上进行编辑。CRISPR-Cas***对DNA分子的靶向切割特性，使其可以被用于定向的基因修饰。2012年，Doudan研究小组首次将crRNAs：tracrRNA二元复合体改造为单链RNA嵌合体，并指导Cas9蛋白在特定位点剪切。目前，CRISPR-Cas9已经在人类细胞、小鼠、斑马鱼、果蝇、拟南芥等生物中成功实现了基因组定点修饰。尽管ZFN、和TALEN技术也具有高效的基因编辑效率，但CRISPR/Cas9定点基因编辑方面有独特优势。首先，CRISPR/Cas9的靶点在基因组中分布频率高，几乎每8bp就有一个靶点，TALEN的靶点在基因组的分布频率大概是1/125bp，而ZFN每500bp才有一个合适的靶点，CRISPR/Cas9***更容易在需要突变的点附近筛选到高效的靶点。其次，CRISPR/Cas9在引入定点***时比ZFN和TALEN具有更精确的优势，这是由于Cas9切割DNA两条链的功能分别属于两个功能域，通过突变其中的一个功能域使Cas9变成只切割一条链的切口酶，同时引入修复模板，这样大大降低了天然Cas9切割双链引入随机突变的概率。因此，CRISPR/Cas9基因编辑技术在研究基因的功能方面具有得天独厚的优势。
但现有基因编辑技术的编辑效率较低，操作较为复杂，亟待改进。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基因敲除方法及其sgRNA片段与应用，用于解决现有技术中基因编辑的效率较低等问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种基因敲除方法，包括分别获得表达Cas9和sgRNA的转基因生物，再将两种转基因生物杂交，获得共表达阳性个体。
在本发明的一些实施例中，所述sgRNA含有如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示序列中的至少一种。
在本发明的一些实施例中，所述生物为家蚕，家蚕的中文学名为桑蚕，拉丁学名Bombyx mori Linnaeus，是一种以桑叶为食料的鳞翅目泌丝昆虫，属无脊椎动物，节肢动物门蚕蛾科蚕蛾属桑蚕种；将Cas9载体和sgRNA载体分别导入家蚕胚胎中，得到对应的目标转基因家蚕，将获得的目标转基因家蚕杂交，获得共表达阳性个体。
在本发明的一些实施例中，利用piggyBac重组表达载体将Cas9基因和sgRNA分别整合至家蚕基因组，含有Cas9基因的piggyBac重组表达载体由含有Cas9基因的表达盒***到载体pBac[3×P3-EGFP]的BglⅡ酶切位点得到，含有sgRNA的piggyBac重组表达载体由含有sgRNA的表达盒***到载体pBac[3×P3-DsRed]的BglⅡ酶切位点得到。
在本发明的一些实施例中，包括将表达盒IE1-Cas9-SV40***到最终载体pBac[3×P3-EGFP]，得到重组表达载体pBac[3×P3-EGFP+IE1-Cas9-SV40]，将上述重组表达载体与辅助质粒混合，将混合液注射至蚕蛾的卵中，孵化得到G0代蚁蚕，蚁蚕羽化成蚕蛾蚕蛾回交或自交，得到G1代蛾圈，取G1代蛾圈中阳性转基因系家蚕，培育至羽化，自交选纯，获得表达Cas9蛋白的转基因家蚕；将内源性基因序列接入家蚕内源性U6启动子后，再将sgRNA序列连接至U6启动子，获得U6-sgRNA表达盒，将U6-sgRNA表达盒***到载体pBac[3×P3-DsRed]，得到重组表达载体，将上述重组表达载体与辅助质粒混合，将混合液注射至蚕蛾的卵中，孵化得到G0代蚁蚕，蚁蚕羽化成蚕蛾蚕蛾回交或自交，得到G1代蛾圈，取G1代蛾圈中阳性转基因系家蚕，培育至羽化，自交选纯，获得表达sgRNA的转基因家蚕；将表达Cas9蛋白的转基因家蚕与表达sgRNA的转基因家蚕杂交，获得共表达阳性个体。
本发明第二方面提供一种sgRNA片段，含有如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示序列中的至少一种。
本发明第三方面提供含有上述sgRNA片段的重组载体、基因表达盒、转基因细胞系或转基因个体。
本发明第四方面提供一种含有上述sgRNA片段的CRISPR/Cas9载体，包括Cas9表达载体以及含有上述sgRNA片段的表达载体，该载体可以为基于piggy Bac转座载体的Cas9蛋白表达载体。
在本发明的一些实施例中，所述Cas9表达载体的启动子选自BmNPV极早期启动子IE1。
在本发明的一些实施例中，所述sgRNA表达载体的启动子选自U6启动子。
在本发明的一些实施例中，Cas9表达载体是以眼和神经特异的启动子3×P3启动的绿色荧光蛋白作为表达盒，绿色荧光蛋白作为筛选标记，筛选标记后含有启动Cas9基因表达的IE1启动子；sgRNA表达载体是以眼和神经特异的启动子3×P3启动的红色荧光蛋白作为表达盒，红色荧光蛋白作为筛选标记，筛选标记后含有启动sgRNA基因表达的U6启动子。
在本发明的一些实施例中，所述Cas9表达载体是以眼和神经特异的启动子3×P3启动的加强型绿色荧光蛋白EGFP作为表达盒，加强型绿色荧光蛋白作为筛选标记，筛选标记后含有启动Cas9基因表达的IE1启动子。
在本发明的一些实施例中，所述sgRNA表达载体是含有以眼和神经特异的启动子3×P3启动的红色荧光蛋白作为表达盒，红色荧光蛋白作为筛选标记，筛选标记后含有启动sgRNA基因表达的U6启动子。
本发明第五方面提供上述sgRNA片段及其CRISPR/Cas9载体在基因敲除中的应用。
如上所述，本发明的一种基因敲除方法及其sgRNA片段与应用，具有以下有益效果：本发明简化了载体构建技术，提高了注射效率，对靶标序列的编辑可以在受精完成后持续进行，因而保证了编辑效率。
附图说明
图1显示为表达载体pBac[3×p3-EGFP+IE1-Cas9-SV40]载体示意图。
