CN107849566A - 用于检测白粉病的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于特异性检测葡萄上的白粉病的致病原——真菌葡萄白粉菌(Erysiphe necator)的工具、方法和试剂盒。更具体而言，本发明的方法是基于定量聚合酶链式反应的定量方法。

Description

用于检测白粉病的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及用于检测葡萄上的白粉病的致病原——真菌葡萄白粉菌(Erysiphenecator)的方法和试剂盒。更具体而言，本发明的方法是基于定量聚合酶链式反应的定量方法。
背景技术
由葡萄白粉菌(也称为葡萄钩丝壳菌(Uncinula necator))引起的葡萄藤白粉病是全世界传播范围最广的葡萄藤(葡萄(Vitis vinifera L.))病害之一。葡萄白粉菌属于子囊菌纲(ascomycetes)并且是专性的生体营养性真菌，即其生长和繁殖完全依赖于其活的葡萄藤宿主(葡萄和叶)。因此，葡萄藤白粉菌无法在体外培养，难以低温保藏，并且尚未建立可靠的转化方案，对于在实验室的实验中使用它而言造成严重的挑战
(Spanu et al.,2012,New Phytologist 195:20-22)。
尽管它们很重要，葡萄园白粉菌的分子表征和遗传数据库信息仍然很少。除了小麦白粉菌(Blumeria graminis)，白粉菌目(Erysiphales)仅有23种表达的序列标签(EST)保藏在GenBank(国家生物技术信息中心，2009)。白粉菌的这种表达数据的缺少的主要促成因素是在实验室体外培养中难以分离和保存该真菌(Cadle-Davidson et al.,2010,J.Phytopathol.158:69-71)。然而，最近的关于葡萄白粉菌真菌的基因组测序的研究提供了一些推定的基因信息，并且NCBI的研究目前提供多于500种EST。
在葡萄园中，病害症状的监测是葡萄园管理和无病害葡萄生产的整合方法的关键部分。然而，对白粉病的视觉评估是高度主观的，特别是当叶的感染轻微时。
本发明的目的是提供分子定量PCR方法，其用于田间白粉菌感染的改善的管理，优选地用于在可见症状出现之前葡萄藤叶上的葡萄白粉菌DNA的早期检测。这样的分子诊断方法在杀真菌剂处理的管理和计划中可以是非常有益的工具。
之前已经进行尝试以试图通过qPCR检测葡萄白粉菌，特别是通过例如设计靶向CYP51基因的qPCR引物来检测和监测抗性种群(Dufour et al.,2011,Pest Manag Sci 67:60-69；Jones et al.,2014,BMC Genomics 15:1081)。
发明内容
本发明提供了方法和工具，其用于检测或测定样品中(特别是葡萄藤样品中)真菌葡萄白粉菌的存在，更特别地用于定量测量葡萄藤上真菌葡萄白粉菌的存在水平。本发明的一个优势在于所述方法的灵敏度，其可能使得在植物上的任何症状变得可见之前检测所述真菌。
本发明的方法利用定量聚合酶链式反应(PCR)技术，其还称为qPCR或实时PCR。PCR是允许使用特定的寡核苷酸作为在重复循环中发生的扩增反应的引物来快速扩增靶DNA序列的技术。该技术是本领域技术人员所公知和理解的。经典PCR允许定性检测某些靶DNA序列，而qPCR允许定量测量靶DNA序列的量。
同经典PCR一样，qPCR需要一组两个寡核苷酸，其被用作扩增反应的引物。引物是特异性针对待扩增的靶DNA序列，即它们由对应于靶DNA序列的部分(优选直接位于靶DNA序列侧翼的部分)的短核酸片段组成。一个引物是正向引物，另一个是反向引物，其分别与所述靶DNA序列侧翼的DNA序列的部分相匹配(即在序列上相同)，因此限定了待扩增的靶DNA序列，其为位于所述两个引物之间(虽然包含两个引物)的DNA序列。正向引物是与位于靶DNA序列一端的DNA序列的一部分的正义链相匹配的寡核苷酸，而反向引物是与位于靶DNA序列另一端的DNA序列的一部分的互补(反义)链相匹配的寡核苷酸。在PCR的每次循环过程中，包含靶DNA序列的DNA序列在高温(约95℃)下变性(不配对)，从而产生引物能够在之后的低温(约65℃)步骤中与其杂交的单链DNA，然后使得耐热的DNA聚合酶能够从每个引物开始延伸靶DNA序列的合成。该热循环的重复(约30次)允许产生数千拷贝的靶DNA序列，其之后可在例如琼脂糖凝胶电泳中被鉴定。
qPCR也称为实时PCR或定量PCR，因为除了经典PCR以外，所述反应还掺入了荧光报告化合物，允许检测和测量在每个循环中形成的靶DNA的量。荧光报告化合物可以是特异性针对PCR扩增的靶DNA序列(特异性的寡核苷酸探针，其上连接了荧光报告分子以及淬灭剂)或非特异性的(结合至双链DNA的荧光染料，例如SYBR Green染料)。所测量的荧光与适当的参照的进一步比较使得能够对(例如样品中的)靶DNA的初始量进行精确定量。
用于测定某一样品(例如植物或土壤样品)中给定病原体的存在和量的qPCR中的重要部分是初步鉴定特异性针对待测定的病原体的引物对。特异性针对给定病原体的引物是允许扩增特异性针对病原体的靶DNA序列(即，该靶DNA序列仅存在于目的病原体中并且不存在或完全不(not exactly)存在于例如不同的病原体物种中)的引物。
根据本发明，引物是特异性针对真菌葡萄白粉菌，即它们允许扩增该真菌物种的DNA的一部分，该部分仅存在于该真菌物种中并且不存在于其他物种(甚至是紧密相关的物种)中。只有使用特异性引物，qPCR方法才能够区分来自不同生物体(其可存在于例如叶或土壤样品中)的全部DNA序列。
根据一个具体的实施方案，本发明因此提供了寡核苷酸引物，其选自包含核苷酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的寡核苷酸。本发明还涵盖了寡核苷酸引物，其选自包含与核苷酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQID NO:5互补的核苷酸序列的寡核苷酸。
本发明的优选实施方案为选自具有核苷酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4和SEQ ID NO:5的寡核苷酸的寡核苷酸引物；或选自具有与核苷酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5互补的核苷酸序列的寡核苷酸的寡核苷酸引物。
