CN111505139A - 一种三叶青药材中山柰酚-3-o-芸香糖苷含量的测定方法 - Google Patents
一种三叶青药材中山柰酚-3-o-芸香糖苷含量的测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种三叶青药材中山柰酚‑3‑O‑芸香糖苷含量的测定方法,属于化学检测技术领域。本发明使用高效液相色谱法对三叶青药材中山柰酚‑3‑O‑芸香糖苷的含量进行测定,取样量小、提取溶剂用量少、提取溶液不需要浓缩,测定方法简便快速且重复性好,能够对三叶青药材的质量进行准确评价。实施例结果表明,本发明方法所得谱图山柰酚‑3‑O‑芸香糖苷峰与其他峰的分离度大于1.5,说明其分离度好;在线性关系试验中,本发明测定方法进样量在0.004~0.12μg范围内线性关系良好;在重复性试验中,本发明测定方法山柰酚‑3‑O‑芸香糖苷含量的相对标准偏差为2.76%,说明本发明方法重复性良好。
Description
技术领域
本发明涉及药物中间体生产技术领域,特别涉及一种三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的测定方法。
背景技术
三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)为葡萄科三叶崖爬藤属多年生常绿藤本植物,是我国特有的珍稀药用植物。三叶青具有清热解毒、消肿止痛、化痰散结的功效,用于治疗高热惊厥、肺炎、肝炎、毒蛇咬伤等症。三叶青主要分布在浙江、江西、福建、湖南、广西、贵州等地。
目前,三叶青药材的质量控制成分为三叶青中黄酮类物质。使用高效液相色谱法对三叶青中黄酮类成分进行测定时,由于三叶青中黄酮类成分种类较多,需要的样品取样量较大,为3.0~4.0g;提取溶剂用量多,为40~50mL,且提取后溶液需要浓缩,测定方法较为繁琐。因此,需要寻找一种新的三叶青药材质量控制成分及其测定方法,以降低样品取样量和提取溶剂用量,并简化测定过程。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的测定方法。本发明通过对三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷进行高效液相色谱测试,取样量小,提取溶剂用量少,方法简单,且能够对三叶青药材的质量进行准确评价。
为了实现上述发明的目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的测定方法,包括以下步骤:
(1)将三叶青粉末与甲醇混合,依次进行超声提取和微滤,所述微滤得到的滤液为供试品溶液;所述三叶青粉末的质量为0.11~0.22g,所述甲醇的体积为5~10mL;
(2)取样所述供试品溶液进行高效液相色谱测试,得到供试品液相色谱测试结果;
所述高效液相色谱测试的条件包括:
色谱柱为CAPCELL PAK C18,所述色谱柱的柱长为250mm,柱径为4.6mm,填料粒径为5μm;
所述高效液相色谱的柱温为30℃;
所述高效液相色谱的流动相A为乙腈,流动相B为纯水;所述流动相A和B的流速为1.0mL/min;
所述流动相的洗脱方式为梯度洗脱,所述梯度洗脱的程序为:
0min时,流动相A与B的体积比为15:85;
30min时,流动相A与B的体积比为30:70;
(3)根据预定的标准曲线和所述步骤(2)得到的供试品液相色谱测试结果,得到所述供试品溶液的理论进样量,所述标准曲线为山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品进样量与液相色谱峰面积之间的线性关系曲线;
(4)根据所述步骤(3)得到的理论进样量和所述步骤(2)的实际进样量,得到三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量。
优选的,所述三叶青粉末的粒度≥40目。
优选的,所述超声提取的功率为300~400W,频率为40kHz,时间为50~60min。
优选的,所述微滤的方法为微孔膜过滤。
优选的,所述微滤用微孔膜为醇溶性微孔膜,孔径为0.45μm。
优选的,所述高效液相色谱测试的进样量为5~10μL。
优选的,所述高效液相色谱测试的检测器为紫外可见光检测器;所述检测器的检测波长为350nm。
