CN111518157A - 一种雷公藤甲素衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种雷公藤甲素衍生物，其具有式I所示结构：

Description

一种雷公藤甲素衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种雷公藤甲素衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

肿瘤治疗的一大难题是化疗药物选择性差，毒性大。基于肿瘤细胞与正常细胞的差异设计药物有望实现抗肿瘤药物一定的选择性。研究表明，肿瘤细胞的线粒体膜电位远大于正常细胞，随着人们对肿瘤细胞中线粒体的功能和结构变化的了解，化合物特异性地靶向至线粒体成为了药物开发的一个新的领域。

天然产物是发现抗肿瘤活性化合物的宝库。1972年，Kupchan第一次从雷公藤的乙醇提取物中分离并鉴定出了具有显著抗白血病活性的环氧二萜内酯类化合物—雷公藤甲素(Triptolide，雷公藤内酯醇)。研究表明，雷公藤甲素是一种有效的抗肿瘤剂，在体外和体内均能抑制癌细胞的生长，但是由于雷公藤甲素水溶性差、治疗窗口狭窄，并能引起严重的不良反应，细胞毒性大，使其临床应用受到了严重的限制。

发明内容

因此，本发明的目的是一种雷公藤甲素衍生物及其制备方法和应用，本发明的雷公藤甲素衍生物相较于雷公藤甲素在保留较好的抗肿瘤活性的同时对肿瘤细胞具有更好的选择性，对正常细胞的毒性降低，以及具有更好的水溶性，有利于药物的体内吸收和发挥药效，减少不良反应，本发明的雷公藤甲素衍生物具有作为抗肿瘤药物的潜力。

具体地，本发明的技术方案如下所示：

在本发明的第一方面，提供了一种雷公藤甲素衍生物，其具有式I所示结构：

其中，n为4-10的整数，优选为5-10的整数。

本发明的化合物是一类具有亲油和亲水双亲性的阳离子化合物，相较于雷公藤甲素具有改善的水溶性，并且其能够在线粒体跨膜电位的推动下，聚集于细胞线粒体部位。由于肿瘤细胞的线粒体膜电位高于正常细胞，可提供推动力在肿瘤细胞线粒体内选择性的积聚,从而具有线粒体靶向性并且本发明的化合物表现出线粒体毒性可导致肿瘤细胞死亡。

本发明的发明人在本发明的研究过程中研究了结构变化对于抗肿瘤活性以及对于正常细胞减毒的影响，结果发现，如下结构所示，A、B、C三部分是实现本发明抗肿瘤效果以及对于正常细胞减毒效果的必要结构，并且B部分中n的取值为4-10的整数，尤其通过研究发现，C部分不仅能够带来靶向定位作用，而且能够当其与A、B(n为4-10的整数)两部分按照下式所示方式相连后可在维持较好的抑瘤作用的同时表现十分理想的对于正常细胞的减毒作用。但是，若B部分中n值过高，比如n为11或以上时，其对于乳腺癌细胞的抑制效果显著降低，抑癌活性(以IC₅₀值计)可降低40倍左右，并且对于肝癌细胞的抑制效果不佳，对于正常细胞几乎不具有减毒作用。

此外，本发明在研究过程中还分别合成了

两种结构，结果发现，两种结构的化合物均能够表现一定的抑制肝癌细胞的活性，其中，

化合物在n取值为4-10的整数时，能够表现出与雷公藤甲素相当的抑癌效果，但却无法降低对于正常细胞的毒性作用；

中，n取值为3-10的整数时，其对于乳腺癌细胞具有一定的抑制作用，IC₅₀值在0.6-0.8μM左右，但并未表现出对于正常细胞的减毒效果。

在本发明的较为优选地实施方式中，n优选为4、5、6、7、10，所述化合物选自以下结构：

在本发明的第二方面，提供了一种制备上述第一方面中所述的雷公藤甲素衍生物的方法，其包括：以雷公藤甲素TP为起始原料，使雷公藤甲素的C-14β-OH进行酯化反应，得中间体化合物，然后将中间体化合物与三苯基膦发生成盐反应，生成式I所示的雷公藤甲素衍生物；

其中，n为4-10的整数。

在本发明提供的一些实施方式中，所述方法通过如下反应路线实现：

其中，n为4-10的整数；

在本发明的一些实施方式中，所述酯化反应的缩合剂选自N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)中的一种或多种，优选为EDCI；所述酯化反应的催化剂选自4-二甲氨基吡啶(DMAP)、三乙胺(TEA)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)中的一种或多种，优选为DMAP。

在本发明的进一步的实施方式中，所述酯化反应采用EDCI/DMAP法，所述酯化反应的溶剂选自三氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷中的一种或多种，优选为二氯甲烷，反应温度为室温。

