CN111534626A

CN111534626A - 一种用于钟器腐霉的lamp检测引物组合物、检测试剂盒及其可视化检测方法

Info

Publication number: CN111534626A
Application number: CN202010330834.4A
Authority: CN
Inventors: 高春生; 余永廷; 纪灏君; 王吐虹; 李智敏; 陈佳; 程毅; 郭利桃; 聂纯武; 文传如
Original assignee: Institute of Bast Fiber Crops of CAAS
Current assignee: Institute of Bast Fiber Crops of CAAS
Priority date: 2020-04-24
Filing date: 2020-04-24
Publication date: 2020-08-14

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于钟器腐霉的LAMP检测引物组合物、检测试剂盒及其可视化检测方法，提取待检测微生物的基因组DNA，取基因组DNA溶液作为反应模板，加入LAMP试剂盒中的检测溶液进行LAMP反应，所述LAMP反应的程序为：64℃反应扩增60min，然后观察扩增产物的颜色变化，如果颜色由紫色变为蓝色，表示待检物中存在钟器腐霉，如果颜色没有变化仍是紫色，表示待检物中不存在钟器腐霉。与传统的依靠形态和分子PCR检测技术相比，本发明具备更高的准确性、灵敏性和实效性，而且操作简单。可用于钟器腐霉的快速检测，为监测和防治钟器腐霉引起的病害提供技术支撑。

Description

一种用于钟器腐霉的LAMP检测引物组合物、检测试剂盒及其可视化检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于钟器腐霉的LAMP检测引物组合物、检测试剂盒及其可视化检测方法。

背景技术

钟器腐霉(Phytopythium vexans)作为卵菌的一种重要病原菌，能侵染烟草，柑橘，苎麻等多种重要的经济作物。苎麻是荨麻科苎麻属的一种多年生草本植物，原产于东亚，是世界上最古老的纤维作物之一，具有很高的经济价值。以钟器腐霉为主引起的根褐腐病是近年来发现的一种新的苎麻根部的毁灭性病害，该病害在多个苎麻主产区均有发生，且危害严重，生产上需要一种能够在苎麻发病早期快速、准确鉴定该病原菌的方法。目前对钟器腐霉菌的鉴定方法主要是通过培养病原菌及观察鉴定，但由于腐霉菌的分离培养较难，近缘种之间的菌丝,孢子囊及卵孢子形态极为相似，且引起的病害症状与其他植物病害较像，难以分辨，致使对该菌的鉴定十分困难。由此可见，传统的鉴定方法需要丰富的病原菌形态识别知识与经验，不仅耗时长，而且难以判断准确性，不利于大容量样本的分析鉴定,无法满足田间生产上的需求。随着分子生物学的发展，以聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光定量PCR 为主的多种检测技术已被开发和广泛应用，并已成为快速、准确、特异性地鉴定病原菌的主要手段，避免了形态学鉴定不确定性的缺点。但是这些检测技术往往需要在具有专业仪器、试剂和严格环境条件的实验室中进行，仪器和试剂的价格昂贵且操作要求较高，过程复杂，检测时间仍然较长，这些缺点使之不适宜在基层环境中使用。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新开发的分子检测技术，它使用4条特异性引物，利用具有链置换活性的 Bst DNA聚合酶实现恒温条件下对目标DNA的短期内大量扩增。LAMP技术的检测结果有多种检验方式，在高效扩增条件下，从脱氧核酸三磷酸基质 (dNTPs)中析出的焦磷酸离子与体系中的镁离子结合可产生大量焦磷酸镁，从而出现白色沉淀，因此可通过浊度仪监测其扩增产物；也可以通过凝胶电泳进行检测，或在反应体系中加入荧光染料钙黄绿素或羟基萘酚蓝(HNB) 等，根据体系颜色变化，用肉眼就可观察判断检测结果。这种方法不需要专业的仪器和复杂的程序，并且具有操作简单、快速高效、特异性强、灵敏度高等优点，是一种适合于基层使用的快速检测技术。LAMP技术已广泛应用于真菌、细菌、病毒和线虫等多种病原物的快速检测,但关于钟器腐霉的LAMP 快速检测方法，国内外均尚未报道。

鉴于此，本发明以ITS序列为检测的靶标序列，设计了钟器腐霉特异性的 LAMP引物，并在此基础上建立了钟器腐霉的LAMP快速检测方法。

发明内容

针对现有技术中钟器腐霉生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种用于钟器腐霉的LAMP检测引物组合物、试剂盒及其可视化检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种用于钟器腐霉的LAMP检测引物组合物，该引物组合物包含:如SEQ ID NO：1所示的正向外引物F3,如SEQ ID NO：2所示的反向外引物B3,如 SEQ ID NO：3所示的正向内引物FI,如SEQ ID NO：4所示的反向内引物BIP。