寡核苷酸是短DNA分子，通常由至少10个核苷酸且最多达30个核苷酸组成。被用作PCR引物或用作探针的最佳寡核苷酸通常由18至24个核苷酸组成，但是可使用更短或更长的寡核苷酸，本领域技术人员知晓选择用于给定目的的适合长度的寡核苷酸时考虑哪些参数。本发明的寡核苷酸优选地由19至21个核苷酸组成。
本发明因此还涵盖了包含这样的核苷酸序列的寡核苷酸引物，即所述核苷酸序列为具有核苷酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的寡核苷酸的至少10个连续核苷酸的核苷酸序列；或涵盖了包含这样的核苷酸序列的寡核苷酸引物，即所述核苷酸序列为具有与核苷酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5互补的核苷酸序列的寡核苷酸的至少10个连续核苷酸的核苷酸序列，但排除(a)具有核苷酸序列SEQ ID NO:2的特定寡核苷酸，和(b)具有核苷酸序列tcactctgtc的特定寡核苷酸。
连续核苷酸指的是DNA分子或寡核苷酸的一系列核苷酸，其在所述DNA分子或寡核苷酸的核苷酸序列中是彼此连续的。
根据某些替代的实施方案，寡核苷酸引物的长度为至少11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续核苷酸。更特别地，寡核苷酸引物的长度为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续核苷酸。
本文使用的“互补”核苷酸序列指的是这样的两个核苷酸序列，其核苷酸碱基根据标准的Watson&Crick互补原则在它们各自序列的某一连续部分上互补，因此能够在它们各自互补部分上相互配对或杂交。特别地，嘌呤碱基与嘧啶碱基配对，更特别地，鸟嘌呤碱基与胞嘧啶碱基配对(G:C)，腺嘌呤碱基与胸腺嘧啶碱基配对(A:T)(在DNA的情况下)、或腺嘌呤碱基与尿嘧啶碱基配对(A:U)(在RNA的情况下)。
寡核苷酸引物是在PCR扩增过程(本发明上下文中的qPCR)中被用作引物的寡核苷酸。因此，寡核苷酸引物是与意欲在PCR过程中扩增的靶DNA的一部分匹配(即序列上相同)的寡核苷酸。当运行PCR过程而使靶DNA的两条链不再配对时，寡核苷酸引物结合至在序列上与其互补的靶DNA的一部分。一旦寡核苷酸引物结合，它可被用作DNA聚合酶的起始点以启动靶DNA的扩增。
本发明的寡核苷酸引物是特异性针对真菌葡萄白粉菌的基因组DNA的一部分。更特别地，这些寡核苷酸引物是特异性针对葡萄白粉菌的细胞核核糖体内部转录间隔区(ITS)。ITS是存在于所有真核细胞中的两个非编码DNA区域(称为ITS1和ITS2)，其位于编码小亚基(18S)核糖体RNA和大亚基(25S或28S)核糖体RNA的两个基因之间，更具体地，分别地，ITS1位于编码小亚基(18S)核糖体RNA的基因和编码5.8S核糖体RNA的基因之间，ITS2位于编码5.8S核糖体RNA的基因和编码大亚基(25S或28S)核糖体RNA的基因之间。
任何PCR扩增过程(包括qPCR)使用至少两种寡核苷酸引物，通常指一对寡核苷酸引物。一对寡核苷酸引物由一个称为正向寡核苷酸引物的寡核苷酸引物和一个称为反向寡核苷酸引物的寡核苷酸引物组成。正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物分别位于PCR过程中待扩增的靶DNA的两端。正向寡核苷酸引物与靶DNA中对应于它的末端的正义链的一部分的序列相同，因此在PCR过程中结合至靶DNA的互补(即反义)链，而反向寡核苷酸引物与靶DNA中对应于它的末端(在靶DNA的另一端)的反义链的一部分的序列相同，因此在PCR过程中结合至靶DNA的互补(即正义)链。因此，寡核苷酸引物对由两个寡核苷酸引物组成——一个正向寡核苷酸引物和一个反向寡核苷酸引物，其共同限定了PCR过程中待扩增的靶DNA并且是必需的。
优选地，本发明因此提供了选自以下的寡核苷酸引物对：(i)正向寡核苷酸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，并且反向寡核苷酸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2的寡核苷酸对；(ii)正向寡核苷酸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，并且反向寡核苷酸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:4的寡核苷酸对；以及(iii)正向寡核苷酸引物的核苷酸序列为SEQ IDNO:3，并且反向寡核苷酸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:5的寡核苷酸对。
或者，本发明还提供了选自以下的寡核苷酸引物对：(i)反向寡核苷酸引物的核苷酸序列与核苷酸序列SEQ ID NO:1互补，并且正向寡核苷酸引物的核苷酸序列与核苷酸序列SEQ ID NO:2互补的寡核苷酸对；(ii)反向寡核苷酸引物的核苷酸序列与核苷酸序列SEQID NO:3互补，并且正向寡核苷酸引物的核苷酸序列与核苷酸序列SEQ ID NO:4互补的寡核苷酸对；以及(iii)反向寡核苷酸引物的核苷酸序列与核苷酸序列SEQ ID NO:3互补，并且正向寡核苷酸引物的核苷酸序列与核苷酸序列SEQ ID NO:5互补的寡核苷酸对。
本发明还涵盖了由包含上述寡核苷酸的核苷酸序列的至少10个连续核苷酸的寡核苷酸组成的寡核苷酸对。
用于实施本发明的优选的寡核苷酸引物对是正向寡核苷酸引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:1的至少10个连续核苷酸，并且反向寡核苷酸引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:2的至少10个连续核苷酸的寡核苷酸对；或者反向寡核苷酸引物包含与核苷酸序列SEQ IDNO:1互补的至少10个连续核苷酸，并且正向寡核苷酸引物包含与核苷酸序列SEQ ID NO:2互补的至少10个连续核苷酸的寡核苷酸对。
