CN105874083A - 微肽及其用于调节基因表达的用途 - Google Patents

Abstract

用于检测和鉴定由包含在微小RNA的初级转录物序列中的核苷酸序列所编码的微肽(miPEP)的方法，以及其用于调节基因表达的用途。

Description

微肽及其用于调节基因表达的用途

本发明涉及微肽(由微小RNA所编码的肽，或“miPEP”)，以及其用于调节基因表达的用途。

微小RNA(miR)是在成熟后具有大约21个核苷酸的非编码小RNA，其在转录后水平上通过降解靶mRNA或通过抑制其翻译来控制靶基因的表达。miR存在于植物和动物中。

靶基因常常是发育过程的关键基因。它们编码例如转录因子或者蛋白酶体的蛋白质。

miR的表达的调控是知之甚少的，但是尤其知道其，像大多数编码基因一样，牵涉RNA聚合物II：该酶产生初级转录物(称为“pri-miR”)，其然后通过包含尤其是Dicer类型的酶的蛋白复合体而成熟。该成熟首先导致形成miR前体(称为“pre-miR”)，其具有以包含miR和其互补序列miR*的茎-环形式的二级结构。然后，所述前体成熟，这导致形成包含miR和miR*的更短的双链RNA。然后，miR由RISC复合体来负责，所述RISC复合体切割靶基因的mRNA或者抑制其翻译。

此外，已显示，在微小RNA的初级转录物中内含子的存在增加成熟的微小RNA的表达(Schwab等人,EMBO Rep.,14(7):615-21,2013)。然而，由于实验的困难，微小RNA的初级转录物或pri-miR很少被研究。

大约50％的真核基因在其5’UTR区域(5’非翻译区)内在编码序列的上游具有小的开放阅读框。这些小的开放阅读框(或者“上游ORF”，“uORF”)可以发挥翻译调节子的作用，这主要通过调节在mRNA上核糖体的结合和速率以顺式(cis)方式来进行，但是也按照依然未知的机制借助于由所述uORF所编码的肽以反式(trans)方式来进行(Combier等人,Gene Dev,22:1549-1559,2008)。从定义本身来说，uORF存在于编码基因的上游。

最近，还发现了在长的基因间非编码RNA(lincRNA)中的小ORF，其推定的功能(如果它存在)还不知晓(Ingolia等人,Cell,147(4):789-802,2011；Guttman&Rinn,Nature,482(7385):339-46,2012)。

然而，关于在非编码微小RNA内编码肽的ORF的存在，还没有报道任何实例。迄今为止，微小RNA，和扩展说来，其初级转录物，总是由于其特殊的作用方式而被认为是不产生任何肽的非编码性调控RNA。

本发明的一个方面为提供能够调节微小RNA的表达的肽。

本发明的另一个方面为提供使得能够调节微小RNA的一个或多个靶基因的表达的工具。

本发明具有这样的优点：允许借助于除了微小RNA以外的工具，更容易和更有效地通过微小RNA来控制靶基因的表达。

因此，本发明涉及用于检测和鉴定由包含在微小RNA的初级转录物序列中的核苷酸序列所编码的微肽(miPEP)的方法，所述方法包括：

a)检测包含在所述微小RNA的初级转录物序列中的具有12至303个核苷酸的开放阅读框的步骤，然后

b)在下列之间进行比较的步骤：

·在由相对于所述开放阅读框的核苷酸序列而言相同或简并的核苷酸序列所编码的肽存在下，所述微小RNA在表达所述微小RNA的指定真核细胞中的积累，其中所述肽不依赖于所述微小RNA的初级转录物的转录而存在于所述细胞中，和

·在所述肽不存在下，所述微小RNA在与上述表达所述微小RNA的指定真核细胞相同类型的真核细胞中的积累，

其中，相对于所述微小RNA在所述肽不存在下的积累而言所述微小RNA在所述肽存在下的积累的调节表明了由所述开放阅读框所编码的微肽的存在。

特别地，本发明涉及用于检测和鉴定由包含在微小RNA的初级转录物序列中的核苷酸序列所编码的微肽(miPEP)的方法，所述方法包括：

a)检测包含在所述微小RNA的初级转录物序列中的具有15至303个核苷酸的开放阅读框的步骤，然后

b)在下列之间进行比较的步骤：

·在由相对于所述开放阅读框的核苷酸序列而言相同或简并的核苷酸序列所编码的肽存在下，所述微小RNA在表达所述微小RNA的指定真核细胞中的积累，其中所述肽不依赖于所述微小RNA的初级转录物的转录而存在于所述细胞中，和

·在所述肽不存在下，所述微小RNA在与上述表达所述微小RNA的指定真核细胞相同类型的真核细胞中的积累，

其中，相对于所述微小RNA在所述肽不存在下的积累而言所述微小RNA在所述肽存在下的积累的调节表明了由所述开放阅读框所编码的微肽的存在。

特别地，本发明涉及用于检测和鉴定由包含在微小RNA的初级转录物序列中的核苷酸序列所编码的微肽(miPEP)的方法，所述方法包括：

a)检测包含在所述微小RNA的初级转录物序列中的具有15至303个核苷酸或12个核苷酸的开放阅读框的步骤，然后

b)在下列之间进行比较的步骤：

·在由相对于所述开放阅读框的核苷酸序列而言相同或简并的核苷酸序列所编码的肽存在下，所述微小RNA在表达所述微小RNA的指定真核细胞中的积累，其中所述肽不依赖于所述微小RNA的初级转录物的转录而存在于所述细胞中，和

·在所述肽不存在下，所述微小RNA在与上述表达所述微小RNA的指定真核细胞相同类型的真核细胞中的积累，

其中，相对于所述微小RNA在所述肽不存在下的积累而言所述微小RNA在所述肽存在下的积累的调节表明了由所述开放阅读框所编码的微肽的存在。

特别地，本发明涉及用于检测和鉴定由包含在微小RNA的初级转录物序列中的核苷酸序列所编码的微肽(miPEP)的方法，所述方法包括：

a)检测包含在所述微小RNA的初级转录物序列中的具有12个核苷酸的开放阅读框的步骤，然后

b)在下列之间进行比较的步骤：

·在由相对于所述开放阅读框的核苷酸序列而言相同或简并的核苷酸序列所编码的肽存在下，所述微小RNA在表达所述微小RNA的指定真核细胞中的积累，其中所述肽不依赖于所述微小RNA的初级转录物的转录而存在于所述细胞中，和

·在所述肽不存在下，所述微小RNA在与上述表达所述微小RNA的指定真核细胞相同类型的真核细胞中的积累，

其中，相对于所述微小RNA在所述肽不存在下的积累而言所述微小RNA在所述肽存在下的积累的调节表明了由所述开放阅读框所编码的微肽的存在。

因此，在第一个步骤中，所述用于检测和鉴定微肽的方法在于检测在微小RNA的初级转录物上潜在地编码肽的开放阅读框的存在。

至于第二个步骤，它使得能够表征所述肽，即测定所述肽是否相应于真正在所述细胞中产生的肽，这通过研究所述肽对于所述微小RNA的积累的影响来进行。

为了证明所述肽对于微小RNA的积累的影响，将大量的肽引入到表达所述微小RNA的第一细胞中。然后，测量所述微小RNA在该第一细胞中的积累，并与所述微小RNA在与第一细胞相同但不包含所述肽的第二细胞中的积累进行比较。

因此，观察到在所述肽存在和不存在下的细胞之间微小RNA的数量的变化表明：(i)存在有在所述微小RNA的初级转录物上编码的肽，(ii)该肽的序列由在所述微小RNA的初级转录物上鉴定出的开放阅读框所编码，和(iii)所述肽作用于所述微小RNA的积累。

因此，本发明基于由发明人作出的出人意料的双重观察结果，即一方面，存在有在微小RNA的初级转录物上存在的能够编码微肽的开放阅读框，和另一方面，所述微肽能够调节所述微小RNA的积累。

特别地，本发明涉及用于检测和鉴定由包含在微小RNA的初级转录物序列中的核苷酸序列所编码的微肽(miPEP)的方法，所述方法包括：

a)检测包含在所述微小RNA的初级转录物序列中的具有15至303个核苷酸的开放阅读框的步骤，然后

b)在下列之间进行比较的步骤：

·在由相对于所述开放阅读框的核苷酸序列而言相同或简并的核苷酸序列所编码的肽存在下，所述微小RNA在表达所述微小RNA的初级转录物的指定真核细胞中的积累，其中所述肽不依赖于所述微小RNA的初级转录物的转录而存在于所述细胞中，和

·在所述肽不存在下，所述微小RNA在与上述表达所述微小RNA的初级转录物的指定真核细胞相同类型的真核细胞中的积累，

其中，相对于所述微小RNA在所述肽不存在下的积累而言所述微小RNA在所述肽存在下的积累的调节表明了由所述开放阅读框所编码的微肽的存在。

特别地，本发明涉及用于检测和鉴定由包含在微小RNA的初级转录物序列中的核苷酸序列所编码的微肽(miPEP)的方法，所述方法包括：

a)检测包含在所述微小RNA的初级转录物序列中的具有15至303个核苷酸或12个核苷酸的开放阅读框的步骤，然后

b)在下列之间进行比较的步骤：

·在由相对于所述开放阅读框的核苷酸序列而言相同或简并的核苷酸序列所编码的肽存在下，所述微小RNA在表达所述微小RNA的初级转录物的指定真核细胞中的积累，其中所述肽不依赖于所述微小RNA的初级转录物的转录而存在于所述细胞中，和

·在所述肽不存在下，所述微小RNA在与上述表达所述微小RNA的初级转录物的指定真核细胞相同类型的真核细胞中的积累，

其中，相对于所述微小RNA在所述肽不存在下的积累而言所述微小RNA在所述肽存在下的积累的调节表明了由所述开放阅读框所编码的微肽的存在。

特别地，本发明涉及用于检测和鉴定由包含在微小RNA的初级转录物序列中的核苷酸序列所编码的微肽(miPEP)的方法，所述方法包括：

a)检测包含在所述微小RNA的初级转录物序列中的具有12个核苷酸的开放阅读框的步骤，然后

b)在下列之间进行比较的步骤：

·在由相对于所述开放阅读框的核苷酸序列而言相同或简并的核苷酸序列所编码的肽存在下，所述微小RNA在表达所述微小RNA的初级转录物的指定真核细胞中的积累，其中所述肽不依赖于所述微小RNA的初级转录物的转录而存在于所述细胞中，和

·在所述肽不存在下，所述微小RNA在与上述表达所述微小RNA的初级转录物的指定真核细胞相同类型的真核细胞中的积累，

其中，相对于所述微小RNA在所述肽不存在下的积累而言所述微小RNA在所述肽存在下的积累的调节表明了由所述开放阅读框所编码的微肽的存在。

在本发明中，术语“微小RNA”、“非编码微小RNA”和“miR”是等价的并且可以互换使用。它们定义了具有大约21个核苷酸的小RNA分子，其不被翻译并且不导致肽或蛋白质。

然而，以该成熟形式，微小RNA确保了通过转录后机制，例如借助于RISC复合体来调控某些基因这样的功能。

微小RNA的初级转录物或“pri-miR”则相应于从DNA分子的转录开始直接获得的RNA分子。通常，该初级转录物经历一个或多个转录后修饰，所述转录后修饰通过剪切现象而引起例如特殊的RNA结构或RNA的某些部分的切割，并且导致微小RNA的前体形式或“pre-miR”，然后导致微小RNA的成熟形式或“miR”。

术语“微肽“和“miPEP”(microRNA encoded PEPtide)是等价的并且可以互换使用。它们定义了由存在于微小RNA的初级转录物上的开放阅读框所编码并且能够调节所述微小RNA的积累的肽。在本发明的范围内，微肽不应当被理解为必需是小尺寸的肽，因为“微”并不对应于肽的尺寸。

根据本发明，miPEP还可以被视为类似于转录调节物，尤其是转录激活物。这样的转录调节物可以在转录水平上起作用，从而调节pri-miR、pre-miR和miR的积累。

考虑到遗传密码的简并性，同一种微肽可以由数种核苷酸序列来编码。此类相互相差至少一个核苷酸但编码同一种肽的核苷酸序列被称为“简并序列”。

术语“开放阅读框”或“ORF”(open reading frame)是等价的并且可以互换使用。它们相应于可以潜在地编码肽或蛋白质的在DNA或RNA分子中的核苷酸序列：所述开放阅读框以起始密码子开始(起始密码子通常编码甲硫氨酸)，随后为一系列的密码子(每个密码子编码一个氨基酸)，和以终止密码子结束(终止密码子不被翻译)。

在本发明中，ORF可以被特别地命名为“miORF”，当其存在于微小RNA的初级转录物上时。

特别地，在本发明中所定义的miORF可以具有12至303个核苷酸的大小，并且编码具有3至100个氨基酸的肽。

特别地，在本发明中所定义的miORF可以具有15至303个核苷酸的大小。由于一个氨基酸由一个具有3个核苷酸的密码子来编码，因而具有15至303个核苷酸的miORF编码具有4至100个氨基酸的miPEP。

特别地，所述miORF具有15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、47、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、198、201、204、207、210、213、216、219、222、225、228、231、234、237、240、243、246、249、252、255、258、261、264、267、270、273、276、279、282、285、288、291、294、297、300或303个核苷酸的大小，并且分别编码具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸的大小的miPEP。

在本发明中，“积累”是指在细胞中分子例如微小RNA或微肽的产生。

因此，在细胞中分子的积累的“调节”相应于存在于该细胞中的该分子的数量的改变。

此外，miPEP的效应可以通过miR的积累的调节，但也可以通过相应的pri-miR或pre-miR的积累的调节来进行观察。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定miPEP的方法，其中所述微小RNA的积累的调节为所述微小RNA的积累的减少或增加，特别是增加。

“积累的减少”相应于在细胞中所述分子的数量的降低。

相反地，“积累的增加”相应于在细胞中所述分子的数量的升高。

在一个有利的实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定miPEP的方法，其中所述微小RNA的积累的调节为所述微小RNA的积累的增加。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定miPEP的方法，其中所述肽在所述细胞中的存在是由于：

-将编码所述肽的核酸引入到所述细胞中，或

-将所述肽引入到所述细胞中。

为了表征miPEP，需要拥有表达微小RNA且其中存在有待测试的所述肽的细胞模型。为此，可能的是，将肽引入到细胞中，要么通过使所述细胞与所述肽相接触，要么通过将编码所述肽的核酸引入到所述细胞中，那么所述核酸将会在所述细胞内被翻译成肽。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定miPEP的方法，其中步骤a)的所述开放阅读框被包含在所述微小RNA的所述初级转录物的5’或3’部分中，优选地在5’部分中。

微小RNA的初级转录物的5’或3’部分相应于在微小RNA的成熟过程中被切割的RNA分子的末端部分。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定miPEP的方法，其中所述微小RNA存在于野生型植物细胞中。

在本发明中，野生型植物细胞相应于未由人进行遗传修饰的植物细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定miPEP的方法，其中所述微小RNA存在于野生型动物细胞中，尤其是存在于野生型人细胞或野生型果蝇细胞中。

在本发明中，野生型动物细胞相应于未由人进行遗传修饰的动物细胞，尤其是人细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定miPEP的方法，其中在步骤b)中所使用的所述指定真核细胞和所述与上述指定真核细胞相同类型的真核细胞为十字花科植物例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)，豆科植物例如大豆(Glycine max)、截形苜蓿(Medicago truncatula)和紫苜蓿(Medicago sativa)，或者茄科植物例如本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、马铃薯(Solanumtuberosum)、番茄(Solanum lycopersicum)或茄子(Solanummelongena)的植物细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定miPEP的方法，其中在步骤b)中所使用的所述指定真核细胞和所述与上述指定真核细胞相同类型的真核细胞为植物细胞，优选地截形苜蓿、本氏烟草或拟南芥的细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定miPEP的方法，其中在步骤b)中所使用的所述指定真核细胞和所述与上述指定真核细胞相同类型的真核细胞为动物细胞，优选地人细胞或果蝇细胞。

在上面所定义的用于检测和鉴定微肽的方法中，在鉴定了在微小RNA的初级转录物上的能够编码肽的ORF后，需要拥有具有所述微小RNA和所述肽的细胞模型，以便能够证明所述肽对于所述微小RNA的可能的效应。