图2显示为表达载体pBac[3×P3-DsRed+U6-sgRNA]载体示意图。
图3显示为表达载体pBac[3×p3-EGFP+IE1-Cas9-SV40]获得的表达Cas9的转基因家蚕品系各时期荧光图。
图4显示为表达载体pBac[3×P3-DsRed+U6-BmDES3sgRNA1]获得的表达sgRNA的转基因家蚕品系各时期荧光图。
图5显示为表达Cas9的转基因家蚕品系Cas9蛋白表达图。
图6a显示为Cas9表达品系与sgRNA1表达品系，在转录水平检测Cas9表达水平和在基因组水平U6-sgRNA1检测图。
图6b显示为Cas9表达品系与sgRNA2表达品系，在转录水平检测Cas9表达水平和在基因组水平U6-sgRNA2检测图。
图7显示为BmDES3基因靶点1的基因编辑示意图。
图8显示为BmDES3基因靶点2的基因编辑示意图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
Piggy Bac转座子是在粉纹夜蛾中发现的一类转座子，Piggy Bac转座***介导的外源基因***其能够识别基因组上的TTAA位点并携带外源基因***，并且可以稳定遗传，被广泛应用于多个物种的转基因研究。在家蚕中，Piggy Bac转座子介导的外源基因***技术被广泛用于基因功能的研究。
实施例一
基于piggy Bac转座载体的Cas9表达载体pBac[3×p3-EGFP+IE1-Cas9-SV40]的构建。
图1显示为表达载体pBac[3×p3-EGFP+IE1-Cas9-SV40]载体示意图。
Cas9基因来自载体pHsp70-Cas9(购自ADDGENE公司，网址：www.addgene.org/)，Cas9基因序列如SEQ ID No.1所示。
将Cas9基因***到出发载体pSL1180的多克隆位点，得到中间载体，然后将完整的含有Cas9基因的表达盒IE1-Cas9-SV40***到最终载体pBac[3×P3-EGFP]得到重组表达载体。
具体操作方法：
步骤S1、制备载体pSL1180[Cas9-SV40]
将Cas9基因通过ClaⅠ/XbaⅠ限制性内切酶双酶切载体pHsp70-Cas9，回收得到Cas9基因片段(回收操作按照TAKARA胶回收(小量)试剂盒使用说明进行)，将回收片段与相同酶切的pSL1180[SV40]载体骨架片段按照TAKARA DNA ligation kit Ver2.1使用说明进行连接，得到pSL1180[Cas9-SV40]。
步骤S2、制备IE1启动子序列
PCR体外扩增，从BmNPV基因组中扩增IE1启动子序列，并在扩增片段上下游分别添加HindIII限制性内切酶和ClaⅠ限制性内切酶酶切位点，经T-A克隆到载体pMD19-T获得质粒，将获得的pMD19-T载体质粒用HindIII限制性内切酶和ClaⅠ限制性内切酶双酶切，回收IE1启动子序列(回收操作按照TAKARA胶回收(小量)试剂盒使用说明进行)，启动子IE1的序列如SEQ ID No.2所示。
所需PCR反应程序为：①94℃预变性4min，②94℃变性40s，③55℃退火40s，④72℃延伸40s，⑤返回步骤②进行30个循环，⑥72℃终延伸10min，⑦12℃Forever。
PCR扩增上、下游引物分别如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示：
IE1-F(SEQ ID No.3)：5’-CGAAGCTTTTGCAGTTCGGGACATAAATG-3’
IE1-R(SEQ ID No.4)：5’–CGATCGATTAGATCCCTAGTCGTTTGGT-3’
步骤S3、制备中间载体pSL1180[IE1-Cas9-SV40]
通过HindIII限制性内切酶和ClaⅠ限制性内切酶双酶切步骤S1所得载体pSL1180[Cas9-SV40]，回收载体骨架(回收操作按照TAKARA胶回收(小量)试剂盒使用说明进行)，与步骤S2获得的IE1启动子序列按照TAKARA DNA ligation kit Ver2.1使用说明进行连接，获得中间载体pSL1180[IE1-Cas9-SV40]。
步骤S4、制备表达盒片段IE1-Cas9-SV40
通过AscⅠ限制性内切酶单酶切pSL1180[IE1-Cas9-SV40]，按试剂盒要求回收并补平黏性末端，制得表达盒片段IE1-Cas9-SV40。
步骤S5、制备载体骨架
通过BglⅡ限制性内切酶单酶切载体pBac[3×P3-EGFP](参见参考文献：TomitaM,MunetsunaH,SatoT,et al.Transgenic silkworms produce recombinant human typeIII procollagenin cocoons.NatBiotechnol,2003,21:52～56.)，按照TAKARA胶回收(小量)试剂盒使用说明进行回收载体骨架并补平去磷酸化，得到载体骨架片段。
步骤S6、制备目标载体pBac[3×P3-EGFP+IE1-Cas9-SV40]
将步骤S4制得的表达盒片段IE1-OmElo-SV40与步骤S5制得的pBac[3×P3-EGFP]载体骨架片段按照TAKARA DNA ligation kit Ver2.1使用说明进行连接，获得目标载体pBac[3×P3-EGFP+IE1-Cas9-SV40]。
本实施例构建获得的转基因重组载体以眼和神经特异的启动子3×P3启动的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达盒，增强型绿色荧光蛋白作为筛选标记，其后含有IE1启动子，启动优化后Cas9基因的表达。
实施例二
培育Cas9基因的转基因系家蚕。
用市购的多化性家蚕品系305作为原始材料，亲代蚕卵经正常桑叶饲养并化蛾交配产卵。
