CN111518724A - 格氏乳杆菌hmv18及其外泌蛋白和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及格氏乳杆菌HMV18及其外泌蛋白和应用。该格氏乳杆菌HMV18于2019年7月11日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CGMCC NO：M 2019538；保藏地址为中国，武汉，武汉大学。提取自该格氏乳杆菌HMV18的蛋白具有抑菌和抗肿瘤作用，但对正常心肌细胞基本无影响，能够用于制备抑菌和抗肿瘤产品。

Description

格氏乳杆菌HMV18及其外泌蛋白和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及格氏乳杆菌HMV18及其外泌蛋白和应用。
背景技术
细菌是生物主要类群之一，对人类而言，既有有益菌，也有致病菌。当致病菌侵入血循环中生长繁殖则有可能引起细菌感染。尤其对于老人、儿童、有慢性病或免疫功能低下者，若细菌感染后处理不当、治疗不及时或伴有并发症，可发展成败血症或者脓毒血症。如，大肠杆菌属于肠道杆菌大类中的一种，寄生在人体大肠和小肠里，是人体常驻菌，正常情况下对人体健康无威胁，并能抵御致病菌以及协助合成B族维生素和维生素K2等。但当机体免疫力降低、肠道缺乏刺激等特殊情况使大肠杆菌寄居到尿道、胆囊、膀胱、阑尾等部位时则会成为致病菌，引起相应部位的感染，甚至扩散至全身感染。此外，大肠杆菌中的致病菌种在体外还可诱发人体食物中毒，或使猪、牛、羊等多种动物产生腹泻，给畜牧业带来严重危害。
现有技术中多以抗生素来防止细菌感染，然而抗生素的大量使用使耐抗生素菌不断增加，因此迫切需要一种抗生素之外的其它抗菌物质来抑制细菌增殖。
另一方面，近几年恶性肿瘤发病率在我国呈明显上升和年轻化的趋势。目前肿瘤治疗方法有手术切除、放疗、化疗和生物疗法。手术切除有多种不适用的情形，如全身性恶性肿瘤、多发性转移灶、伴有严重心肺疾病等，还有可能产生手术并发症。放疗对于骨肉瘤、纤维肉瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤等低放射敏感性肿瘤不适用，并常伴有恶心呕吐、发热、造血***受损、皮肤损害、脱发等副作用。化疗对大多数肿瘤还不可能完全治愈，需配合手术、放疗等其他治疗手段，而且化疗对正常组织存在损伤，可出现骨髓抑制、白细胞和血小板减少、恶心呕吐、肝肾功能损害、免疫功能抑制等，并会产生耐药性。生物疗法也可能在治疗过程中出现免疫过强的副作用，如发高烧，恶心等。由于实体瘤具有复杂的生物学特性，生物疗法中的免疫疗法还未达到能精准杀伤癌细胞的阶段，在实体肿瘤的治疗中存在严重的脱靶效应，并可损伤正常组织或细胞。
鉴于目前肿瘤治疗方法中的缺陷，迫切需要疗效明确、不易耐药、安全可靠、毒副作用轻微，同时能提高肿瘤患者自身的抗肿瘤免疫功能的新型疗法。
发明内容
针对抗生素的大量使用使耐抗生素菌不断增加、现有肿瘤治疗存在副作用大、靶向性差的技术问题，本发明提供一种格氏乳杆菌HMV18，
以及，本发明还提供上述格氏乳杆菌HMV18的培养方法。
以及，本发明还提供一种格氏乳杆菌外泌蛋白。
以及，本发明还提供一种格氏乳杆菌外泌蛋白的制备方法。
以及，本发明还提供上述格氏乳杆菌外泌蛋白在制备抑菌产品中的应用。
以及，本发明还提供上述制备方法制备所得格氏乳杆菌外泌蛋白在制备抑菌产品中的应用。
以及，本发明还提供上述格氏乳杆菌外泌蛋白在制备抗肿瘤产品中的应用。
以及，本发明还提供上述制备方法制备所得格氏乳杆菌外泌蛋白在制备抗肿瘤产品中的应用。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
格氏乳杆菌HMV18，其分类名称为格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)，于2019年7月11日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CGMCC NO：M 2019538；保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