在本发明的一些实施方式中，所述成盐反应的溶剂选自甲苯、N,N-二甲基甲酰胺、正丁醇和乙腈中的一种或多种，优选为乙腈。

在本发明的一些实施方式中，成盐反应在80-85℃加热回流条件下进行。

在一些较为优选的实施方式中，所述方法包括：以雷公藤甲素为起始原料，以EDCI/DMAP法，室温下在二氯甲烷中与

进行酯化反应，检测反应完成，得到黄色澄清溶液，分离得到中间体化合物

然后以乙腈为溶剂在80-85℃加热回流条件下与三苯基膦进行成盐反应，检测反应完成后，分离得到本发明的式X化合物。

其中，所述方法中，雷公藤甲素、EDCI、DMAP、

二氯甲烷的加入量之比为1mol:4mol:2mol:3mol:55mL；中间体化合物、三苯基膦和乙腈加入量之比为1mol：(3-3.1)mol：120mL。

应当知晓，在本发明的披露下，本领域技术人员能够在本发明的基础上进一步优化反应条件，比如在本领域更多的常用的试剂中选择替代溶剂，比如根据本发明公开的物质用量在常规的调整中进一步扩大或缩小比例以获得更高的收率或减少杂质的产生，当然，还应当理解的是，每步反应后，本领域技术人员可选择对产物进行纯化的操作以使得下一步反应更加精准，常规的纯化方法都可以作为选择或者经过常规实验后加以选择。

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，其包含上述第一方面中所述的雷公藤甲素衍生物。

在本发明的第四方面，提供了一种药物制剂，其包含上述第一方面中所述雷公藤甲素衍生物和至少一种药学上可接受的载体或辅料。

本发明所述“组合物”指包括治疗有效量的规定成分的药物产品，以及直接或间接地由规定量的规定成分的组合产生的任何产品。

本发明的雷公藤甲素衍生物或含有它的药物组合物或药物制剂可以单位剂量形式给药。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混旋剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物等。

本发明的药物组合或药物制剂中还可以含有常用的载体，这些载体包括但不局限于：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清蛋白、缓冲物质(如磷酸盐、甘油、山梨酯、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐)或电解质、硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜂蜡、羊毛酯等。载体在药物组合物或药物制剂中的含量可以是1wt％-98wt％，通常大约占到80wt％。为方便起见，防腐剂、缓冲剂等可直接溶于载体中。

所述药学上可接受的辅料，包括但不限于赋形剂，所述赋形剂可以为粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂等等。所述辅料指药物组合物或药物制剂中除有效成分之外的成分，其对受试者无毒，且与药物活性成分可稳定共存或采用适当手段后稳定共存。

口服片剂和胶囊可以含有粘合剂，比如糖浆、***胶、山梨醇、黄芪胶或聚乙烯吡咯烷酮；可以含有填充剂，比如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇、氨基乙酸；可以含有润滑剂，如硬脂酸镁，滑石，聚乙二醇，硅土；可以含有崩解剂，如马铃薯淀粉，或可接受的增润剂，如月桂醇钠硫酸盐。片剂可以用制药学上公知的方法包衣。

口服液可以制成水和油的悬浮液，溶液，乳浊液，糖浆，也可以制成干品，用前补充水或其它合适的媒质。这种液体制剂可以包含常规的添加剂，如悬浮剂、山梨醇、纤维素甲醚、葡萄糖糖浆、凝胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶、氢化的食用油脂、乳化剂、如卵磷脂、山梨聚糖单油酸盐、***树胶；或非水载体(可能包含可食用油)，如杏仁油、油脂如甘油、乙二醇、或乙醇；防腐剂，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，山梨酸。如需要可添加调味剂或着色剂。

对于胃肠外投药，液态剂型通常由化合物和一种消毒的载体制成。载体首选水。依照所选载体和药物浓度的不同，化合物既可溶于载体中也可制成悬浮溶液，在制成注射用溶液时先将化合物溶于水中，过滤消毒后装入封口瓶或安瓿中。

在本发明的第五方面，提供了一种靶向线粒体的药物载体，其包含上述第一方面中所述的雷公藤甲素衍生物。

在本发明的实施方式中，经验证本发明的雷公藤甲素衍生物可以利用肿瘤细胞膜电位差异在肿瘤细胞线粒体内选择性地积聚，因而具有很好的肿瘤细胞线粒体靶向性。

在本发明的第六方面，提供了一种递药***，其包含上述第一方面中所述的雷公藤甲素衍生物或上述第五方面中所述的靶向线粒体的药物载体。本发明的雷公藤甲素衍生物因其良好的对肿瘤细胞线粒体的靶向性，使得其能够作为递药***或递药***中的主要成分，可选择地将更多具有活性的药物递送至肿瘤细胞的线粒体内，实现良好的肿瘤治疗作用。

在本发明的第七方面，提供了上述第一方面中所述的雷公藤甲素衍生物或上述第三方面中所述的药物组合物或上述第四方面中所述药物制剂或上述第五方面中所述的靶向线粒体的药物载体或上述第六方面中所述的递药***在制备抗肿瘤药物中的应用。