取10nL～15nL浓度为400ng/μL的实施例一所制得重组载体质粒pBac[3×P3-EGFP+IE1-Cas9-SV40]与辅助质粒pHA3PIG混合。将混合液分别注射至400粒家蚕品系305雌蛾产下2h～6h的蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25℃、相对湿度为85％的环境中催青孵化。孵化后pBac[3×P3-EGFP+IE1-Cas9-SV40]获得156头G0代蚁蚕。
所得蚁蚕用桑叶饲养至羽化成蛾，将获得蚕蛾回交或自交，获得注射了pBac[3×P3-EGFP+IE1-Cas9-SV40]质粒的蛾圈37个。
蛾圈G1代蚕卵，用电动宏观荧光显微镜观察筛选，获得6个眼睛发绿色荧光的蛾圈，转化效率为16.22％。
将获得的阳性转基因家蚕饲养至羽化后进一步自交选纯，即获得能稳定遗传的在家蚕中全时期全组织表达Cas9蛋白的家蚕转基因系，即IE1-Cas9-SV40转基因家蚕系。
图3显示为表达载体pBac[3×p3-EGFP+IE1-Cas9-SV40]获得的表达Cas9的转基因家蚕品系各时期荧光图。
图5显示为表达Cas9的转基因家蚕品系Cas9蛋白表达图。
实施例三
本实施例以家蚕内源性脂肪酸去饱和酶基因BmDES3为例，该基因为家蚕脂肪酸去饱和酶基因家族中的一员，需要说明的是，本发明的敲除方法适用于任何具有特异性适合靶点的单个内源性基因或具有类似结构域的基因家族的多重敲除。BmDES3基因序列如SEQID No.5所示。
构建家蚕内源性脂肪酸去饱和酶基因BmDES3的打靶载体。
将设计好的BmDES3特异靶序列接入家蚕内源性U6启动子后，再与sgRNA相连，然后将含有完整靶序列的sgRNA表达盒***到最终载体pBac[3×P3-DsRed]得到重组表达载体。
图2显示为表达载体pBac[3×P3-DsRed+U6-sgRNA]载体示意图。
具体操作方法：
步骤S1、制备U6启动子序列
PCR体外扩增，从家蚕DZ品系基因组中扩增U6启动子序列，经T-A克隆到载体pMD19-T获得质粒pMD19-T-U6。
所需PCR反应程序为：①94℃预变性4min，②94℃变性40s，③55℃退火40s，④72℃延伸40s，⑤返回步骤②进行30个循环，⑥72℃终延伸10min，⑦12℃Forever。
PCR扩增上下游引物分别如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示：
U6-F(SEQ ID No.7)：5’-AGGTTATGTAGTACACAT-3’
U6-R(SEQ ID No.8)：5’-ACTTGTAGAGCACGATAT-3’
U6启动子序列如SEQ ID No.6所示。
步骤S2、筛选BmDES3的sgRNA靶点序列
根据CRISPRdirect在线分析工具(http://crispr.dbcls.jp/)预测家蚕内源性去饱和酶基因BmDes3的sgRNA序列，同时根据软件分析靶序列在家蚕中的脱靶效率，最后选择高效编缉的sgRNA序列，其序列为SEQ ID No.9和SEQ ID No.10。
Target1(SEQ ID No.9)：GGCTTATGGCGAGTGCATAA
Target2(SEQ ID No.10)：GCGTAACTCGGGATATGTTT
需要说明的是，本实施例选择的sgRNA序列是通过与家蚕基因组序列进行blast比对，筛选出的具有最佳特异性的两条序列，以有利于后续的敲除实验，当然，sgRNA序列也有其他选择。
步骤S3、制备sgRNA表达盒
以U6-BmDES3-F(SEQ ID No.11)和U6-BmDES3-R11(SEQ ID No.12)作为引物，以质粒pMD19-T-U6为模版进行体外扩增，得到扩增产物；将得到的扩增产物稀释50倍后作为模版，再次用引物U6-BmDES3-F(SEQ ID No.11)和引物U6-BmDES3-R2(SEQ ID No.13)进行体外扩增，得到扩增产物；将得到的扩增产物稀释50倍后作为模版，第三次用引物U6-BmDES3-F(SEQ ID No.11)和引物U6-BmDES3-R3(SEQ ID No.14)体外扩增得到扩增产物。扩增产物按照TAKARA胶回收(小量)试剂盒使用说明进行回收，并用NcoI和EcoRⅠ双酶切回收产物并补平及去磷酸化。获得表达BmDES3基因Target1sgRNA的表达盒U6-BmDES3sgRNA1。
同理，用引物U6-BmDES3-F(SEQ ID No.11)和引物U6-BmDES3-R21(SEQ IDNo.15)，以质粒pMD19-T-U6为模版进行体外扩增得到扩增产物；将得到的扩增产物稀释50倍后作为模版，再次用引物U6-BmDES3-F(SEQ ID No.11)和引物U6-BmDES3-R2(SEQ IDNo.13)进行体外扩增得到扩增产物；将得到的扩增产物稀释50倍后作为模版，第三次用引物U6-BmDES3-F(SEQ ID No.11)和引物U6-BmDES3-R3(SEQ ID No.14)体外扩增得到扩增产物。扩增产物按照TAKARA胶回收(小量)试剂盒使用说明进行回收，并用NcoI和EcoRⅠ双酶切回收产物并补平及去磷酸化。获得表达BmDES3基因Target2sgRNA的表达盒U6-BmDES3sgRNA2。
所需PCR反应程序均为：①94℃预变性4min，②94℃变性40s，③60℃退火40s，④72℃延伸40s，⑤返回步骤②进行30个循环，⑥72℃终延伸10min，⑦12℃Forever。
U6-BmDES3-F(SEQ ID No.11)：5’-GCGAATTCAGGTTATGTAGTACACATT-3’
U6-BmDES3-R11(SEQ ID No.12)：
5’-TATTTCTAGCTCTAAAACTTATGCACTCGCCATAAGCCACTTGTAGAGCACGAT ATT-3’