本发明所提供的格氏乳杆菌HMV18从正常健康女性***中分离、筛选得到，属于乳杆菌属，具有无毒、无污染、无致癌性且无致病性，不损伤正常组织，并且不含有耐药质粒，不会引起水平传播耐药。该格氏乳杆菌HMV18分泌的蛋白成分能够抑制大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、产酸克雷伯菌等致病菌的生长繁殖。并且，该蛋白成分体外作用于肿瘤细胞系可以在40分钟内引起肿瘤细胞膜渗漏，具有明显的溶瘤作用。体内实验也证实该格氏乳杆菌HMV18 的外泌蛋白明显抑制了移植瘤动物模型中肿瘤的生长，而且可激活机体的体液免疫和细胞免疫，使机体产生肿瘤坏死因子、干扰素和白细胞介素等细胞因子，增强机体的抗肿瘤免疫应答。实体瘤具有低氧代谢区，该格氏乳杆菌HMV18 在厌氧条件下繁殖，具有向低氧代谢区趋化的特性，小鼠皮下注射格氏乳杆菌 HMV18进行安全性评价，未见明显病理改变，因此格氏乳杆菌HMV18对实体瘤有良好的靶向性，能够通过产生抗肿瘤活性的代谢产物发挥抗实体瘤的作用，抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡或直接导致肿瘤细胞膜渗漏起到溶瘤作用，可用于肿瘤治疗或作为肿瘤基因治疗的转移载体。
该格氏乳杆菌HMV18菌株的筛选方法具体包括以下步骤：
(1)标本采集
采集一个月内未服用抗生素，无肿瘤、乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒及艾滋病、恶性疾病、传染病及糖尿病等代谢性疾病病史的25岁至45岁育龄期女性的***分泌物，将收集到的分泌物编号，分别接种于改良型MRS液体培养基 (包括以下重量份数的原料：胰蛋白胨10份，牛肉膏10份，酵母提取物5份，棉子糖20份，乙酸钠5份，柠檬酸二胺2份，吐温80 1份，磷酸氢二钾2份，硫酸锰0.05份，硫酸镁0.5份，双蒸水1000份，121℃高压蒸气灭菌20min)， 37℃恒温孵育箱厌氧培养24h，将孵育好的样本以4000r/min离心15分钟，分离上清液和沉淀物，将上清放入-20℃冰箱冷冻待用(共100份上清液)，将沉淀物放入-20℃冰箱冷冻待抑菌鉴定和分离(共100份沉淀物)。
(2)抑菌试验
将大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca，K.oxytaca)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)分别划线 LB平板复苏，挑取单个菌落接种LB液体培养基，37℃培养24小时，5000r/min 离心10分钟获得菌沉淀。用生理盐水稀释菌液至1×109CFU/mL，此时分光光度计读取OD600＝1，再使用生理盐水制成浓度为105CFU/mL的菌悬液。吸取稀释好的菌悬液0.1毫升，用无菌玻璃珠均匀涂布于LB固体培养基上。涂布好敏感菌的LB固体培养基上均匀摆放3个牛津杯，向牛津杯内分别加入步骤1所得临床样本的上清液，平板放4℃吸收24h，后转入37℃温箱中孵育。24小时后，在56份上清液中发现对E.coli、K.oxytaca、S.aureus均呈现抑菌作用的菌落。
(3)分离
将(2)中得到的对E.coli、K.oxytaca、S.aureus均呈现抑菌作用的上清所对应的沉淀物划线分离接种于改良MRS琼脂培养基(包括以下重量份数的原料：胰蛋白胨10份，牛肉膏10份，酵母提取物5份，棉子糖20份，乙酸钠5 份，柠檬酸二胺2份，吐温80 1份，磷酸氢二钾2份，硫酸锰0.05份，硫酸镁0.5份，双蒸水1000份，琼脂15份和0.5份L-半胱氨酸盐酸盐，121℃高压蒸气灭菌20min)。置37℃厌氧活化72h后挑取白色光滑菌落，再通过2次划线纯化后，转至MRS液体培养基，置37℃厌氧培养。对获得的乳杆菌进行鉴定。
以及，本发明实施例还提供了一种上述格氏乳杆菌HMV18的培养方法，用改良型MRS琼脂培养基37℃恒温厌氧培养，所述改良型MRS琼脂培养基包括以下重量份数的原料：胰蛋白胨10份，牛肉膏10份，酵母提取物5份，棉子糖20份，乙酸钠5份，柠檬酸二胺2份，吐温80 1份，磷酸氢二钾2份，硫酸锰0.05份，硫酸镁0.5份，双蒸水1000份，琼脂15份和0.5份L-半胱氨酸盐酸盐。该培养基对于不同菌的增殖效果不同，能够使格氏乳杆菌HMV18 与其他菌产生形态差异而被筛选分离。
