CN108060257B - 一种基于环介导等温扩增技术检测强雄腐霉的引物组合物及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于环介导等温扩增技术检测强雄腐霉的引物组合物及其检测方法，提取待检微生物的基因组DNA，取基因组DNA溶液作为反应模板，加入LAMP试剂盒中的检测溶液进行LAMP反应，所述LAMP反应的程序为：64℃反应扩增60min，然后观察扩增产物的颜色变化，如果颜色由紫色变为天蓝色，表示待检物中存在强雄腐霉，如果颜色没有变化仍是紫色，表示待检物中不存在强雄腐霉。与传统的依据形态特征来鉴定强雄腐霉的检测技术相比，本发明具备更高的准确性、灵敏度和实效性，而且操作方便、实用性好，为强雄腐霉的检测提供了新的技术平台，可用于强雄腐霉的快速检测。

Description

一种基于环介导等温扩增技术检测强雄腐霉的引物组合物及 其检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于强雄腐霉的LAMP检测引物组合物、试剂盒及其可视化检测方法。

背景技术

强雄腐霉(Pythium arrhenomane)是玉米茎腐病的重要致病菌，其生长的最适温度为23-25℃，主要引起玉米的根腐和茎腐，对玉米生产具有较大的危害。鉴于强雄腐霉的危害性，生产上需要一种能够在玉米发病早期快速、准确鉴定该病原菌的方法。目前玉米茎腐病病原菌的鉴定通常采用传统的形态特征鉴定方法，即发病样品从田间采回后，立即进行病原菌的分离培养，再进行形态学鉴定。该方法耗时耗力，需要丰富和专业的病原菌鉴定经验，而且很难依据形态学将近似种区分开，无法满足田间生产上的需求。随着分子生物学的发展，已经建立了一系列基于聚合酶链式反应(PCR)的分子检测方法，包括普通PCR检测法、real-time PCR检测法、多重PCR检测法等。这些检测方法需要使用昂贵的仪器设备如PCR仪、荧光定量PCR仪，而且程序繁琐，不适于一些资源有限的实验室和生产上的基层工作者。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近些年开发的一种新的核酸扩增技术，该技术通过具有链置换活性的BstDNA聚合酶在等温条件(60～65℃)下扩增，使用4条引物特异性地识别靶标DNA上的6个区域，扩增效率在1小时内可以达到109拷贝数。此外，在反应体系中加入SYBR Green、羟基萘酚蓝(HNB)等显色染料，反应结果可直接通过颜色变化来判定。LAMP检测方法具有操作简单、特异性高、灵敏度高、成本低等优点，成为可以替代普通PCR的新的核酸扩增技术。目前该技术已广泛应用于真菌、细菌、病毒和卵菌的快速检测。

本发明以β-tubulin基因为检测的靶标序列，设计了强雄腐霉特异性的LAMP引物组合物，在此基础上建立了强雄腐霉的LAMP快速检测方法。

发明内容

针对现有技术中强雄腐霉生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种用于强雄腐霉的LAMP检测引物组合物、试剂盒及其可视化检测方法

为了实现上述发明目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种用于检测强雄腐霉的LAMP引物组合物，该引物组合物包含：如SEQ ID NO.1所示的正向内引物FIP，如SEQ ID NO.2所示的反向内引物BIP，如SEQ ID NO.3所示的正向外引物F3，如SEQ ID NO.4所示的反向外引物B3，如SEQ ID NO.5所示的反向环引物LB。

上述的LAMP引物组合物在检测强雄腐霉中的应用。

上述的LAMP引物组合物在制备用于检测强雄腐霉试剂盒中的应用。

一种用于检测强雄腐霉的LAMP试剂盒，该试剂盒中包含上述的LAMP引物组合物。

作为一种优选技术方案，以待检微生物的基因组DNA为模板，采用上述的LAMP试剂盒检测强雄腐霉的LAMP反应体系为：2.5μL 10×ThermoPol Buffer，6mmol·L^-1MgSO₄，1.4mmol·L^-1dNTPs，内引物FIP和BIP各1.6μmol·L^-1，外引物F3和B3各0.2μmol·L^-1，环引物LB 0.8μmol·L^-1，0.8mol·L^-1甜菜碱，0.1％Triton X-100，20mmol·L^-1Tris-HCl(pH8.8)，10mmol·L^-1KCl，10mmol·L^-1(NH₄)₂SO₄，8U·μL^-1Bst DNA polymerase，192μmol·L^-1羟基萘酚蓝(HNB)，2μL模板DNA，灭菌水补至25μL。