优选地，寡核苷酸引物对由以下寡核苷酸组成：其正向寡核苷酸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，并且反向寡核苷酸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；或者由以下寡核苷酸组成：其反向寡核苷酸引物的核苷酸序列与SEQ ID NO:1互补，并且正向寡核苷酸引物的核苷酸序列与SEQ ID NO:2互补。
在qPCR中，寡核苷酸引物对的使用允许对真菌葡萄白粉菌的ITS区域的特异性扩增。
本发明还提供了被用作探针以特异性检测qPCR过程中扩增的靶DNA并测量其量的寡核苷酸。本发明的寡核苷酸探针选自包含核苷酸序列SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的至少10个连续核苷酸的寡核苷酸；或选自包含核苷酸序列SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的互补序列的至少10个连续核苷酸的寡核苷酸，但排除具有核苷酸序列cgtagagccca的特定寡核苷酸。
被用作实施本发明qPCR的探针的优选寡核苷酸是包含核苷酸序列SEQ ID NO:6的至少10个连续核苷酸的寡核苷酸。或者，被用作实施本发明qPCR的探针的优选寡核苷酸是包含与核苷酸序列SEQ ID NO:6互补的至少10个连续核苷酸的寡核苷酸。
根据核苷酸序列SEQ ID NO:6设计的用作探针的寡核苷酸与根据核苷酸序列SEQID NO:1和2设计的用作引物的寡核苷酸对一起使用。对于实施本发明的qPCR而言，优选寡核苷酸引物和探针的这种组合。
或者，根据核苷酸序列SEQ ID NO:7设计的用作探针的寡核苷酸与根据核苷酸序列SEQ ID NO:3和4设计的用作引物的寡核苷酸对一起使用；或与根据核苷酸序列SEQ IDNO:3和5设计的用作引物的寡核苷酸对一起使用。
本发明提供的用作引物或用作探针的寡核苷酸的长度为至少10个连续核苷酸。根据某些替代的实施方案，所述寡核苷酸的长度为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。优选地，本发明的寡核苷酸的长度为19至21个核苷酸。
本发明因此还提供了特异性检测真菌葡萄白粉菌的方法，其包括：
(a)使用本发明的寡核苷酸引物对，对样品进行定量聚合酶链式反应(qPCR)；和
(b)通过是否可见到qPCR扩增的靶DNA来确定样品中存在或不存在葡萄白粉菌。
“特异性检测”意指旨在特异性检测可能还包含其他活生物体的样品中的真菌葡萄白粉菌而非其他活生物体的方法。至少，本发明的方法并非旨在检测在容易含有葡萄白粉菌的地点收集的样品中可能存在的任何活生物体，所述样品即在葡萄属(Vitis)植物物种(更特别为葡萄(Vitis vinifera))上或其周围收集的样品。
优选地，本发明的“样品”指在葡萄白粉菌容易存在的地点收集的少量材料，但是原则上可在任何地点收集。由于葡萄白粉菌以葡萄属物种作为其优选的宿主植物，因此其中该真菌容易存在的优选地点为在葡萄属植物物种上，或其中这类植物物种生长的地点，例如周围的土壤。由于葡萄白粉菌的这类宿主植物物种之一是广泛栽培的葡萄园葡萄，因此其中容易存在所述真菌的优选地点是在葡萄种植物上(例如叶、葡萄、树干(trunk)(或大树枝(arm))、或茎(木质茎(cane))上)，或其中这类植物种生长的地点，例如周围的土壤。因此，本发明的优选样品为葡萄种植物的少量叶(例如从整片叶切下的叶盘)或葡萄，或其中葡萄种植物生长的地点周围的少量土壤。也可通过技术人员已知的适当方法，从叶的上表面或下表面，或从葡萄、树干(或大树枝)、或茎(木质茎)的表面收集本发明的样品，即不收集植物材料。
为了使qPCR能够扩增样品中存在的任何靶DNA，需要使样品中存在的任何活物质(包括葡萄白粉菌孢子或任何其他生物结构)的DNA自由地易于接近qPCR的不同要素(即引物、DNA聚合酶、荧光报告分子)。因此，可使用样品本身进行qPCR，或可事先对样品进行DNA提取步骤。当事先对样品进行DNA提取时，技术人员可使用本领域已知的任何DNA提取方法。
本发明还涉及真菌葡萄白粉菌的特异性定量的方法，其包括：
(a)使用本发明的寡核苷酸引物对，对样品进行定量聚合酶链式反应(qPCR)；以及
(b)将qPCR扩增的靶DNA的测定量与参照DNA扩增数据进行比较，以确定样品中葡萄白粉菌的量。
“特异性定量”意指旨在特异性定量可能还包含其他活生物体的样品中存在的真菌葡萄白粉菌而非其他活生物体的量的方法。
根据本发明的方法来测定样品中存在的葡萄白粉菌的量：首先测量qPCR扩增的靶DNA的量，然后将qPCR扩增的靶DNA的该测定量与一些参照DNA扩增数据比较。“参照DNA扩增数据”是由这样的标准数据组成：其对应于从已知的靶DNA的初始量开始，在确定的扩增循环数之后，由qPCR扩增的靶DNA的量的预先确定的量度。基于所述参照DNA扩增数据，可从样品中由qPCR扩增的靶DNA的测定量来推断在qPCR扩增过程之前样品中存在的所述靶DNA的量(由此推断真菌葡萄白粉菌的量)。
使用本发明的寡核苷酸探针或使用下文所述的任何报告分子，来确定和测量qPCR过程中的靶DNA。
本发明还提供了用于检测真菌葡萄白粉菌的诊断试剂盒，因此所述试剂盒包含至少一种选自以下的寡核苷酸引物：包含核苷酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的至少10个连续核苷酸的寡核苷酸；或包含至少一种选自以下的寡核苷酸引物：包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQID NO:5的至少10个连续核苷酸互补的至少10个连续核苷酸的寡核苷酸。
优选地，用于检测真菌葡萄白粉菌的诊断试剂盒包含选自以下寡核苷酸对的寡核苷酸引物对：其正向寡核苷酸引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:1的至少10个连续核苷酸且反向寡核苷酸引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:2的至少10个连续核苷酸，正向寡核苷酸引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:3的至少10个连续核苷酸且反向寡核苷酸引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:4的至少10个连续核苷酸，正向寡核苷酸引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:3的至少10个连续核苷酸且反向寡核苷酸引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:5的至少10个连续核苷酸。