因此，两种选择是可设想的：

-其中鉴定出了miORF的细胞模型和其中证明了肽对于miR的效应的细胞模型是相同的，或者

-其中鉴定出了miORF的细胞模型和其中证明了肽对于miR的效应的细胞模型是不同的。

在第一种选择中，用于观察肽的效应的细胞模型与其中分离出了所述微小RNA的初级转录物的细胞模型是相同的。在该细胞模型中，所述指定真核细胞天然地包含所述微小RNA，并且应当仅将待测试的肽引入到这些细胞中。在该背景下，所述微小RNA被称为是“内源来源的”，因为其在所述细胞中天然地存在。然而，在细胞中可以加入内源来源的微小RNA的其他拷贝，例如通过在所述细胞中引入编码所述内源来源的微小RNA的载体。

在第二种选择中，用于观察肽的效应的细胞模型与其中分离出了所述微小RNA的初级转录物的细胞模型是不同的。在该细胞模型中，所述指定真核细胞不包含所述微小RNA和待测试的肽。因此，应当将这两种成分引入到这些细胞中。在该背景下，所述微小RNA被称为是“外源来源的”，因为其不在所述细胞中天然地存在。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定miPEP的方法，其中在步骤b)中所使用的所述真核细胞和所述与上述指定真核细胞相同类型的真核细胞之中，所述微小RNA是内源来源的。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定miPEP的方法，其中在步骤b)中所使用的所述真核细胞和所述与上述指定真核细胞相同类型的真核细胞之中，所述微小RNA是外源来源的，所述真核细胞包含允许所述微小RNA表达的载体。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定miPEP的方法，其中所述微小RNA的积累通过使用定量RT-PCR或Northern印迹来进行测定。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定miPEP的方法，其中所述微小RNA的积累通过使用DNA芯片或RNA芯片来进行测定。

所述微小RNA的积累可以借助于允许对特定核酸分子进行含量分析的分子生物学技术来进行测定。

在另一个方面，本发明还涉及用于检测和鉴定其初级转录物序列包含编码miPEP的核苷酸序列的微小RNA的方法，所述方法包括：

a)检测包含在所述微小RNA的初级转录物序列中的具有15至303个核苷酸的开放阅读框的步骤，然后

b)在下列之间进行比较的步骤：

·在由相对于所述开放阅读框的核苷酸序列而言相同或简并的核苷酸序列所编码的肽存在下，所述微小RNA在表达所述微小RNA的指定真核细胞中的积累，其中所述肽不依赖于所述微小RNA的初级转录物的转录而存在于所述细胞中，和

·在所述肽不存在下，所述微小RNA在与上述表达所述微小RNA的指定真核细胞相同类型的真核细胞中的积累，

其中，相对于所述微小RNA在所述肽不存在下的积累而言所述微小RNA在所述肽存在下的积累的调节表明了其初级转录物包含编码微肽的核苷酸序列的微小RNA的存在。

特别地，本发明涉及用于检测和鉴定其初级转录物序列包含编码miPEP的核苷酸序列的微小RNA的方法，所述方法包括：

a)检测包含在所述微小RNA的初级转录物序列中的具有15至303个核苷酸的开放阅读框的步骤，然后

b)在下列之间进行比较的步骤：

·在由相对于所述开放阅读框的核苷酸序列而言相同或简并的核苷酸序列所编码的肽存在下，所述微小RNA在表达所述微小RNA的初级转录物的指定真核细胞中的积累，其中所述肽不依赖于所述微小RNA的初级转录物的转录而存在于所述细胞中，和

·在所述肽不存在下，所述微小RNA在与上述表达所述微小RNA的初级转录物的指定真核细胞相同类型的真核细胞中的积累，

其中，相对于所述微小RNA在所述肽不存在下的积累而言所述微小RNA在所述肽存在下的积累的调节表明了其初级转录物包含编码微肽的核苷酸序列的微小RNA的存在。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定微小RNA的方法，其中所述微小RNA的积累的调节为所述微小RNA的积累的减少或增加，特别是增加。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定微小RNA的方法，其中所述肽在所述细胞中的存在是由于：

-将编码所述肽的核酸引入到所述细胞中，或

-将所述肽引入到所述细胞中。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定微小RNA的方法，其中步骤a)的所述开放阅读框被包含在所述微小RNA的所述初级转录物的5’或3’部分中，优选地在5’部分中。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定微小RNA的方法，其中所述微小RNA存在于野生型植物细胞中。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定微小RNA的方法，其中所述微小RNA存在于野生型动物细胞中，尤其是存在于野生型人细胞中。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定微小RNA的方法，其中在步骤b)中所使用的所述真核细胞和所述与上述指定真核细胞相同类型的真核细胞为植物细胞，优选地截形苜蓿的细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定微小RNA的方法，其中在步骤b)中所使用的所述真核细胞和所述与上述指定真核细胞相同类型的真核细胞为动物细胞，优选地果蝇细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定微小RNA的方法，其中在步骤b)中所使用的所述真核细胞和所述与上述指定真核细胞相同类型的真核细胞之中，所述微小RNA是内源来源的。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定微小RNA的方法，其中在步骤b)中所使用的所述真核细胞和所述与上述指定真核细胞相同类型的真核细胞之中，所述微小RNA是外源来源的，所述真核细胞包含允许所述微小RNA表达的载体。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定微小RNA的方法，其中所述微小RNA的积累通过使用定量RT-PCR或Northern印迹来进行测定。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于检测和鉴定微小RNA的方法，其中所述微小RNA的积累通过使用DNA芯片或RNA芯片来进行测定。

在另一个方面，本发明涉及通过实施上面所定义的方法而获得的miPEP。

更特别地，本发明涉及由通过实施上面所定义的方法而获得的核苷酸序列所编码的miPEP。换言之，本发明涉及由通过实施上面所定义的方法而检测和鉴定出的核苷酸序列所编码的miPEP。

本发明的另一个方面还涉及具有3至100个氨基酸，特别地4至100个氨基酸，尤其是4至60个氨基酸，优选地4至40个氨基酸的miPEP，其由包含在微小RNA的初级转录物中的核苷酸序列所编码，所述miPEP能够调节所述微小RNA在真核细胞中的积累。

本发明的另一个方面还涉及具有4至100个氨基酸或3个氨基酸的miPEP，其由包含在微小RNA的初级转录物中的核苷酸序列所编码，所述miPEP能够调节所述微小RNA在真核细胞中的积累。

本发明的另一个方面还涉及具有3个氨基酸的miPEP，其由包含在微小RNA的初级转录物中的核苷酸序列所编码，所述miPEP能够调节所述微小RNA在真核细胞中的积累。

特别地，在本发明中所定义的miPEP由具有15至303个核苷酸的miORF所编码，并且具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸，特别地5、8、10、18、19、23、37、50或59个氨基酸的大小。

特别地，本发明的miPEP具有4至10个氨基酸、4至20个氨基酸、4至30个氨基酸、4至40个氨基酸、4至50个氨基酸、4至60个氨基酸、4至70个氨基酸、4至80个氨基酸、4至90个氨基酸或4至100个氨基酸的大小。

此外，应当注意，在微小RNA的初级转录物上可以鉴定出数个miORF，这表明一个微小RNA的初级转录物可以潜在地编码数个miPEP。

还应当注意，miPEP的效应通常特异于单一的微小RNA，即其产生自编码所述miPEP的初级转录物。

在观察到在miPEP存在和不存在下的细胞之间微小RNA的数量的变化后，可以证明所述miPEP对于所述微小RNA的调节。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的miPEP，其中所述核苷酸序列被包含在微小RNA的所述初级转录物的5’或3’部分中，优选地在5’部分中。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的miPEP，其中所述核苷酸序列相应于存在于微小RNA的所述初级转录物上的第一开放阅读框。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的miPEP，所述miPEP具有碱性的等电点，优选地大于8的等电点。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的miPEP，所述miPEP具有酸性的等电点。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的miPEP，所述miPEP选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:375至SEQ ID NO:386和SEQ ID NO:355组成的肽的组(表1)。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的miPEP，所述miPEP选自由下列组成的肽的组：

-SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:355，

-SEQ ID NO:375至SEQ ID NO:386，或

-SEQ ID NO:424。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的miPEP，其由氨基酸序列MVT组成。

在另一个方面，本发明涉及编码上面所定义的miPEP的核酸分子。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的核酸分子，所述分子选自由SEQ ID NO:105至SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:387至SEQ ID NO:399和SEQ ID NO:356组成的核酸的组(表2)。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的核酸分子，所述分子选自由下列组成的核酸的组：

-SEQ ID NO:105至SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:356，

-SEQ ID NO:387至SEQ ID NO:399，或

-SEQ ID NO:425。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及由包含在miR171b(SEQID NO:319)的初级转录物中的核苷酸序列(SEQ ID NO:163)所编码的MtmiPEP171b1(SEQ ID NO:59)，所述MtmiPEP171b1能够调节所述miR171b在真核细胞中的积累。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及由包含在miR164a(SEQID NO:297)的初级转录物中的核苷酸序列(SEQ ID NO:128)所编码的AtmiPEP164a1(SEQ ID NO:24)，所述AtmiPEP164a1能够调节所述miR164a在真核细胞中的积累。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及由包含在miR165a(SEQID NO:305)的初级转录物中的核苷酸序列(SEQ ID NO:147)所编码的AtmiPEP165a(SEQ ID NO:43)，所述miPEP165a能够调节所述miR165a在真核细胞中的积累。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及由包含在miR319a(SEQID NO:331)的初级转录物中的核苷酸序列(SEQ ID NO:180)所编码的AtmiPEP319a1(SEQ ID NO:76)，所述AtmiPEP319a1能够调节所述miR319a在真核细胞中的积累。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及由包含在miR319a(SEQID NO:331)的初级转录物中的核苷酸序列(SEQ ID NO:181)所编码的AtmiPEP319a2(SEQ ID NO:77)，所述AtmiPEP319a2能够调节所述miR319a在真核细胞中的积累。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及由包含在miR160b(SEQID NO:291)的初级转录物中的核苷酸序列(SEQ ID NO:118)所编码的AtmiPEP160b1(SEQ ID NO:14)，所述AtmiPEP160b1能够调节所述miR160b在真核细胞中的积累。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及由包含在miR169d(SEQID NO:427)的初级转录物中的核苷酸序列(SEQ ID NO:425)所编码的MtmiPEP169d(SEQ ID NO:424)，所述MtmiPEP169d能够调节所述miR169d在真核细胞中的积累。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及由包含在miR171e(SEQID NO:322)的初级转录物中的核苷酸序列(SEQ ID NO:167)所编码的MtmiPEP171e(SEQ ID NO:63)，所述MtmiPEP171e能够调节所述miR171e在真核细胞中的积累。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及由包含在miR1(SEQ IDNO:353)的初级转录物中的核苷酸序列(SEQ ID NO:206)所编码的DmmiPEP1a(SEQ ID NO:102)，所述DmmiPEP1a能够调节所述miR1在真核细胞中的积累。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及由包含在miR1(SEQ IDNO:353)的初级转录物中的核苷酸序列(SEQ ID NO:207)所编码的DmmiPEP1b(SEQ ID NO:103)，所述DmmiPEP1b能够调节所述miR1在真核细胞中的积累。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及由包含在miR8(SEQ IDNO:354)的初级转录物中的核苷酸序列(SEQ ID NO:208)所编码的DmmiPEP8(SEQ ID NO:104)，所述DmmiPEP8能够调节所述miR8在真核细胞中的积累。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及由包含在miR155(SEQ IDNO:358)的初级转录物中的核苷酸序列(SEQ ID NO:356)所编码的HsmiPEP155(SEQ ID NO:355)，所述HsmiPEP155能够调节所述miR155在真核细胞中的积累。

在另一个方面，本发明涉及分离的肽，或者分离且纯化的肽，或者合成肽或重组肽，其包含与miPEP的序列相同的序列或由与miPEP的序列相同的序列组成，所述miPEP尤其天然地存在于植物中或存在于动物例如人中。

在另一个方面，本发明涉及包含至少一种上面所定义的核酸分子的载体。

在另一个方面，本发明还涉及至少一种：

-上面所定义的miPEP，

-编码所述miPEP的核酸，或

-包含所述核酸的载体，

用于在指定真核细胞中调节至少一种基因的表达的用途，

所述指定真核细胞能够表达微小RNA，所述微小RNA的初级转录物包含至少一种编码所述至少一种miPEP的核苷酸序列，并且所述微小RNA的积累由所述至少一种miPEP来进行调节，

所述至少一种基因的表达由所述微小RNA来进行调控。

在另一个方面，本发明还涉及至少一种：

-具有4至100个氨基酸，优选地4至40个氨基酸的miPEP，其由包含在微小RNA的初级转录物中的核苷酸序列所编码，所述miPEP能够调节所述微小RNA在真核细胞中的积累，

-编码所述miPEP的核酸，或

-包含所述核酸的载体，

用于在指定真核细胞中调节至少一种基因的表达的用途，

所述指定真核细胞能够表达微小RNA，所述微小RNA的初级转录物包含至少一种编码所述至少一种miPEP的核苷酸序列，并且所述微小RNA的积累由所述至少一种miPEP来进行调节，

所述至少一种基因的表达由所述微小RNA来进行调控。

在另一个方面，本发明还涉及至少一种：

-具有4至100个氨基酸或3个氨基酸的miPEP，其由包含在微小RNA的初级转录物中的核苷酸序列所编码，所述miPEP能够调节所述微小RNA在真核细胞中的积累，

-编码所述miPEP的核酸，或

-包含所述核酸的载体，

用于在指定真核细胞中调节至少一种基因的表达的用途，

所述指定真核细胞能够表达微小RNA，所述微小RNA的初级转录物包含至少一种编码所述至少一种miPEP的核苷酸序列，并且所述微小RNA的积累由所述至少一种miPEP来进行调节，

所述至少一种基因的表达由所述微小RNA来进行调控。

在另一个方面，本发明还涉及至少一种：

-具有3个氨基酸的miPEP，其由包含在微小RNA的初级转录物中的核苷酸序列所编码，所述miPEP能够调节所述微小RNA在真核细胞中的积累，

-编码所述miPEP的核酸，或

-包含所述核酸的载体，

用于在指定真核细胞中调节至少一种基因的表达的用途，

所述指定真核细胞能够表达微小RNA，所述微小RNA的初级转录物包含至少一种编码所述至少一种miPEP的核苷酸序列，并且所述微小RNA的积累由所述至少一种miPEP来进行调节，

所述至少一种基因的表达由所述微小RNA来进行调控。

本发明基于由发明人作出的令人惊讶的观察，可能调节同一个微小RNA的一个或多个靶基因的表达，这通过借助于miPEP调节所述微小RNA的积累来进行。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述指定真核细胞为植物细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述指定真核细胞为十字花科植物例如拟南芥，豆科植物例如大豆、截形苜蓿和紫苜蓿，或者茄科植物例如本氏烟草、马铃薯、番茄或茄子的植物细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述指定真核细胞为动物细胞，尤其是人细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述指定真核细胞为动物细胞，尤其是人细胞，所述miPEP不用于人或动物身体的手术或治疗性处理，也不用于改变人类的遗传同一性。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述指定真核细胞为动物细胞，所述miPEP用于人或动物身体的手术或治疗性处理。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中在所述指定真核细胞中，所述微小RNA和所述基因是内源来源的。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中在所述指定真核细胞中，所述微小RNA和所述基因是外源来源的，所述指定真核细胞包含至少一种允许所述微小RNA和所述基因表达的载体。

在本发明中，表述“内源来源的”和“外源来源的”用于区分不同物种的所述微小RNA和/或所述基因，鉴于物种之间的序列保守性。

因此，术语“内源来源的”表明，所述微小RNA和/或所述基因可以天然地存在于所讨论的细胞中。然而，可以人工地在所讨论的细胞中加入内源来源的所述微小RNA和/或所述基因的其他拷贝，例如通过克隆。

相反地，术语“外源来源的”表明，所述微小RNA和/或所述基因从未天然地存在于所讨论的细胞中。它是在另一个细胞类型中或在另一个物种的生物中鉴定出的微小RNA和/或基因，因此该微小RNA和/或该基因必需人工地引入到所讨论的细胞中。

因此，在本发明中，经遗传转化的细胞可以包含2组在序列方面潜在地近似的微小RNA和/或基因，其中一组是内源来源的，而另一组是外源来源的。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中在所述指定真核细胞中，所述miRNA的初级转录物和所述基因是外源来源的，所述指定真核细胞包含至少一种允许所述微小RNA的初级转录物表达的载体。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述miRNA的初级转录物由人工地引入到细胞中的载体来编码。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述miPEP选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:375至SEQ ID NO:386和SEQ ID NO:355组成的肽的组(表1)。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述miPEP选自由下列组成的肽的组：

-SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:355，

-SEQ ID NO:375至SEQ ID NO:386，或

-SEQ ID NO:424。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述miPEP选自MtmiPEP171b1(SEQ ID NO:59)、AtmiPEP164a1(SEQID NO:24)、AtmiPEP165a(SEQ ID NO:43)、AtmiPEP319a1(SEQID NO:76)和AtmiPEP319a2(SEQ ID NO:77)。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述miPEP选自MtmiPEP171b1(SEQ ID NO:59)、AtmiPEP164a1(SEQID NO:24)、AtmiPEP165a(SEQ ID NO:43)、AtmiPEP319a1(SEQID NO:76)、AtmiPEP319a2(SEQ ID NO:77)、AtmiPEP160b1(SEQID NO:14)、MtmiPEP171e(SEQ ID NO:63)和MtmiPEP169d(SEQID NO:424)。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述miPEP选自DmmiPEP1a(SEQ ID NO:102)、DmmiPEP1b(SEQ IDNO:103)和DmmiPEP8(SEQ ID NO:104)。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述miPEP为HsmiPEP155a(SEQ ID NO:355)。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述核酸选自由SEQ ID NO:105至SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:356组成的核酸的组(表2)。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述核酸选自由下列组成的核酸的组：

-SEQ ID NO:105至SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:356，

-SEQ ID NO:387至SEQ ID NO:399，或

-SEQ ID NO:425。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述核酸选自miORF171b(SEQ ID NO:163)、miORF164a1(SEQ ID NO:128)、miORF165a(SEQ ID NO:147)、miORF319a1(SEQ ID NO:180)和miORF319a2(SEQ ID NO:181)。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述核酸选自miORF171b(SEQ ID NO:163)、miORF164a1(SEQ ID NO:128)、miORF165a(SEQ ID NO:147)、miORF319a1(SEQ ID NO:180)、miORF319a2(SEQ ID NO:181)、miORF160b1(SEQ ID NO:118)、miORF169d(SEQ ID NO:425)和miORF171e(SEQ ID NO:167)。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述核酸选自miORF1a(SEQ ID NO:206)、miORF1b(SEQ ID NO:207)和miORF8(SEQ ID NO:208)。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述核酸选自miORF155(SEQ ID NO:356)。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述微小RNA选自由SEQ ID NO:282至SEQ ID NO:354和SEQ ID NO:358组成的核酸的组。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述微小RNA选自由下列组成的核酸的组：

-SEQ ID NO:282至SEQ ID NO:354和SEQ ID NO:358，

-SEQ ID NO:412至SEQ ID NO:423，或

-SEQ ID NO:427。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述微小RNA选自miR171b(SEQ ID NO:319)、miR165a(SEQ ID NO:305)和miR319a(SEQ ID NO:331)。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述微小RNA选自miR171b(SEQ ID NO:319)、miR164a(SEQ ID NO:297)、miR165a(SEQ ID NO:305)、miR319a(SEQ ID NO:331)、miR160b(SEQ ID NO:291)、miR171e(SEQ ID NO:322)和miR169d(SEQ ID NO:427)。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述微小RNA选自miR1a(SEQ ID NO:353)和miR8(SEQ ID NO:354)。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述微小RNA选自miR155(SEQ ID NO:358)。

在另一个方面，本发明特别地涉及用于在真核细胞中调节由微小RNA所调控的基因表达的方法，所述方法包括实施miPEP在所述真核细胞中积累的步骤，

所述miPEP：

-具有3至100个氨基酸，优选地4至20个氨基酸的大小，和

-具有与由包含在调控所述基因的表达的微小RNA的初级转录物中的核苷酸序列所编码的肽序列相同的肽序列，和

-能够调节所述微小RNA的积累，

其中，所述miPEP在所述真核细胞中的积累诱导所述基因的表达相对于在没有所述miPEP的积累的情况下所述基因的表达而言发生调节。

在另一个方面，本发明特别地涉及用于在真核细胞中调节由微小RNA所调控的基因表达的方法，所述方法包括实施miPEP在所述真核细胞中积累的步骤，

所述miPEP：

-具有4至100个氨基酸或3个氨基酸的大小，和

-具有与由包含在调控所述基因的表达的微小RNA的初级转录物中的核苷酸序列所编码的肽序列相同的肽序列，和

-能够调节所述微小RNA的积累，

其中，所述miPEP在所述真核细胞中的积累诱导所述基因的表达相对于在没有所述miPEP的积累的情况下所述基因的表达而言发生调节。

在另一个方面，本发明特别地涉及用于在真核细胞中调节由微小RNA所调控的基因表达的方法，所述方法包括实施miPEP在所述真核细胞中积累的步骤，

所述miPEP：

-具有3个氨基酸的大小，和

-具有与由包含在调控所述基因的表达的微小RNA的初级转录物中的核苷酸序列所编码的肽序列相同的肽序列，和

-能够调节所述微小RNA的积累，

其中，所述miPEP在所述真核细胞中的积累诱导所述基因的表达相对于在没有所述miPEP的积累的情况下所述基因的表达而言发生调节。

特别地，本发明涉及用于在真核细胞中调节由微小RNA所调控的基因表达的方法，所述方法包括实施miPEP在所述真核细胞中积累的步骤，

所述miPEP：

-具有4至100个氨基酸，优选地4至20个氨基酸的大小，和

-具有与由包含在调控所述基因的表达的微小RNA的初级转录物中的核苷酸序列所编码的肽序列相同的肽序列，和

-能够调节所述微小RNA的积累，

其中，所述miPEP在所述真核细胞中的积累诱导所述基因的表达相对于在没有所述miPEP的积累的情况下所述基因的表达而言发生调节。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于调节基因表达的方法，其中所述miPEP在所述细胞中的积累是由于：

-将编码所述miPEP的核酸引入到所述细胞中，或

-将所述miPEP引入到所述细胞中。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于调节基因表达的方法，其中所述真核细胞为植物细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于调节基因表达的方法，其中所述真核细胞为动物细胞，尤其是人细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于调节基因表达的方法，其中所述真核细胞为动物细胞，尤其是人细胞，所述方法不用于人或动物身体的手术或治疗性处理，也不用于改变人类的遗传同一性。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于调节基因表达的方法，其中在所述真核细胞中，所述微小RNA和所述基因是内源来源的。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于调节基因表达的方法，其中在所述真核细胞中，所述微小RNA和所述基因是外源来源的，所述真核细胞包含至少一种允许所述微小RNA和所述基因表达的载体。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于调节基因表达的方法，其中所述miPEP选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:375至SEQ ID NO:386和SEQ ID NO:355组成的肽的组。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于调节基因表达的方法，其中所述miPEP选自由下列组成的肽的组：

-SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:355，

-SEQ ID NO:375至SEQ ID NO:386，或

-SEQ ID NO:424。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及用于在真核细胞中调节由miR171b(SEQ ID NO:319)所调控的基因表达的方法，所述方法包括实施MtmiPEP171b1(SEQ ID NO:59)在所述真核细胞中积累的步骤，

其中，所述MtmiPEP171b1在所述真核细胞中的积累诱导所述基因的表达相对于在没有所述MtmiPEP171b1的积累的情况下所述基因的表达而言发生调节。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及用于在真核细胞中调节由miR171b(SEQ ID NO:319)所调控的基因表达的方法，所述方法包括实施MtmiPEP171b1(SEQ ID NO:59)在所述真核细胞中积累的步骤，

其中，所述MtmiPEP171b1在所述真核细胞中的积累诱导所述基因的表达相对于在没有所述MtmiPEP171b1的积累的情况下所述基因的表达而言发生调节，

其中，所述基因选自基因HAM1(登录号MtGI9-TC114268)和HAM2(登录号MtGI9-TC120850)(根据数据库“Medicago truncatulaGene Expression Atlas(MtGEA)”的登录号)。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及用于在真核细胞中调节由miR164a(SEQ ID NO:297)所调控的基因表达的方法，所述方法包括实施AtmiPEP165a1(SEQ ID NO:24)在所述真核细胞中积累的步骤，

其中，所述AtmiPEP164a1在所述真核细胞中的积累诱导所述基因的表达相对于在没有所述AtmiPEP164a1的积累的情况下所述基因的表达而言发生调节。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及用于在真核细胞中调节由miR165a(SEQ ID NO:305)所调控的基因表达的方法，所述方法包括实施AtmiPEP165a(SEQ ID NO:43)在所述真核细胞中积累的步骤，

其中，所述AtmiPEP165a在所述真核细胞中的积累诱导所述基因的表达相对于在没有所述AtmiPEP165a的积累的情况下所述基因的表达而言发生调节。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及用于在真核细胞中调节由miR319a(SEQ ID NO:331)所调控的基因表达的方法，所述方法包括实施AtmiPEP319a1(SEQ ID NO:76)在所述真核细胞中积累的步骤，

其中，所述AtmiPEP319a1在所述真核细胞中的积累诱导所述基因的表达相对于在没有所述AtmiPEP319a1的积累的情况下所述基因的表达而言发生调节。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及用于在真核细胞中调节由miR319a(SEQ ID NO:331)所调控的基因表达的方法，所述方法包括实施AtmiPEP319a2(SEQ ID NO:77)在所述真核细胞中积累的步骤，

其中，所述AtmiPEP319a2在所述真核细胞中的积累诱导所述基因的表达相对于在没有所述AtmiPEP319a2的积累的情况下所述基因的表达而言发生调节。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及用于在真核细胞中调节由miR160b(SEQ ID NO:291)所调控的基因表达的方法，所述方法包括实施AtmiPEP160b1(SEQ ID NO:14)在所述真核细胞中积累的步骤，

其中，所述AtmiPEP160b1在所述真核细胞中的积累诱导所述基因的表达相对于在没有所述AtmiPEP160b1的积累的情况下所述基因的表达而言发生调节。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及用于在真核细胞中调节由miR169d(SEQ ID NO:427)所调控的基因表达的方法，所述方法包括实施MtmiPEP169d(SEQ ID NO:424)在所述真核细胞中积累的步骤，

其中，所述MtmiPEP169d在所述真核细胞中的积累诱导所述基因的表达相对于在没有所述MtmiPEP169d的积累的情况下所述基因的表达而言发生调节。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及用于在真核细胞中调节由miR171e(SEQ ID NO:322)所调控的基因表达的方法，所述方法包括实施MtmiPEP171e(SEQ ID NO:63)在所述真核细胞中积累的步骤，

其中，所述MtmiPEP171e在所述真核细胞中的积累诱导所述基因的表达相对于在没有所述MtmiPEP171e的积累的情况下所述基因的表达而言发生调节。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及用于在真核细胞中调节由miR1(SEQ ID NO:353)所调控的基因表达的方法，所述方法包括实施DmmiPEP1a(SEQ ID NO:102)在所述真核细胞中积累的步骤，

其中，所述DmmiPEP1a在所述真核细胞中的积累诱导所述基因的表达相对于在没有所述DmmiPEP1a的积累的情况下所述基因的表达而言发生调节。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及用于在真核细胞中调节由miR1(SEQ ID NO:353)所调控的基因表达的方法，所述方法包括实施DmmiPEP1b(SEQ ID NO:103)在所述真核细胞中积累的步骤，

其中，所述DmmiPEP1b在所述真核细胞中的积累诱导所述基因的表达相对于在没有所述DmmiPEP1b的积累的情况下所述基因的表达而言发生调节。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及用于在真核细胞中调节由miR8(SEQ ID NO:354)所调控的基因表达的方法，所述方法包括实施DmmiPEP8(SEQ ID NO:104)在所述真核细胞中积累的步骤，

其中，所述DmmiPEP8在所述真核细胞中的积累诱导所述基因的表达相对于在没有所述DmmiPEP8的积累的情况下所述基因的表达而言发生调节。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及用于在真核细胞中调节由miR155(SEQ ID NO:358)所调控的基因表达的方法，所述方法包括实施HsmiPEP155(SEQ ID NO:355)在所述真核细胞中积累的步骤，

其中，所述HsmiPEP155在所述真核细胞中的积累诱导所述基因的表达相对于在没有所述HsmiPEP155的积累的情况下所述基因的表达而言发生调节。

在另一个方面，本发明涉及经修饰的真核细胞，其包含与上面所定义的miPEP相同的肽，所述肽不依赖于携带编码所述miPEP的核苷酸序列的微小RNA的初级转录物的转录而存在于所述真核细胞中。

在本发明中，术语“经修饰的真核细胞”意味着，所述真核细胞包含人工引入到所述细胞中的miPEP，其要么作为肽，要么借助于编码所述miPEP的载体。

除了人工引入到所述细胞中的miPEP之外，根据本发明的经修饰的真核细胞还包含至少一种相应于编码所述miPEP的miORF的核酸。

除了人工引入到所述细胞中的miPEP和所述miORF之外，根据本发明的经修饰的真核细胞还包含至少一种miR，其初级转录物包含所述miORF。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的经修饰的真核细胞，其中所述微小RNA是内源来源的。

在另一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的经修饰的真核细胞，其中所述微小RNA是外源来源的，所述经修饰的真核细胞包含允许所述微小RNA表达的载体。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的经修饰的真核细胞，其中所述细胞为植物细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的经修饰的真核细胞，其中所述植物细胞为截形苜蓿或拟南芥的细胞，所述肽选自由下列组成的肽的组：

-SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:101，

-SEQ ID NO:375至SEQ ID NO:386，或

-SEQ ID NO:424。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的经修饰的真核细胞，其中所述植物细胞为截形苜蓿或拟南芥的细胞，所述肽选自由SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:77组成的肽的组。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的经修饰的真核细胞，其中所述植物细胞为截形苜蓿或拟南芥的细胞，所述肽选自由SEQ IDNO:59、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:424和SEQ ID NO:63组成的肽的组。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的经修饰的真核细胞，其中所述细胞为动物细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的经修饰的真核细胞，其中所述动物细胞为果蝇细胞，并且所述肽选自由SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:104组成的肽的组。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的经修饰的真核细胞，其中所述动物细胞为人细胞，并且所述肽选自SEQ ID NO:355。

在另一个方面，本发明涉及包含至少一个上面所定义的经修饰的真核细胞的植物。

在另一个方面，本发明还涉及包含至少一个上面所定义的经修饰的真核细胞的非人动物生物。

在另一个方面，本发明涉及组合物，其包含至少一种：

-上面所定义的miPEP，

-编码所述miPEP的核酸，或

-包含所述核酸的载体。

在另一个方面，本发明涉及组合物，其包含至少一种选自由下列组成的组的miPEP：

-SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:101，

-SEQ ID NO:375至SEQ ID NO:386，或

-SEQ ID NO:424。

在另一个方面，本发明涉及杀有害生物剂组合物，其包含至少一种：

-上面所定义的miPEP，

-编码所述miPEP的核酸，或

-包含所述核酸的载体。

在另一个方面，本发明涉及植物药学组合物，其包含至少一种：

-上面所定义的miPEP，

-编码所述miPEP的核酸，或

-包含所述核酸的载体。

在另一个方面，本发明涉及诱发性组合物，其包含至少一种：

-上面所定义的miPEP，

-编码所述miPEP的核酸，或

-包含所述核酸的载体。

“诱发性组合物”是指能够赋予植物以更好的共生能力或更好的对于不同胁迫的抗性的组合物，不论所述胁迫是热性质的，是水分性质的，还是化学性质的。

为此，本发明还涉及对于植物的生长(生长的抑制，或者相反，生长的增加)和生理学(更好的菌根形成、结瘤的能力，更好的对于不同胁迫的耐受性)起作用的组合物。

特别地，本发明涉及用于促进植物的生长的组合物。

在另一个方面，本发明涉及除草剂组合物，其包含至少一种：

-上面所定义的miPEP，

-编码所述miPEP的核酸，或

-包含所述核酸的载体。

在另一个方面，本发明涉及杀昆虫剂组合物，其包含至少一种：

-上面所定义的miPEP，

-编码所述miPEP的核酸，或

-包含所述核酸的载体。

在另一个方面，本发明涉及组合物，特别是植物卫生组合物，其包含miPEP164a作为活性物质，所述miPEP164a优选地由SEQ IDNO:24组成。

在另一个方面，本发明涉及组合物，特别是植物卫生组合物，其包含miPEP319a作为活性物质，所述miPEP319a优选地由SEQ IDNO:76组成。

在另一个方面，本发明涉及组合物，特别是植物卫生组合物，其包含miPEP171b作为活性物质，所述miPEP171b优选地由SEQ IDNO:59组成。

在另一个方面，本发明涉及组合物，特别是植物卫生组合物，其包含miPEP165a作为活性物质，所述miPEP165a优选地由SEQ IDNO:43组成。

在另一个方面，本发明涉及组合物，特别是植物卫生组合物，其包含miPEP319a2作为活性物质，所述miPEP319a2优选地由SEQ IDNO:77组成。

在另一个方面，本发明涉及组合物，特别是植物卫生组合物，其包含miPEP160b1作为活性物质，所述miPEP160b1优选地由SEQ IDNO:14组成。

在另一个方面，本发明涉及组合物，特别是植物卫生组合物，其包含miPEP169d作为活性物质，所述miPEP169d优选地由SEQ IDNO:424组成。

在另一个方面，本发明涉及组合物，特别是植物卫生组合物，其包含miPEP171e作为活性物质，所述miPEP171e优选地由SEQ ID NO:63组成。

miPEP的可溶特性尤其由其氨基酸组成决定。可以将亲水的miPEP溶解和包装在水性溶液例如水中。可以将疏水的miPEP溶解和包装在溶剂例如有机溶剂中。

对于用miPEP对植物进行处理，所述有机溶剂为低量的对于植物来说非毒性的溶剂，即它们对于植物的发育不具有有害的效应。非限制性地，所述有机溶剂可以选自乙腈和乙酸。

还可以将miPEP溶解和包装在有机溶剂的混合物(例如，乙腈和乙酸的混合物)中。特别地，可以将miPEP溶解在包含50％乙腈、10％乙酸和40％水(体积/体积/体积)的溶液中。