在本发明的实施方式中，所述肿瘤为肝癌或乳腺癌。

在本发明的实施方式中，本发明的化合物在保留较好的抗肿瘤活性(对于肝癌和乳腺癌的抗癌活性与雷公藤甲素相当，但显著优于盐酸阿霉素)的同时相较于雷公藤甲素对肿瘤细胞具有更好的选择性和对正常细胞更低的毒性，其中，本发明的雷公藤甲素衍生物相较于雷公藤甲素对于正常肝细胞的毒性降低高达827倍(以IC₅₀值计算)，至少能够降低6-20倍，对与肿瘤细胞具有更好的选择性，以及对于正常细胞更为安全。

同时，本发明的雷公藤甲素衍生物相较于雷公藤甲素具有更好的水溶性，有利于药物的体内吸收和发挥药效，减少不良反应。

以及，本发明还提供了一种***的方法，其包括向受试者施用治疗有效剂量的上述第一方面中所述的雷公藤甲素衍生物或上述第三方面中所述的药物组合物或上述第四方面中所述药物制剂或上述第五方面中所述的靶向线粒体的药物载体或上述第六方面中所述的递药***，所述肿瘤尤其指肝癌和乳腺癌，特别是肝癌；所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。所述“治疗有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织***、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。必须认识到，本发明所述活性成分的最佳给药剂量和间隔是由其性质和诸如给药的形式、路径和部位以及所治疗的特定哺乳动物等外部条件决定的，而这一最佳给药剂量可用常规的技术确定。同时也必须认识到，最佳的疗程，即同时化合物在额定的时间内每日的剂量，可用本领域内公知的方法确定。

本发明具有以下有益效果：本发明的雷公藤甲素衍生物能够靶向肿瘤细胞线粒体，与雷公藤甲素相比，具有对于肿瘤细胞相当的抑制活性，但具有更好的水溶性和对肿瘤细胞的选择性，对正常细胞的毒性作用大大降低，能够有效地抑制肝癌细胞和乳腺癌细胞，且由于水溶性的改善能够有利于药物的体内吸收和发挥药效，以及对正常细胞的更低的毒性作用，能够大大减少药物的不良反应，本发明的雷公藤甲素衍生物具有被开发为抗肿瘤新药的潜力。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1化合物Mito-TP-1制备

将雷公藤甲素(0.055mmol，20mg)、5-溴戊酸(0.165mmol，29.9mg)、EDCI(0.22mmol，42.2mg)、DMAP(0.11mmol，13.4mg)加入到2ml无水二氯甲烷中，氮气保护下室温反应8小时，反应进程在TLC检测下进行，得到黄色澄清溶液。用碳酸氢钠饱和溶液萃取三次，取下层二氯甲烷层，加入适量无水硫酸镁干燥20分钟，减压抽滤，旋蒸浓缩。采用硅胶制备板法(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)分离，得到白色固体粉末，取中间体1(0.0382mmol，20.0mg)溶于3mL乙腈中，加入三苯基膦(0.116mmol，29.3mg)，油浴80℃加热回流48h，TLC检测反应基本反应完成，旋蒸浓缩。采用硅胶制备板法(二氯甲烷：甲醇＝15：1)分离，得到白色固体13.1mg，即为Mito-TP-1。

合成路线如下：

波谱数据：

中间体1：¹H NMR(600MHz,CD₃OD)δ5.09(s,1H,H-14),4.79(m,2H,H-19),3.97(d,J＝3.2Hz,1H,H-11),3.64(d,J＝3.0Hz,1H,H-12),3.49(m,2H,H-5'),3.49(m,1H,H-7),2.79(m,1H,H-5),2.41(m,2H,H-2'),2.27(m,1H,H-2a),2.27(m,1H,H-6a),2.07(m,1H,H-2b),1.90(m,1H,H-15),1.90(m,1H,H-6b),1.90(m,4H,H-3',H-4'),1.52(m,1H,H-1a),1.35(m,1H,H-1b),1.05(s,3H,H-20),0.96(d,J＝7.0Hz,3H,H-17),0.86(d,J＝6.9Hz,3H,H-16)；¹³CNMR(150MHz,CD₃OD)δ176.24(C-18),174.29(CH ₂CO-,C-1'),164.02(C-4),125.69(C-3),72.89(C-14),72.13(C-19),65.04(C-13),64.33(C-9),62.92(C-8),61.28(C-7),56.90(C-11),56.39(C-12),41.60(C-5),36.97(C-10),34.32(C-2'),33.95(C-5'),33.08(C-4'),30.97(C-1),29.79(C-15),24.89(C-6),24.33(C-3'),18.06(C-17),18.06(C-2),17.26(C-16),14.34(C-20).