以及，本发明实施例还提供另一种上述格氏乳杆菌HMV18的培养方法，用改良型MRS液体培养基37℃恒温厌氧培养，所述改良型MRS液体培养基包括以下重量份数的原料：胰蛋白胨10份，牛肉膏10份，酵母提取物5份，棉子糖20份，乙酸钠5份，柠檬酸二胺2份，吐温80 1份，磷酸氢二钾2份，硫酸锰0.05份，硫酸镁0.5份，双蒸水1000份。该培养方法可实现格氏乳杆菌 HMV18的增菌。
以及，本发明实施例还提供一种格氏乳杆菌外泌蛋白，所述格氏乳杆菌外泌蛋白提取自上述格氏乳杆菌HMV18，是格氏乳杆菌HMV18的外泌蛋白。
以及，本发明实施例还提供一种格氏乳杆菌外泌蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤a、厌氧培养上述格氏乳杆菌HMV18并传代；
步骤b、将第二代菌液以5000rpm离心10min，弃去沉淀，得到上清液I；
步骤c、向所述上清液I中加入1N NaOH和过氧化氢酶，使所述上清液I 中的pH为6.2，4℃搅拌2h，静置2h，4℃12000rpm离心30min，弃去沉淀，得到上清液II；
步骤d、向所述上清液II中加入硫酸铵，4℃搅拌2h，静置10h，4℃12000rpm 离心30min，弃去上清液，即得。
该制备方法通过过氧化氢酶处理以及pH调节，将上清液I中的杂质，硫酸铵能够将目的蛋白进行沉淀，所得蛋白具有比格氏乳杆菌HMV18更明显的抑菌作用和抗肿瘤作用，对于大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、产酸克雷伯菌有显著的抑制作用，并能够使人***细胞Hela、人卵巢癌细胞SHIN3、人肺腺癌细胞A549、人软骨肉瘤细胞SW1353、人肝癌细胞HepG2、人骨髓神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y、黑色素瘤细胞B16-OVA等肿瘤细胞死亡，但对心肌细胞无明显影响。
优选地，步骤a中厌氧培养所述格氏乳杆菌的方法为：用改良型MRS液体养基37℃恒温厌氧培养，所述改良型MRS液体培养基包括以下重量份数的原料：胰蛋白胨10份，牛肉膏10份，酵母提取物5份，棉子糖20份，乙酸钠5 份，柠檬酸二胺2份，吐温80 1份，磷酸氢二钾2份，硫酸锰0.05份，硫酸镁0.5份，双蒸水1000份。
优选地，步骤d还包括将离心所得产物透析纯化。
以及，本发明实施例还提供上述格氏乳杆菌外泌蛋白在制备抑菌产品中的应用，所述抑菌产品中的活性成分包括上述格氏乳杆菌外泌蛋白。该格氏乳杆菌外泌蛋白能够抑制大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、产酸克雷伯菌等致病菌的生长繁殖，且不会产生耐药性。
以及，本发明实施例还提供按上述格氏乳杆菌外泌蛋白的制备方法制备所得的格氏乳杆菌外泌蛋白在制备抑菌产品中的应用。
以及，本发明实施例还提供上述格氏乳杆菌外泌蛋白在制备抗肿瘤产品中的应用。该蛋白能够使人***细胞系(Hela细胞)、人卵巢癌细胞系(SHIN3 细胞)、人肺腺癌细胞系(A549细胞)、人软骨肉瘤细胞系(SW1353细胞)、人肝癌细胞系(HepG2)、人骨髓神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y细胞)、小鼠黑色素瘤细胞系(B16-OVA细胞)等肿瘤细胞死亡，但对心肌细胞无明显影响。
以及，本发明实施例还提供按上述格氏乳杆菌外泌蛋白的制备方法制备所得的格氏乳杆菌外泌蛋白在制备抑菌产品中的应用。
附图说明
图1为本发明实施例1中改良型MRS固体培养基中的格氏乳杆菌HMV18 菌落形态；
图2为本发明实施例1中格氏乳杆菌HMV18革兰染色结果；
图3为本发明实施例1中格氏乳杆菌HMV18的H2O2实验结果；
图4为本发明实施例1中格氏乳杆菌HMV18的全长16S rDNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果；
图5为本发明实施例1中格氏乳杆菌HMV18的PCR扩增产物测序鉴定结果；
图6为本发明实施例1中格氏乳杆菌HMV18的CARD抗性基因数据库分析结果；
图7为本发明实施例1中格氏乳杆菌HMV18的细菌完成图；
图8为本发明实施例1中格氏乳杆菌HMV18的溶血现象；
图9为本发明实施例1中格氏乳杆菌HMV18灌胃实验的胃粘膜切片；
图10为本发明实施例1中格氏乳杆菌HMV18腹腔注射实验中的大菌落形态；
图11为本发明实施例1中格氏乳杆菌HMV18腹腔注射实验中的中菌落形态；
图12为本发明实施例1中格氏乳杆菌HMV18腹腔注射实验中的小菌落形态；