本发明提供了一种三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的测定方法,山柰酚-3-O-芸香糖苷在三叶青药材黄酮类成分中含量较高,且是三叶青抗氧化、抗炎和抗肿瘤作用的活性成分。本发明使用三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷作为质量控制成分,通过高效液相色谱法对三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量进行测定,取样量小、提取溶剂用量少、提取溶液不需要浓缩,测定方法简便快速且重复性好,能够对三叶青药材的质量进行准确评价。实施例结果表明,本发明方法所得谱图山柰酚-3-O-芸香糖苷峰与其他峰的分离度大于1.5,说明其分离度好;在线性关系试验中,本发明测定方法进样量在0.004~0.12μg范围内线性关系良好;在重复性试验中,本发明测定方法山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的相对标准偏差为2.76%,说明本发明方法重复性良好。
附图说明
图1为1μL(0.004mg/mL)对照品溶液的HPLC图谱;
图2为3μL(0.004mg/mL)对照品溶液的HPLC图谱;
图3为5μL(0.004mg/mL)对照品溶液的HPLC图谱;
图4为7μL(0.004mg/mL)对照品溶液的HPLC图谱;
图5为10μL(0.004mg/mL)对照品溶液的HPLC图谱;
图6为3μL(0.04mg/mL)对照品溶液的HPLC图谱;
图7为对照品溶液的标准曲线图;
图8为实施例1中供试品溶液的HPLC图谱;
图9为实施例2中供试品溶液的HPLC图谱;
图10为实施例3中供试品溶液的HPLC图谱;
图11为实施例4中供试品溶液的HPLC图谱;
图12为实施例5中供试品溶液的HPLC图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的测定方法,包括以下步骤:
(1)将三叶青粉末与甲醇混合,依次进行超声提取和微滤,所述微滤得到的滤液为供试品溶液;所述三叶青粉末的质量为0.11~0.22g,所述甲醇的体积为5~10mL;
(2)取样所述供试品溶液进行高效液相色谱测试,得到供试品液相色谱测试结果;
所述高效液相色谱测试的条件包括:
色谱柱为CAPCELL PAK C18,所述色谱柱的柱长为250mm,柱径为4.6mm,填料粒径为5μm;
所述高效液相色谱的柱温为30℃;
所述高效液相色谱的流动相A为乙腈,流动相B为纯水;所述流动相的流速为1.0mL/min;
所述流动相的洗脱方式为梯度洗脱,所述梯度洗脱的程序为:
0min时,流动相A与B的体积比为15:85;
30min时,流动相A与B的体积比为30:70;
(3)根据预定的标准曲线和所述步骤(2)得到的供试品液相色谱测试结果,得到所述供试品溶液的理论进样量,所述标准曲线为山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品进样量与液相色谱峰面积之间的线性关系曲线;
(4)根据所述步骤(3)得到的理论进样量和所述步骤(2)的实际进样量,得到三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量。
本发明将三叶青粉末与甲醇混合,依次进行超声提取和微滤,所述微滤得到的滤液为供试品溶液。在本发明中,所述三叶青粉末的制备方法优选包括以下步骤:
将三叶青药材依次进行粉碎和过筛,得到三叶青粉末。
本发明对所述粉碎的方式没有特殊的要求,使用本领域技术人员熟知的粉碎方式即可。在本发明中,所述过筛优选为过40~60目筛,所述三叶青粉末的粒度优选≥40目,更优选≥60目。
在本发明中,所述三叶青粉末的质量为0.11~0.22g,优选为0.2g;所述甲醇的体积为5~10mL,优选为10mL。本发明对所述三叶青粉末与甲醇的混合方式没有特殊的要求,使用本领域技术人员熟知的混合方式即可,具体的如搅拌混合。在本发明中,所述超声提取的功率优选为300~400W,更优选为350W;所述超声提取的频率优选为40kHz,时间优选为50~60min,更优选为52~56min。本发明在所述超声提取后,优选将所得溶液冷却至室温并用甲醇补足减失量。本发明使用甲醇作为提取剂,能够将目标组分充分的提取出来。
在本发明中,所述过滤的方式优选为微孔膜过滤,所述微孔膜优选为醇溶性微孔膜,所述微孔膜的孔径优选为0.45μm。
本发明得到所述滤液后,不需要浓缩,所述滤液直接作为供试品溶液进样。
得到供试品溶液后,本发明取样所述供试品溶液进行高效液相色谱测试,得到供试品液相色谱测试结果。在本发明中,所述高效液相色谱测试的进样量优选为5~10μL。在本发明中,所述高效液相色谱测试的条件包括:
色谱柱为CAPCELL PAK C18,所述色谱柱的柱长为250mm,柱径为4.6mm,填料粒径为5μm;
所述高效液相色谱的柱温为30℃;
所述高效液相色谱的流动相A为乙腈,流动相B为纯水;所述流动相的流速为1.0mL/min;