化合物Mito-TP-1：¹H NMR(600MHz,CD₃OD)δ7.78(m,3H,H-4”),7.65(m,6H,H-2”,H-6”),7.61(m,6H,H-3”,H-5”),4.99(s,1H,H-14),4.77(m,2H,H-19),4.01(d,J＝3.3Hz,1H,H-11),3.68(d,J＝3.1Hz,1H,H-12),3.45(d,J＝5.7Hz,1H,H-7),3.23(m,2H,H-5'),2.70(m,1H,H-5),2.45(m,2H),2.14(m,2H),1.97(m,1H),1.75(m,5H),1.51(m,1H),1.32(m,1H,H-1a),1.20(m,1H,H-1b),0.78(d,J＝7.0Hz,3H,H-20),0.68(d,J＝6.9Hz,3H,H-16),0.62(s,3H,H-20)；¹³C NMR(150MHz,CD₃OD)δ176.15(C-18),174.07(C-1'),163.83(C-4),136.49(d,J＝3.0Hz,C-4”),135.02(d,J＝10.1Hz,C-2”,C-6”),131.72(d,J＝12.9Hz,C-3”,C-5”),125.69(C-3),120.02(d,J＝86.5Hz,C-1”),72.91(C-14),72.11(C-19),65.00(C-13),64.24(C-9),63.10(C-8),61.35(C-7),57.04(C-11),56.25(C-12),41.49(C-5),36.89(C-10),34.18(C-2'),30.93(C-1),29.77(C-15),26.77(d,J＝17.6Hz,C-4'),24.30(C-6),22.98(d,J＝4.2Hz,C-3'),22.58(d,J＝51.8Hz,C-5'),18.07(C-17),18.00(C-2),17.26(C-16),14.46(C-20).HPLC purity:99％.HR-ESI-MS m/z 705.2981(C₄₃H₄₆O₇P⁺[M-Br]⁺计算值705.2976)

实施例2化合物Mito-TP-2制备

根据实施例1的方法，按如下合成路线选择原料制备得到中间体2和化合物Mito-TP-2。

合成路线如下：

波谱数据：

中间体2：¹H NMR(600MHz,CD₃OD)δ5.08(s,1H,H-14),4.80(m,2H,H-19),3.96(d,J＝3.2Hz,1H,H-11),3.63(d,J＝3.1Hz,1H,H-12),3.48(m,2H,H-6'),3.48(m,1H,H-7),2.78(m,1H,H-5),2.48(m,2H,H-2'),2.27(m,1H,H-2a),2.27(m,1H,H-6a),2.06(m,1H,H-2b),1.85(m,1H,H-15),1.85(m,1H,H-6b),1.85(m,2H,H-5'),1.67(m,2H,H-3'),1.50(m,2H,H-4'),1.50(m,1H,H-1a),1.33(m,1H,H-1b),1.04(s,3H,H-20),0.95(d,J＝7.0Hz,3H,H-17),0.85(d,J＝6.9Hz,3H,H-16)；¹³C NMR(150MHz,CD₃OD)δ176.18(C-18),174.53(C-1'),163.98(C-4),125.66(C-3),72.77(C-14),72.12(C-19),65.03(C-13),64.35(C-9),62.85(C-8),61.24(C-7),56.86(C-11),56.35(C-12),41.59(C-5),36.96(C-10),35.10(C-2'),34.29(C-6'),33.83(C-5'),30.96(C-1),29.73(C-15),28.66(C-4'),25.40(C-3'),24.32(C-6),18.09(C-17),18.05(C-2),17.28(C-16),14.37(C-20).

化合物Mito-TP-2：¹H NMR(600MHz,CD₃OD)δ7.90(m,3H,H-4”),7.86(m,6H,H-2”,H-6”),7.77(m,6H,H-3”,H-5”),5.06(s,1H,H-14),4.79(m,2H,H-19),3.95(d,J＝3.2Hz,1H,H-11),3.61(d,J＝2.5Hz,1H,H-12),3.46(m,1H,H-7),3.42(m,2H,H-6'),2.76(d,J＝13.2Hz,1H,H-5),2.37(m,2H,H-2'),2.25(m,1H,H-2a),2.25(m,1H,H-6a),2.00(s,1H,H-2b),1.82(m,1H,H-15),1.82(m,1H,H-6b),1.74(m,6H,H-3',H-4',H-5'),1.30(m,2H,H-1),0.93(d,J＝7.0Hz,3H,H-17),0.90(s,3H,H-20),0.84(d,J＝6.9Hz,3H,H-16)；¹³C NMR(150MHz,CD₃OD)δ176.19(C-18),174.26(C-1'),163.95(C-4),136.48(d,J＝3.6Hz,C-4”),135.02(d,J＝10.5Hz,C-2”,C-6”),131.72(d,J＝12.9Hz,C-3”,C-5”),125.63(C-3),120.08(d,J＝86.6Hz,C-1”),72.84(C-14),72.14(C-19),65.12(C-13),64.30(C-9),62.98(C-8),61.29(C-7),57.05(C-11),56.25(C-12),41.50(C-5),36.91(C-10),34.64(C-2'),30.91(C-1),30.53(d,J＝16.7Hz,C-5'),29.85(C-15),25.16(C-3'),24.29(C-6),23.12(d,J＝5.1Hz,C-4'),22.81(d,J＝51.3Hz,C-6'),18.11(C-17),18.02(C-2),17.29(C-16),14.50(C-20).HPLC purity:98％.HR-ESI-MS m/z 719.3122(C₄₄H₄₈O₇P⁺[M-Br]⁺计算值719.3132)