图13为本发明实施例1中格氏乳杆菌HMV18皮下注射实验中的皮肤切片；
图14为本发明实施例2中格氏乳杆菌外泌蛋白经SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色结果；
图15为本发明实施例3中格氏乳杆菌外泌蛋白对大肠杆菌的抑菌实验结果；
图16为本发明实施例4中格氏乳杆菌外泌蛋白的抗肿瘤实验结果；
图17为本发明实施例4中格氏乳杆菌外泌蛋白对心肌细胞的影响结果；
图18为本发明实施例4中格氏乳杆菌外泌蛋白对B16-OVA细胞的作用结果；
图19为本发明实施例4中格氏乳杆菌外泌蛋白在不同浓度和作用时间下对人肺腺癌细胞系A549的作用结果。
图20为本发明实施例4中格氏乳杆菌外泌蛋白抑制移植瘤的生长的试验结果；
图21为本发明实施例4中格氏乳杆菌外泌蛋白诱导Hela细胞凋亡的试验结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供了格氏乳杆菌HMV18的筛选、鉴定程序：
1、格氏乳杆菌HMV18的分离纯化
1.1标本采集
采集100例未服用抗生素，无肿瘤、乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒及艾滋病、糖尿病等恶性疾病、传染病或代谢性疾病病史的25岁至45岁育龄期女性的***分泌物，将收集到的分泌物编号，分别接种于改良型MRS液体培养基(胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二胺2g，吐温80 1g，磷酸氢二钾2g，硫酸锰0.05g，硫酸镁0.2g，双蒸水1 升，121℃高压蒸气灭菌20min)，37℃恒温孵育箱厌氧培养24h，将孵育好的样本以4000r/min离心15分钟，分离上清液和沉淀物，将上清液放入-20℃冰箱冷冻待用(共100份上清液)将沉淀物放入-20℃冰箱冷冻待抑菌鉴定和分离(共 100份沉淀物)。
1.2抑菌试验
将大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca，K.oxytaca)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)分别划线 LB平板复苏，挑取单个菌落接种LB液体培养基，37℃培养24小时，5000r/min 离心10分钟获得菌沉淀。用生理盐水稀释菌液至1×109CFU/mL，此时分光光度计读取OD600＝1，再使用生理盐水制成浓度为105CFU/mL的菌悬液。吸取稀释好的菌悬液0.1毫升，用无菌玻璃珠均匀涂布于LB固体培养基上。涂布好敏感菌的LB固体培养基上均匀摆放3个牛津杯，向牛津杯内分别加入步骤1所得临床样本的上清液，平板放4℃吸收24h，后转入37℃温箱中孵育。24小时后，在56份上清液中发现对E.coli、K.oxytaca、S.aureus均呈现抑菌作用的菌落。
1.3分离
将1.2中得到的对E.coli、K.oxytaca、S.aureus均呈现抑菌作用的上清所对应的沉淀物划线分离接种于改良MRS琼脂培养基。改良MRS琼脂培养基(包括以下重量份数的原料：胰蛋白胨10份，牛肉膏10份，酵母提取物5份，棉子糖20份，乙酸钠5份，柠檬酸二胺2份，吐温80 1份，磷酸氢二钾2份，硫酸锰0.05份，硫酸镁0.5份，双蒸水1000份，琼脂15份和0.5份L-半胱氨酸盐酸盐，121℃高压蒸气灭菌20min)。置37℃厌氧活化72h后挑取白色光滑菌落，再通过2次划线纯化后，转至MRS液体培养基，置37℃厌氧培养。对获得的乳杆菌进行鉴定。
2、鉴定
2.1革兰染色
将1.3中得到的白色光滑菌落培养液涂片、干燥、固定、然后进行革兰染色，待涂片干燥后，置油镜下观察。革兰染色结果为蓝紫色，说明格氏乳杆菌HMV18 为革兰阳性菌，如图2所示。
2.2过氧化氢酶试验
挑取适量1.3中得到的白色光滑菌落培养液，与3％H2O2溶液混匀。结果为阴性，说明格氏乳杆菌HMV18不产生H2O2酶，如图3所示。
2.3生化鉴定
取1.3中得到的白色光滑菌落，过夜培养，离心，获得菌体沉淀，用PBS缓冲液重悬，配成0.5麦氏单位菌液，分别接种到乳杆菌生化鉴定试剂盒的以下培养基中，每瓶100μl：纤维二糖、乳糖、菊糖、棉子糖、蔗糖、山梨醇、水杨苷、甘露醇、麦芽糖、七叶苷、1％马尿酸钠，其中七叶苷用无菌石蜡覆盖液面。培养结束后，放在记录卡上观察结果。马尿酸钠在实验结束后，观察结果时加入 0.2ml茚三酮溶液，在36±1℃水浴箱或培养箱中放置10min后判读结果。结果显示格氏乳杆菌HMV18能分解纤维二糖、乳糖、菊糖、棉子糖、蔗糖、水杨苷、麦芽糖，见表1。