优选地，将miPEP 164a和165a溶解在水中，而将miPEP 171b和319a溶解在包含50％乙腈、10％乙酸和40％水(体积/体积/体积)的溶液中。

非限制性地，上面所定义的组合物、杀有害生物剂组合物、植物药学组合物、除草剂组合物和杀昆虫剂组合物可以包含10^-9M至10^-4M的miPEP，尤其是10^-9M、10^-8M、10^-7M、10^-6M、10^-5M或10^-4M的miPEP。

根据所设想的应用，还可以预先考虑或多或少经浓缩的组合物。例如，在应当通过撒播向植物施用miPEP的情况下，可以设想包含10^-1M至10^-3M的miPEP，尤其是10^-1M、10^-2M或10^-3M的miPEP的组合物。

在另一个方面，本发明涉及上面所定义的组合物作为除草剂以便用于消除植物或减慢其生长的用途，优选地作为特异于一个种的植物或一个属的植物的除草剂。

在另一个方面，本发明涉及上面所定义的组合物作为植物药学试剂以便用于下述目的的用途：

-用于促进植物的生长和/或发育，尤其是用于调节植物的生理学参数，特别是生物量、叶表面积、开花、果实大小、植物种子的产生和/或选择，特别地用于控制植物的单性结实或雌雄同株，或用于改变植物种子的生理学参数，特别是萌发、根系建立和对于水分胁迫的抗性，或者

-用于预防或治疗植物疾病，特别地用于促进对于感染性疾病的抗性。

在另一个方面，本发明涉及上面所定义的组合物用于调节植物的生理学参数(特别是生物量、叶表面积或果实大小)的用途。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的组合物用于果园疏果以便增加果实大小的用途。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的组合物用于植物种子的产生和/或选择的用途，其中所述组合物用于控制植物的单性结实或雌雄同株。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的组合物的用途，其中所述组合物通过叶途径或通过根途径来施用给所述植物。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的组合物用于植物种子的产生和/或选择的用途。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的组合物的用途，其中所述组合物用于改变所述植物种子的生理学参数，特别是根系建立、萌发和对于水分胁迫的抗性。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的组合物的用途，其中所述组合物通过在所述植物种子上包裹或覆膜来进行施加。

在另一个方面，本发明涉及上面所定义的组合物作为杀有害生物剂以便用于消除植物的有害生物或能够被归类为此类的生物的用途，尤其是作为杀昆虫剂、杀蜘蛛剂、杀软体动物剂或杀啮齿动物剂。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的组合物作为杀昆虫剂的用途。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的组合物用于消除破坏性昆虫的用途。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的组合物用于消除被归类为有害的动物物种或能够被归类为此类的动物物种(特别是鼠科动物，尤其是大鼠)的用途。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的组合物作为杀有害生物剂以便用于消除植物的有害生物或能够被归类为此类的生物的用途，

尤其是作为杀昆虫剂、杀蜘蛛剂、杀软体动物剂或杀啮齿动物剂，

特别地通过将所述组合物施加在植物上或施加在与所述植物相接触的支持物上。

在另一个方面，本发明涉及上面所定义的组合物的用途，其中在植物上施加所述组合物以保护所述植物免于破坏性昆虫侵害。

在另一个方面，本发明涉及肽用于促进植物的生长的用途，其中将所述肽引入到所述植物中，所述肽所具有的氨基酸序列包含与天然地存在于所述植物中的miPEP的序列相同的序列或由与天然地存在于所述植物中的miPEP的序列相同的序列组成，

其中所述天然地存在于所述植物中的miPEP为具有4至100个氨基酸的肽，其序列由位于miR的初级转录物上的开放阅读框所编码，所述miPEP能够调节所述miR在所述植物中的积累，所述miR调控至少一种在所述植物的营养或生殖部分(尤其是根、茎、叶或花)的发育中所牵涉的基因的表达。

发明人令人惊讶地发现，其序列包含与在miR的初级转录物上所编码的miPEP的序列相同的序列或由与在miR的初级转录物上所编码的miPEP的序列相同的序列组成的肽的使用，使得能够促进植物的生长。

在本发明中，术语“植物”通常是指植物的整体或部分，无论其发育阶段为何(其中包括以籽或幼芽形式的植物)；植物的一个或多个器官(例如叶、根、茎、花)；植物的一个或多个细胞；或者植物的细胞团簇。

在本发明中，术语“生长”是指植物的整体或部分随时间而进行的发育。因此，植物的生长可以通过对于植物的某些部分、细胞或器官(例如叶、根、茎或者花)追踪可观察的演变性参数来测定和定量。

非限制性地，使得能够测定或定量植物的生长的参数可以尤其是：

-叶的大小、表面积、体积、质量和数目，

-花的大小和数目，

-茎(或花梗)的大小

-根的长度和数目，

-萌发的提早，

-出芽的提早，

-成花诱导(或成花转换)的提早，

-或者，细胞的数目。

在豆科植物的情况下，植物的生长还可以与结瘤的速度相关联，或者与在根上的根瘤的大小和数目相关联。

此外，在本发明中，表述“促进植物的生长”或“改善植物的生长”：

-要么表明所述植物的发育的加速(例如，对于某一植物，在给定时刻相对于参考植物而言更大的叶大小)，

-要么表明所述植物的发育的增长(例如，对于某一植物，由参考植物不能达到的更大的叶大小)，

-要么表明所述植物的发育的加速和增长。

重要的是注意，根据本发明的用途相比于在园艺中或在农业中常规使用的化学方法而言具有其是生态的这样的优点，因为miPEP是天然地存在于植物中的肽。

本发明还涉及引入到植物中的miPEP用于促进生长的用途，

所述引入的miPEP为包含与天然地存在于所述植物中的miPEP的序列相同的序列或由与天然地存在于所述植物中的miPEP的序列相同的序列组成的肽，

所述天然地存在的miPEP为具有4至100个氨基酸的肽，其序列由在miR的初级转录物上位于5’处的开放阅读框所编码，

所述miPEP能够调节所述miR在所述植物中的积累，所述miR调控至少一种在植物的营养或生殖部分(尤其是根、茎、叶或花)的发育中所牵涉的基因的表达，

所述引入的miPEP的量和所述天然地存在的miPEP的量之和严格地高于所述天然地存在的miPEP的量。

在本发明中，表述“引入的miPEP”是指人工地引入到植物中的miPEP，这与“天然地存在于植物中的miPEP”相反。因此，在植物中引入miPEP牵涉技术步骤，所述步骤不是天然现象，并且既不相应于杂交，也不相应于选择。

引入的miPEP可以要么是在植物之外产生的肽(例如，分离的和/或经纯化的肽、合成肽或重组肽)，要么是在将编码所述miPEP的核酸非天然地引入到所述植物中之后在植物中产生的肽。

其中未引入miPEP的植物具有基础量的所述miPEP，其相应于所述天然地存在的miPEP的量。包含与所述miPEP的序列相同的序列或由与所述miPEP的序列相同的序列组成的miPEP的使用导致miPEP的总量增加，这调节其初级转录物包含编码所述miPEP的序列的miR的积累。

此外，引入的miPEP存在于所述植物中，并且其引入不影响其稳定性。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述在植物的营养或生殖部分的发育中所牵涉的基因选自由下列组成的组：NAC1(登录号AT1G56010.1)、NAC4(登录号AT5G07680.1)、NAC5(登录号AT5G61430.1)、CUC1(登录号AT3G15170.1)、CUC2(登录号AT5G53950.1)、TCP3(登录号AT1G53230.1)和TCP4(登录号AT3G15030.1)(根据数据库“The Arabidopsis InformationResource(TAIR)”的登录号)。

特别地，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述在植物的营养或生殖部分的发育中所牵涉的基因选自由下列组成的组：NAC1、NAC4、NAC5、CUC1和CUC2。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述在植物的营养或生殖部分的发育中所牵涉的基因选自由下列组成的组：TCP3和TCP4。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述miRNA选自miR164a和miR319a。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述miR选自miR164a、miR319a、miR171b、miR165a、miR160b、miR169d和miR171e。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述miPEP选自AtmiPEP164a1、AtmiPEP319a1、AtmiPEP319a2、MtmiPEP171b1、AtmiPEP165a1、AtmiPEP160b1、MtmiPEP169d、MtmiPEP171e。

特别地，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述miR164a具有由SEQ ID NO:297组成的核苷酸序列。

特别地，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述miR164a具有与核苷酸序列SEQ ID NO:297有着至少80％的同一性，优选地至少90％的同一性的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述miPEP为AtmiPEP164a1，特别地，其中所述AtmiPEP164a1具有由SEQ ID NO:24组成的氨基酸序列。

特别地，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述miR319a具有由SEQ ID NO:331组成的核苷酸序列。

特别地，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述miR319a具有与核苷酸序列SEQ ID NO:331有着至少80％的同一性，优选地至少90％的同一性的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述miPEP为AtmiPEP319a1，特别地，其中所述AtmiPEP319a1具有由SEQ ID NO:76组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述植物为十字花科植物例如拟南芥，豆科植物例如大豆、截形苜蓿和紫苜蓿，或者茄科植物例如本氏烟草、马铃薯、番茄或茄子。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述植物为十字花科植物。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中所述植物为拟南芥。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，所述用途为用于促进拟南芥植物的生长，其中将AtmiPEP164a1引入到所述拟南芥植物中，所述AtmiPEP164a1也天然地存在于所述拟南芥植物中，

所述引入的AtmiPEP164a1为其序列包含与所述天然地存在的AtmiPEP164a1的序列相同的序列或由与所述天然地存在的AtmiPEP164a1的序列相同的序列组成的肽，所述天然地存在的AtmiPEP164a1的所述序列由在miR164a的初级转录物上位于5’处的开放阅读框所编码，所述miR164a调控至少一种在拟南芥的营养或生殖部分的发育中所牵涉的基因的表达，

所述引入的AtmiPEP164a1的量和所述天然地存在的AtmiPEP164a1的量之和严格地高于所述天然地存在于所述拟南芥植物中的AtmiPEP164a1的量。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，所述用途为用于促进拟南芥植物的生长，其中将AtmiPEP319a1引入到所述拟南芥植物中，所述AtmiPEP319a1也天然地存在于所述拟南芥植物中，

所述引入的AtmiPEP319a1为其序列包含与所述天然地存在的AtmiPEP319a1的序列相同的序列或由与所述天然地存在的AtmiPEP319a1的序列相同的序列组成的肽，所述天然地存在的AtmiPEP319a1的所述序列由在miR319a的初级转录物上位于5’处的开放阅读框所编码，所述miR319a调控至少一种在拟南芥的营养或生殖部分的发育中所牵涉的基因的表达，

所述引入的AtmiPEP319a1的量和所述天然地存在的AtmiPEP319a1的量之和严格地高于所述天然地存在于所述拟南芥植物中的AtmiPEP319a1的量。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中通过外部途径，优选地通过浇灌，通过喷洒，或者通过添加肥料、腐殖土、培养基质或惰性支持物，来将所述miPEP引入到植物中。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中通过浇灌和通过喷洒来引入所述miPEP。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中通过浇灌和通过添加肥料来引入所述miPEP。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中通过喷洒和通过添加肥料来引入所述miPEP。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中通过浇灌、通过喷洒和通过添加肥料来引入所述miPEP。

事实上，发明人出人意料地发现，可能在植物上直接施加包含miPEP的组合物以调节相应的miR在植物中的积累，这表明所述miPEP被所述植物接收。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中用包含10^-9M至10^-4M的所述miPEP，尤其是10^-9M、10^-8M、10^-7M、10^-6M、10^-5M或10^-4M的所述miPEP的组合物来处理植物。

优选地，对于通过浇灌或通过喷洒来施加在植物上，所述组合物具有10^-8M至10^-5M的浓度。

作为补充，对于用miPEP来处理植物，可以设想或多或少经浓缩的组合物。例如，和非限制性地，在通过撒播向植物施用通过外源途径而引入的miPEP的情况下，可以使用包含10^-1M至10^-3M，尤其是10^-2M的miPEP的更为浓缩的组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中经由编码所述miPEP的核酸来将所述miPEP引入到植物中，所述核酸被引入到植物中。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中在其中引入了所述miPEP的植物中的茎大小相对于其中未引入任何miPEP的具有同样年龄的相同植物的茎大小而言或者相对于其中未引入所述miPEP的具有同样年龄的相同植物的茎大小而言增加了。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中在其中引入了所述miPEP的植物中的叶数目相对于其中未引入任何miPEP的具有同样年龄的相同植物的叶数目而言或者相对于其中未引入所述miPEP的具有同样年龄的相同植物的叶数目而言增加了。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中在其中引入了所述miPEP的植物中的叶大小相对于其中未引入任何miPEP的具有同样年龄的相同植物的叶大小而言或者相对于其中未引入所述miPEP的具有同样年龄的相同植物的叶大小而言增加了。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中在其中引入了所述miPEP的植物中的根数目相对于其中未引入任何miPEP的具有同样年龄的相同植物的根数目而言或者相对于其中未引入所述miPEP的具有同样年龄的相同植物的根数目而言增加了。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中在其中引入了所述miPEP的植物中的根长度相对于其中未引入任何miPEP的具有同样年龄的相同植物的根长度而言或者相对于其中未引入所述miPEP的具有同样年龄的相同植物的根长度而言增加了。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中在其中引入了所述miPEP的植物中的结瘤速度相对于其中未引入任何miPEP的具有同样年龄的相同植物的结瘤速度而言或者相对于其中未引入所述miPEP的具有同样年龄的相同植物的结瘤速度而言增加了。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中在其中引入了所述miPEP的植物中的根瘤数目相对于其中未引入任何miPEP的具有同样年龄的相同植物的根瘤数目而言或者相对于其中未引入所述miPEP的具有同样年龄的相同植物的根瘤数目而言增加了。

使得能够测定和定量在其中引入了miPEP的植物中的生长的参数(例如，茎的大小、叶的数目和大小、根的数目和长度、结瘤的速度或者在根上的根瘤的数目)的增加优选地通过与相同的(即同样物种和/或品种的植物)、同样年龄的且在同样条件下栽培的但其中未引入任何miPEP的植物进行比较来证明。

在另一个方面，本发明涉及用于促进植物的生长的方法，所述方法包括将miPEP引入到植物中的步骤，所述miPEP也天然地存在于所述植物中，

所述引入的miPEP为具有4至100个氨基酸的肽，其序列包含与所述天然地存在的miPEP的序列相同的序列或由与所述天然地存在的miPEP的序列相同的序列组成，所述天然地存在的miPEP的所述序列由在miR的初级转录物上位于5’处的开放阅读框所编码，所述miPEP能够调节所述miR的积累，所述miR调控至少一种在植物的营养或生殖部分(尤其是根、茎、叶或花)的发育中所牵涉的基因的表达，