本发明还提供了一种用于钟器腐霉的LAMP检测试剂盒，LAMP检测试剂包括上述LAMP检测引物组合物。

作为优选，LAMP检测试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、反应缓冲液、 MgSO₄、dNTP、甜菜碱、染色指示剂中的一种或几种。

作为优选，LAMP检测试剂还包括水。

本发明还提供了一种钟器腐霉的LAMP检测方法，采用上述LAMP检测引物对钟器腐霉的DNA进行扩增。

LAMP检测方法的反应体系如下：FIP和BIP各1.6μmol/L,F3和B3各 0.2μmol/L,8UBst DNA聚合酶,2.5μL 10×反应缓冲液,6mmol/L MgSO₄,1.4 mmol/L dNTPs,0.8mol/L甜菜碱,180μmol/L染色指示剂,2μL DNA模板,灭菌水补至25μL。

LAMP的反应温度为64℃，反应时间为60min。

染色指示剂为羟基萘酚蓝时，LAMP检测方法的判断方法为：反应液颜色为紫色，表示结果为阴性，待测样品中不含钟器腐霉；反应液颜色为蓝色，表示结果为阳性，待测样品中含有钟器腐霉。

本发明与现有技术相比,其优点和积极效果为：

1、操作方便：本发明提供的检测钟器腐霉的LAMP方法客服了现有技术中钟器腐霉的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测钟器腐霉的问题。本发明检测方法在64℃等温条件下，只需60min就能准确、快速、高效地检测到钟器腐霉，对实验场所要求简单，不需要其它复杂仪器，能较好的满足钟器腐霉的现场检测，适合在基层部门推广使用。

2、准确性高：由于传统钟器腐霉的检测方法主要通过培养病原菌及观察鉴定，但由于腐霉菌的分离培养较难，近缘种之间的菌丝,孢子囊及卵孢子形态极为相似，且引起的病害症状与其他植物病害较像，难以分辨，致使对该菌的鉴定十分困难。而本发明根据钟器腐霉的基因组序列，使用Megalign软件将其与其它的腐霉基因组进行比较，选择钟器腐霉与其他菌株差异较大的基因作为靶标基因设计特异性的LAMP引物。LAMP反应通过4条引物(FIP、BIP、 F3、B3)特异性识别耙序列上的6个独立区域，其特异性比较高。此外，本发明在LAMP反应体系中提前加入了染色指示剂，使得LAMP检测结果能够通过肉眼观察加以判断，避免了开盖污染的可能性。

3、灵敏度高：本发明建立的钟器腐霉的LAMP检测方法,灵敏度非常高， DNA浓度在10ng/μL～1pg/μL之间均能检测到扩增产物，体系颜色变为不同程度的蓝色，表明该检测方法足以在DNA浓度较低情况下准确快速检测出钟器腐霉。

附图说明

图1钟器腐霉菌落形态；

图2钟器腐霉LAMP引物的特异性检测；其中，(a)：2％琼脂糖凝胶电泳检测结果；(b)：羟基萘酚蓝(HNB)可视化显色检测结果,结果显示只有钟器腐霉可观察到蓝色的阳性反应，而其它病原菌显色结果为紫色的阴性反应；

图3钟器腐霉常规PCR与LAMP检测方法灵敏度的比较；其中，(a)：常规PCR扩增产物的2％琼脂糖凝胶电泳检测结果；(b)：LAMP扩增产物的 2％琼脂糖凝胶电泳检测结果；(c)：LAMP扩增产物的羟基萘酚蓝(HNB)可视化显色检测结果；DNA浓度范围为10ng/μL～1fg/μL,结果显示钟器腐霉常规PCR的最低检测限度是100pg/μL,钟器腐霉的LAMP检测体系的最低检测限度1pg/μL；

图4不同腐霉侵染的苎麻病根；

图5不同腐霉菌侵染的苎麻根的LAMP检测；其中，(a)：2％琼脂糖凝胶电泳检测结果；(b)：羟基萘酚蓝(HNB)可视化显色检测结果,结果显示钟器腐霉侵染的苎麻根DNA体系有条带产生,LAMP检测体系显色结果为蓝色阳性反应；其余腐霉侵染的苎麻根DNA体系均无条带产生,LAMP检测体系显色结果为紫色阴性反应。

具体实施方式

本发明公开了一种用于钟器腐霉的LAMP检测引物组合物、检测试剂盒及其可视化检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的用于钟器腐霉的LAMP检测引物、检测试剂和检测方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。本发明分离的钟器腐霉菌落形态见图1。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1利用LAMP方法检测钟器腐霉