表1格氏乳杆菌HMV18生化鉴定
Figure RE-GDA0002525785540000101
2.4基因组提取及16S rDNA测序鉴定种属
基因组提取：取1.3中得到的白色光滑菌落培养液，过夜培养，离心获得菌体，磁珠法破碎菌体，提取基因组，扩增16S rDNA序列，纯化PCR产物，通过DNA测序获得16S rDNA序列，与数据库中已知细菌比较获得样品种属信息，选取近似菌种序列，构建***发育树。
结果显示，新分离株为格氏乳杆菌，与Genebank已有的29株格氏乳杆菌亲缘关系较远。
全长16S rDNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示(其中：Lane 1为阳性对照，唾液乳杆菌标准株CGMCC1.1881；Lane 2为DNA Marker；Lane 3为E.coli K-12MG1655；Lane 4为新分离株)，PCR扩增产物测序鉴定结果如图5所示。经以上NCBI Blast种属特异性鉴定，可确定本发明所得格式乳杆菌是一株新的格氏乳杆菌，命名为HMV18。
3、格氏乳杆菌HMV18的安全性分析
3.1耐药性试验
对格氏乳杆菌HMV18通过全基因组测序，显示其基因组包括1.95Mb染色体，4626bp小质粒、3.2Kb大质粒和3.9Kb噬菌体。经CARD抗性基因数据库分析，基因预测结果显示，该菌质只在染色体上携带有耐利福平、链霉素、林可酰胺类抗生素、阿尔法霉素可疑序列，质粒或噬菌体上没有编码耐抗生素的基因，说明该菌不具有水平转移耐药性的威胁(如图6所示)。格氏乳杆菌 HMV18的细菌完成图(如图7所示)。
3.2溶血性试验
使用血琼脂平板接种法评估格氏乳杆菌HMV18溶血性能，实验结果显示菌落周围培养基出现1～2mm的草绿色环，α溶血环中的红细胞未完全溶解(如图8所示)。说明格氏乳杆菌HMV18该菌无致病性或为条件致病菌。
3.3动物实验
3.3.1将18-22g成年健康雄性昆明小鼠随机分成对照组和实验组，用于进行动物实验。设置环境温度22℃，湿度60％，光照12h，鼠粮和纯净水每天补足，喂养3d后进行实验。分组情况见表2。
HMV18菌悬液的制备：将活化后HMV18菌种接入15mL离心管中置于温箱中培养18-24小时。在温箱培养的HMV18菌悬液加入MRS液体培养基测定 OD值，并通过用MRS液体反复稀释菌悬液来调节OD值，至分光光度计显示 1OD时，所得菌液即可用于进行动物实验。
分别用灌胃实验检测该格氏乳杆菌对小鼠胃粘膜的损害，用腹腔注射实验检测该格氏乳杆菌是否引起腹膜炎，用皮下接种实验检测该格氏乳杆菌是否造成感染，用静脉注射实验检测该格氏乳杆菌是否引起菌血症、败血症。结果如表3所示。胃粘膜切片如图9所示。
表2动物实验分组
Figure RE-GDA0002525785540000111
Figure RE-GDA0002525785540000121
表3灌胃实验各项目考察结果
Figure RE-GDA0002525785540000122
注：同列肩标小写字母表示差异不显著(P>0.05)。
表4腹腔注射实验考察结果(2天)
Figure RE-GDA0002525785540000123
Figure RE-GDA0002525785540000131
注：同列肩标小写字母表示差异不显著(P>0.05)。
表5腹腔注射实验考察结果(4天)
Figure RE-GDA0002525785540000132
注：同列肩标小写字母表示差异不显著(P>0.05)。
表6腹腔注射实验考察结果(8天)
Figure RE-GDA0002525785540000141
注：同列肩标小写字母表示差异不显著(P>0.05)。
表7腹腔注射实验细菌易位实验结果
Figure RE-GDA0002525785540000142
Figure RE-GDA0002525785540000151
各组大菌落形态如图10所示，中菌落形体如图11所示，小菌落形态如图 12所示。
表8皮下注射实验实验考察结果
Figure RE-GDA0002525785540000152
注：同列肩标小写字母表示差异不显著(P>0.05)。