上述的LAMP试剂盒在检测强雄腐霉中的应用。

一种强雄腐霉的LAMP检测方法，提取待检微生物的基因组DNA，取基因组DNA溶液作为反应模板，加入上述LAMP试剂盒中的检测溶液进行LAMP反应，所述LAMP反应的程序为：64℃反应扩增60min，然后观察扩增产物的颜色变化，如果颜色由紫色变为天蓝色，表示待检物中存在强雄腐霉，如果颜色没有变化仍是紫色，表示待检物中不存在强雄腐霉。

本发明的检测强雄腐霉的方法，以提取的DNA为模板，利用所述的LAMP引物组合物进行LAMP反应；Hydroxylnaphthol blue(HNB)属于金属离子指示剂的一种。HNB是Mg²⁺的滴定剂，其颜色随溶液PH变化而改变，因此可以通过监测LAMP反应体系中Mg²⁺浓度的变化及溶液pH而起到颜色指示剂的作用。反应前将HNB加入到反应液中，反应体系呈紫色，反应过程中Mg²⁺与LAMP反应的副产物结合产生大量沉淀，溶液中Mg²⁺浓度降低，pH发生变化，从而使HNB的颜色由紫色变为天蓝色。因此，反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断强雄腐霉的有无：天蓝色表示检测为阳性，存在强雄腐霉；紫色表示检测结果为阴性，不存在强雄腐霉。

本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：

(1)操作方便：本发明提供的检测强雄腐霉的LAMP方法克服了现有技术中强雄腐霉的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测强雄腐霉的问题。本发明检测方法在64℃等温条件下，只需60min就能准确、快速、高效地检测到强雄腐霉，对实验场所的要求简单，不需要其它复杂仪器，能较好满足对强雄腐霉的现场检测，适合在基层和进出口检验检疫部门推广使用。

(2)准确性高：由于传统强雄腐霉检测方法只是依据形态特征来进行鉴定，而强雄腐霉的生长受温度影响形态不稳定，同时受到相近种的影响，很难准确鉴定出来。而本发明根据强雄腐霉的基因组序列，利用Blast软件将强雄腐霉的基因组序列与其它腐霉的基因组序列进行比较，选取了终极腐霉菌特有的一端序列并设计特异性的LAMP引物。LAMP反应通过4条引物(FIP、BIP、F3、B3)特异性识别靶序列上的6个独立区域，其特异性比较高。此外，反向环引物LB能够提高反应速率，和其它四条引物一起，在确保反应准确性的情况下，使本发明能快速的进行强雄腐霉检测。

(3)灵敏度高：本发明建立的强雄腐霉的LAMP检测方法，灵敏度非常高，可以达到10pg DNA，表明该检测方法足以在DNA浓度较低情况下准确快速地检测出强雄腐霉。

附图说明

图1为强雄腐霉LAMP引物的特异性验证：

使用强雄腐霉的LAMP特异性引物对不同病原菌进行LAMP检测，在64℃水浴恒温扩增60min后观察反应溶液的颜色变化，结果显示：只有以强雄腐霉为模板的反应管中溶液的颜色由紫色变成天蓝色(图1)，而其他腐霉的反应管中溶液颜色都没有发生变化，仍为紫色。

图2为强雄腐霉LAMP检测方法的灵敏度验证：

基于反应溶液的颜色变化检测LAMP方法的灵敏度，设置强雄腐霉的模板浓度范围为10ng·μL^-1～1fg·μL^-1。结果显示：当强雄腐霉的模板浓度分别为10ng·μL^-1、1ng·μL^-1、100pg·μL^-1、10pg·μL^-1时，其对应的反应管中溶液颜色变成天蓝色，呈阳性反应；而当强雄腐霉的模板浓度分别为1pg·μL^-1、100fg·μL^-1、10fg·μL^-1、1fg·μL^-1时，其对应的反应管中溶液颜色仍为紫色，呈阴性反应。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案更清楚明白，本发明用具体实例做进一步的说明，但并非仅限用于这些例子。

实施例1：利用LAMP方法检测强雄腐霉

用于检测强雄腐霉的LAMP引物组合物：正向内引物FIP如SEQ ID NO.1所示，反向内引物BIP如SEQ ID NO.2所示，正向外引物F3如SEQ ID NO.3所示，反向外引物B3如SEQ IDNO.4所示，反向环引物LB如SEQ ID NO.5所示。