所述引入的miPEP的量和所述天然地存在的miPEP的量之和严格地高于所述天然地存在的miPEP的量。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，其中所述在植物的营养或生殖部分的发育中所牵涉的基因选自由下列组成的组：NAC1(登录号AT1G56010.1)、NAC4(登录号AT5G07680.1)、NAC5(登录号AT5G61430.1)、CUC1(登录号AT3G15170.1)、CUC2(登录号AT5G53950.1)、TCP3(登录号AT1G53230.1)和TCP4(登录号AT3G15030.1)。

特别地，本发明涉及上面所定义的方法，其中所述在植物的营养或生殖部分的发育中所牵涉的基因选自由下列组成的组：NAC1、NAC4、NAC5、CUC1和CUC2。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，其中所述在植物的营养或生殖部分的发育中所牵涉的基因选自由下列组成的组：TCP3和TCP4。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，其中所述miR选自miR164a、miR319a、miR171b、miR165a、miR160b、miR169d和miR171e。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，其中所述miPEP选自AtmiPEP164a1、AtmiPEP319a1、AtmiPEP319a2、MtmiPEP171b1、AtmiPEP165a1、AtmiPEP160b1、MtmiPEP169d、MtmiPEP171e。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，其中所述miRNA为miR164a，特别地，其中所述miR164a具有由SEQ ID NO:297组成的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，其中所述miPEP为AtmiPEP164a1，特别地，其中所述AtmiPEP164a1具有由SEQ ID NO:24组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，其中所述miRNA为miR319a，特别地，其中所述miR319a具有由SEQ ID NO:331组成的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，其中所述miPEP为AtmiPEP319a1，特别地，其中所述AtmiPEP319a1具有由SEQ ID NO:76组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，其中所述植物为十字花科植物例如拟南芥，豆科植物例如大豆、截形苜蓿和紫苜蓿，或者茄科植物例如本氏烟草、马铃薯、番茄或茄子。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，其中所述植物为十字花科植物。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，其中所述植物为拟南芥。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，所述方法用于促进拟南芥植物的生长，其中将AtmiPEP164a1引入到所述拟南芥植物中，所述AtmiPEP164a1也天然地存在于所述拟南芥植物中，

所述引入的AtmiPEP164a1为包含与所述天然地存在的AtmiPEP164a1的序列相同的序列或由与所述天然地存在的AtmiPEP164a1的序列相同的序列组成的肽，所述天然地存在的AtmiPEP164a1为具有4至100个氨基酸的肽，其序列由在miR164a的初级转录物上位于5’处的开放阅读框所编码，

所述AtmiPEP164a1能够增加所述miR164a的积累，所述miR164a调控至少一种在拟南芥的营养或生殖部分的发育中所牵涉的基因的表达，

所述引入的AtmiPEP164a1的量和所述天然地存在的AtmiPEP164a1的量之和严格地高于所述天然地存在的AtmiPEP164a1的量。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，所述方法用于促进拟南芥植物的生长，其中将AtmiPEP319a1引入到所述拟南芥植物中，所述AtmiPEP319a1也天然地存在于所述拟南芥植物中，

所述引入的AtmiPEP319a1为包含与所述天然地存在的AtmiPEP319a1的序列相同的序列或由与所述天然地存在的AtmiPEP319a1的序列相同的序列组成的肽，所述天然地存在的AtmiPEP319a1为具有4至100个氨基酸的肽，其序列由在miR319a的初级转录物上位于5’处的开放阅读框所编码，

所述AtmiPEP319a1能够增加所述miR319a的积累，所述miR319a调控至少一种在拟南芥的营养或生殖部分的发育中所牵涉的基因的表达，

所述引入的AtmiPEP319a1的量和所述天然地存在的AtmiPEP319a1的量之和严格地高于所述天然地存在的AtmiPEP319a1的量。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，其中通过外部途径，优选地通过浇灌，通过喷洒，或者通过添加肥料、腐殖土、培养基质或惰性支持物，来将所述miPEP引入到植物中。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，其中以包含10^-9M至10^-4M的所述miPEP，特别地10^-9M、10^-8M、10^-7M、10^-6M、10^-5M或10^-4M的所述miPEP的组合物的形式，向植物施用所述miPEP。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，其中经由编码所述miPEP的核酸来将所述miPEP引入到植物中，所述核酸被引入到植物中。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，其中在其中引入了所述miPEP的植物中的茎大小相对于其中未引入任何miPEP的具有同样年龄的相同植物的茎大小而言或者相对于其中未引入所述miPEP的具有同样年龄的相同植物的茎大小而言增加了。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，其中在其中引入了所述miPEP的植物中的叶数目相对于其中未引入任何miPEP的具有同样年龄的相同植物的叶数目而言或者相对于其中未引入所述miPEP的具有同样年龄的相同植物的叶数目而言增加了。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，其中在其中引入了所述miPEP的植物中的叶大小相对于其中未引入任何miPEP的具有同样年龄的相同植物的叶大小而言或者相对于其中未引入所述miPEP的具有同样年龄的相同植物的叶大小而言增加了。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，其中在其中引入了所述miPEP的植物中的根数目相对于其中未引入任何miPEP的具有同样年龄的相同植物的根数目而言或者相对于其中未引入所述miPEP的具有同样年龄的相同植物的根数目而言增加了。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，其中在其中引入了所述miPEP的植物中的根长度相对于其中未引入任何miPEP的具有同样年龄的相同植物的根长度而言或者相对于其中未引入所述miPEP的具有同样年龄的相同植物的根长度而言增加了。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，其中在其中引入了所述miPEP的植物中的结瘤速度相对于其中未引入任何miPEP的具有同样年龄的相同植物的结瘤速度而言或者相对于其中未引入所述miPEP的具有同样年龄的相同植物的结瘤速度而言增加了。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的方法，其中在其中引入了所述miPEP的植物中的根瘤数目相对于其中未引入任何miPEP的具有同样年龄的相同植物的根瘤数目而言或者相对于其中未引入所述miPEP的具有同样年龄的相同植物的根瘤数目而言增加了。

在另一个方面，本发明涉及其中根据上面所描述的用于促进植物的生长的用途或方法而引入了miPEP的植物。

在另一个方面，本发明涉及用于产生转基因植物的方法，所述方法包括：

a)将编码具有4至100个氨基酸的miPEP的核酸在允许所述miPEP表达的条件下引入到植物中或引入到所述植物的至少一个细胞中的步骤，

所述miPEP也天然地存在于所述植物中，所述天然地存在的miPEP为其序列由在miR的初级转录物上位于5’处的开放阅读框所编码的肽，所述miPEP能够调节所述miR在植物中的积累，所述miR调控至少一种在植物的营养或生殖部分(尤其是根、茎、叶或花)的发育中所牵涉的基因的表达，和

b)在允许获得转基因植物的条件下培养在步骤a)中获得的植物或所述植物的至少一个细胞的步骤。

在另一个方面，本发明涉及用于产生转基因植物的方法，所述方法包括：

a)将编码具有4至100个氨基酸或3个氨基酸的miPEP的核酸在允许所述miPEP表达的条件下引入到植物中或引入到所述植物的至少一个细胞中的步骤，

所述miPEP也天然地存在于所述植物中，所述天然地存在的miPEP为其序列由在miR的初级转录物上位于5’处的开放阅读框所编码的肽，所述miPEP能够调节所述miR在植物中的积累，所述miR调控至少一种在植物的营养或生殖部分(尤其是根、茎、叶或花)的发育中所牵涉的基因的表达，和

b)在允许获得转基因植物的条件下培养在步骤a)中获得的植物或所述植物的至少一个细胞的步骤。

在另一个方面，本发明涉及用于产生转基因植物的方法，所述方法包括：

a)将编码具有3个氨基酸的miPEP的核酸在允许所述miPEP表达的条件下引入到植物中或引入到所述植物的至少一个细胞中的步骤，

所述miPEP也天然地存在于所述植物中，所述天然地存在的miPEP为其序列由在miR的初级转录物上位于5’处的开放阅读框所编码的肽，所述miPEP能够调节所述miR在植物中的积累，所述miR调控至少一种在植物的营养或生殖部分(尤其是根、茎、叶或花)的发育中所牵涉的基因的表达，和

b)在允许获得转基因植物的条件下培养在步骤a)中获得的植物或所述植物的至少一个细胞的步骤。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中在步骤b)中获得的所述转基因植物具有相对于其中未引入所述核酸的相同植物而言经改善的生长。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中由引入到植物中的核酸所编码的所述miPEP的表达导致相对于其中未引入所述核酸的相同植物而言经改善的生长。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中步骤a)借助于包含所述核酸的载体(优选地质粒)来施行。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中将步骤a)的所述核酸的表达置于强启动子(优选地组成型强启动子，例如35S启动子)的控制之下。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中所述在植物的营养或生殖部分的发育中所牵涉的基因选自由下列组成的组：NAC1(登录号AT1G56010.1)、NAC4(登录号AT5G07680.1)、NAC5(登录号AT5G61430.1)、CUC1(登录号AT3G15170.1)、CUC2(登录号AT5G53950.1)、TCP3(登录号AT1G53230.1)和TCP4(登录号AT3G15030.1)。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中所述miPEP所具有的氨基酸序列包含选自由下列组成的组的序列或由选自由下列组成的组的序列组成：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:375至SEQ ID NO:386。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中所述miPEP所具有的氨基酸序列包含选自由下列组成的组的序列或由选自由下列组成的组的序列组成：

-SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:101，

-SEQ ID NO:375至SEQ ID NO:386，或

-SEQ ID NO:424。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中所述miRNA为miR164a，特别地，其中所述miR164a具有由SEQ ID NO:297组成的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中所述miPEP为AtmiPEP164a1，特别地，其中所述AtmiPEP164a1具有由SEQ ID NO:24组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中所述miRNA为miR319a，特别地，其中所述miR319a具有由SEQ ID NO:331组成的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中所述miPEP为AtmiPEP319a1，特别地，其中所述AtmiPEP319a1具有由SEQ ID NO:76组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中在步骤a)中引入的所述核酸包含选自SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:180的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中所述植物为十字花科植物例如拟南芥，豆科植物例如大豆、截形苜蓿和紫苜蓿，或者茄科植物例如本氏烟草、马铃薯、番茄或茄子。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中所述转基因植物为十字花科植物。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中所述转基因植物为拟南芥。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，所述方法包括：

a)将包含核苷酸序列SEQ ID NO:128(其编码由氨基酸序列SEQ ID NO:24组成的AtmiPEP164a1)的核酸在允许AtmiPEP164a1表达的条件下引入到拟南芥植物中或引入到所述拟南芥植物的至少一个细胞中的步骤，

所述AtmiPEP164a1也天然地存在于所述拟南芥植物中，所述天然地存在的miPEP为其序列由在miR164a的初级转录物上位于5’处的开放阅读框所编码的肽，所述AtmiPEP164a1能够调节所述miR164的积累，所述miR164a调控至少一种在拟南芥的营养或生殖部分的发育中所牵涉的基因的表达，和

b)在允许获得转基因拟南芥植物的条件下培养在步骤a)中获得的植物或所述植物的至少一个细胞的步骤。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，所述方法包括：

a)将包含核苷酸序列SEQ ID NO:180(其编码由氨基酸序列SEQ ID NO:76组成的AtmiPEP319a1)的核酸在允许AtmiPEP319a1表达的条件下引入到拟南芥植物中或引入到所述拟南芥植物的至少一个细胞中的步骤，

所述AtmiPEP319a1也天然地存在于所述拟南芥植物中，所述天然地存在的miPEP为其序列由在miR319a的初级转录物上位于5’处的开放阅读框所编码的肽，所述AtmiPEP319a1能够调节所述miR319的积累，所述miR319a调控至少一种在拟南芥的营养或生殖部分的发育中所牵涉的基因的表达，和

b)在允许获得转基因拟南芥植物的条件下培养在步骤a)中获得的植物或所述植物的至少一个细胞的步骤。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的产生方法，其中经由编码所述miPEP的核酸来将所述miPEP引入到植物中，所述核酸被引入到植物中。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中在其中引入了所述miPEP的植物中的茎大小相对于其中未引入任何miPEP的具有同样年龄的相同植物的茎大小而言或者相对于其中未引入所述miPEP的具有同样年龄的相同植物的茎大小而言增加了。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中在其中引入了所述miPEP的植物中的叶数目相对于其中未引入任何miPEP的具有同样年龄的相同植物的叶数目而言或者相对于其中未引入所述miPEP的具有同样年龄的相同植物的叶数目而言增加了。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中在其中引入了所述miPEP的植物中的叶大小相对于其中未引入任何miPEP的具有同样年龄的相同植物的叶大小而言或者相对于其中未引入所述miPEP的具有同样年龄的相同植物的叶大小而言增加了。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中在其中引入了所述miPEP的植物中的根数目相对于其中未引入任何miPEP的具有同样年龄的相同植物的根数目而言或者相对于其中未引入所述miPEP的具有同样年龄的相同植物的根数目而言增加了。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中在其中引入了所述miPEP的植物中的根长度相对于其中未引入任何miPEP的具有同样年龄的相同植物的根长度而言或者相对于其中未引入所述miPEP的具有同样年龄的相同植物的根长度而言增加了。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中在其中引入了所述miPEP的植物中的结瘤速度相对于其中未引入任何miPEP的具有同样年龄的相同植物的结瘤速度而言或者相对于其中未引入所述miPEP的具有同样年龄的相同植物的结瘤速度而言增加了。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的用于产生转基因植物的方法，其中在其中引入了所述miPEP的植物中的根瘤数目相对于其中未引入任何miPEP的具有同样年龄的相同植物的根瘤数目而言或者相对于其中未引入所述miPEP的具有同样年龄的相同植物的根瘤数目而言增加了。

在一个方面，本发明还涉及通过上面所定义的产生方法而获得的转基因植物。

在另一个方面，本发明涉及包含编码miPEP的载体的转基因植物，所述miPEP也天然地存在于所述植物中，

所述天然地存在的miPEP为其序列由在miR的初级转录物上位于5’处的开放阅读框所编码的肽，所述miPEP能够调节所述miR在植物中的积累，所述miR调控至少一种基因的表达，

由引入到植物中的载体所编码的所述miPEP的表达导致相对于其中未引入所述核酸的相同植物而言所述基因的表达的调节。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的转基因植物，其中所述基因牵涉于植物的营养或生殖部分(尤其是根、茎、叶或花)的发育之中，并且由引入到植物中的核酸所编码的所述miPEP的表达导致相对于其中未引入所述核酸的相同植物而言所述转基因植物的经改善的生长。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的转基因植物，其中所述miPEP选自由下列组成的组：

-SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:101，

-SEQ ID NO:375至SEQ ID NO:386，或

-SEQ ID NO:424。

在另一个方面，本发明涉及包含载体的转基因植物，

所述载体包含允许miR的初级转录物表达的核酸，

所述miR的初级转录物包含编码miPEP的开放阅读框，

所述miPEP能够调节所述miR在所述植物中的积累，所述miR调控至少一种基因在所述植物中的表达，

由引入到植物中的载体所编码的所述miPEP的表达导致相对于其中未引入所述载体的相同植物而言所述基因的表达的调节。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的转基因植物，其中所述核酸是内源来源的。

如果所述核酸是内源来源的，那么至少一个拷贝的所述核酸已经独立于引入到植物中的载体而天然地存在于所述植物中。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的转基因植物，其中所述核酸是外源来源的。

如果所述核酸是外源来源的，那么没有任何拷贝的所述核酸天然地存在于所述植物中。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的转基因植物，其中所述基因牵涉于植物的营养或生殖部分(尤其是根、茎、叶或花)的发育之中，并且由引入到植物中的核酸所编码的所述miPEP的表达导致相对于其中未引入所述核酸的相同植物而言所述转基因植物的经改善的生长。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的转基因植物，其中所述miPEP选自由下列组成的组：

-SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:101，

-SEQ ID NO:375至SEQ ID NO:386，或

-SEQ ID NO:424。

在另一个方面，本发明涉及组合物，该组合物以组合方式包含一定数量的植物种子和一定数量的肽，所述肽的序列包含与天然地存在于所述植物中的miPEP的序列相同的序列或由与天然地存在于所述植物中的miPEP的序列相同的序列组成。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的组合物，其中所述miPEP选自由下列组成的组：

-SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:101，

-SEQ ID NO:375至SEQ ID NO:386，或

-SEQ ID NO:424。

在一个实施方案中，本发明涉及组合物，该组合物以组合方式包含一定数量的植物(尤其是拟南芥)种子和一定数量的肽，所述肽的序列包含与AtmiPEP164a1的序列相同的序列或由与AtmiPEP164a1的序列相同的序列组成。