用于检测钟器腐霉的LAMP引物组合物：正向外引物F3如SEQ ID NO： 1所示,反向外引物B3如SEQ ID NO：2所示,正向内引物FI如SEQ ID NO：3 所示,反向内引物BIP如SEQID NO：4所示。

检测钟器腐霉的LAMP试剂盒中各试剂浓度为：FIP和BIP各1.6μmol/L, F3和B3各0.2μmol/L,8U Bst DNA聚合酶,2.5μL 10×反应缓冲液,6mmol/L MgSO₄,1.4mmol/LdNTPs,0.8mol/L甜菜碱,180μmol/L染色指示剂,2μL DNA模板,灭菌水补至25μL。

LAMP检测方法：提取待检测的微生物的DNA,取2μL DNA模板,加入 23μL LAMP试剂盒中的检测溶液进行LAMP检测，64℃反应60min。然后观察产物颜色变化,反应液颜色为紫色，表示待测样品中无钟器腐霉，反应液颜色为蓝色，表示待测样品中含有钟器腐霉。

为了验证LAMP检测方法的特异性，以2株钟器腐霉，13株腐霉菌近缘种及5种其他病原真菌为供试材料。供试菌株的种类、寄主、来源及数量详见表1。LAMP检测结果显示钟器腐霉可观察到蓝色的阳性反应，而其它病原菌显色结果为紫色的阴性反应(图2)。

表1用于LAMP检测的供试菌株及来源

实施例2钟器腐霉LAMP反应的灵敏度检测

为了确定LAMP检测方法的灵敏度,将提取的钟器腐霉DNA用 NanoDrop 2000超微量分光光度计测定浓度后进行10倍比稀释,稀释成10 ng/μL～1fg/μL的范围。分别作为模板进行LAMP扩增反应，设置阴性对照，反应结束后根据HNB可视化检测法观察颜色变化,判断LAMP反应的最低检测限，并用2％的琼脂糖凝胶电泳加以验证。结果显示：进行常规PCR检测 DNA浓度在10ng/μL～100pg/μL之间能够检测到扩增产物，但是稀释至100 pg/μL时，其凝胶检测的电泳条带亮度极弱，继续稀释至10pg/μL时已检测不到扩增产物，证明钟器腐霉常规PCR的最低检测限度是100pg/μL[图3(a)]。验证LAMP检测方法的灵敏度时，发现DNA浓度在10ng/μL～1pg/μL之间均能检测到扩增产物，体系颜色变为不同程度的蓝色，凝胶电泳检测也有梯形条带出现，是阳性结果；浓度稀释至100fg/μL时，体系颜色不再发生变化，仍为紫色阴性，且无电泳条带，因此1pg/μL是钟器腐霉的LAMP检测体系的最低检测限度[图3(b)、(c)]。以上结果证明本发明建立的钟器腐霉LAMP 检测体系的灵敏度至少是常规PCR的100倍。

实施例3菌株回接与苎麻组织LAMP检测

苎麻的无性繁殖：将土壤栽培的苎麻中生长旺盛且过高的植株剪去适当长度的带有顶芽的茎秆，选取粗细适中、没有弯曲的苎麻茎，***干净的 100mL锥形瓶中，加入适量的水，放入温室25℃进行培养，长出须根后选取健康、生长情况相似的植株进行回接实验。

菌株回接：将表1供试菌株中的15种腐霉菌在PDA培养基上活化培养后3～4天后，使用打孔器打菌饼，并将其分别回接到水培苎麻长出的的白色须根上，使菌丝贴近须根，每株苎麻根接同一腐霉的4个菌饼，在温室25℃条件下培养7～10天，收集各植株发病部位的须根，分别提取病根的DNA。

以发病植物组织DNA为模板构建LAMP反应体系，并使用HNB可视化显色检测和2％琼脂糖凝胶电泳检测2种方法检测其扩增产物，进一步验证钟器腐霉的LAMP反应体系的准确性。

水培苎麻经过15天的培养长出了较长的白色须根，将活化的供试菌株的菌饼贴在生长密集的须根上，25℃培养10天后，不同菌株侵染的苎麻须根呈现出了不同的发病状态，病根由正常的白色变成了不同程度的棕黄色，对照组的须根仍为白色(图4)。