检测强雄腐霉的LAMP试剂盒中各试剂浓度为：2.5μL 10×ThermoPol Buffer，6mmol·L^-1MgSO₄，1.4mmol·L^-1dNTPs，内引物FIP和BIP各1.6μmol·L^-1，外引物F3和B3各0.2μmol·L^-1，环引物LB 0.8μmol·L^-1，0.8mol·L^-1甜菜碱，0.1％Triton X-100，20mmol·L^-1Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol·L^-1KCl，10mmol·L^-1(NH₄)₂SO₄，8U·μL^-1Bst DNApolymerase，192μmol·L^-1羟基萘酚蓝(HNB)，2μL模板DNA，灭菌水补至25μL。

LAMP检测方法：提取待检微生物的DNA，取2μL DNA溶液作为反应模板，加入23μLLAMP试剂盒中的检测溶液进行LAMP，LAMP反应程序为：64℃反应扩增60min，然后观察扩增产物的颜色变化，如果颜色由紫色变为天蓝色，表示待检物中存在强雄腐霉，如果颜色没有变化仍是紫色，表示待检物中不存在强雄腐霉。

为了验证LAMP方法的特异性，以强雄腐霉和其他9种腐霉为供试材料，LAMP检测结果显示强雄腐霉可观察到天蓝色的阳性反应，而其他腐霉显色结果为紫色的阴性反应(图1)。

实施例2：强雄腐霉LAMP反应的灵敏度试验

为了确定LAMP检测方法的灵敏度，将提取的强雄腐霉的DNA用分光光度计测定浓度后进行10倍比稀释，设置DNA浓度范围为10ng·μL^-1～1fg·μL^-1。分别取稀释后的各浓度DNA稀释液2μL作为模板，加入23μL试剂盒中的检测溶液进行LAMP反应，反应程序为：64℃反应扩增60min。HNB显色反应表明：当强雄腐霉的DNA浓度达到10pg·μL^-1时，反应管中的溶液就能变成天蓝色(图2)。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种基于环介导等温扩增技术检测强雄腐霉的引物组合物及其检测方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acacaaggtg gttgaggtct cctatctgct tccgtacgct ca 42

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctgccatgt ccggcatcac cggccaactt acgaagatcc 40

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acaacgaagc cctctacga 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agacgcggga aagggatc 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcttgcgttt cccgggtca 19

Claims (7)

1.一种用于检测强雄腐霉的LAMP引物组合物，其特征在于，该引物组合物包含：如SEQID NO.1所示的正向内引物FIP，如SEQ ID NO.2所示的反向内引物BIP，如SEQ ID NO.3所示的正向外引物F3，如SEQ ID NO.4所示的反向外引物B3，如SEQ ID NO.5所示的反向环引物LB。

2.权利要求1所述的LAMP引物组合物在检测强雄腐霉中的应用。

3.权利要求1所述的LAMP引物组合物在制备用于检测强雄腐霉试剂盒中的应用。

4.一种用于检测强雄腐霉的LAMP试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包含权利要求1所述的LAMP引物组合物。

5.根据权利要求4所述的用于检测强雄腐霉的LAMP试剂盒，其特征在于，以待检微生物的基因组DNA为模板，采用权利要求4所述的LAMP试剂盒检测强雄腐霉的LAMP反应体系为：2.5μL 10×ThermoPol Buffer，6mmol·L^-1MgSO₄，1.4mmol·L^-1dNTPs，内引物FIP和BIP各1.6μmol·L^-1，外引物F3和B3各0.2μmol·L^-1，环引物LB 0.8μmol·L^-1，0.8mol·L^-1甜菜碱，0.1％Triton X-100，20mmol·L^-1Tris-HCl，10mmol·L^-1KCl，10mmol·L^-1(NH₄)₂SO₄，8U·μL^-1Bst DNA polymerase，192μmol·L^-1羟基萘酚蓝，2μL模板DNA，灭菌水补至25μL。

6.权利要求4或5所述的LAMP试剂盒在检测强雄腐霉中的应用。

7.一种强雄腐霉的LAMP检测方法，其特征在于，提取待检微生物的基因组DNA，取基因组DNA溶液作为反应模板，加入权利要求4或5所述LAMP试剂盒中的检测溶液进行LAMP反应，所述LAMP反应的程序为：64℃反应扩增60min，然后观察扩增产物的颜色变化，如果颜色由紫色变为天蓝色，表示待检物中存在强雄腐霉，如果颜色没有变化仍是紫色，表示待检物中不存在强雄腐霉。

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