CN108490095B

CN108490095B - 一种毛大丁草药材中多种成分含量测定的方法

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Publication number: CN108490095B
Application number: CN201810313063.0A
Authority: CN
Inventors: 刘春花; 孙佳; 陆苑; 潘洁; 李勇军; 马雪; 李月婷; 陈思颖; 王爱民; 王永林
Original assignee: Guizhou Medical University
Current assignee: Guizhou Medical University
Priority date: 2018-04-09
Filing date: 2018-04-09
Publication date: 2020-01-31
Anticipated expiration: 2038-04-09
Also published as: CN108490095A

Abstract

本发明涉及中药检测技术领域，具体是一种毛大丁草药材中多种成分含量测定的方法。本发明采用UPLC‑PDA方法，以Waters BEH C₁₈(2.1×150mm，1.7μm)为色谱柱，乙腈‑0.1％甲酸水溶液进行梯度洗脱，检测波长为280nm和328nm，流速为0.28mL/min，柱温40℃。按照本发明的方法，毛大丁草药材中绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草苷和熊果苷得到较好的分离，方法的加样回收率为97.20％‑103.57％，RSD≤3.0％。该方法简便、准确，重复性好，可用于毛大丁草药材中绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草苷和熊果苷的含量测定，为毛大丁草的质量控制提供参考依据。

Description

一种毛大丁草药材中多种成分含量测定的方法

技术领域

本发明涉及中药检测技术领域，具体是一种毛大丁草药材中多种成分含量测定的方法。

背景技术

毛大丁草为菊科植物毛大丁草Piloselloides hirsuta(Forsk.)G.Jeffrey的干燥全草，亦是贵州省少数民族用药，在苗族医药中命名为“加八喽龚旧(jab batnexjongxjud)”。毛大丁草性平味苦、辛，归肺、胃经，具有宣肺止咳，发汗利水，行气活血的功效，主要用于伤风咳嗽，哮喘，水肿胀满，小便不利，小儿食积，经闭，跌扑损伤，痈疖，疔疮等疾病。据《贵阳民间药草》记载，毛大丁草主要治疗风咳嗽、咳嗽哮喘和肺痈等与肺相关的疾病。现代药理学研究表明，毛大丁草具有止咳化痰、平喘的作用。

目前已知毛大丁草中含有绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草苷和熊果苷等多种酚酸类和黄酮类成分，研究表明这些成分均可能是其活性成分。毛大丁草被收载于2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》、2005年版《云南省中药饮片质量标准》等质量标准，但未对其中各有益成分的含量进行测定，目前毛大丁草药材质量标准不完善，不能较全面的控制毛大丁草药材的内在质量。

因此，寻找一种能够同时测定毛大丁草药材中绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草苷和熊果苷等多种有益成分含量的测定方法，是当务之急。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种毛大丁草药材中多种成分含量测定的方法，包括以下步骤：

一种毛大丁草药材中多种成分含量测定的方法，用于同时测定毛大丁草中绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草苷和熊果苷的含量，其特征在于，采用UPLC-PDA方法进行测定，以Waters BEH C₁₈(2.1×150mm，1.7μm)为色谱柱，乙腈-0.1％甲酸水溶液进行梯度洗脱，同时利用检测波长280nm和328nm，流速为0.28mL/min，柱温40℃。

所述UPLC-PDA方法，将毛大丁草药材提取液稀释后作为供试品溶液。

所述毛大丁草药材提取液是以甲醇为溶剂对毛大丁草药材进行提取得到。甲醇极性比乙醇大，用以提取有效成分的话提取率比乙醇高，所得结果更准确。

所述以甲醇为溶剂对毛大丁草药材进行提取，是用50％甲醇对毛大丁草药材进行回流提取，回流提取时间为2h。此时提取效率较高，且不会导致毛大丁草药材中的有益成分被破坏。