或者，用于检测真菌葡萄白粉菌的诊断试剂盒包含选自以下寡核苷酸对的寡核苷酸引物对：其反向寡核苷酸引物包含与核苷酸序列SEQ ID NO:1互补的至少10个连续核苷酸且正向寡核苷酸引物包含与核苷酸序列SEQ ID NO:2互补的至少10个连续核苷酸，反向寡核苷酸引物包含与核苷酸序列SEQ ID NO:3互补的至少10个连续核苷酸且正向寡核苷酸引物包含与核苷酸序列SEQ ID NO:4互补的至少10个连续核苷酸，反向寡核苷酸引物包含与核苷酸序列SEQ ID NO:3互补的至少10个连续核苷酸且正向寡核苷酸引物包含与核苷酸序列SEQ ID NO:5互补的至少10个连续核苷酸。
最优选地，用于检测真菌葡萄白粉菌的诊断试剂盒包含以下寡核苷酸引物对：其正向寡核苷酸引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:1的至少10个连续核苷酸且反向寡核苷酸引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:2的至少10个连续核苷酸；或包含以下寡核苷酸引物对：反向寡核苷酸引物包含与核苷酸序列SEQ ID NO:1互补的至少10个连续核苷酸且正向寡核苷酸引物包含与核苷酸序列SEQ ID NO:2互补的至少10个连续核苷酸。
根据一个具体的实施方案，所述诊断试剂盒包含由以下寡核苷酸组成的寡核苷酸引物对：所述寡核苷酸的正向寡核苷酸引物具有核苷酸序列SEQ ID NO:1且反向寡核苷酸引物具有核苷酸序列SEQ ID NO:2；或包含由以下寡核苷酸组成的寡核苷酸引物对：所述寡核苷酸的反向寡核苷酸引物具有与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列且正向寡核苷酸引物具有与SEQ ID NO:2互补的核苷酸序列。
除了寡核苷酸引物以外，所述试剂盒还包含报告分子，优选荧光报告分子。报告分子是在qPCR过程中结合至被扩增的DNA从而使得能够测量被扩增的DNA的量的化合物。荧光报告分子是化合物(例如荧光团)，当该化合物被针对其的特定波长的光激发时发射特定的荧光。
为了本发明试剂盒和方法的目的，报告分子可以是***双链DNA分子的非特异性染料。这些染料与双链核酸结合时能够增加它们的荧光信号，并且可通过标准荧光检测***来检测。技术人员已知的任何的这种***DNA的染料(例如溴化乙锭或SYBR Green)均可适于实施本发明。用于实施本发明的优选的非特异性的***DNA的荧光染料为SYBR Green染料，其IUPAC名称为N',N'-二甲基-N-[4-[(E)-(3-甲基-1,3-苯并噻唑-2-亚基)甲基]-1-苯基喹啉-1-鎓-2-基]-N-丙基丙烷-1,3-二胺。
除了非特异性的***DNA的染料，本发明的试剂盒的荧光报告分子也可以是序列特异性的荧光探针。这类探针是荧光团标记的寡核苷酸。当用于qPCR目的时，这类标记的寡核苷酸探针的序列与通过qPCR扩增的靶序列的至少10个连续核苷酸互补。
用于实施本发明的优选探针为根据TaqMan***标记的探针。TaqMan***是可从制造商Life Technologies Inc.获得的技术。根据TaqMan***，被特别设计以与被扩增的靶DNA杂交的寡核苷酸探针的5’端与荧光团共价连接，3’端与淬灭剂共价连接。用于TaqMan***的适当的荧光团的实例包括6羧基荧光素(FAM)或四氯荧光素(TET)。典型的淬灭剂为四甲基罗丹明(TAMRA)。该TaqMan***的原理是，只要淬灭剂和荧光团在探针上的位置非常接近，淬灭剂就抑制荧光团的荧光。一旦寡核苷酸探针在qPCR扩增过程中与靶DNA杂交，它就会被Taq聚合酶降解，因为该酶使寡核苷酸引物沿着对应于靶DNA的DNA延伸。这种降解释放了荧光团和淬灭剂，淬灭剂变得不再与荧光团非常接近，从而使荧光团能够发射它的荧光，该荧光随后可通过通常整合在qPCR设备(即热循环仪)中的适当工具来检测和测量。
用TaqMan***标记、或用技术人员已知的任何适当的其他***标记的用于试剂盒中的优选的寡核苷酸探针是选自以下的寡核苷酸：包含核苷酸序列SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7的至少10个连续核苷酸的寡核苷酸；或包含与核苷酸序列SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7互补的序列的至少10个连续核苷酸的寡核苷酸。
被用作实施本发明的qPCR的探针的优选的寡核苷酸是包含核苷酸序列SEQ IDNO:6的至少10个连续核苷酸的寡核苷酸。或者，被用作实施本发明的qPCR的探针的优选的寡核苷酸是包含与核苷酸序列SEQ ID NO:6互补的至少10个连续核苷酸的寡核苷酸。
根据核苷酸序列SEQ ID NO:6设计、被用作试剂盒中的探针的寡核苷酸与根据核苷酸序列SEQ ID NO:1和2设计、被用作引物的寡核苷酸对一起使用。对于用于试剂盒中及对于实施本发明的qPCR，优选寡核苷酸引物和探针的这种组合。
或者，根据核苷酸序列SEQ ID NO:7设计、被用作探针的寡核苷酸与根据核苷酸序列SEQ ID NO:3和4设计、被用作引物的寡核苷酸对一起使用；或与根据核苷酸序列SEQ IDNO:3和5设计、被用作引物的寡核苷酸对一起使用。
为本发明的试剂盒提供的寡核苷酸的长度优选地为至少10个连续核苷酸。根据某些替代实施方案，所述寡核苷酸的长度为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个核苷酸。
试剂盒还可包含实施qPCR必需的要素，例如试剂，如技术人员已知的。除了引物对和探针，试剂盒还可包含一种或多种酶(Taq聚合酶)或用于qPCR反应中的试剂。酶可以以冻干形式存在或存在于适合的缓冲剂中。另外，试剂盒可包含实施qPCR必需的所有额外的要素，例如缓冲剂、提取试剂、酶、移液管、板、核酸、三磷酸核苷、滤纸、凝胶材料、转移材料、放射自显影设备、说明书等。
序列表：
SEQ ID NO:1：引物ITS-F
SEQ ID NO:2：引物ITS-R
SEQ ID NO:3：引物ITS A-F