所述流动相的洗脱方式为梯度洗脱,所述梯度洗脱的程序为:
0min时,流动相A与B的体积比为15:85;
30min时,流动相A与B的体积比为30:70。
在本发明中,所述高效液相色谱分析的检测器优选为紫外可见光检测器;所述检测器的检测波长优选为350nm。本发明通过对检测波长筛选、对洗脱程序进行设定,在进行高效液相色谱分离时,洗脱相不需要加酸,山柰酚-3-O-芸香糖苷成分即能得到很好的分离。
得到供试品液相色谱测试结果后,本发明根据预定的标准曲线和所述步骤(2)得到的供试品液相色谱测试结果,得到所述供试品溶液的理论进样量,所述标准曲线为山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品进样量与液相色谱峰面积之间的线性关系曲线。
在本发明中,所述标准曲线的获得方法优选为:
提供山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品溶液;
对不同进样量的对照品溶液进行高效液相色谱分析,得到对照品液相色谱图和山柰酚-3-O-芸香糖苷峰面积;
以峰面积为纵坐标,以山柰酚-3-O-芸香糖苷进样量为横坐标绘制标准曲线。
在本发明中,所述对照品溶液的浓度优选为0.004mg/mL。在本发明中,所述提供山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品溶液优选包括以下步骤:
称取山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品1.6mg,加甲醇溶解定容至1mL,取0.25mL置于10mL容量瓶中加甲醇定容,再取1mL溶液至10mL的容量瓶中加甲醇定容,得浓度为0.004mg/mL的山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品溶液。
在本发明中,对不同进样量的对照品溶液进行高效液相色谱分析时,所选取的对照品溶液的进样量优选为1μL(浓度为0.004mg/mL)、3μL(浓度为0.004mg/mL)、5μL(浓度为0.004mg/mL)、7μL(浓度为0.004mg/mL)、10μL(浓度为0.004mg/mL)和3μL(浓度为0.04mg/mL);所述对对照品溶液进行高效液相色谱测试时,高效液相色谱测试的条件、检测器种类和检测波长与上文相同,在此不再赘述。
得到对照品液相色谱图和山柰酚-3-O-芸香糖苷峰面积后,本发明以峰面积为纵坐标,以山柰酚-3-O-芸香糖苷进样量(μg)为横坐标绘制标准曲线。本发明对所述绘制标准曲线的方法没有特殊的要求,使用本领域技术人员熟知的绘制标准曲线的方法即可。在本发明中,所述进样量与山柰酚-3-O-芸香糖苷峰面积呈正相关。作为本发明的一个具体实施例,所述标准曲线为Y=175.74x+2047.3。
得到标准曲线后,本发明根据所述供试品液相色谱图和山柰酚-3-O-芸香糖苷峰面积,以及标准曲线得到供试品溶液中山柰酚-3-O-芸香糖苷进样质量(μg);得到供试品溶液中山柰酚-3-O-芸香糖苷进质样量后,本发明根据式I计算得到供试品溶液中山柰酚-3-O-芸香糖苷的质量浓度;
式I中,C供试品为供试品溶液中山柰酚-3-O-芸香糖苷的质量浓度,mg/mL;
m进样为供试品溶液中山柰酚-3-O-芸香糖苷的进样质量,mg;
V进样为供试品溶液的进样体积,mL;
得到供试品溶液的质量浓度后,本发明根据式II计算得到三叶青粉末中山柰酚-3-O-芸香糖苷的质量含量:
式II中,A为三叶青粉末中山柰酚-3-O-芸香糖苷的质量百分含量,%;
C供试品为供试品溶液中山柰酚-3-O-芸香糖苷的质量浓度,mg/mL;
V供试品为供试品溶液的体积,mL;
m三叶青为三叶青粉末的质量,mg。
本发明使用高效液相色谱法对三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量进行测定,取样量小、提取溶剂用量少、提取溶液不需要浓缩,测定方法简便快速且重复性好,能够对三叶青药材的质量进行准确评价。
下面结合实施例对本发明提供的三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的测定方法进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
专属性实验:
(1)精密称取山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品(购买于成都埃法生物科技有限公司,批号:AF8112493,纯度:98%)1.6mg,加甲醇溶解定容至1mL,取0.25ml置于10mL容量瓶中加甲醇定容,再取1mL溶液至10mL的容量瓶中加甲醇定容,得浓度为0.004mg/mL的山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品溶液。