实施例3化合物Mito-TP-3制备

根据实施例1的方法，按如下合成路线选择原料制备得到中间体3和化合物Mito-TP-3。

合成路线如下：

波谱数据：

中间体3：¹H NMR(600MHz,CD₃OD)δ5.08(s,1H,H-14),4.80(m,2H,H-19),3.96(d,J＝3.1Hz,1H,H-11),3.63(d,J＝2.5Hz,1H,H-12),3.46(m,2H,H-7'),3.46(m,1H,H-7),2.78(m,1H,H-5),2.45(m,2H,H-2'),2.27(m,1H,H-2a),2.27(m,1H,H-6a),2.06(m,1H,H-2b),1.85(m,1H,H-15),1.85(m,1H,H-6b),1.85(m,2H,H-6'),1.67(m,2H,H-3'),1.50(m,2H,H-5'),1.50(m,2H,H-4'),1.50(m,1H,H-1a),1.33(m,1H,H-1b),1.04(s,3H,H-20),0.95(d,J＝7.0Hz,3H,H-17),0.85(d,J＝6.9Hz,3H,H-16)；¹³C NMR(150MHz,CD₃OD)δ176.24(C-18),174.73(C-1'),164.03(C-4),125.68(C-3),72.78(C-14),72.13(C-19),65.04(C-13),64.36(C-9),62.83(C-8),61.26(C-7),56.85(C-11),56.39(C-12),41.61(C-5),36.98(C-10),35.22(C-2'),34.42(C-7'),34.00(C-6'),30.97(C-1),29.78(C-15),29.21(C-4'),29.02(C-5'),26.08(C-3'),24.35(C-6),18.07(C-17),18.07(C-2),17.26(C-16),14.36(C-20).

化合物Mito-TP-3：¹H NMR(600MHz,CD₃OD)δ7.89(m,3H,H-4”),7.85(m,6H,H-2”,H-6”),7.76(m,6H,H-3”,H-5”),5.06(m,1H,H-14),4.78(m,2H,H-19),3.93(d,J＝3.2Hz,1H,H-11),3.60(d,J＝2.4Hz,1H,H-12),3.45(d,J＝5.6Hz,1H,H-7),3.40(m,2H,H-7'),2.76(m,1H,H-5),2.39(m,2H,H-2'),2.24(m,1H,H-2a),2.24(m,1H,H-6a),2.00(m,1H,H-2b),1.81(m,1H,H-15),1.81(m,1H,H-6b),1.69(m,6H,H-3',H-4',H-6'),1.45(m,2H,H-5'),1.45(m,1H,H-1a),1.31(m,1H,H-1b),0.93(d,J＝7.0Hz,3H,H-17),0.88(s,3H,H-20),0.83(d,J＝6.9Hz,3H,H-16)；¹³C NMR(150MHz,CD₃OD)δ176.18(C-18),174.60(C-1'),163.93(C-4),136.47(d,J＝3.6Hz,C-4”),135.00(d,J＝10.2Hz,C-2”,C-6”),131.71(d,J＝13.2Hz,C-3”,C-5”),125.68(C-3),120.11(d,J＝86.2Hz,C-1”),72.77(C-14),72.11(C-19),65.01(C-13),64.29(C-9),62.84(C-8),61.36(C-7),56.91(C-11),56.32(C-12),41.48(C-5),36.91(C-10),35.10(C-2'),31.33(d,J＝16.4Hz,C-6'),30.85(C-1),29.83(C-15),29.05(C-4'),25.83(C-3'),24.33(C-6),23.41(d,J＝4.8Hz,C-5'),22.74(d,J＝50.8Hz,C-7'),18.09(C-17),18.05(C-2),17.26(C-16),14.40(C-20).HPLC purity:94％.HR-ESI-MS m/z733.3292(C₄₅H₅₀O₇P⁺[M-Br]⁺计算值733.3289)

实施例4化合物Mito-TP-4制备

根据实施例1的方法，按如下合成路线选择原料制备得到中间体4和化合物Mito-TP-4。

合成路线如下：

波谱数据：

中间体4：¹H NMR(600MHz,CD₃OD)δ5.07(s,1H,H-14),4.79(m,2H,H-19),3.96(d,J＝3.2Hz,1H,H-11),3.62(m,1H,H-12),3.45(m,2H,H-8'),3.45(m,1H,H-7),2.78(m,1H,H-5),2.39(m,2H,H-2'),2.27(m,1H,H-2a),2.27(m,1H,H-6a),2.08(m,1H,H-2b),1.87(m,1H,H-15),1.87(m,1H,H-6b),1.87(m,2H,H-7'),1.67(m,2H,H-3'),1.47(m,2H,H-6'),1.47(m,2H,H-4'),1.47(m,1H,H-1a),1.36(m,2H,H-5'),1.36(m,1H,H-1b),1.04(s,3H,H-20),0.95(d,J＝7.0Hz,3H,H-17),0.85(d,J＝6.9Hz,3H,H-16)；¹³C NMR(150MHz,CD₃OD)δ176.22(C-18),174.79(C-1'),164.04(C-4),125.68(C-3),72.75(C-14),72.13(C-19),65.04(C-13),64.36(C-9),62.80(C-8),61.24(C-7),56.83(C-11),56.39(C-12),41.61(C-5),36.98(C-10),35.28(C-2'),34.56(C-8'),34.09(C-7'),30.97(C-1),29.92(C-4'),29.77(C-5'),29.64(C-6'),29.18(C-15),26.17(C-3'),24.36(C-6),18.07(C-17),18.06(C-2),17.27(C-16),14.37(C-20).