皮肤切片如图13所示，其中A图为皮下注射HMV18皮肤，B图为皮下注射PBS的皮肤。
3.4有害代谢产物检测
配制分别含有组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、酪氨酸、精氨酸的氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基MRS培养基。接种格氏乳杆菌HMV18，对其进行脱羧酶试验,对照管应呈黄色，测定管呈紫色(指示剂为溴甲酚紫)为阳性，若测定管呈黄色为阴性。生物胺过量会使人体中毒，导致严重的后果，会引起头疼、血压变化、呼吸紊乱、心悸、呕吐等严重反应。格氏乳杆菌HMV18结果如表9所示，格氏乳杆菌HMV18不产生脱羧酶，不会分解氨基酸使其脱羧生成有害物质生物胺。
表9脱羧酶试验结果
氨基酸 组氨酸 赖氨酸 鸟氨酸 酪氨酸 精氨酸 MRS培养基
结果 黄色 黄色 黄色 黄色 黄色 黄色
3.5粘蛋白降解实验
取1.3中得到的白色光滑菌落培养液，过夜培养，分别以1％的量接种至四种MRS培养基(每100ml培养基中添加粘蛋白和/或葡萄糖，添加量如表10所示)，37℃培养48h。孵育后，通过在12,24,36和48小时测量600nm处的吸光度来评估细菌生长。粘蛋白是上皮组织中的主要成分，覆盖于粘膜表面，对上皮细胞起保护和润滑作用。当细菌能够利用和降解粘蛋白时，表明它可能通过机体屏障进行细菌移位。在检测微生物的安全性时，应检测粘液的溶解能力，以判断细菌的易位能力。结果如表10所示，该结果表明格氏乳杆菌HMV18不能分解利用粘蛋白，不具备体内细菌异位的能力，此结果与小鼠皮下接种格氏乳杆菌HMV18安全性评价的结果一致，接种部位皮肤无明显炎症反应，亦无 HMV18在皮下组织中的扩散。
表10粘蛋白降解实验结果(OD值)
添加物和添加量 0h 12h 24h 36h 48h 72h
0.25g粘蛋白 0.019 0.229 0.287 0.248 0.288 0.161
0.5g粘蛋白 0 0.03 0.052 0.036 0.048 0.006
0.2g葡萄糖 0 1.999 1.627 1.586 1.598 1.36
0.2g葡萄糖+0.25g粘蛋白 0 0.518 0.392 0.317 0.512 0.132
4、全基因组测序结果分析
全基因组测序结果显示，其染色体上携带gatAX基因(见表11)，说明格氏乳杆菌HMV18可以产生细菌素Gassericin T，对***致病菌有拮抗作用。
表11格氏乳杆菌HMV18全基因组测序基因预测结果
Figure RE-GDA0002525785540000161
实施例2
本实施例提供了一种格氏乳杆菌外泌蛋白，其制备方法为：
1、格氏乳杆菌外泌蛋白的分离
取-80℃冷冻保存的格式乳杆菌HMV18按5wt％的接种量，接种到10ml改良型MRS液体培养基中，混匀。置于37℃恒温培养箱中厌氧培养20h。培养基混浊代表活化成功，得到第一代菌液。
取第一代菌液，按3wt％的接种量接入密封螺口玻璃瓶中的改良型MRS液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中厌氧培养24h，得到第二代菌液。
将第二代菌液倒入50ml离心管中，配平后，以5000rpm离心10min，弃去沉淀，得到上清液I；
向上清液I中加入1N NaOH和过氧化氢酶，使所述上清液I中的pH为6.2， 4℃搅拌2h，静置2h，4℃12000rpm离心30min，弃去沉淀，得到上清液II；
向上清液II中用秤量勺缓慢加入研细的硫酸铵粉末，4℃下用磁力搅拌器搅拌2h，静置10h，4℃12000rpm离心30min，弃去上清液，所得沉淀即为格氏乳杆菌外泌蛋白粗品。
2、格氏乳杆菌外泌蛋白的纯化
用2％NaHCO3·1mM EDTA(PH8.0)溶液煮沸透析袋10分钟，用双蒸水彻底清洗，1mMEDTA煮沸10分钟，冷却，用透析液彻底清洗。将步骤1所得格氏乳杆菌外泌蛋白粗品用移液器移入透析袋内，密封后，浸入PBS-0.2g叠氮化钠透析液中，用磁力搅拌器4℃搅拌，每隔6小时换一次透析液，共三次，最后一次换成无叠氮化钠PBS。透析24小时后，收集产物，即纯化后的格氏乳杆菌外泌蛋白。
3、格氏乳杆菌外泌蛋白的鉴定