所述稀释，是用蒸馏水将毛大丁草药材提取液稀释5倍。此比例稀释后UPLC-PDA测定效果较好。

所述毛大丁草药材，是过三号筛的毛大丁草药材粉末。过三号筛的毛大丁草药材粉末提取效果较好。

优选的，所述UPLC-PDA方法，其中供试品溶液是通过如下方法制备的：取过三号筛的毛大丁草药材粉末0.5g，并精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，量取续滤液5ml，转移至25ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。此时毛大丁草药材提取效率更高，供试液浓度也较为适中，测定所得结果较为精确。

本发明的具体操作步骤如下：

(1)制备对照品溶液和供试品溶液；

对照品溶液的制备：分别精密称取绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草苷和熊果苷适量置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，分别得绿原酸浓度为1.80mg/mL、异绿原酸A浓度为0.987mg/mL、异绿原酸B浓度为0.963mg/mL、异绿原酸C浓度为0.963mg/mL、木犀草苷浓度为0.991mg/mL和熊果苷浓度为1.92mg/mL的对照品储备液。分别精密量取上述6种对照品储备液经稀释后置同一个10mL容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液，绿原酸浓度为9.00μg/mL、异绿原酸A浓度为24.7μg/mL、异绿原酸B浓度为9.63μg/mL、异绿原酸C浓度为9.63μg/mL、木犀草苷浓度为9.91μg/mL和熊果苷浓度为3.84μg/mL，于4℃保存备用。

供试品溶液的制备：取毛大丁草药材粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，量取续滤液5ml至25ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

(2)测定过程：分别取混合对照品溶液和供试品溶液，利用UPLC-PDA测定，得色谱图，熊果苷在280nm波长下测定，其余的5种化合物于328nm下测定，6个成分与其他物质峰完全分离。其中色谱条件为：色谱柱为Waters BEH C₁₈(2.1×150mm，1.7μm)，流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液进行梯度洗脱，检测波长280nm和328nm，流速为0.28mL/min，柱温40℃，进样量10μL。

步骤3：分别进行线性关系考察、精密度实验、重复性试验、稳定性试验和加样回收率实验。

样品制备方法筛选：

为了选择稳定的样品制备方法，以溶剂、提取方式、提取时间为变量，对毛大丁草的提取方法进行筛选试验，结果如下：

由上数据可知：以50％甲醇为溶剂时，提取效率较高且杂质少；超声提取和水浴回流提取相较，回流提取效率较高；回流1h的提取效果较差，回流2h与3h的提取效果无较大差异。

测定波长筛选：

由于毛大丁草中这些待测成分均有紫外吸收，所以选择紫外检测器对待测成分进行检测。

经PDA检测器进行全波长扫描，各成分的最大吸收波长如下：

成分	最大吸收波长(nm)
		熊果苷	194.9、221.1、280.0
绿原酸	326.1
		木樨草苷	347.9
异绿原酸B	328.0
		异绿原酸A	327.4
异绿原酸C	328.6

由上数据可知，熊果苷的最大吸收波长与其他成分的最大吸收波长相差较大，兼顾在同一波长检测，会明显影响检测灵敏度，综合考虑，选择双波长(280nm和328nm)对着6种成分进行含量测定，280nm下测定熊果苷，328nm条件下测其余5个成分，达到同一色谱条件同时测定不同类型的多种化学成分的目的。

为了选择合适的色谱条件，考察了不同色谱柱、不同流动相***、不同流动相PH、不同流动相洗脱梯度，进行多次反复试验，最终选择以0.1％甲酸水溶液和乙腈作为流动相，进行梯度洗脱，最终熊果苷、绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C等6个成分得到较好的分离。

本实验采用HPLC-PAD的方法对毛大丁草中6种化学成分熊果苷、绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C进行含量测定，该方法处理简便，达到了同一色谱条件下对6种成分进行了良好的分离，经方法学验证，线性良好，重复性、精密度、稳定性和回收率均较好，可用于毛大丁草质量控制。经过对多批毛大丁草进行测定结果进行分析，发现6种成分含量波动较大，因此需要通过多指标来控制毛大丁草的质量。