U6-BmDES3-R2(SEQ ID No.13)：
5’-CAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACA-3’
U6-BmDES3-R3(SEQ ID No.14)：
5’-GCCATGGAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTA G-3’
U6-BmDES3-R21(SEQ ID No.15)：
5’-TATTTCTAGCTCTAAAACAAACATATCCCGAGTTACGCACTTGTAGAGCACGAT ATT-3’
步骤S4、制备载体骨架
通过BglⅡ限制性内切酶单酶切载体pBac[3×P3-DsRed]，按照TAKARA胶回收(小量)试剂盒使用说明进行回收载体骨架并补平去磷酸化，得到载体骨架片段。
步骤S5、制备目标载体pBac[3×P3-DsRed+U6-BmDES3sgRNA1]和pBac[3×P3-DsRed+U6-BmDES3sgRNA2]
将步骤S3制得的表达盒片段U6-BmDES3sgRNA1和U6-BmDES3sgRNA2分别与步骤S5制得的pBac[3×P3-DsDed]载体骨架片段按照TAKARA DNA ligation kit Ver2.1使用说明进行连接，获得目标载体pBac[3×P3-DsRed+U6-BmDES3sgRNA1]和pBac[3×P3-DsRed+U6-BmDES3sgRNA2]。
本实施例构建获得的转基因重组载体以眼和神经特异的启动子3×P3启动的红色荧光蛋白(DsDed)的表达盒，红色荧光蛋白作为筛选标记，其后含有以U6启动子启动sgRNA的表达盒。
实施例四
培育表达家蚕内源性基因BmDES3的sgRNA1和sgRNA2的转基因家蚕品系。
用市购的多化性家蚕品系305作为初始材料，亲代蚕卵经正常桑叶饲养至羽化后交配产卵。
取10nL～15nL浓度为400ng/μL的实施例三所制得的重组载体pBac[3×P3-DsRed+U6-BmDES3sgRNA1]和pBac[3×P3-DsRed+U6-BmDES3sgRNA2]，分别与辅助质粒pHA3PIG混合。将混合液分别注射至400粒家蚕品系305雌蛾产下2h～6h的蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25℃、相对湿度为85％的环境中催青孵化。孵化后获得注射pBac[3×P3-DsRed+U6-BmDES3sgRNA1]质粒的G0代蚁蚕79头，注射pBac[3×P3-DsRed+U6-BmDES3sgRNA2]质粒的G0代蚁蚕93头。
所得蚁蚕用桑叶饲养至羽化成蛾，将获得蚕蛾回交或自交。pBac[3×P3-DsRed+U6-BmDES3sgRNA1]获得24个蛾圈，pBac[3×P3-DsRed+U6-BmDES3sgRNA2]获得31个蛾圈。
蛾圈G1代蚕卵，用电动宏观荧光显微镜观察，经筛选pBac[3×P3-DsRed+U6-BmDES3sgRNA1]获得9个眼睛发红色荧光的蛾圈，转化效率为37.5％，pBac[3×P3-DsRed+U6-BmDES3sgRNA2]获得13个眼睛发红色荧光的蛾圈，转化效率为41.94％。
将获得的阳性转基因家蚕饲养至羽化成蛾并进一步自交选纯，即获得能稳定遗传的在家蚕中表达家蚕内源性基因BmDES3的sgRNA1和sgRNA2的转基因家蚕品系，即U6-BmDES3sgRNA1转基因家蚕系和U6-BmDES3sgRNA2转基因家蚕系。
图4显示为表达载体pBac[3×P3-DsRed+U6-BmDES3sgRNA1]获得的表达sgRNA的转基因家蚕品系各时期荧光图。表达载体pBac[3×P3-DsRed+U6-BmDES3sgRNA2]获得的转基因家蚕品系各时期荧光图与图4类似。
图6a显示为Cas9表达品系与sgRNA1表达品系，在转录水平检测Cas9表达水平和在基因组水平U6-sgRNA1检测图。
图6b显示为Cas9表达品系与sgRNA2表达品系，在转录水平检测Cas9表达水平和在基因组水平U6-sgRNA2检测图。
测试例一
将实施例二获得的IE1-Cas9-SV40转基因家蚕系和实施例四获得的U6-BmDES3sgRNA1转基因家蚕系进行杂交，蚕卵用电动宏观荧光显微镜观察，并筛选出眼睛部位既发红色荧光，又发绿色荧光的蚕卵，以新鲜桑叶饲喂至4龄。随机选择5只个体，分别提取基因组，用特异性引物进行扩增并测序，所有个体打靶位点1(PAM基序前方20bp)附近均有不同碱基数量的缺失，大小分别为2个到14个碱基之间，其序列如图7所示。
测试例二
将实施例二获得的IE1-Cas9-SV40转基因家蚕系和实施例四获得的U6-BmDES3sgRNA2转基因家蚕系进行杂交，蚕卵用电动宏观荧光显微镜观察，并筛选出眼睛部位既发红色荧光，又发绿色荧光的蚕卵，以新鲜桑叶饲喂至4龄。随机选择5头个体，分别提取基因组，用特异性引物进行扩增并测序，所有个体打靶位点2(PAM基序前方20bp)附近均有不同碱基数量的缺失，大小分别为1个到9个碱基之间且其中一个个体有碱基替换，其序列如图8所示。
上述实施例将CRISPR/Cas9基因组定点编辑技术与piggy Bac转座子介导的基因***技术相结合，即先分别获得Cas9和sgRNA的稳定转家蚕基因系，然后通过杂交的方式获得同时表达Cas9和sgRNA的家蚕个体，可有效提高靶标基因的敲除效率。同现有的直接注射sgRNA混合纯化后的Cas9蛋白、mRNA或者能够转录为Cas9mRNA的表达载体技术相比，简化了载体构建技术，提高了注射效率，对靶标序列的编辑可以在受精完成后持续进行，因而保证了编辑效率。