在一个实施方案中，本发明涉及组合物，该组合物以组合方式包含一定数量的植物(尤其是拟南芥)种子和一定数量的肽，所述肽的序列包含与AtmiPEP319a1的序列相同的序列或由与AtmiPEP319a1的序列相同的序列组成。

在一个实施方案中，本发明涉及组合物，该组合物以组合方式包含一定数量的植物(尤其是截形苜蓿)种子和一定数量的肽，所述肽的序列包含与MtmiPEP171b的序列相同的序列或由与MtmiPEP171b的序列相同的序列组成。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的组合物，对其进行配制以便形成经包裹的种子。

所述包裹可以根据在农产品加工工业中常规使用的方法来施行，并且可以通过使用能够在溶剂中或在土地中分解的材料(例如粘结剂或粘土)来获得。

根据本发明，所述包裹可以例如用于将特殊的特性赋予miPEP的组合物，或者赋予与miPEP相组合的种子的组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的组合物，对其进行配制以便形成包含MtmiPEP171b的经包裹的种子。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的组合物，对其进行配制以便形成包含AtmiPEP164a1的经包裹的种子。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的组合物，对其进行配制以便形成包含AtmiPEP319a1的经包裹的种子。

在另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含至少一种：

-上面所定义的miPEP，

-编码所述miPEP的核酸，或

-包含所述核酸的载体，

和药学上可接受的赋形剂。

在另一个方面，本发明涉及组合物，其包含至少一种：

-上面所定义的miPEP，

-编码所述miPEP的核酸，或

-包含所述核酸的载体，

所述组合物用于其作为药物(尤其是用于人或用于动物的药物)的应用。

本发明的组合物的用途可适用于人类医学和兽医学。

在另一个方面，本发明涉及组合物，其包含至少一种：

-上面所定义的miPEP，

-编码所述miPEP的核酸，或

-包含所述核酸的载体，

所述组合物用于其在预防和/或治疗牵涉患者基因表达失调的病理学状况中的应用，

所述基因的表达由微小RNA来进行调控，所述微小RNA的积累由所述miPEP来进行调节。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的组合物，其中所述病理学状况选自癌症、糖尿病、肥胖症、感染性疾病和神经变性疾病。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的组合物，其中所述病理学状况选自癌症、糖尿病、肥胖症、感染性疾病、神经变性疾病、心血管疾病和自身免疫疾病。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的组合物，其中所述病理学状况选自癌症、糖尿病、肥胖症、感染性疾病和神经变性疾病，或者选自心血管疾病和自身免疫疾病。

在一个实施方案中，本发明涉及上面所定义的组合物，其中所述病理学状况选自心血管疾病和自身免疫疾病。

在另一个方面，本发明涉及组合物，其包含至少一种：

-上面所定义的miPEP，

-编码所述miPEP的核酸，或

-包含所述核酸的载体，

所述组合物用于其在预防和/或治疗由寄生生物引起的动物或人的感染中的应用，

所述寄生生物具有其表达由微小RNA来进行调控的基因，所述微小RNA的积累由所述miPEP来进行调节。

在另一个方面，本发明涉及具有4至100个氨基酸或3个氨基酸的miPEP，其由包含在微小RNA的初级转录物中的核苷酸序列所编码，所述miPEP能够调节所述微小RNA在真核细胞中的积累，所述miPEP用于其作为药物的应用。

在另一个方面，本发明涉及特异性地识别miPEP的抗体。

特别地，本发明涉及特异性地识别AtmiPEP165a的抗体。

特别地，本发明涉及特异性地识别MtmiPEP171b的抗体。

特别地，本发明涉及特异性地识别AtmiPEP164a1的抗体。

特别地，本发明涉及特异性地识别AtmiPEP319a1的抗体。

这样的抗体可以由技术人员已知的方法来获得，例如通过将所述miPEP注射到非人动物中以起动由所述动物进行的免疫反应和抗体产生。

在另一个方面，本发明涉及用于对miPEP进行免疫定位的方法，所述方法包括用特异性地识别miPEP的抗体来标记植物的生物学样品的步骤。

特别地，本发明涉及用于借助于特异性地识别AtmiPEP165a的抗体来对AtmiPEP165a进行免疫定位的方法。

特别地，本发明涉及用于借助于特异性地识别MtmiPEP171b的抗体来对MtmiPEP171b进行免疫定位的方法。

特别地，本发明涉及用于借助于特异性地识别AtmiPEP164a1的抗体来对AtmiPEP164a1进行免疫定位的方法。

特别地，本发明涉及用于借助于特异性地识别AtmiPEP319a1的抗体来对MtmiPEP319a1进行免疫定位的方法。

在另一个方面，本发明涉及根据本发明的特异性地识别miPEP的抗体，所述抗体用于其作为药物的应用。

在另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含根据本发明的特异性地识别miPEP的抗体，和药学上可接受的赋形剂。

在另一个方面，本发明涉及用于产生重组肽的实验方案，所述重组肽的序列包含与上面所定义的miPEP的序列相同的序列或由与上面所定义的miPEP的序列相同的序列组成，所述实验方案包括用编码所述重组肽的表达载体转化生物的步骤。

在一个实施方案中，所述生物选自包括下列的组：细菌、酵母、真菌(除酵母之外的)、动物细胞、植物和动物。

在一个实施方案中，所述生物为大肠杆菌(Escherichia coli)。

特别地，本发明涉及上面所定义的用于产生重组肽的实验方案，所述实验方案包括下列步骤：

-将编码所述重组肽的核酸与编码标签(例如GST)的核酸相连接，

-将包含所述编码所述重组肽的核酸的表达载体引入到细菌大肠杆菌中，

-将包含该表达载体的细菌大肠杆菌在LB培养基中进行培养，优选地直至达到0.2至0.4的OD，

-用IPTG来诱导重组肽的产生，优选地进行4至5个小时，

-将所述细菌大肠杆菌进行离心并裂解，

-过滤上清液，

-在谷胱甘肽-Sepharose亲和柱上纯化所述重组肽，

-如果需要，用蛋白酶切割下GST。

在表1、2、3、4、5和6中指明了所有的miPEP、miORF、miR和miR的初级转录物的序列。

表7呈现了pri-miR171b的不同区域的DNA序列的多态性分析(当它与其他单元型相差至少一个氨基酸时，定义出一种单元型)。

下面的附图和实施例将会更好地举例说明本发明，但并不因此而限制本发明的范围。

附图说明

图1.在截形苜蓿中MtmiR171b(在截形苜蓿中鉴定出的miR171b)的过表达对于基因HAM1和HAM2的表达(A)或者对于侧根数目(B)的效应。

(A)纵坐标轴指明了在对照植物中(白色柱)或者在其中过表达MtmiR171b的植物中(黑色柱)，MtmiR171b(左边的柱)、HAM1(中间的柱)或HAM2(右边的柱)的相对表达。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝10)。MtmiR171b的过表达诱导了基因HAM1和HAM2的表达减少。

(B)纵坐标轴指明了在对照植物中(白色柱)或者在其中过表达MtmiR171b的植物中(黑色柱)观察到的侧根的平均数目。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝100)。MtmiR171b的过表达引起了侧根数目减少。

图2.在截形苜蓿中MtmiPEP171b1的过表达对于MtmiR171b以及基因HAM1和HAM2的表达(A)或者对于侧根数目(B)的效应。

(A)纵坐标轴指明了在对照植物中(白色柱)或者在其中过表达MtmiPEP171b1的植物中(黑色柱)，MtmiPEP171b1(左图)、miR171b(右图，左边的柱)、HAM1(登录号MtGI9-TC114268)(右图，中间的柱)或HAM2(登录号MtGI9-TC120850)(右图，右边的柱)的相对表达。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝10)。MtmiPEP171b1的过表达诱导了MtmiR171b的积累增加，以及基因HAM1和HAM2的表达减少。

(B)纵坐标轴指明了在对照植物中(白色柱)或者在其中过表达MtmiPEP171b1的植物中(黑色柱)观察到的侧根的平均数目。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝100)。MtmiPEP171b1的过表达引起了侧根数目减少。

图3.在截形苜蓿中MtmiPEP171b1对于MtmiR171b以及基因HAM1和HAM2的表达(A)和对于侧根数目(B)的效应。

(A)纵坐标轴指明了在对照植物中(白色柱)或者在通过用0.01μM(浅灰色柱)、0.1μM(深灰色柱)或1μM(黑色柱)的MtmiPEP171b1每天浇灌1次并持续5天来进行处理的植物中，MtmiR171b(左边的柱)、HAM1(中间的柱)或HAM2(右边的柱)的相对表达。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝10)。不同浓度的MtmiPEP171b1的施加诱导了MtmiR171b的积累增加，以及基因HAM1和HAM2的表达减少。

(B)纵坐标轴指明了在对照植物中(白色柱)或者在通过用0.1μM的MtmiPEP171b1每天浇灌1次并持续5天来进行处理的植物中(黑色柱)观察到的侧根的平均数目。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝100)。0.1μM的MtmiPEP171b1的施加引起了侧根数目减少。

(C)纵坐标轴指明了在对照植物中(白色柱)或者在通过用0.01μM(灰色柱)、0.1μM(深灰色柱)或1μM(黑色柱)的MtmiPEP171b1或用0.01μM的其氨基酸组成与miPEP171b相同但其序列不同的混杂肽(LIVSHLYSEKFDCMRKILRI，SEQ ID NO:428)(浅灰色柱)每天浇灌1次并持续5天来进行处理的植物中，MtmiR171b(左边的柱)、HAM1(中间的柱)或HAM2(右边的柱)的相对表达。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝10)。

图4.在截形苜蓿中MtmiPEP171b1对于pre-MtmiR171b(A)和MtmiR171b(B)的表达的效应。

纵坐标轴指明了在对照植物中(左边的柱)或者在通过用0.01μM、0.1μM或1μM的MtmiPEP171b1每天浇灌1次并持续5天来进行处理的植物中(右边的柱)，微小RNA的不同形式的前体的相对表达。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝200)。不同浓度的MtmiPEP171b1的施加引起了pre-MtmiR171b(A)和MtmiR171b(B)的积累增加。

图5.在截形苜蓿中MtmiPEP171b1的过表达(A)和MtmiPEP171b1(B)对于微小RNA的不同前体的表达的效应。

纵坐标轴指明了在过表达MtmiPEP171b1的植物中微小RNA的前体的表达与在对照根中这些相同前体的表达之比(A)，或者在用MtmiPEP171b1(0.1μM)进行处理的植物中微小RNA的前体的表达与在对照根中这些相同前体的表达之比(B)。在横坐标轴上从左至右指明了所测试的微小RNA的不同前体，即pre-MtmiR171b(SEQ IDNO:246)、pre-MtmiR169(SEQ ID NO:359)、pre-MtmiR169a(SEQID NO:360)、pre-MtmiR171a(SEQ ID NO:361)、pre-MtmiR171h(SEQ ID NO:362)、pre-MtmiR393a(SEQ ID NO:363)、pre-MtmiR393b(SEQ ID NO:364)、pre-MtmiR396a(SEQ ID NO:365)和pre-MtmiR396b(SEQ ID NO:366)。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝10)。察看到，MtmiPEP171b1仅引起对于MtmiR171b的积累的效应，而不引起对于其他miR的效应。

图6.在模式植物本氏烟草中证明的MtmiPEP171b1的翻译对于MtmiR171b的表达的效应。

纵坐标轴指明了在经转化以表达pri-MtmiR171b(白色柱)或其中密码子ATG被ATT代替的突变型pri-MtmiR171b(黑色柱)的烟草植物中，MtmiR171b的相对表达。因此，突变型pri-MtmiR171b不能够产生MtmiPEP171b1。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝30)。察看到，MtmiPEP171b1的翻译的不存在引起了miR171b的积累强烈减少。

图7.在模式植物本氏烟草中证明的MtmiPEP171b1的过表达对于pre-MtmiR171b的表达的效应。

纵坐标轴指明了在经转化以表达MtmiR171b(左边的柱)，MtmiR171b和MtmiPEP171b1(中央的柱)，或者MtmiR171b和其中起始密码子ATG被ATT代替的MtmiORF171b的突变形式(右边的柱)的烟草植物中，pre-MtmiR171b的相对表达。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝30)。察看到，MtmiPEP171b1的表达增加了MtmiR171b的表达，并且该效应依赖于MtmiORF171b被翻译成MtmiPEP171b1。

图8.在模式植物本氏烟草中证明的MtmiPEP171b1对于pre-MtmiR171b的表达的效应。

纵坐标轴指明了在其上喷洒了2次(在取样前12小时，然后在取样前30分钟)MtmiPEP171b1(0.1μM)(右边的柱)或未喷洒(左边的柱)的经转化以表达MtmiR171b的烟草植物中，MtmiR171b的相对表达。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝6)。通过喷洒来使用的肽MtmiPEP171b1诱导了MtmiR171b的积累增加。

图9.在模式植物本氏烟草中证明的MtmiPEP171b1对于pri-miR171b(A)、pre-MtmiR171b(B)和MtmiR171b(C)的表达的效应。

纵坐标轴指明了在经修饰以表达MtmiR171b(左边的柱)或经修饰以表达MtmiR171b和过表达MtmiPEP171b1(右边的柱，图9A)或者用0.1μM的miPEP171b1(图9B和C)进行处理的烟草植物中，微小RNA的不同形式的前体的相对表达。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝30)。MtmiPEP171b1的过表达或miPEP171b1的施加增加了pri-MtmiR171b(A)、pre-MtmiR171b(B)和MtmiR171b(C)的积累。

图10.在经修饰以表达MtmiPEP171b1的烟草叶细胞中MtmiPEP171b1的定位。

照片显示了经修饰以表达单独的蛋白GFP(左边的图版)或与MtmiPEP171b1相融合的蛋白GFP(右边的图版)的烟草叶细胞。这些观察结果表明，MtmiPEP171b1定位于小核体中。

图11.在烟草的模式植物中证明的AtmiPEP165a(在拟南芥中鉴定出的)的表达对于AtmiR165a的表达的效应(A)，和AtmiPEP319a2(在拟南芥中鉴定出的)的表达对于AtmiR319a的效应(B)。

(A)纵坐标轴指明了在经修饰以表达AtmiR165a(左边的柱)或者表达AtmiR165a和AtmiPEP165a(右边的柱)的烟草植物中，AtmiR165a的相对表达。

(B)纵坐标轴指明了在经修饰以表达AtmiR319a(左边的柱)或者表达AtmiR319a和AtmiPEP319a(右边的柱)的烟草植物中，AtmiR319a的相对表达。

误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝30)。

在这两种情况下均察看到，miORF的表达和因此miPEP的产生引起了pre-miR的积累增加。

图12.用AtmiPEP165a进行的处理对于拟南芥的根生长的效应。

照片显示了两株具有相同年龄的植物：对照植物(左边的植物)和用AtmiPEP165a进行处理的植物(右边的植物)。用AtmiPEP165a进行的处理在拟南芥中引起了非常加快的根生长的表型。绘制的图显示了响应于用剂量渐增的AtmiPEP165a进行处理而发生的pre-miR165的表达。

图13.在果蝇中鉴定出的miPEP8的序列的保守性。

从12个不同果蝇物种的miORF8的序列(SEQ ID NO:208)中推断出miPEP8的序列(SEQ ID NO:104)，并将它们进行比对。直方图显示了在所分析的12个物种中在miORF8的序列之间每个氨基酸的保守性。

图14.在所述果蝇物种中miPEP8的质量(kDa)和等电点(pI)的演变。

左边的纵坐标轴指明了miPEP8的大小(kD)。右边的纵坐标轴指明了miPEP的等电点。横坐标轴指明了miPEP的来源，即果蝇物种。察看到，尽管其大小有重大的改变(大于3倍)，但是在所研究的12个物种中miPEP的电荷保持是非常碱性的(>9.8)。

图15.序列的添加对于miPEP的功能的效应。

对烟草叶进行转化以过表达miPEP171b。这些图显示，序列的添加(His、HA或GFP标签)不改变miPEP的功能。纵坐标轴指明了在经转化以表达MtmiR171b(左边的柱)、MtmiR171b和添加了或没有添加蛋白质标签的MtmiPEP171b1(右边的柱)的烟草植物中，pre-MtmiR171b的相对表达。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝6)。察看到，MtmiPEP171b1的表达增加了MtmiR171b的表达，并且该效应不依赖于标签的存在。