化合物Mito-TP-4：¹H NMR(600MHz,CD₃OD)δ7.89(m,3H,H-4”),7.80(m,6H,H-2”,H-6”),7.75(m,6H,H-3”,H-5”),5.06(s,1H,H-14),4.78(m,2H,H-19),3.94(d,J＝3.2Hz,1H,H-11),3.61(d,J＝2.3Hz,1H,H-12),3.45(d,J＝5.7Hz,1H,H-7),3.39(m,2H,H-8'),2.77(m,1H,H-5),2.37(m,2H,H-2'),2.25(m,1H,H-2a),2.25(m,1H,H-6a),2.03(m,1H,H-2b),1.82(m,1H,H-15),1.82(m,1H,H-6b),1.64(m,6H,H-3',H-4',H-7'),1.39(m,4H,H-5',H-6'),1.39(m,2H,H-1),0.96(s,3H,H-20),0.93(d,J＝7.0Hz,3H,H-17),0.83(d,J＝6.9Hz,3H,H-16)；¹³C NMR(150MHz,CD₃OD)δ176.20(C-18),174.67(C-1'),163.99(C-4),136.46(d,J＝3.6Hz,C-4”),134.98(d,J＝10.4Hz,C-2”,C-6”),131.69(d,J＝12.4Hz,C-3”,C-5”),125.68(C-3),120.15(d,J＝86.2Hz,C-1”),72.76(C-14),72.12(C-19),65.03(C-13),64.32(C-9),62.78(C-8),61.30(C-7),56.87(C-11),56.33(C-12),41.53(C-5),36.95(C-10),35.21(C-2'),31.52(d,J＝16.5Hz,C-7'),30.89(C-1),29.79(C-15),29.62(C-5'),29.56(C-4'),26.01(C-3'),24.35(C-6),23.54(d,J＝5.0Hz,C-6'),22.76(d,J＝50.8Hz,C-8'),18.09(C-17),18.06(C-2),17.26(C-16),14.40(C-20).HPLC purity:96％.HR-ESI-MS m/z747.3457(C₄₆H₅₂O₇P⁺[M-Br]⁺计算值747.3445)

实施例5化合物Mito-TP-5制备

根据实施例1的方法，按如下合成路线选择原料制备得到中间体5和化合物Mito-TP-5。

合成路线如下：

波谱数据：

中间体5：¹H NMR(600MHz,CD₃OD)δ5.07(s,1H,H-14),4.80(m,2H,H-19),3.96(d,J＝3.2Hz,1H,H-11),3.63(d,J＝3.0Hz,1H,H-12),3.45(m,2H,H-11'),3.45(m,1H,H-7),2.78(m,1H,H-5),2.39(m,2H,H-2'),2.26(m,1H,H-2a),2.26(m,1H,H-6a),2.08(m,1H,H-2b),1.87(m,1H,H-15),1.87(m,1H,H-6b),1.87(m,2H,H-10'),1.66(m,2H,H-3'),1.51(m,1H,H-1a),1.43(m,2H,H-4'),1.35(m,1H,H-1b),1.35(m,10H,H-5',H-6',H-7',H-8',H-9'),1.04(s,3H,H-20),0.95(d,J＝7.0Hz,3H,H-17),0.85(d,J＝6.9Hz,3H,H-16)；¹³CNMR(150MHz,CD₃OD)δ176.23(C-18),174.86(C-1'),164.04(C-4),125.69(C-3),72.74(C-14),72.14(C-19),65.03(C-13),64.35(C-9),62.77(C-8),61.24(C-7),56.82(C-11),56.39(C-12),41.61(C-5),36.98(C-10),35.36(C-2'),34.63(C-11'),34.15(C-10'),30.97(C-1),30.66(C-6'),30.63(C-7'),30.52(C-5'),30.11(C-4'),29.98(C-8'),29.78(C-9'),29.32(C-15),26.30(C-3'),24.38(C-6),18.08(C-17),18.07(C-2),17.27(C-16),14.38(C-20).