将步骤2所得格氏乳杆菌外泌蛋白进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后(如图14所示，其中1为硫酸铵加入量为30wt％时得到的沉淀蛋白，2为硫酸铵加入量为40wt％时得到的沉淀蛋白，M为Marker)，进行分子量比对鉴定。结果提示该格氏乳杆菌外泌蛋白编码并表达细菌素Gassericin T(Gat A和Gat X)。
实施例3
本发明实施例提供了实施例2所得格氏乳杆菌外泌蛋白在抑菌方面的实验效果。
将实施例2所得格氏乳杆菌外泌蛋白用牛津杯法检测其对E.coli、K. oxytaca、S.aureus的抑菌活性。将大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca，K.oxytaca)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)分别划线LB平板复苏，挑取单个菌落接种LB液体培养基， 37℃培养24小时，5000r/min离心10分钟获得菌沉淀。用生理盐水稀释菌液至 1×109CFU/mL，此时分光光度计读取OD600＝1，再使用生理盐水制成浓度为105 CFU/mL的菌悬液。吸取稀释好的菌悬液0.1毫升，用无菌玻璃珠均匀涂布于 LB固体培养基上。涂布好敏感菌的LB固体培养基上均匀摆放3个牛津杯，向牛津杯内分别加入中和后的实施例2所得格氏乳杆菌外泌蛋白，37℃孵育24h。结果显示实施例2所得HMV18分泌的格氏乳杆菌外泌蛋白对E.coli的抑菌圈直径15mm，为阳性，对K.oxytaca的抑菌圈直径18mm，为阳性，对S.aureus 的抑菌圈直径17mm，为阳性(如图15所示，其中A为大肠杆菌的抑制结果， B为金黄色葡萄球菌的抑制结果，C为产酸克雷伯菌的抑制结果)。L.salivarias 11741为标准株，L.salivarias F1为市售益生菌产品中分离的菌株，均为阳性对照菌。以上结果说明HMV18分泌的格氏乳杆菌外泌蛋白对大肠杆菌、产酸克雷伯菌、金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果。
实施例4
本发明实施例提供了实施例2所得格氏乳杆菌外泌蛋白在抗肿瘤方面的实验效果。
将实施例2中的厌氧培养改为有氧培养，按实施例2的分离纯化方法制备蛋白，作为对比例。以改良型MRS液体培养基为空白对照，将实施例2所得格氏乳杆菌外泌蛋白以及对比例所得蛋白以相同的添加量分别与人***细胞系(Hela细胞)、人卵巢癌细胞系(SHIN3细胞)、人肺腺癌细胞系(A549)、人软骨肉瘤细胞系(SW1353细胞)、人肝癌细胞系(HepG2)、人骨髓神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y细胞)的细胞在37℃共同孵育40min，结果如图16所示，与实施例2所得格氏乳杆菌外泌蛋白共同孵育的上述肿瘤细胞凸起逐渐收缩消失，变圆，95％以上贴壁细胞浮起，2h后可见细胞溶解碎裂，仍然可见少数散在、较为完整的细胞轮廓，但是这些残留的细胞轮廓与正常细胞的大小、形态有着明显的差别，并且，实施例2所得格氏乳杆菌外泌蛋白的溶瘤作用明显优于对比例所得蛋白。由该结果可见，实施例2所得格氏乳杆菌外泌蛋白对肿瘤细胞系的溶瘤作用没有明显的选择性，对多种肿瘤均有良好的抑瘤效果。
恢复各细胞至正常培养条件24h，未见再次贴壁，最终细胞崩解死亡。
同时，实施例2所得格氏乳杆菌外泌蛋白对正常心肌细胞系亦无明显影响 (如图17所示)。
以改良型MRS液体培养基为空白对照，用实施例2所得格氏乳杆菌外泌蛋白以及对比例蛋白在37℃与B16-OVA(黑色素瘤细胞系)共同孵育2h，显微镜观察细胞形态及OVA蛋白的表达。结果提示改良型MRS液体培养基中 B16-OVA细胞有较正常培养细胞仍有少量绿色荧光蛋白GFP表达；与实施例2 所得格氏乳杆菌外泌蛋白共同孵育后，95％以上细胞变圆、脱落、浮起，无绿色荧光蛋白表达，GFP溶瘤作用显著；与对比例蛋白共同孵育后，B16-OVA细胞无绿色荧光蛋白表达，但细胞形态尚可，并未浮起脱落(如图18所示)。
以改良型MRS液体培养基为空白对照，将实施例2所得的格氏乳杆菌外泌蛋白以不同浓度(1μg/ml，100μg/ml)与人肺腺癌细胞系A549在37℃孵育 35min、60min后扫描电镜观察。结果显示如图19所示，其中a为无蛋白的培养上清(即按实施例2的制备方法分离蛋白粗品时经饱和硫酸铵沉淀后弃去的上清液)的孵育结果，b为与1μg/ml格氏乳杆菌外泌蛋白共同孵育35min的结果，c为与100μg/ml格氏乳杆菌外泌蛋白共同孵育35min的结果，d为与100μg/ml格氏乳杆菌外泌蛋白共同孵育1小时结果。图19可见，与1μg/ml和 100μg/ml格氏乳杆菌外泌蛋白共同孵育35min，均可以观察到A549细胞膜出现许多圆形孔洞，细胞膜完整性受损，蛋白浓度为100μg/ml时细胞病变更加明显。d图中可见细胞崩解碎裂，形成细胞碎片，肿瘤细胞死亡。