SEQ ID NO:4：引物ITS A-R
SEQ ID NO:5：引物ITS A-R1
SEQ ID NO:6：ITS-F探针
SEQ ID NO:7：ITS-A-R探针
通过以下实验实施例将更充分地理解本发明的各方面。
下文所述的所有方法或操作以实施例的方式给出，并且对应于在用于实现相同结果的各种可获得的方法中做出的选择。这种选择对结果的质量没有影响，因此本领域技术人员可使用任何适当的方法来实现相同的结果。特别地，除非实施例中另外说明，所使用的全部重组DNA技术是根据以下文献中所述的标准方案来实施：Sambrook andRussel(2001,Molecular cloning:A laboratory manual,第三版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,NY)、Ausubel et al.(1994,Current Protocols in Molecular Biology,Currentprotocols,USA,第1和2卷)和Brown(1998,Molecular Biology LabFax,第二版,AcademicPress,UK)。用于植物分子生物学的标准材料和方法记载于Croy R.D.D.(1993,PlantMolecular Biology LabFax,BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和BlackwellScientific Publications(UK))中。PCR(聚合酶链式反应)的标准材料和方法还记载于Dieffenbach and Dveksler(1995,PCR Primer:A laboratory manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,NY)和McPherson et al.(2000,PCR-Basics:From backgroundto bench,第一版,Springer Verlag,德国)中。
实施例
实施例1：葡萄白粉菌的特异性引物的设计
将若干白粉菌分离株用于进行qPCR方法。将这些分离株纯化并将其维持在经分离的葡萄(Vitis Vinifera cv.Cinsaut)叶上。通过树脂玻璃沉降塔(Plexiglas settlingtower)中的气泵将孢子从形成孢子12-14天的叶上吹到经消毒的叶的上表面，进行生物测定接种。将被感染的叶在22℃下在生长室(12/12h光照/黑暗的光周期)中培养，并且每3至4天转移至新鲜的琼脂培养基。将生长于叶表面的真菌材料刮到Eppendorf管中，并将被污染的叶盘冷冻于-20℃。
按照制造商的说明书，根据plantII试剂盒(Macherey-Nagel)，从葡萄白粉菌真菌分离株中提取DNA。将DNA提取物贮存于-20℃。
使用ITS1和ITS4引物，对三种实验室葡萄白粉菌分离株的ITS区域进行PCR扩增和测序(White,T.J.et al.(1990),PCR Protocols:a Guide to Methods and Applications18,315-322)。所有PCR扩增均在25μl反应混合物中进行，该反应混合物包括10μl GoTaqMix(Promega，法国)、400pmol的每种引物和30ng模板DNA。在Eppendorf热循环仪中，PCR循环被编程为如下：94℃10min；然后94℃1min、58℃退火温度1min、72℃1min，进行30个循环，之后72℃最终延伸10min。在1.5％琼脂糖凝胶中对扩增产物进行电泳(TBE 0.5X)，用Safe检测并在UV光下拍照。
对三种试验的葡萄白粉菌分离株的ITS扩增的PCR产物进行测序。通过比对软件，将所得序列与NCBI数据库中公开的序列(GenBank登录号AF049332.1和AF011325.1)进行比较。
从葡萄白粉菌真菌的不同分离株扩增的内部转录间隔区的多种序列均可在数据库中获得。用引物ITS1和ITS4对从纯菌丝体分离株提取的DNA或总坏死叶盘DNA的ITS区域进行PCR扩增，得到相同的结果。从三种试验的分离株获得约600个核苷酸的序列(附录1)。使用ClustalW多序列比对软件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)对该序列进行的分析表明所公开的序列与实验室中试验的三种分离株的序列之间的相似性。
设计用于在不同分离株之间的保守区和比对区中进行的qPCR的引物。设计的探针和引物组如表1所示。
表1：葡萄白粉菌qPCR中试验的引物和探针
所进行的所有qPCR包含正向引物、反向引物、以及探针或非特异性报告分子(例如SYBR Green)，所述探针在其5’端使用6-羧基荧光素(FAM)作为报告分子荧光团，在其3’端使用N,N,N_,N_四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)作为淬灭剂(表1)。在添加任何DNA模板之前，将qPCR两倍浓缩的主混合液(master mix)(Platinium MasterMix SybrGreen-Invitrogen和探针MasterMix-Roche)、300nM探针和300nM的每种引物合并到无菌、无核酸酶的水(Invitrogen)中。将包含所述主混合液的小瓶进行涡旋以确保溶液的均一性并在微量离心机中进行短暂地旋转沉降。将反应混合物的等分溶液(15μl)分配到每个20μl玻璃毛细管(Roche，法国)中。测试两个报告分子***——***SYBR Green测定法和TaqMan探针***。
将模板DNA(5μl)添加到每个反应，并将毛细管用塑料盖密封。在qPCR分析之前离心LightCycler 2.0样品传送装置(Sample Carousel)。使用不同的运行程序在毛细管LightCycler(Roche applied science)***中测试三组引物或引物/探针(表1)。所有测定均具有相同的探针和引物浓度。仅选择实现高qPCR效率(90％至100％)和特异性扩增的引物组和对应的程序来进行体内实验。
从以初始模板浓度范围存在的靶基因(DNA质粒)的扩增产生标准曲线，然后确定每个模板浓度的Ct值。随后，绘制这些Ct值针对初始基因拷贝数的log的简单线性回归。对于每次实验，扩增效率(E)、线性回归系数(r2)以及特别是y截距值描述了标准曲线并表明反应的灵敏度。标准曲线的斜率通过以下方程给出PCR反应的效率：效率＝10(-1/斜率)–1。