化合物Mito-TP-5：¹H NMR(600MHz,CD₃OD)δ7.80(m,3H,H-4”),7.70(m,6H,H-2”,H-6”),7.65(m,6H,H-3”,H-5”),4.97(s,1H,H-14),4.68(m,2H,H-19),3.84(d,J＝3.2Hz,1H,H-11),3.52(m,1H,H-12),3.35(d,J＝5.7Hz,1H,H-7),3.29(m,2H,H-11'),2.68(m,1H,H-5),2.27(m,2H,H-2'),2.15(m,1H,H-2a),2.15(m,1H,H-6a),1.94(m,1H,H-2b),1.75(m,1H,H-15),1.75(m,1H,H-6b),1.55(m,4H,H-3',H-4'),1.44(m,2H,H-10'),1.37(m,1H,H-1a),1.22(m,10H,H-5',H-6',H-7',H-8',H-9'),1.22(m,1H,H-1b),0.91(s,3H,H-20),0.84(d,J＝7.0Hz,3H,H-17),0.73(d,J＝6.9Hz,3H,H-16)；¹³C NMR(150MHz,CD₃OD)δ176.20(C-18),174.81(C-1'),164.04(C-4),136.46(d,J＝3.6Hz,C-4”),134.96(d,J＝10.3Hz,C-2”,C-6”),131.69(d,J＝13.1Hz,C-3”,C-5”),125.65(C-3),120.16(d,J＝86.3Hz,C-1”),72.72(C-14),72.13(C-19),65.03(C-13),64.33(C-9),62.79(C-8),61.25(C-7),56.83(C-11),56.36(C-12),41.57(C-5),36.96(C-10),35.33(C-2'),31.69(d,J＝16.5Hz,C-10'),30.94(C-1),30.47(C-7'),30.42(C-6'),30.07(C-8'),29.94(C-5'),29.77(C-15),26.25(C-4'),24.35(C-3'),23.63(d,J＝5.0Hz,C-9'),22.74(d,J＝51.1Hz,C-11'),18.09(C-17),18.07(C-2),17.26(C-16),14.36(C-20).HPLC purity:99％.HR-ESI-MS m/z 789.3919(C₄₉H₅₈O₇P⁺[M-Br]⁺计算值789.3915)

实施例6雷公藤甲素与雷公藤甲素衍生物抗肿瘤活性对照研究

1.实验材料

对照药物：雷公藤甲素(简称：TP)，盐酸阿霉素(简称：DO)；

实验药物：本发明实施例1-5制备的中间体1，中间体2，中间体3，中间体4，中间体5，以及化合物Mito-TP-1，化合物Mito-TP-2，化合物Mito-TP-3，化合物Mito-TP-4，化合物Mito-TP-5。

细胞培养：L-02人正常肝细胞株，上海中乔新舟生物科技有限公司；HepG-2人肝癌细胞株，山东大学药学院；MCF-7人胸腺癌细胞株，山东大学药学院；RPMI-1640培养液，DMEM培养液，胎牛血清，含0.25％EDTA胰蛋白酶，MTT(四甲基偶氮唑)，DMSO(二甲基亚砜)，青霉素-链霉素溶液(100×)，0.5％乳酸环丙沙星氯化钠注射液，PBS(磷酸盐缓冲液)。

仪器：酶标仪：美国Bio Ted；移液器：德国Eppendorf；超净生物安全柜：美国Thermo Fisher Scientific；二氧化碳培养箱：美国Thermo Fisher Scientific；灭菌锅：日本Sanyo；倒置显微镜：日本Olympus；Minispin离心机：德国Eppendorf。

2.实验方法

对于人肝癌细胞(HepG-2)：将人肝癌细胞(HepG-2)在含10％胎牛血清，1％青链霉素混合液(100X)，0.5％乳酸环丙沙星氯化钠注射液的DMEM培养液中，使细胞在含5％CO₂，37℃培养箱中培养至铺满皿底(d-60mm培养皿)，吸除培养基，1mL PBS洗一次，加入500μL含EDTA胰酶消化3min，1mL 10％FBS的DMEM培养基终止消化，转移到1.5mL离心管中，1000rpm离心4min，弃上清，取1mL培养基重悬制成细胞悬液。取10μL细胞悬液，用血球计数板计数。计算公式：细胞数/毫升原细胞悬液＝(四个象限的细胞总数/4)*细胞悬液的稀释倍数*10⁴。取300μL细胞悬液，加入到11mL10％FBS的DMEM培养基中，将细胞接种至96孔板中，每孔100μL，接种浓度为(8-10)*10³/ml，5％CO₂，37℃培养箱中培养过夜。待细胞贴壁且生长至对数生长期后，将药物用2％FBS的DMEM培养基稀释，采用不同浓度药物处理细胞，同时设立对照组(空白对照组：2％FBS的DMEM培养基加入0.1％DMSO)，每孔100μL，药物作用时间48h。药物作用时间结束，取1mL MTT加到9mL无血清DMEM培养基，吸除含药物2％FBS的DMEM培养基，每孔100μL，5％CO₂，37℃培养箱中培养4h。MTT孵育结束后，吸除含MTT的DMEM培养基，每孔加入100μL DMSO，振板1min，酶标仪570nm处测吸光值(OD值)。