(2)取三叶青药材饮片适量,粉碎,过60目筛,称取三叶青粉末0.2g,精密称定,置于10mL容量瓶中加甲醇定容,密塞,超声(功率:400W,频率:40kHz)60min,放冷至室温,用甲醇补足减失量,取溶液用醇溶性0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液。
(3)分别精密吸取对照品溶液1μL(0.004mg/mL)、3μL(0.004mg/mL)、5μL(0.004mg/mL)、7μL(0.004mg/mL)、10μL(0.004mg/mL)和3μL(0.04mg/mL)进行高效液相色谱分析,测定山柰酚-3-O-芸香糖苷峰面积,其中1μL(0.004mg/mL)、3μL(0.004mg/mL)、5μL(0.004mg/mL)、7μL(0.004mg/mL)、10μL(0.004mg/mL)和3μL(0.04mg/mL)对照品溶液的高效液相色谱分析(HPLC)图谱分别如图1~6所示,图1~6中的出峰为山柰酚-3-O-芸香糖苷峰;
其中高效液相色谱分析的参数为:色谱柱:CAPCELLC18(250mm×4.6mm,5μm);流动相A为乙腈,B为纯水;梯度洗脱(0~30min,85%~70%B);柱温:30℃;流速:1.0mL/min;检测器为紫外可见光检测器,检测波长:350nm;进样量:10μL;以峰面积为纵坐标,以山柰酚-3-O-芸香糖苷进样量为横坐标绘制标准曲线;其中线性回归方程数据如表1所示:
表1线性回归方程数据
所得标准曲线如图7所示,进样量0.004~0.12μg范围内线性关系良好。
(4)对10μL供试品溶液进行高效液相色谱分析,分析参数与步骤(3)相同,所得HPLC图谱如图8所示,图8中21.456min处出峰为山柰酚-3-O-芸香糖苷峰,由图8可知,所得谱图山柰酚-3-O-芸香糖苷峰与其他峰的分离度大于1.5,说明其分离度好;通过回归方程和式I、式II计算出三叶青粉末中山柰酚-3-O-芸香糖苷的质量百分含量为0.00867%。
实施例2
(1)取三叶青药材饮片适量,粉碎,过60目筛,称取三叶青粉末0.2g,精密称定,置于10mL容量瓶中加甲醇定容,密塞,超声(功率:400W,频率:40kHz)60min,放冷至室温,用甲醇补足减失量,取溶液用醇溶性0.45μm微孔滤膜过滤,取滤液作为供试品溶液。
(2)对10μL供试品溶液进行高效液相色谱分析,分析参数与实施例1相同,所得HPLC图谱如图9所示,图9中21.451min处出峰为山柰酚-3-O-芸香糖苷峰,通过回归方程和式I、式II计算出三叶青粉末中山柰酚-3-O-芸香糖苷的质量百分含量为0.00927%。
实施例3
(1)取三叶青药材饮片适量,粉碎,过40目筛,称取三叶青粉末0.2g,精密称定,置于10mL容量瓶中加甲醇定容,密塞,超声(功率:400W,频率:40kHz)55min,放冷至室温,用甲醇补足减失量,取溶液用醇溶性0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液。
(2)对10μL供试品溶液进行高效液相色谱分析,分析参数与实施例1相同,所得HPLC图谱如图10所示,图10中21.541min处出峰为山柰酚-3-O-芸香糖苷峰,通过回归方程和式I、式II计算出三叶青粉末中山柰酚-3-O-芸香糖苷的质量百分含量为0.00907%。
实施例4
(1)取三叶青药材饮片适量,粉碎,过60目筛,称取三叶青粉末0.2g,精密称定,置于10mL容量瓶中加甲醇定容,密塞,超声(功率:400W,频率:40kHz)60min,放冷至室温,用甲醇补足减失量,取溶液用醇溶性0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液。
(2)对10μL供试品溶液进行高效液相色谱分析,分析参数与实施例1相同,所得HPLC图谱如图11所示,图11中21.454min处出峰为山柰酚-3-O-芸香糖苷峰,通过回归方程和式I、式II计算出三叶青粉末中山柰酚-3-O-芸香糖苷的质量百分含量为0.00934%。
实施例5
(1)取三叶青药材饮片适量,粉碎,过40目筛,称取三叶青粉末0.2g,精密称定,置于10mL容量瓶中加甲醇定容,密塞,超声(功率:400W,频率:40kHz)60min,放冷至室温,用甲醇补足减失量,取溶液用醇溶性0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液。