qPCR效率和特异性
为了选择表1中列出的最佳引物组，将包含葡萄白粉菌的ITS区域序列的质粒DNA以1:10的比例连续稀释。克隆的ITS序列的拷贝数来自克隆载体和***序列的分子量。使用不同的引物组(具有SYBRGreen或引物与另外的TaqMan水解探针***偶联)，按照质粒浓度进行qPCR分析。高质量测定的特征标记物是PCR扩增效率。效率的评估对于每个qPCR定量程序而言是必需的。使用以下引物获得最佳qPCR扩增效率：ITS-正向(5’-GACAGAGTGACGCTCGTGAT-3’)和ITS-反向(5’-TTCAGCGGGTATTCCTACCT-3’)(组-II)，荧光团为SYBRGreen。使用以下扩增参数来进行定量：在95℃初步预加热15min；然后在95℃变性30s、在60℃退火60s、在72℃延伸20s，进行40个循环。额外的熔解曲线分析包括在95℃预熔解15s，然后是60℃到95℃的温度斜坡，每0.1℃坡级停留15s。根据二阶导数最大值法获得数据采集和分析。
使用这组引物(组-II)的qPCR分析的计算效率接近100％，而其他试验引物显示出低效率及在一个稀释率与下一个稀释率之间更高的ΔCp丢弃(discard)。SYBR Green检测的灵敏度比TaqMan探针***的灵敏度更高，本发明人观察到在相同的更高质粒DNA浓度(1.2×106个基因拷贝)下两个测试***之间3个循环的差异。用所选择的引物组和程序来重复质粒DNA标准曲线运行(run)揭示了qPCR测定的稳定性和鲁棒性(robustness)。
因为SYBR Green是非特异性的并且结合至任何双链DNA，使用对其靶序列高度特异性的引物对是必要的。为了确保使用这些引物进行的qPCR方法高度特异性地针对葡萄白粉菌靶基因，测试其他真菌的基因组DNA。使用所选择的引物(组-II)，通过qPCR分析从灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、索兰尼链格孢(Alternaria solani)、分枝孢子菌属种(Cladosporium spp.)、青霉属种(Penicillium spp.)、轮枝孢属种(Verticilium spp.)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)和葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)的菌丝体中提取的100ng DNA。所有测试的真菌或者未被检测到，或者被检测到具有更高的Ct值以及在标准曲线的稀释最多的模板DNA(120个基因拷贝)的范围之外。由于实际上qPCR分析应当对从叶提取的总DNA进行，这些结果表明，qPCR方法是特异性针对葡萄白粉菌真菌并且其他污染真菌的存在并未干扰叶上白粉菌的定量。
实施例2：葡萄藤叶上的葡萄白粉菌DNA的体内定量
为了验证所述方法对生物样品的灵敏度和准确度，在实验室生物测定中将qPCR分析应用于从叶盘提取的总DNA，所述叶盘被葡萄白粉菌孢子的连续稀释物污染。对4个叶盘提取总DNA，并使用qPCR分析方法来分析不同培养时期测试的每个孢子浓度的100ng DNA。
从质粒DNA标准曲线来确定葡萄白粉菌靶基因的数量。在Ct＝27,13循环时检测出最低浓度2个孢子/cm2(喷洒后(d+0)立即测试)，相当于9.4×102个基因拷贝。值得注意的是，其他测试的孢子浓度的qPCR定量表明，基因拷贝数随着叶表面葡萄白粉菌孢子数成比例地增加。在Ct＝21,98循环时检测出所测试的最高孢子浓度(C4＝175个孢子/cm2)，相当于3.5×104个基因拷贝。在白粉菌的充分生长条件下培养的几乎所有叶盘都显示出样品中所定量的葡萄白粉菌靶基因的增加。这些结果证实了通过qPCR方法分析的DNA量与通过视觉注意(annotation)估计的叶上的真菌生物量变化之间的相关性。在培养以175个孢子/cm2的孢子浓度感染的叶盘12天之后，通过qPCR分析测量的葡萄白粉菌DNA的量达到1.3×106个基因拷贝。
因此，使用qPCR分析方法允许本发明人在葡萄藤叶的更早阶段、甚至在萌芽和可见症状初现之前即特异性地检测和定量葡萄白粉菌孢子的DNA。所述方法在生物测定中的灵敏度使其能够检测叶上存在的低至2个孢子/cm2的孢子。
实施例3：在田间污染中通过qPCR分析来评估葡萄白粉菌DNA
为了在田间条件下验证qPCR方法，使用实验室制备的不同密度的接种物，在不同日期在葡萄藤地块(parcel)进行人工污染。
从2013年4月到8月，在法国葡萄园St Martin d’Armagnac(Gros Manseng)进行测定。具有10株植物的种植葡萄园地块与邻近的未接种的5株植物地块一起进行试验。通过喷洒不同浓度的葡萄白粉菌孢子溶液(C1(0.1个孢子/cm2)、C2(1个孢子/cm2)和C3(10个孢子/cm2))来污染叶。在三个不同的日期进行白粉菌孢子的人工接种：4月18日、5月7日和5月23日。对于每种条件，在污染后d+0、d+7、d+14和d+30天收集5片叶，用于qPCR分析。
对于每种测试条件，对5片叶进行取样，并从这些叶制备混合的叶盘。提取总DNA并通过qPCR分析100ng。因此，qPCR数据表示每个样品的5片叶中的葡萄白粉菌DNA的量。
对于第一个接种日(2013年4月23日)，从Gros Manseng葡萄园地块收集的叶的分析表明，当在污染后立即(d+0)收集叶时，仅在对应于被孢子浓度C2(1个孢子/cm2)和C3(10个孢子/cm2)感染的叶的样品中存在葡萄白粉菌DNA(1.1×103个基因拷贝)。在从被C3(10个孢子/cm2)污染并在d+14收集的叶提取的总DNA中，靶DNA也被扩增(4.2×103个基因拷贝)。在其他测试样品中没有检测出葡萄白粉菌DNA。
对于第二个接种日(2013年5月7日)，在被三种测试浓度的葡萄白粉菌孢子感染并在d+0收集的叶中观察到显著扩增(C1：1.03×103个基因拷贝；C2：1.1×103个基因拷贝；C3：1.03×103个基因拷贝)。人工试验污染30天之后收集的叶显示，对于C2(1个孢子/cm2)和C3(10个孢子/cm2)，存在的葡萄白粉菌DNA分别为9.93×103和2.38×103个基因拷贝。在污染日期为2013年5月23日的所收集的所有样品中，仅对用C2(1个孢子/cm2)试验并立即收集(d+0)的叶检测到葡萄白粉菌DNA。