人肝正常细胞L-02：将人肝正常细胞(L-02)在含10％胎牛血清，1％青链霉素混合液(100X)，0.5％乳酸环丙沙星氯化钠注射液的RPMI-1640培养液中，使细胞在含5％CO₂，37℃培养箱中培养至铺满皿底(d-60mm培养皿)，吸除培养基，1mL PBS洗一次，加入500μL含EDTA胰酶消化2min，1mL10％FBS的RPMI-1640培养基终止消化，转移到1.5mL离心管中，1000rpm离心4min，弃上清，取1mL培养基重悬制成细胞悬液。取10μL细胞悬液，用血球计数板计数。计算公式：细胞数/毫升原细胞悬液＝(四个象限的细胞总数/4)*细胞悬液的稀释倍数*10⁴。取300μL细胞悬液，加入到11mL10％FBS的RPMI-1640培养基中，将细胞接种至96孔板中，每孔100μL，接种浓度为(8-10)*10³/ml，5％CO₂，37℃培养箱中培养过夜。待细胞贴壁且生长至对数生长期后，将药物用2％FBS的RPMI-1640培养基稀释，采用不同浓度药物处理细胞，同时设立对照组(空白对照组：2％FBS的RPMI-1640培养基加入0.1％DMSO)，每孔100μL，药物作用时间48h。药物作用时间结束，取1mL MTT加到9mL无血清RPMI-1640培养基，吸除含药物2％FBS的RPMI-1640培养基，每孔100μL，5％CO₂，37℃培养箱中培养4h。MTT孵育结束后，吸除含MTT的培养基，每孔加入100μL DMSO，振板1min，酶标仪570nm处测吸光值(OD值)。

对于人乳腺肿瘤细胞(MCF-7)：操作步骤同人肝正常细胞(L-02)。

所有结果按公式：lgIC₅₀＝Xm-I*[sigP-(3-Pm-Pn)/4]，计算出IC₅₀，其中Xm:药物最高浓度的对数值；sigP:所有抑制率的总和；I:lg(药物最高浓度/与最高浓度相邻的药物浓度)；Pm:最大杀伤率；Pn:最小杀伤率。

3.实验结果

化合物Mito-TP-1、化合物Mito-TP-2、化合物Mito-TP-3、化合物Mito-TP-4、化合物Mito-TP-5与雷公藤甲素的IC₅₀(μM)比较结果，见表1。

表1雷公藤甲素衍生物与雷公藤甲素的IC₅₀(μM)比较

由表1可以看出：本发明制备的雷公藤甲素衍生物与雷公藤甲素相比对于肝癌细胞和乳腺癌细胞具有相当的抑制活性，与盐酸阿霉素相比具有更好的抑制活性；并且本雷公藤甲素衍生物的中间体化合物1-5也表现出对于肝癌细胞和乳腺癌细胞的抑制活性，但是Mito-TP-1～Mito-TP-5与雷公藤甲素相比对正常细胞的毒性普遍降低，其中化合物Mito-TP-1、Mito-TP-2、Mito-TP-3、Mito-TP-4、Mito-TP-5分别对正常肝细胞L-02的毒性降低了约827倍、16倍、15倍、6倍和20倍，而中间体化合物1-5并未出现明显的减毒活性，与雷公藤甲素的毒性作用相当。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种雷公藤甲素衍生物，其具有式I所示结构：

其中，n为4-10的整数。

2.根据权利要求1所述的雷公藤甲素衍生物，其特征在于，所述化合物选自以下结构：

3.一种制备权利要求1或2中所述的雷公藤甲素衍生物的方法，其包括：以雷公藤甲素TP为起始原料，使雷公藤甲素的C-14β-OH进行酯化反应，得中间体化合物，然后将中间体化合物与三苯基膦发生成盐反应，生成式I所示的雷公藤甲素衍生物；

其中，n为4-10的整数。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法通过如下反应路线实现：

其中，n为4-10的整数；

优选地，所述酯化反应的缩合剂选自DCC、DIC和EDCI中的一种或多种；所述酯化反应的催化剂选自DMAP、TEA和DIPEA中的一种或多种；

优选地，所述酯化反应采用EDCI/DMAP法，所述酯化反应的溶剂选自三氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷中的一种或多种，反应温度为室温；

优选地，所述成盐反应的溶剂选自甲苯、N,N-二甲基甲酰胺、正丁醇和乙腈中的一种或多种；

优选地，成盐反应在80-85℃加热回流条件下进行。

5.一种药物组合物，其包含权利要求1或2中所述的雷公藤甲素衍生物。

6.一种药物制剂，其包含权利要求1或2中所述的雷公藤甲素衍生物和至少一种药学上可接受的载体或辅料。

7.一种靶向线粒体的药物载体，其包含权利要求1或2中所述的雷公藤甲素衍生物。

8.一种递药***，其包含权利要求1或2中所述的雷公藤甲素衍生物或权利要求7中所述的靶向线粒体的药物载体。

9.权利要求1或2所述的雷公藤甲素衍生物或权利要求5所述的药物组合物或权利要求6所述的药物制剂或权利要求7所述的靶向线粒体的药物载体或权利要求8所述的递药***在制备抗肿瘤药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌或乳腺癌。