与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：

本发明采用采用UPLC-PDA方法，以Waters BEH C₁₈(2.1×150mm，1.7μm)为色谱柱，乙腈-0.1％甲酸水溶液进行梯度洗脱，检测波长为280nm和328nm，流速为0.28mL/min，柱温40℃。按照本发明的方法，毛大丁草药材中绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草苷和熊果苷得到较好的分离，方法的加样回收率为97.20％-103.57％，RSD≤3.0％。该方法简便、准确，重复性好，可用于毛大丁草药材中绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草苷和熊果苷的含量测定，为毛大丁草的质量控制提供参考依据。

附图说明

图1是***适用性实验UPLC图。

其中各吸收峰对应关系如下：1-熊果苷；2-绿原酸；3-木犀草苷；4-异绿原酸B；5-异绿原酸A；6-异绿原酸C。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

实施例：

仪器与材料：

Acquity UPLC-PDA***(Waters公司，包含二元超高压梯度泵、自动进样器、色谱柱温箱、阵列二级管检测器、Empower工作站)；EL204万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)。

熊果苷对照品(批号：111951-201301)、绿原酸(批号：110753)和木犀草苷(批号：111720-201609)均购买于中国食品药品检定研究院；异绿原酸A(批号：MUST-16031611)、异绿原酸B(批号：MUST-16031612)和异绿原酸C(批号：MUST-16031613)购买于成都曼思特生物科技有限公司/中国科学院成都生物研究所。

甲醇(分析纯)、乙醇(分析纯)、乙腈(色谱纯)均购买于国药集团化学试剂有限公司；甲酸(色谱纯)购于美国TEDIA有限公司。实验用毛大丁草药材均由贵州医科大学药学院生药与药用植物学教研室张旭副教授鉴定为毛大丁草Piloselloides hirsuta(Forsk.)G.Jeffrey的干燥全草。

对照溶液制备：

分别精密称取绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草苷和熊果苷适量置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，分别得绿原酸浓度为1.80mg/mL、异绿原酸A浓度为0.987mg/mL、异绿原酸B浓度为0.963mg/mL、异绿原酸C浓度为0.963mg/mL、木犀草苷浓度为0.991mg/mL和熊果苷浓度为1.92mg/mL的对照品储备液。分别精密量取上述6种对照品储备液经稀释后置同一个10mL容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液，绿原酸浓度为9.00μg/mL、异绿原酸A浓度为24.7μg/mL、异绿原酸B浓度为9.63μg/mL、异绿原酸C浓度为9.63μg/mL、木犀草苷浓度为9.91μg/mL和熊果苷浓度为3.84μg/mL，于4℃保存备用。

供试品溶液制备：

取毛大丁草过三号筛的药材粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，量取续滤液5ml至25ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，即可进样分析。

色谱条件：

色谱柱为Waters BEH C₁₈(2.1×150mm，1.7μm)，流动相为乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)进行梯度洗脱，检测波长280nm和328nm，流速为0.28mL/min，柱温40℃，进样量10μL，洗脱程序如表1所示。

表1流动相梯度洗脱表

***适应性考察：

分别取混合对照品溶液和供试品溶液各5μL，在上述的色谱条件下，用UPLC-PDA测定，得色谱图，6种化合物与其他物质峰分离完全，见图1。

2.4.2线性关系考察

分别精密吸取前述混合对照品溶液1，2，4，6，8，10μL按上述色谱条件测定，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制工作曲线，结果见表2。

表2回归方程和线性范围

精密度实验：

取同一供试品溶液，连续进样6次，计算熊果苷、绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C峰面积的RSD分别为0.82％、1.9％、1.7％、1.4％、1.5％、1.3％，结果说明仪器精密度良好。取同一样品，分别是不同的3天处理，进样分析，计算6个成分熊果苷、绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C的峰面积RSD，结果为0.79％、1.1％、1.5％、2.4％、2.6％、1.6％。