这些结果表明，当葡萄白粉菌在植物上发展时，可检测到该真菌的DNA。
实施例4：人工和天然田间污染2014：qPCR分析和白粉病进展
为了进一步评估所述qPCR方法，在2014年在不同地区的两个人工污染测定和4个天然测定中进行了其他试验。对于天然测定中的每个样品，收集10片叶。相比之下，在人工污染试验中，对于每个喷洒的孢子浓度(C1＝0.1个孢子/cm2,C2＝1个孢子/cm2和C3＝10个孢子/cm2)，收集5片叶。对于两种测定，对每片叶分析4个叶盘。在2014年4月9日进行的名为“140006-EN”的人工污染测定中，在d+0(对应于新鲜收集的叶)时在所收集的15片叶的5片叶(这些叶中的4片已用最高测试浓度C3污染、1片已用浓度C1污染)中检测出葡萄白粉菌。7天(d+7)和14天(d+14)之后收集的叶中的一半包含葡萄白粉菌。在30天(d+30)之后分析的叶样品中，6片叶被测试为葡萄白粉菌阳性。在其他试验日，以不同的比例在叶上检测到白粉菌。对于三种测试浓度而言，在所收集的15片叶中在d+0时包含葡萄白粉菌的叶的比例为在2片叶(2014年4月23日进行的试验)到6片叶(2014年5月7日进行的试验)之间变化。
同时，还在4株葡萄藤中进行监测，没有引入任何葡萄白粉菌孢子。在这种情况下，在不同阶段收集10片叶并送到实验室进行qPCR分析。对于试验“14 00 08 EN-B”，qPCR分析在第2个日期(2014年4月30日)和第3个日期(2015年5月13日)收集的叶中检测到葡萄白粉菌，但是未在第1个日期(2014年4月17日)收集的叶中检测到葡萄白粉菌。在测试区域(区域1、区域2和区域3)之间，白粉菌天然污染叶的频率不同。在从区域1收集的叶中，白粉菌DNA高度存在于所收集的10片叶的9片中。同时，在葡萄藤中进行视觉注意，在这个阶段未在视觉上观察到白粉病症状。仅在15天之后开始出现葡萄白粉菌坏死(首次视觉注意在2014年5月22日)。
在其他监测试验中所收集的叶的qPCR分析表明，葡萄白粉菌DNA仅在D1(2014年4月23日)时存在于少数叶上，但在其他两个测试日期(2014年5月5日和19日)未在叶中检测到白粉菌。从另一个试验中得到相同数据，在该试验中，在D1(2014年4月22日)时仅有2片叶被鉴定为含有葡萄白粉菌DNA，并且在D2(2014年5月5日)和D3(2014年6月2日)收集的叶上通过qPCR未检测到感染。
根据qPCR结果，葡萄白粉菌孢子在试验开始时以低频率存在并且在后来的日期没有发生发展。田间视觉注意证实了这一假设，因为仅在季末观察到白粉病症状。因此，使用本发明的方法进行的检测与植物上真菌的存在及其发展非常相关。
实施例5：在天然侵染情况下的qPCR分析和白粉病症状监测
2015年，在法国的两个不同地区(Champagne区和Armagnac区)，在天然侵染条件下进行进一步试验。在每个地区，在若干地块上进行测定(在Champagne区中的10个地块和Armagnac区中的9个地块)。对于每次试验，对每个地块收集10片叶的样品。此外，在葡萄藤植物的三个不同发育阶段收集这个量的样品：第一次样品收集在发育阶段BBCH 14/15进行(4至5个发育的叶)，第二次样品收集在阶段BBCH 53进行(6至7个发育的叶)，第三次样品收集在阶段BBCH 57进行(8至10个发育的叶)。
平行地，还仔细监测叶症状的初现和发展。该监测从阶段BBCH14/15后15天开始，然后每15天进行监测，直到发育阶段后期，包括阶段BBCH 61(开花)和阶段BBCH 71(果实形成)。
一个重要的观察结果是，在两个地区的地块中，本发明的qPCR方法能够在葡萄藤发育的极早期检测出葡萄白粉菌。在这两个地区，可在能够观察到任何可见症状之前，在早至所测试的第一发育阶段时检测到葡萄白粉菌的存在。
在Champagne区，所述测定还揭示出在不同的地块中病害的发展是在不断进展的(10个地块中仅有3个地块在阶段BBCH 14/15显示出葡萄白粉菌的存在，而10个地块中有8个地块在阶段BBCH 57时显示出葡萄白粉菌的存在)。此外，在不同的地块中，叶的症状仅在阶段BBCH 57时开始可观察到，然后进展，直到阶段BBCH 71。然而，Champagne区的测定经历了中度的侵染，这是由于在试验过程中预防性的施用了杀真菌剂。后一观察结果至少表明预防性的处理能够控制葡萄白粉菌症状的发展，而通过qPCR在葡萄藤发育的极早期就观察到该真菌的存在。
在Armagnac区，也能够在一些地块中在早期(在BBCH 14/15时)检测到葡萄白粉菌，但是在更多地块中未显示出显著的进展，因为葡萄藤正在发育(使用qPCR方法，在阶段BBCH 57时仅3个地块显示出可检测量的葡萄白粉菌)。这可通过以下事实来解释：所述病害进展缓慢，可能是由于试验期间的气候条件，因为在阶段BBCH 61之前未能观察到可见的叶的症状。然而，在这些地块上未进行杀真菌剂处理，并且所述测定揭示出所述病害在发育阶段后期(BBCH 61和BBCH 71)具有较大发展。值得注意的是，在这些发育阶段后期似乎受到侵染最严重的地块与在通过qPCR方法在更早阶段(BBCH 14/15和BBCH57)检测到葡萄白粉菌的地块是相同的地块。这些结果进一步证明，本发明的qPCR方法是用于在植物发育的极早期在葡萄藤田间检测葡萄白粉菌的准确方法，从而使得能够在病害扩散并真正影响作物之前应用预防性的但精确的处理。
序列表
<110> Bayer SAS
<120> 用于检测白粉病的方法和试剂盒
<130> BCS154006
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 葡萄钩丝壳菌(Uncinula necator)
<400> 1
gacagagtga cgctcgtgat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 葡萄钩丝壳菌(Uncinula necator)
<400> 2
ttcagcgggt attcctacct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 葡萄钩丝壳菌(Uncinula necator)
<400> 3
gtggccctta aagacagtgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 葡萄钩丝壳菌(Uncinula necator)