综上所述，本发明提供了一种高效、稳定的Cas9介导的靶标基因编辑方法。即先分别获得单独表达Cas9蛋白和sgRNA的转基因家蚕系，然后通过杂交的方式使Cas9介导的靶标基因编辑更加高效的进行，避免了现有的注射表达载体后直接筛选阳性个体效率低的问题，共表达阳性个体中靶标基因的敲除效率达100％，从而更好地服务于基因功能研究，并在基因工程育种中发挥重要意义。
本发明适用的物种广泛，目前发现每个物种都具有相应于该物种的U6启动子，均可用于构建pBac[3×P3-DsRed+U6-sgRNA]表达载体，因而具有在所有物种中均可适用的潜力。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 西南大学
<120> 一种基因敲除方法及其sgRNA片段与应用
<130> 2017
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4272
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Cas9
<400> 1
atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta caaagacgat 60
gacgataaga tggccccaaa gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc 120
gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 180
accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 240
agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 300
acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 360
ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 420
gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 480
atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 540
ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 600
atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 660
gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 720
aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 780
ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg 840
attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 900
gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 960
atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 1020
ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 1080
atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1140
cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1200
tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1260
aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1320
cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1380
attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1440
aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1500
ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1560
gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1620
ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1680
aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1740
ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1800
aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1860
ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1920
aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1980
accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 2040
ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 2100
ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2160
ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2220
ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2280
gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2340
aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2400
gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2460
aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2520
gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2580
atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc 2640
gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2700
aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2760
tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2820
aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2880
gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2940
aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 3000
ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 3060
caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3120
cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3180
atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3240
atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3300
ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3360
accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3420
acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3480
agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3540
tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3600
gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3660
ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3720
tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3780
aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3840
tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3900
cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3960
ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 4020
atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 4080
gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4140
gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4200
ctgtctcagc tgggaggcga caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa 4260
aagaaaaagt aa 4272
<210> 2
<211> 638
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IE1 promoter
<400> 2
ttgcagttcg ggacataaat gtttaaatat atcaatgtct ttgtgatgcg cgcgacattt 60
ttgtaagtta ttaataaaat gcaccgacac gttgcccgac attatcatta aatccttggc 120
gtagaatttg tcgggtccgt tgtccgtgtg cgctagcatg cccgtaacgg accttgagct 180
tttggcttca aaggttttgc gcacagacaa aatgtgccac acttgcagct ctgcttgtgt 240
acgcgttacc acaaatccca acggcgcagt gtacttgtta tatgtaaata aatctcgata 300
aaggcgcggc gcgcgaatgc agctgatcac gtacgctcct cgtgttccgt tcaaggacgg 360
tgttatcgac ctcagattaa tatttatcgg ccgactgttt tcgtatccgc tcaccaaacg 420
ggtttttgca ttaacattgt atgtcggcgg atgttctgta tctaatttga ataaataaat 480
gataaccgca ttggttttag agggcataat aaaaaaaata ttattatcgt gttcgccatt 540
ggggcagtat aaattgacgt tcatgttgaa tattgtttca gttgcaagtt gacattggcg 600
gcgacacgat cgtgaacaac caaacgacta gggatcta 638
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IE1-F
<400> 3
cgaagctttt gcagttcggg acataaatg 29
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IE1-R
<400> 4
cgatcgatta gatccctagt cgtttggt 28
<210> 5
<211> 1359
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> BmDES3
<400> 5
atggcgccta aaaatgttga atatattgaa atagctcatc gaagagcagc agaaaagaaa 60
actcatgtca gttttcctca actcaaatac ccctcgctaa gggacgaagg gttaagagac 120
ccggtacaat ggttaatcgg gaaatccatg gacgacggag cagaaggctt atggcgagtg 180
cataatggga tttacaattt caatgatttc ctcgagaagc atcccggtgg ggcggagtgg 240
ttggagctct ctaagggtac cgatatcaca gaagccttcg aaagtcatca cctcaattcg 300
tctgtgaata aagttctcga gaaatattac gttagggaag ctaaaacacc taggaattcg 360
ccttttactt ttgaagatga tggattctac cgcacattga aaagagcggt cgttgaagaa 420
ttaaaaaaag ttcctaaaca tatcccgagt tacgctgata tgatcatcga tggtctcttc 480
gcgactttgc tcatatcttc agcggtttca tgttgggcca acgattattg ggtggtaatg 540
tcagcgtatt tgatcgcctc gttgagtttg gcatgggtca cagttgccgc tcacaattac 600
atccacagga aaactaattg gagaatgtac ttgttcaatt tgagtttgtg gtcttatagg 660
gatttcagag tatcacacgc cctttctcac catctttatc cgaacaccct tatggattta 720
gaagttagcg gatttgagcc tttagtgatt tggaatccga ggaaaaagcc ggtacatgcc 780
aaatttgctt ttttgattga acagattaca ttcccgtttc tgttcgtttt aaatttcctg 840
aagcggttaa ttttaaattt cctacgcgaa ggattcttca ccgagcacta ccgttggcat 900
gatggtgtag ggttcacttt acctgtctgg atgtggctcg tgagcggttg cagtttctac 960
gaagcagcgg tgatgtggtt gtggattgtg tgcaccgcga gctacatatt ctttagcatc 1020
ggatcgaatg ctgctcacca ccatcctgac atctttaagg acggtgacca agttagggac 1080
gttacacctg actggggtat gcacgaactg gaggctgtga tggatcgcac cgacattaat 1140
ggaaaccttt tcaaggtgat gacgtttttc ggagaccacg cccttcatca tctgttcccg 1200
acattggatc acgccgtgtt accctatctg tatccagttt tcttagattt atgtcagaag 1260
tatcgcgcca attttagaat gacatcgtca ttggatttgt ttataggaca gattaagatg 1320
acgcttaaga cggaacctaa tatattagat aataactaa 1359
<210> 6
<211> 467
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> U6 promoter
<400> 6