图16.在截形苜蓿的根系中MtmiPEP171b1的表达。

对截形苜蓿的根进行转化以表达蛋白GUS(蓝色)与miR17b的启动子(A、E)、miPEP171b1的ATG(B、F)、整个miPEP171b1(C、G)或ATG2(在miPEP之后，位于前体上的第二个ATG)(D、H)之间的融合物。清楚地看见在根尖(A)以及侧根(E)中的miR的表达。转录融合物(B、F)和翻译融合物(C、G)在相同组织中显示出miPEP171b的表达，而随后的ATG不是有活性的(D、H)。

图17.在黑腹果蝇细胞中DmmiPEP8的表达。

对黑腹果蝇细胞进行转染以过表达DmmiPEP8(OE miPEP8)或者其翻译起始密码子经突变的miPEP8(OE miPEP8mut)。纵坐标轴指明了Pre-miR8的相对表达。误差条相应于平均值的标准误差(独立实验次数＝6)。察看到，DmmiPEP8的表达增加了DmmiR8的表达，并且该效应与mRNA的翻译相关联。

图18.在黑腹果蝇细胞中DmmiPEP8对于DmmiR8的积累的影响。

对黑腹果蝇细胞进行转染以过表达野生型DmmiR8(OE miR8)或者其中翻译起始密码子经突变的DmmiR8(OE miR8miPEP8mut)。纵坐标轴指明了Pre-miR8的相对表达。误差条相应于平均值的标准误差(独立实验次数＝2)。察看到，DmmiPEP8的存在增加了DmmiR8的表达。

图19.在智人细胞中HsmiPEP155对于HsmiR155的积累的影响。

对智人的HeLa细胞进行转染以过表达HsmiPEP155(OEmiPEP155)。纵坐标轴指明了Pre-miR155的相对表达。误差条相应于平均值的标准误差(独立实验次数＝2)。察看到，HsmiPEP155的表达增加了HsmiR155的表达。

图20.在模式植物本氏烟草中证明的MtmiPEP171b1的翻译对于MtmiR171b的表达的效应。

纵坐标轴指明了在经转化以表达pri-miR171b(左边的柱)、其中miORF171b被删除的pri-miR171b(中间的柱)或其中密码子ATG被ATT代替的突变型pri-miR171b(右边的柱)的烟草植物中，MtmiR171b的相对表达。因此，突变型pri-miR171b不能够产生miPEP171b1。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝30)。察看到，miPEP171b1的翻译的不存在引起了miR171b的积累强烈减少。

图21.在模式植物本氏烟草中证明的MtmiPEP171b1的过表达对于MtmiR171b的表达的效应。

纵坐标轴指明了在用下列载体进行转化的烟草植物中MtmiR171b的相对表达：允许miPEP171b表达的载体，和要么第二空载体(白色柱)，要么允许MtmiPEP171b表达的载体(左边的黑色柱)，要么其中编码MtmiPEP171b的ORF的密码子ATG被ATT代替的载体(中间的黑色柱)，要么其中ORF的核苷酸序列经突变但不改变所翻译的肽的氨基酸序列的载体(由简并ORF所编码的miPEP)(右边的黑色柱)。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝30)。察看到，MtmiPEP171b1的表达增加了MtmiR171b的表达，并且该效应依赖于MtmiORF171b被翻译成MtmiPEP171b1。

图22.AtmiPEP165a对于AtmiR165a以及其靶基因(PHAVOLUTA：PHV、PHABOLUSA：PHB和REVOLUTA：REV)的积累的效应。

纵坐标轴指明了在用水(对照)或不同浓度的AtmiPEP165a(0.01μM、0.1μM、1μM或10μM)进行处理的拟南芥根中AtmiR165a、PHV、PHB和REV的相对表达。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝10)。

用浓度越来越高的AtmiPEP165a处理植物证明了随AtmiPEP165a的量而变化的AtmiR165a的积累以及其靶基因的负调控的剂量依赖性效应。

图23.在拟南芥中用AtmiPEP164a进行的处理对于AtmiR164a的表达的效应。

照片显示了在用水(对照，左边的照片)或用0.1μM的溶解在水中的具有与AtmiPEP164a的序列相同的序列的合成肽(0.1μMmiPEP164a)进行处理的根中，AtmiR164a的积累的Northern印迹分析的结果。使用U6RNA作为上样对照，其使得能够定量AtmiR164a的量。

该实验独立地重复4次，并且导致相似的结果。

用0.1μM的miPEP164a处理拟南芥的芽引起了miR164a的积累增加。

图24.用AtmiPEP164a进行的处理对于拟南芥的生长的效应。

照片显示了在生长3周之后的两株植物(顶视图和侧视图)：用水进行浇灌的对照植物(A)，和用0.1μM的相应于AtmiPEP164a的合成肽的组合物进行浇灌的植物(B)。用AtmiPEP164a对拟南芥植物进行浇灌显著地增加了植物的生长。

图25.在拟南芥中用AtmiPEP165a进行的处理对于AtmiR165a的表达的效应。

照片显示了在用水(对照，左边的照片)或用0.1μM的溶解在水中的具有与AtmiPEP165a的序列相同的序列的合成肽(0.1μMmiPEP165a)进行处理的根中，AtmiR165a的积累的Northern印迹分析的结果。使用U6RNA作为上样对照，其使得能够定量AtmiR165a的量。

该实验独立地重复4次，并且导致相似的结果。

用0.1μM的miPEP165a处理拟南芥的芽引起了miR165a的积累增加。

图26.在拟南芥中AtmiPEP319a1的过表达对于AtmiR319a的表达的效应。

纵坐标轴指明了在对照植物中(左边的柱)或者在其中过表达了AtmiPEP319a1的植物中(右边的柱)，AtmiR319a的相对表达。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝10)。AtmiPEP319a1的过表达诱导了AtmiR319a的积累增加。

图27.用AtmiPEP319a进行的处理对于拟南芥的生长的效应。

照片显示了在生长3周之后的两株植物(顶视图和侧视图)：用水进行浇灌的对照植物(A)，和用0.1μM的相应于AtmiPEP319a1的合成肽的组合物进行浇灌的植物(B)。用AtmiPEP319a1对拟南芥植物进行浇灌显著地增加了植物的生长。

图28.免疫定位

对截形苜蓿的根进行转化以表达蛋白GUS(蓝色)与miPEP171b的ATG(Pro_miR171b-ATG1:GUS)或ATG2(在miPEP之后，位于前体上的第二个ATG)(Pro_miR171b-ATG2:GUS)之间的融合物。还用抗-miPEP171b抗体(miPEP171b)来进行标记。在截形苜蓿的根中miPEP171b的免疫定位揭示了在侧根的起始位点中miPEP171b的存在，这显示了微小RNA和相应的miPEP之间的共定位。

图29.在拟南芥中AtmiPEP160b1的过表达对于AtmiR160b的表达的效应。

纵坐标轴指明了在对照植物中(左边的柱)或者在其中过表达了AtmiPEP160b1的植物中(右边的柱)，AtmiR160b的相对表达。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝10)。

AtmiPEP160b1的过表达引起了AtmiR160b的相对表达增加。

图30.AtmiPEP164a1对于AtmiR164a的表达的效应。

纵坐标轴指明了在对照植物中(左边的柱)或者在通过用0.1μM的AtmiPEP164a1每天浇灌1次来进行处理的植物中(右边的柱)，AtmiR164a的相对表达。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝10)。

AtmiPEP164a1的添加引起了AtmiR164a的相对表达增加。

图31.在拟南芥中AtmiPEP319a1的过表达对于AtmiR319a的表达的效应。

纵坐标轴指明了在对照植物中(左边的柱)或者在其中过表达了AtmiPEP319a1的植物中(右边的柱)，AtmiR319a的相对表达。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝10)。

AtmiPEP319a1的过表达引起了AtmiR319a的相对表达增加。

图32.在截形苜蓿中MtmiPEP169d对于MtmiR169d的表达的效应。

纵坐标轴指明了在对照植物中(左边的柱)或者在通过用0.1μM的MtmiPEP169d每天浇灌1次来进行处理的植物中(右边的柱)，MtmiR169d的相对表达。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝10)。

MtmiPEP169d的添加引起了MtmiR169d的相对表达增加。

图33.在截形苜蓿中MtmiPEP171e的过表达对于MtmiR171e的表达的效应。

纵坐标轴指明了在对照植物中(左边的柱)或者在其中过表达了MtmiPEP171e的植物中(右边的柱)，MtmiR171e的相对表达。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝10)。

MtmiPEP171e的过表达引起了MtmiR171e的相对表达增加。

图34.在野生型截形苜蓿植物中MtmiPEP171b1的定位。

通过用特异于MtmiPEP171b1的抗体来进行的免疫印迹，分析了不同量的合成肽MtmiPEP171b1(1、0.5或0.1nmol)以及截形苜蓿的根的总提取物。

MtmiPEP171b1天然地产生于截形苜蓿的根中。

图35.在野生型拟南芥植物中AtmiPEP165a的存在。

上面的照片相应于在野生型拟南芥Col-0的幼小植物中(左)和在过表达AtmiPEP165a的拟南芥的幼小植物中(右)，AtmiPEP165a的量的Western印迹分析。

下面的照片相应于在野生型拟南芥Col-0的幼小植物中(左)和在过表达AtmiPEP165a的拟南芥的幼小植物中(右)，对照蛋白即微管蛋白的量的Western印迹分析。

AtmiPEP165a天然地产生于拟南芥中，并且以更大的量存在于过表达AtmiPEP165a的植物中。

图36.在拟南芥中AtmiPEP165a的作用模式。

(A)纵坐标轴指明了在对照根中(左边的柱)或者在通过用10μM的AtmiPEP165a每天浇灌1次来进行处理的根中(右边的柱)，pri-miR165a的相对表达。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝10)。

AtmiPEP165a的添加引起了AtmiR165a的相对表达增加。

(B)纵坐标轴指明了在对照根中(灰色曲线)或者在通过用10μM的AtmiPEP165a每天浇灌1次来进行处理的根中(黑色曲线)，在蛹虫草菌素(RNA合成的抑制剂)存在下，pri-miR165a的相对表达。横坐标轴指明了蛹虫草菌素处理的持续时间。

AtmiPEP165a的添加没有引起更好的pri-miR165a的稳定性。

(C)纵坐标轴指明了在野生型植物(Col-0)中或者在具有RNA聚合酶II的第二个大亚基的弱等位基因的突变型植物(nrpb2-3)中，pri-miR165a的相对表达。横坐标轴指明了所述植物是用水还是用10μM的AtmiPEP165a进行了浇灌。

与野生型植物相反，突变型植物不能够响应于AtmiPEP165a而积累AtmiR165a。

图37.在截形苜蓿中pri-miR171b对于侧根数目的效应。

纵坐标轴指明了在对照植物中(白色柱)或者在其中过表达了pri-miR171b的植物中(黑色柱)观察到的侧根的平均数目。误差条相应于平均值的标准误差(个体数目＝100)。

pri-miR171b的过表达引起了侧根数目减少。

图38.在黑腹果蝇细胞中DmmiPEP8的可翻译性。

对黑腹果蝇细胞进行转染以过表达DmmiPEP8(miPEP8::GFP)或DmmiPEP8mt(其翻译起始密码子已被突变(miPEP8mt::GFP))。作为转染对照，将产生“膜突蛋白-RFP”这种蛋白质的质粒(下面的图像)与编码DmmiPEP8(左边的图像)和DmmiPEP 8mt(右边的图像)的质粒一起进行共转染。察看到，存在于DmmiPEP8序列中的起始密码子是功能性的，因为它们允许GFP的合成(左上的图像)，而在ATG上经突变的构建体几乎不再产生GFP(右上的图像)。

因此，这些结果暗示，miPEP的ORF是功能性的。

实施例

A：在植物中的miPEP的分析

实施例1－在模式植物截形苜蓿中的表征

实施例1A－MtmiPEP171b1

a)MtmiPEP171b1(在截形苜蓿中鉴定出的miPEP171b1)的鉴 定和表征

在根的分生组织区域中表达微小RNA MtmiR171b。该微小RNA的过表达尤其导致基因HAM1(登录号MtGI9-TC114268)和HAM2(登录号MtGI9-TC120850)的表达减少(图1A)，以及导致侧根数目减少(图1B)。pri-miR171b的过表达也引起侧根数目减少(图37)。

通过使用RACE-PCR技术测定了MtmiR171b的初级转录物的序列。所述初级转录物的序列的分析使得能够鉴定出数个完全出人意料的小的开放阅读框(ORF)的存在。将这些ORF命名为miORF(microRNA ORF)。这些miORF潜在地编码具有大约4至100个氨基酸的短肽。在数据库中未发现任何涉及这些miORF的显著的同源性。

第一个miORF(其被命名为MtmiORF171b)的过表达导致MtmiR171b的积累增加和基因HAM1和HAM2的表达减少(参见图2A)，以及导致侧根数目减少(图2B)，如已经在过表达MtmiR171b时所观察到的那样。

为了测定MtmiORF171b是否导致真正产生肽和上面所观察到的调控功能是否确实由所述肽所携带，在截形苜蓿的根上施加其序列与潜在地由MtmiORF171b所编码的序列相同的合成肽。该肽的施加引起了在上面在过表达MtmiORF171b时已经观察到的表型，即它引起MtmiR171b的积累增加和基因HAM1和HAM2的表达减少(参见图3A)，以及引起侧根数目减少(图3B)。

这些实验的结果证明了，MtmiORF171b编码能够调节MtmiR171b的积累以及MtmiR171b的靶基因(HAM1和HAM2)的表达的肽。将所述肽命名为MtmiPEP171b1(“miPEP”相应于microRNA encoded PEPtide)。

此外，MtPEP171b1引起MtmiR171b(图4A)和pre-MtmiR171b(图4B)的积累增加。

b)miPEP171b1的特异性

测定了截形苜蓿的不同微小RNA前体(MtmiR171b SEQ ID NO:319，MtmiR169SEQ ID NO:367，MtmiR169a SEQ ID NO:368，MtmiR171a SEQ ID NO:369，MtmiR171h SEQ ID NO:370，MtmiR393a SEQ ID NO:371，MtmiR393b SEQ ID NO:372，MtmiR396a SEQ ID NO:373，和MtmiR396b SEQ ID NO:374)的表达，并且在对照植物与其中过表达了编码MtmiPEP171b1的MtmiORF171b的植物之间进行了比较(图5A)，或在对照植物与在包含MtmiPEP171b1的培养基上进行培养的植物之间进行了比较(图5B)。

所获得的结果表明，MtmiPEP171b1仅引起MtmiR171b的积累增加，而不引起其他miR的积累增加，这表明miPEP仅对于其所源自的微小RNA具有效应。

c)miPEP171b1的定位

此外，在截形苜蓿的根中miPEP171b1的免疫定位揭示了在侧根的起始位点中miPEP171b1的存在，这显示了微小RNA和相应的miPEP之间的共定位(图28和34)。

实施例1B－MtmiPEP169d

关于MtmiPEP169d，在截形苜蓿中在体内证明了，MtmiPEP169d的添加引起MtmiR169d的积累(图32)。

实施例1C－MtmiPEP171e

关于MtmiPEP171e，在截形苜蓿中在体内证明了，该miPEP的过表达引起MtmiR171e的积累(图33)。

实施例2－在烟草模式植物中的表征

a)在烟草中机制的保守性

为了测定微小RNA的调控机制在其他植物物种中是否是保守的，在不同的细胞模型中测试了MtmiPEP171b1对MtmiR171b的调控。为此，将MtmiR171b和MtmiPEP171b1引入到烟草叶中。

在经转化以从能够产生MtmiPEP171b1的野生型pri-miR开始或者从不能产生MtmiPEP171b1的突变形式的pri-miR(其中MtmiORF171b的起始密码子ATG被ATT代替)开始表达MtmiR171b的烟草叶中，测量了MtmiR171b的积累(图6和图20)。MtmiPEP171b1的翻译的不存在导致MtmiR171b的积累强烈减少。

在经转化以表达单独的截形苜蓿的MtmiR171b(对照)，或者另外还表达截形苜蓿的野生型MtmiORF171b(35SmiPEP171b1ATG)或其中起始密码子ATG被ATT代替的MtmiORF171b的突变形式(35SmiPEP171b1ATT)的烟草叶中，测量了pre-MtmiR171b的积累(图7和图21)。MtmiORF171b的表达引起pre-miR171b的积累增加，并且pre-miR171b的该积累依赖于MtmiORF171b被翻译成微肽。