<400> 4
ctgtcgcgag gaacaagtta 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 葡萄钩丝壳菌(Uncinula necator)
<400> 5
tcactctgtc gcgaggaac 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 葡萄钩丝壳菌(Uncinula necator)
<400> 6
cacctttgtc cggtcatccg g 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 葡萄钩丝壳菌(Uncinula necator)
<400> 7
ctacgcgtag agcccacgcg 20

Claims (17)

1.一种寡核苷酸引物，其选自：
(i)具有核苷酸序列SEQ ID NO:1、3、4或5的寡核苷酸；
(ii)具有与核苷酸序列SEQ ID NO:1、3、4或5互补的核苷酸序列的寡核苷酸；
(iii)具有寡核苷酸SEQ ID NO:1、2、3、4、5或它们的互补核苷酸序列的至少10个连续核苷酸的核苷酸序列的寡核苷酸，但排除(a)具有核苷酸序列SEQ ID NO:2的特定寡核苷酸，和(b)具有核苷酸序列tcactctgtc的特定寡核苷酸。
2.一个寡核苷酸引物对，其由选自以下的一个正向寡核苷酸引物和一个反向寡核苷酸引物组成：
(i)寡核苷酸对，其正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，且反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，且反向引物的核苷酸序列为SEQID NO:4；正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，且反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:5；
(ii)寡核苷酸对，其反向引物的核苷酸序列与核苷酸序列SEQ ID NO:1互补，且正向引物的核苷酸序列与核苷酸序列SEQ ID NO:2互补；反向引物的核苷酸序列与核苷酸序列SEQID NO:3互补，且正向引物的核苷酸序列与核苷酸序列SEQ ID NO:4互补；反向引物的核苷酸序列与核苷酸序列SEQ ID NO:3互补，且正向引物的核苷酸序列与核苷酸序列SEQ IDNO:5互补；
(iii)任何寡核苷酸对，其核苷酸序列为(i)和(ii)的寡核苷酸对的至少10个连续核苷酸的核苷酸序列。
3.权利要求2的寡核苷酸引物对，其中所述对由以下组成：
(i)寡核苷酸对，其正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，且反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
(ii)寡核苷酸对，其反向引物的核苷酸序列与核苷酸序列SEQ ID NO:1互补，且正向引物的核苷酸序列与核苷酸序列SEQ ID NO:2互补；
(iii)任何寡核苷酸对，其核苷酸序列为(i)和(ii)中的寡核苷酸对的至少10个连续核苷酸的核苷酸序列。
4.一种寡核苷酸探针，其选自：
(i)具有核苷酸序列SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的寡核苷酸；
(ii)具有与核苷酸序列SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7互补的核苷酸序列的寡核苷酸；
(iii)具有(i)和(ii)中的寡核苷酸的至少10个连续核苷酸的核苷酸序列的任何寡核苷酸，但排除具有核苷酸序列cgtagagccca的特定寡核苷酸。
5.权利要求4的寡核苷酸探针，其选自：
(i)具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的寡核苷酸；
(ii)具有与核苷酸序列SEQ ID NO:6互补的核苷酸序列的寡核苷酸。
6.一种用于特异性检测真菌葡萄白粉菌(Erysiphe necator)的方法，其包括：
(a)使用寡核苷酸引物对，对样品进行定量聚合酶链式反应(qPCR)扩增，所述寡核苷酸引物对(i)包括至少权利要求1的寡核苷酸引物或(ii)存在于权利要求2和3的寡核苷酸引物对中；和
(b)通过是否可见到qPCR扩增的靶DNA来确定样品中存在或不存在葡萄白粉菌。
7.一种用于特异性定量真菌葡萄白粉菌的方法，其包括：
(a)使用寡核苷酸引物对，对样品进行定量聚合酶链式反应(qPCR)，所述寡核苷酸引物对(i)包括至少权利要求1的寡核苷酸引物或(ii)存在于权利要求2和3的寡核苷酸引物对中；和
(b)如果存在的话，通过比较由qPCR扩增的靶DNA的测定量与参照DNA的扩增数据来确定样品中葡萄白粉菌的量。
8.权利要求6或7中任一项的方法，其中所述寡核苷酸引物对是权利要求2和3的任意对。
9.权利要求6至8中任一项的方法，其中使用权利要求4和5中任一项的寡核苷酸探针来确定样品中葡萄白粉菌的存在或葡萄白粉菌的量。
10.权利要求9的方法，其中使用权利要求3的寡核苷酸引物对，对样品进行qPCR扩增，并使用权利要求5的寡核苷酸探针来确定样品中葡萄白粉菌的存在或葡萄白粉菌的量。
11.权利要求6至10中任一项的方法，其中扩增包括扩增葡萄白粉菌的基因间转录间隔区(ITS)序列的至少一部分。
12.一种用于检测和/或定量真菌葡萄白粉菌的诊断试剂盒，其包含至少一种权利要求1的寡核苷酸引物或权利要求2和3的寡核苷酸引物对。
13.权利要求13的诊断试剂盒，其包含权利要求2或3中任一项的寡核苷酸引物对。
14.权利要求13的诊断试剂盒，其包含权利要求4或5中任一项的寡核苷酸探针。
15.权利要求13或15中任一项的诊断试剂盒，其包含权利要求3的寡核苷酸引物对和权利要求5的寡核苷酸探针。
16.权利要求13或14中任一项的诊断试剂盒，其还包含非特异性的DNA***染料。
17.权利要求17的诊断试剂盒，其中所述非特异性的***DNA的染料是化合物SYBRGreen。
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