aggttatgta gtacacattg ttgtaaatca ctgaattgtt ttagatgatt ttaacaatta 60
gtacttatta atattaaata agtacatacc ttgagaattt aaaaatcgtc aactataagc 120
catacgaatt taagcttggt acttggctta tagataagga cagaataaga attgttaacg 180
tgtaagacaa ggtcagatag tcatagtgat tttgtcaaag taataacaga tggcgctgta 240
caaaccataa ctgttttcat ttgtttttat ggattttatt acaaattcta aaggttttat 300
tgttattatt taatttcgtt ttaattatat tatatatctt taatagaata tgttaagagt 360
ttttgctctt tttgaataat ctttgtaaag tcgagtgttg ttgtaaatca cgctttcaat 420
agtttagttt ttttaggtat atatacaaaa tatcgtgctc tacaagt 467
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> U6-F
<400> 7
aggttatgta gtacacat 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> U6-R
<400> 8
acttgtagag cacgatat 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Target1
<400> 9
ggcttatggc gagtgcataa 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Target2
<400> 10
gcgtaactcg ggatatgttt 20
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> U6-BmDES3-F
<400> 11
gcgaattcag gttatgtagt acacatt 27
<210> 12
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> U6-BmDES3-R11
<400> 12
tatttctagc tctaaaactt atgcactcgc cataagccac ttgtagagca cgatatt 57
<210> 13
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> U6-BmDES3-R2
<400> 13
caagttgata acggactagc cttattttaa cttgctattt ctagctctaa aaca 54
<210> 14
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> U6-BmDES3-R3
<400> 14
gccatggaaa aaagcaccga ctcggtgcca ctttttcaag ttgataacgg actag 55
<210> 15
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> U6-BmDES3-R21
<400> 15
tatttctagc tctaaaacaa acatatcccg agttacgcac ttgtagagca cgatatt 57

Claims (10)

1.一种基因敲除方法，其特征在于，包括分别获得表达Cas9和sgRNA的转基因生物，再将两种转基因生物杂交，获得共表达阳性个体。
2.根据权利要求1所述的基因敲除方法，其特征在于，所述sgRNA含有如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示序列中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的基因敲除方法，其特征在于，所述转基因生物为家蚕，将Cas9载体和sgRNA载体分别导入家蚕胚胎中，得到对应的目标转基因家蚕，将获得的目标转基因家蚕杂交，获得共表达阳性个体。
4.根据权利要求3所述的基因敲除方法，其特征在于，利用piggyBac重组表达载体将Cas9基因和sgRNA分别整合至家蚕基因组，含有Cas9基因的piggyBac重组表达载体由含有Cas9基因的表达盒***到载体pBac[3×P3-EGFP]的BglⅡ酶切位点得到，含有sgRNA的piggyBac重组表达载体由含有sgRNA的表达盒***到载体pBac[3×P3-DsRed]的BglⅡ酶切位点得到。
5.一种sgRNA片段，其特征在于，含有如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示序列中的至少一种。
6.含有如权利要求5所述sgRNA片段的重组载体、基因表达盒、转基因细胞系或转基因个体。
7.一种含有如权利要求5所述sgRNA片段的CRISPR/Cas9载体。
8.根据权利要求7所述的CRISPR/Cas9载体，其特征在于：Cas9表达载体的启动子选自BmNPV极早期启动子IE1。
9.根据权利要求7所述的CRISPR/Cas9载体，其特征在于：sgRNA表达载体的启动子选自U6启动子。
10.根据权利要求5所述的sgRNA片段、权利要求7至9任一项所述的CRISPR/Cas9载体在基因敲除中的应用。
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