将菌饼周围发病的苎麻根剪碎并装入离心管中，分装2管，每管须根重 0.2g左右，提取其DNA，并以之为模板构建LAMP反应体系，检测该反应的准确性。反应结束后，通过观察体系颜色可知以2种钟器腐霉侵染的苎麻根 DNA为模板的LAMP体系为蓝色阳性，含有其余苎麻根DNA的体系颜色皆为紫色阴性[图5(b)]。电泳检测也呈现出了相同的结果，除钟器腐霉外，其余腐霉侵染的苎麻根DNA体系均无条带产生[图5(a)]，说明使用该引物进行的LAMP扩增反应能够较为准确地检测出苎麻根部的钟器腐霉,可以用于田间苎麻根褐腐病发病植株的钟器腐霉病原菌检测。

对比例1-8

对比例1-8的引物序列如下：

表2对比例1-8的钟器腐霉的LAMP引物

试验例1不同引物组的特异性验证

对表1中所列的20个真菌ITS区进行PCR扩增，经过测序和对比后筛选出的钟器腐霉ITS序列使用在线引物设计软件PrimerExplorerV5设计出了9 组引物(具体见实施例1、对比例1-8引物组序列)，每组包括一对外引物F3、 B3和一对内引物FIP、BIP，即4条LAMP特异性引物。

建立LAMP反应体系，包括：外引物F3和B3各0.2μmol/L，内引物FIP 和BIP各1.6μmol/L，2.5μL 10×Isothermal Amplification Buffer[含20mmol/L Tris-HCL(PH8.8)，10mmol/L(NH₄)₂SO₄，50mmol/L KCL，0.1％Tween-20]， 1.4mmol/L dNTPs，6mmol/L MgSO₄，0.8mol/L甜菜碱，8U Bst DNA聚合酶， 180μmol/L羟基萘酚蓝(HNB)，2μL DNA模板，用灭菌水补足至25μL。体系中羟基萘酚蓝作为指示剂，紫色为阴性反应，蓝色为阳性反应。

以钟器腐霉DNA为模板构建上述体系，并在64℃条件下水浴60min以验证引物；取出后观察体系颜色变化，若颜色由紫色变成了蓝色，则证明该引物成功扩增出了钟器腐霉DNA，可进行进一步优化；若颜色没有发生变化，则证明该引物不可用。也可以使用2.0％的琼脂糖凝胶电泳加以验证，若出现梯形条带则引物可用，反之引物不可用。

结果显示：实施例1的引物组特异性最高，电泳检测显示除钟器腐霉外，其余病原菌中均无条带产生，LAMP结果显示只有钟器腐霉可观察到蓝色的阳性反应，而其它病原菌显色结果为紫色的阴性反应(图2)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院麻类研究所

<120> 一种用于钟器腐霉的LAMP检测引物组合物、检测试剂盒及其可视化检测方法

<130> MP2005939

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtgtagtcg tcggttgtt 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcaaatcga gcaatccact 20

<210> 3

<211> 42

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcgtccgac tttaaaggga cttgcagatg tgaggttgtc tc 42

<210> 4

<211> 40

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gttttgtgct tgatggggtg cggccatcgc caaaggtcac 40

Claims

1.一种用于钟器腐霉的LAMP检测引物组合物，其特征在于，所述引物的序列如下：

正向外引物F3：序列如SEQ ID NO：1所示；

反向外引物B3：序列如SEQ ID NO：2所示；

正向内引物FIP：序列如SEQ ID NO：3所示；

反向内引物BIP：序列如SEQ ID NO：4所示。

2.一种用于钟器腐霉的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP检测试剂包括权利要求1所述LAMP检测引物组合物。

3.根据权利要求2所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP检测试剂还包括BstDNA聚合酶、反应缓冲液、MgSO₄、dNTP、甜菜碱、染色指示剂中的一种或几种。

4.根据权利要求3所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP检测试剂还包括水。

5.一种钟器腐霉的LAMP检测方法，其特征在于，采用权利要求1至4中任一项所述LAMP检测引物组合物对钟器腐霉的DNA进行扩增。

6.根据权利要求5所述的LAMP检测方法，其特征在于，所述LAMP检测方法的反应体系如下：FIP和BIP各1.6μmol/L,F3和B3各0.2μmol/L,8U BstDNA聚合酶,2.5μL 10×反应缓冲液,6mmol/L MgSO₄,1.4mmol/L dNTPs,0.8mol/L甜菜碱,180μmol/L染色指示剂,2μL DNA模板,灭菌水补至25μL。

7.根据权利要求6所述的LAMP检测方法，其特征在于，所述LAMP的反应温度为64℃，反应时间为60min。

8.根据权利要求7所述的LAMP检测方法，其特征在于，所述染色指示剂为羟基萘酚蓝，所述LAMP检测方法的判断方法为：

反应液颜色为紫色，表示结果为阴性，待测样品中不含钟器腐霉；

反应液颜色为蓝色，表示结果为阳性，待测样品中含有钟器腐霉。