(2)对10μL供试品溶液进行高效液相色谱分析,分析参数与实施例1相同,所得HPLC图谱如图12所示,图12中21.360min处出峰为山柰酚-3-O-芸香糖苷峰,通过回归方程和式I、式II计算出三叶青粉末中山柰酚-3-O-芸香糖苷的质量百分含量为0.00929%。
测试例1
(1)精密度试验
分别取10μL对照品溶液,按实施例1的色谱条件连续进样5次,记录各峰面积于表2中;经计算,山柰酚-3-O-芸香糖苷峰面积的相对标准偏差(RSD)为2.49%(n=5),表明本发明使用仪器精密度良好。
表2精密度试验所得各峰面积
进样次数 | 第1次进样 | 第2次进样 | 第3次进样 | 第4次进样 | 第5次进样 |
峰面积 | 73192 | 74574 | 76253 | 75538 | 78220 |
(2)重复性试验
取同一批三叶青(购买于亳州市齐心药业销售有限公司,批号:191022),平行取样5份,按实施例1的方法制备供试品溶液,按照实施例1的色谱条件进行分析,记录峰面积并计算含量于表3中;经计算,山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的相对标准偏差(RSD)为2.76%(n=5),表明本发明所述方法重复性良好。
表3重复性试验所得各峰面积和含量
(3)稳定性试验
取实施例1中的供试品溶液,于室温下放置0、6、10、12、24h后,按照实施例1的色谱条件进行分析,记录峰面积于表4中;经计算,山柰酚-3-O-芸香糖苷峰面积的相对标准偏差(RSD)为2.62%(n=5),表明本发明供试品溶液在24h内能够保持稳定。
表4稳定性试验所得各峰面积
放置时间h | 0 | 6 | 10 | 12 | 24 |
峰面积 | 38271 | 37106 | 36988 | 37895 | 39437 |
(4)加样回收率试验
取已知含量的三叶青粉末(批号:191022)5份,精密称定适量,分别加入等量的已知含量的山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品溶液,按照实施例1的方法制备供试品溶液,按照实施例1的色谱条件进行分析,计算加样回收率,记录结果于表5中。经计算,山柰酚-3-O-芸香糖苷平均加样回收率为97.3%,相对标准偏差(RSD)为3.83%(n=5)。
表5加样回收率试验数据
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的测定方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将三叶青粉末与甲醇混合,依次进行超声提取和微滤,所述微滤得到的滤液为供试品溶液;所述三叶青粉末的质量为0.11~0.22g,所述甲醇的体积为5~10mL;
(2)取样所述供试品溶液进行高效液相色谱测试,得到供试品液相色谱测试结果;
所述高效液相色谱测试的条件包括:
色谱柱为CAPCELL PAK C18,所述色谱柱的柱长为250mm,柱径为4.6mm,填料粒径为5μm;
所述高效液相色谱的柱温为30℃;
所述高效液相色谱的流动相A为乙腈,流动相B为纯水;所述流动相A和B的流速为1.0mL/min;
所述流动相的洗脱方式为梯度洗脱,所述梯度洗脱的程序为:
0min时,流动相A与B的体积比为15:85;
30min时,流动相A与B的体积比为30:70;
(3)根据预定的标准曲线和所述步骤(2)得到的供试品液相色谱测试结果,得到所述供试品溶液的理论进样量,所述标准曲线为山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品进样量与液相色谱峰面积之间的线性关系曲线;
(4)根据所述步骤(3)得到的理论进样量和所述步骤(2)的实际进样量,得到三叶青药材中山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量。
2.根据权利要求1所述的测定方法,其特征在于,所述三叶青粉末的粒度≥40目。
3.根据权利要求1所述的测定方法,其特征在于,所述超声提取的功率为300~400W,频率为40kHz,时间为50~60min。
4.根据权利要求1所述的测定方法,其特征在于,所述微滤的方法为微孔膜过滤。
5.根据权利要求4所述的测定方法,其特征在于,所述微滤用微孔膜为醇溶性微孔膜,孔径为0.45μm。
6.根据权利要求1所述的测定方法,其特征在于,所述高效液相色谱测试的进样量为5~10μL。
7.根据权利要求1所述的测定方法,其特征在于,所述高效液相色谱测试的检测器为紫外可见光检测器;所述检测器的检测波长为350nm。
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