构建移植瘤动物模型，观察体内溶瘤效果，结果显示实施例2所得格氏乳杆菌外泌蛋白可以明显抑制移植瘤的生长(如图20所示)。流式细胞技术结果显示实施例2所得格氏乳杆菌外泌蛋白可以诱导Hela细胞凋亡，并对Hela细胞的细胞周期也有显著影响，用实施例2所得格氏乳杆菌外泌蛋白处理细胞 35min，如图21所示细胞数量显著减少，S期细胞占比降低至0％，细胞DNA 合成停止，S期消失，对其它各期也有明显影响。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.格氏乳杆菌HMV18，于2019年7月11日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CGMCC NO：M 2019538；保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
2.一种权利要求1所述格氏乳杆菌HMV18的培养方法，其特征在于，用改良型MRS琼脂培养基37℃恒温厌氧培养，所述改良型MRS琼脂培养基包括以下重量份数的原料：胰蛋白胨10份，牛肉膏10份，酵母提取物5份，棉子糖20份，乙酸钠5份，柠檬酸二胺2份，吐温80 1份，磷酸氢二钾2份，硫酸锰0.05份，硫酸镁0.5份，双蒸水1000份，琼脂15份和0.5份L-半胱氨酸盐酸盐。
3.一种权利要求1所述格氏乳杆菌HMV18的培养方法，其特征在于，用改良型MRS液体培养基37℃恒温厌氧培养，所述改良型MRS液体培养基包括以下重量份数的原料：胰蛋白胨10份，牛肉膏10份，酵母提取物5份，棉子糖20份，乙酸钠5份，柠檬酸二胺2份，吐温80 1份，磷酸氢二钾2份，硫酸锰0.05份，硫酸镁0.5份，双蒸水1000份。
4.一种格氏乳杆菌外泌蛋白，其特征在于，所述格氏乳杆菌外泌蛋白提取自权利要求1所述格氏乳杆菌HMV18。
5.一种格氏乳杆菌外泌蛋白的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤a、厌氧培养权利要求1所述格氏乳杆菌HMV18并传代；
步骤b、将第二代菌液以5000rpm离心10min，弃去沉淀，得到上清液I；
步骤c、向所述上清液I中加入1N NaOH和过氧化氢酶，使所述上清液I中的pH为6.2，4℃搅拌2h，静置2h，4℃12000rpm离心30min，弃去沉淀，得到上清液II；
步骤d、向所述上清液II中加入硫酸铵，4℃搅拌2h，静置10h，4℃12000rpm离心30min，弃去上清液，收集沉淀蛋白，即得。
6.根据权利要求5所述格氏乳杆菌外泌蛋白的制备方法，其特征在于，步骤a步骤a中厌氧培养所述格氏乳杆菌HMV18的方法为：用改良型MRS液体养基37℃恒温厌氧培养，所述改良型MRS液体培养基包括以下重量份数的原料：胰蛋白胨10份，牛肉膏10份，酵母提取物5份，棉子糖20份，乙酸钠5份，柠檬酸二胺2份，吐温80 1份，磷酸氢二钾2份，硫酸锰0.05份，硫酸镁0.5份，双蒸水1000份；和/或
步骤d还包括将离心所得产物透析纯化。
7.权利要求4所述格氏乳杆菌外泌蛋白在制备抑菌产品中的应用，所述抑菌产品中的活性成分包括所述格氏乳杆菌外泌蛋白。
8.权利要求5制备所得格氏乳杆菌外泌蛋白在制备抑菌产品中的应用，所述抑菌产品中的活性成分包括权利要求5制备所得格氏乳杆菌外泌蛋白。
9.权利要求4所述格氏乳杆菌外泌蛋白在制备抗肿瘤产品中的应用，所述抗肿瘤产品中的活性成分包括权利要求4所述格氏乳杆菌外泌蛋白。
10.权利要求5制备所得格氏乳杆菌外泌蛋白在制备抗肿瘤产品中的应用，所述抗肿瘤产品中的活性成分包括权利要求5制备所得所述格氏乳杆菌外泌蛋白。
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CN113717875A (zh) * 2021-03-17 2021-11-30 孙长春 一种格氏乳杆菌及其应用

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