重复性实验：

取同一批号药材6份，精密称定，按前述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别测定。6份供试品溶液中熊果苷、绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C平均含量分别为0.728％、0.0671％、0.0197％、0.0278％、0.142％、0.0390％，含量结果RSD分别为1.7％、2.3％、2.3％、1.7％、1.0％、1.8％，表明重复性良好。

稳定性实验：

分别按前述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h分别进样，测定各指标成分熊果苷、绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C峰面积。计算峰面积RSD，分别为1.8％、1.6％、1.4％、1.2％、1.9％、1.4％，说明样品溶液在0至24小时内是稳定的。

加样回收率实验：

称取前述供试品溶液制备方法中取样量的50％9份，分别按毛大丁草中重复性测得各成分含量为本底值，分别加入50％、100％、150％的对照品溶液，每个水平分别按前述供试品溶液制备方法制备3份供试品溶液，按前述色谱条件测定并计算6个成分的回收率，结果见表3。熊果苷平均回收率99.69％，RSD(％)为1.7％，绿原酸平均回收率100.9％，RSD(％)为1.9％，木犀草苷平均回收率99.92％，RSD(％)为1.8％，异绿原酸A平均回收率100.7％，RSD(％)为1.2％，、异绿原酸B平均回收率101.1％，RSD(％)为1.9％，异绿原酸C平均回收率99.80％，RSD(％)为2.0％，表明6个待测成分回收率良好。

表3加样回收率实验结果

样品测定

收集贵州不同产地的毛大丁草，并利用已经建立的方法对熊果苷、绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C成分进行含量测定，结果如表4所示。

表4不同批次毛大丁草中6种成分的含量(％，n＝2)

由上可知，本发明的方法能使毛大丁草药材中绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草苷和熊果苷得到较好的分离，且该方法简便、准确，重复性好，可用于毛大丁草药材中绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草苷和熊果苷的含量测定，为毛大丁草的质量控制提供参考依据。

最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种毛大丁草药材中多种成分含量测定的方法，用于同时测定毛大丁草中绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草苷和熊果苷的含量，其特征在于，采用UPLC-PDA方法进行测定，以Waters BEH C₁₈2.1×150mm 1.7μm为色谱柱，乙腈-0.1％甲酸水溶液进行梯度洗脱，同时利用检测波长280nm和328nm，流速为0.28mL/min，柱温40℃，具体洗脱程序为：

时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 2 98 3 2 98 4 10 90 7.5 10 90 10 15 85 13 17 83 18 17 83 23 28 72 25 50 50 30 53 47 32 95 5 33 95 5 34 2 98 35 2 98

。

2.根据权利要求1所述的毛大丁草药材中多种成分含量测定的方法，其特征在于，所述UPLC-PDA方法，将毛大丁草药材提取液稀释后作为供试品溶液。

3.根据权利要求2所述的毛大丁草药材中多种成分含量测定的方法，其特征在于，所述毛大丁草药材提取液是以甲醇为溶剂对毛大丁草药材进行提取得到。

4.根据权利要求3所述的毛大丁草药材中多种成分含量测定的方法，其特征在于，所述以甲醇为溶剂对毛大丁草药材进行提取，是用50％甲醇对毛大丁草药材进行回流提取，回流提取时间为2h。

5.根据权利要求2所述的毛大丁草药材中多种成分含量测定的方法，其特征在于，所述稀释，是用蒸馏水将毛大丁草药材提取液稀释5倍。

6.根据权利要求2所述的毛大丁草药材中多种成分含量测定的方法，其特征在于，所述毛大丁草药材，是过三号筛的毛大丁草药材粉末。

7.根据权利要求1所述的毛大丁草药材中多种成分含量测定的方法，其特征在于，所述UPLC-PDA方法，其中供试品溶液是通过如下方法制备的：取过三号筛的毛大丁草药材粉末0.5g，并精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，量取续滤液5ml，转移至25ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。