同样地，在通过用MtmiPEP171b1(0.1μM)进行喷洒(在取样前12小时第一次，然后在取样前30分钟第二次)来进行处理或未处理的、经转化以表达截形苜蓿的MtmiR171b的烟草叶中，观察到MtmiPEP171b1可以直接以肽的形式通过叶喷洒来进行使用(图8)。

此外，在烟草中观察到(如在截形苜蓿中那样)，MtmiPEP171b1引起了MtmiR171b(图9A)和pre-MtmiR171b(图9B)的积累增加，但减少了pri-MtmiR171b的积累(图9C)。

所有这些结果表明，微小RNA和其靶基因在miPEP控制之下的调控机制在物种之间是保守的。

b)MtmiPEP171b1的细胞内定位

对烟草叶进行转化以过表达与荧光蛋白(GFP)相融合的截形苜蓿的MtmiPEP171b1(图10)。所获得的结果表明，miPEP定位于小核体中。

c)从数据库开始来鉴定miPEP

从植物的基因组数据库开始，搜寻了在70种miR的初级转录物内开放阅读框的存在，我们鉴定出了101种能够编码miPEP的miORF。

目前，已经表征了在拟南芥中鉴定出的AtmiPEP165a和AtmiPEP319a2。在烟草模式植物中进行的实验使得能够证明，AtmiORF165a或AtmiORF319a的过表达分别引起AtmiR165a或AtmiR319a的积累增加(图11)。

miR165a调控转录因子例如Revoluta、Phavoluta和Phabulosa。miR319调控TCP家族的基因。

实施例3－在模式植物拟南芥中的表征

实施例3A－AtmiPEP165a

关于AtmiPEP165a，在拟南芥中在体内证明了，用AtmiPEP165a进行的处理引起非常加快的根生长的表型(图12)。

此外，用浓度越来越高的miPEP165a处理植物表明了随miPEP165A的量而变化的miR165a的积累以及其靶基因(PHAVOLUTA：PHV、PHABOLUSA：PHB和REVOLUTA：REV)的负调控的剂量依赖性效应(参见图22)。

实施例3B－AtmiPEP164a

关于AtmiPEP164a，合成了它并将其用于探究在用该合成肽进行处理的拟南芥根中miR164a的积累的增加。

Northen印迹分析表明，用肽miPEP164a处理植物引起miR164a的积累增加(图23)。

通过qRT-PCR获得了相同类型的结果(图30)。

还在拟南芥中在体内证明了，用AtmiPEP164a处理植物显著地增加植物的生长(图24)。

实施例3C－AtmiPEP165a

关于AtmiPEP165a，合成了它并将其用于探究在用该合成肽进行处理的拟南芥根中miR165a的积累的增加。

Northen印迹分析表明，用肽miPEP165a处理植物引起miR165a的积累增加(图25)。

此外，为了测定miPEP对于其专有的miR的积累的作用模式，在野生型植物中和在经转化以过表达miPEP165a的植物中分析了pri-miR165a的表达(图35)。

pri-miR165a的表达在过表达miPEP165a的植物中得到促进(图36A)。

在蛹虫草菌素(RNA合成的抑制剂)存在下，pri-miR165a的量在野生型植物中与在经转化的植物中是相同的(图36B)，这表明miPEP165a不是作为RNA的稳定剂起作用，而是作为pri-miR165a的转录激活物起作用。

此外，在野生型植物(Col-0植物)中和在携带RNA聚合酶II的第二个大亚基的弱等位基因的突变型植物(nrpb2-3植物)中分析了pri-miR165a的表达。所获得的结果表明，与野生型植物相反，突变型植物没有呈现出响应于miPEP165a而发生的pri-miR165的积累的增加。这看起来表明，miPEP作为转录调节子起作用。

实施例3D－AtmiPEP319a1

关于AtmiPEP319a1，也合成了它并将其用于探究在用该合成肽进行处理的拟南芥根中miR319a的积累的增加。

qRT-PCR分析表明，AtmiPEP319a1的过表达引起miR319a的积累增加(图26和31)。

还在拟南芥中在体内证明了，用AtmiPEP319a1处理植物显著地增加植物的生长(图27)。

实施例3E－AtmiPEP160b1

关于AtmiPEP160b1，在拟南芥中在体内证明了，该miPEP的过表达引起AtmiR160b的积累(图29)。

材料和方法

生物材料

对截形苜蓿的籽的表面进行消毒，并且使所述籽在琼脂平板上在黑暗中于4℃萌发5天。然后，将幼芽在填充有没有氮且包含7.5μM磷酸盐的Fahraeus培养基(Lauresergues等人,Plant J.,72(3):512-22，2012)的12cm的方形平板上进行培养。每天对侧根进行计数。在罐中，每两天一次用包含很少磷的改性Long Ashton培养基对植物进行浇灌(Balzergue等人,Journal of experimental botany,(62)1049-1060,2011)。

所述肽由Eurogentec或Smartox-Biotech来合成。使MtmiPEP171b1悬浮在40％水/50％乙腈/10％乙酸(v/v/v)的溶液中，和将其他肽悬浮在水中。

通过使用不同浓度(0.01、0.1、1μM)的肽溶液来实施经由用所述肽进行喷洒来进行的叶浇灌，其中在取样前12小时第一次，然后在取样前30分钟第二次。

微小RNA的反转录

按照制造商的说明书(除了用3个体积的乙醇来进行RNA的沉淀之外)，通过使用试剂Tri-Reagent(MRC)，提取了RNA。通过与六聚体相组合地使用特异性的茎-环引物RTprimer171b来进行RNA的反转录，以便实施高分子量RNA的反转录。

简而言之，将1μg的RNA添加至在25μl的最终反应混合物中的MIR171b茎-环引物(0.2μM)、六聚体(500ng)、RT缓冲液(1X)、SuperScript逆转录酶(SSIII)(一个单位)、dNTPs(每种0.2mM)、DTT(0.8mM)。为了实施反转录，进行了脉冲式反转录反应(下列循环的40次重复：16℃2分钟、42℃1分钟和50℃1秒，接着为在85℃下最终使反转录失活5分钟)。

定量RT-PCR(qRT-PCR)分析

通过使用提取试剂盒RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)，提取了截形苜蓿根或烟草叶的总RNA。通过使用逆转录酶SuperScript II(Invitrogen)从500ng总RNA开始来进行反转录。进行了三次重复(n＝3)，其中每次具有两次技术重复。每个实验重复二至三次。按照在Lauressergues等人(Plant J.,72(3):512-22,2012)中所描述的方法，通过使用循环变温仪LightCycler 480System(Roche Diagnostics)来进行经由qPCR的扩增。

统计学分析

通过使用Student检验或Kruskal-Wallis检验，分析了基因的相对表达或侧根的产生的平均值。误差条表示平均值的标准误差(SEM，Standard Error of the Mean)。星号指明了显著差异(p<0.05)。

质粒构建

用Pfu聚合酶(Promega)扩增目的DNA片段。按照在Combier等人(Genes&Dev,22:1549-1559,2008)中所描述的方法，将所述DNA片段借助于酶XhoI和NotI而克隆在质粒pPEX-DsRED中以用于在组成型强启动子35S的控制之下进行过表达，和借助于酶KpnI-NcoI而克隆在质粒pPEX GUS中以用于报道基因。

对于miPEP 165a和miPEP 319a，按照在Combier等人(Genes&Dev,22:1549-1559,2008)中所描述的方法，将相应的miORF克隆在pBIN19中。

植物的转化

通过在Boisson-Dernier等人(Mol Plant-Microbe Interact,18:1269-1276,2005)中所描述的方法来获得具有用发根土壤杆菌(Agrobacterium Rhizogenes)进行转化的根的混合式植物。通过用荧光双筒放大镜对DsRED进行观察来验证和选择经转化的根。对照根相应于用不包含载体pPEX-DsRED的发根土壤杆菌进行转化的根。烟草叶的转化按照在Combier等人(Genes&Dev,22:1549-1559,2008)中所描述的方法来进行。

Northern印迹

Northern印迹分析按照在Lauressergues等人,Plant J,72(3):512-22,2012中所描述的实验方案来进行。

将生物学样品在包含0.1M NaCl、2％SDS、50mM Tris-HCl(pH9)、10mM EDTA(PH 8)和20mM巯基乙醇的缓冲液中进行匀浆，并且用酚/氯仿混合物提取RNA 2次并用乙醇使其沉淀。

将RNA加载在15％PAGE凝胶上，并转移到尼龙膜(HybondNX，Amersham)上。使RNA与在其末端经放射性标记的寡核苷酸探针进行杂交，以检测U6RNA或miR164a。

杂交在55℃下进行。杂交信号通过使用感光成像仪(Fuji)来进行定量，并且用U6RNA的特异性探针的信号来进行标准化。

RNA的稳定性

对于每种条件，将2周龄的且垂直培养在固体MS培养基上的植物转移到包含1ml液体MS培养基的6-孔平板中。在与1mM miPEP一起温育16小时后，用100μg/ml的蛹虫草菌素或用水(用作对照)处理植物，并且在不同的时刻收获植物以提取和定量RNA。每个实验进行3次。

组织化学标记

用GUS进行的标记按照在Combier等人(Genes&Dev,22:1549-1559,2008)中所描述的方法来进行。样品用显微镜(axiozoom)来进行观察。

免疫定位

将苜蓿组织的根或胚芽在具有50mM的磷酸盐缓冲液(pH 7.2)的4％***(v/v)中固定2小时，然后包埋在处于水中的5％LMP琼脂糖(具有低熔点)之中。获得薄切片(100μm)并将其置于在包覆有特氟龙的载玻片上的Pbi(用于免疫学的磷酸盐缓冲液(phosphatebuffer for immunology))之中，在Pbi、2％Tween和1％牛血清白蛋白(PbiT-BSA)中封闭2小时，然后在4℃下用在BSA-PbiT中进行稀释的一抗标记过夜(12小时)。将切片用PBiT进行洗涤，并且在环境温度下与在PbiT-BSA中进行稀释的二抗一起温育2小时。然后，将载玻片在Pbi中洗涤30分钟，并安置在Citifluor(封固剂)中。一抗和稀释度为下列：1716a(1:500，v/v)。二抗为与荧光探针AlexaFluor 633相偶联的山羊抗兔IgG抗体(Molecular Probes)，并且以1:1000(v/v)的稀释度进行使用。

Western印迹

按照在Combier等人(Genes&Dev,22:1549-1559,2008)中所描述的方法来获得总蛋白质提取物，并且通过SDS-PAGE来将其分开。转移在4℃下于15V在磷酸盐缓冲液中进行一夜，然后将膜在环境温度下在0.2％(v/v)的戊二醛溶液中温育45分钟。一抗以1:1000(v/v)的稀释度进行使用，和与HRP相缀合的山羊抗兔IgG抗体作为二抗以1:40000(v/v)的稀释度进行使用。

表8.引物的列表

B：在动物中的miPEP的分析

实施例4－在果蝇中候选miPEP的鉴定

a)候选miPEP的鉴定

在模式动物黑腹果蝇中通过RACE-PCR来进行的第一项研究显示了在胚胎发生过程中表达的miR(miR1和miR8)的存在。

如在植物中那样，在两种所研究的miR中的每一种之中鉴定出了miORF。例如，miR8(其由于其在昆虫生长的调控中的作用而为人所知)具有潜在地编码miPEP8的miORF。关于DmmiR1(在黑腹果蝇中鉴定出的)，其具有潜在地编码DmmiPEP1a和DmmiPEP1b的两个DmmiORF。

***发生分析在所分析的十二个果蝇物种之中显示了miORF的存在的进化保守性，即自从它们趋异起已有超过6千万年(图13)。

此外，在果蝇中鉴定出的miPEP还具有几个与植物的miPEP的相似性。如果它们的一级序列和因此它们的大小在物种之间快速演变，那么发现了减小的大小(从32至104aa)，以及关于碱性总电荷的强烈的保守性(9.5至12的pHi)(图14)。

因此，所有这些结果在广谱的真核生物物种之中表明了由微小RNA的初级转录物所编码的调控性miPEP的存在。所发现的这些肽代表了尚未探索的天然分子储库，所述天然分子能够在植物中以及在动物中调控各种各样的基础生物学功能。

b)miPEP的表达

对黑腹果蝇细胞进行转染以过表达DmmiPEP8(从序列SEQ IDNO:494开始)或者其翻译起始密码子经突变的DmmiPEP8mt(从序列SEQ ID NO:495开始)。作为转染对照，将产生“膜突蛋白-RFP”这种蛋白质的质粒与编码DmmiPEP8和DmmiPEP 8mt的质粒一起进行共转染。察看到，存在于DmmiPEP8序列中的起始密码子是功能性的，因为它们允许融合蛋白miPEP::GFP(其通过GFP而可视化)的合成，而在ATG上经突变的构建体几乎不再产生GFP。

因此，这些结果暗示，miPEP的ORF是功能性的(图38)。

材料和方法

黑腹果蝇细胞

在T75瓶中，在12mL的包含1％的100U/mL青霉素和100mg/mL链霉抗生物素蛋白(Sigma)和10％的经去补体的胎牛血清的Schneider培养基(GIBCO)中培养S2细胞(在56℃下30分钟)。

借助于转染试剂盒HD(Roche)，按照其建议来进行瞬时转染。常规地，将150万个预先接种在6-孔平板中(3ml培养基/孔)的S2细胞用250ng的总质粒DNA进行转染。使DNA与处于100μl OPTIMEM(GIBCO)中的Fugene(3μl)相接触。在20分钟后，使所形成的转染试剂与在培养基中的细胞相接触。在转染后66小时，提取细胞的RNA。

编码DmmiPEP8和突变型DmmiPEP8的片段的克隆

通过PCR来扩增相应于DmmiPEP8的序列(SEQ ID NO:494)和在起始密码子上经突变的DmmiPEP8的序列(SEQ ID NO:495)的DNA片段，以用于与GFP相配合地克隆到pUAS质粒中。将昆虫细胞S2用具有下列组分的混合物来进行共转染：编码DmmiPEP8::GFP或其突变形式DmmiPEP8mt::GFP的质粒；允许它们通过在肌动蛋白启动子的控制之下产生的转录因子GAL4来进行过表达的pACT-GAL4；和编码用作转染对照的“膜突蛋白-RFP”这种蛋白质(其也置于肌动蛋白启动子的控制之下)的表达载体(比例1/1/1，总共300ng)。在转染后48小时，通过向培养基中添加甲醛至最终4％(W/V)来将细胞固定10分钟。然后，将细胞用1X PBS漂洗2次，并安置在载玻片上以便在显微镜(Leica SPE)下进行观察。

表9.克隆出的序列

C：在人中的miPEP的表征

实施例5－HsmiPEP155的表征

借助于特异性引物通过PCR来合成或扩增目的DNA片段(HsmiPEP155和突变型miPEP)，然后借助于酶XhoI和NotI将其克隆到允许其通过转录因子GAL4进行过表达的pUAS质粒中，所述转录因子GAL4的表达由组成型强启动子来控制。

不同的构建体要么通过在HeLa细胞的基因组DNA上进行PCR扩增，要么通过在人细胞L428的总RNA上进行RT-PCR来制备。将扩增出的PCR片段用限制酶HindIII/EcoRI进行消化，然后克隆到载体pcDNA3.1中。将大肠杆菌DH5α菌株进行电穿孔，然后在固体培养基(2YT+琼脂+氨苄青霉素)上进行培养。然后，制备不同克隆的质粒DNA，并进行测序以用于验证。然后，借助于QIAfilter PlasmidMidi试剂盒(QIAGEN)来制备构建体，并保存于-20℃。

将HeLa细胞(经建立的肿瘤细胞系，ATCC CCL-2.2)在6-孔平板中在完全培养基[DMEM(1x)+Glutamax+4.5g/L葡萄糖(无丙酮酸)+1x青霉素/链霉素+1mM丙酮酸钠+10％牛血清]中进行培养，并且放置在具有37℃和5％CO₂的培养箱中。

当细胞处于50％的汇合时，转染细胞。在实验开始时，用没有抗生素的完全培养基替代包含抗生素的完全培养基。

对于每个孔，制备混合物A[250μl Optimem(+Glutamax)(Gibco)+2μg DNA]和混合物B[250μl Optimem+4μlLipofectamine 2000(Invitrogen)]，让其在环境温度下静置5分钟。然后，将混合物B逐滴混合到混合物A中，并让其在环境温度下温育25分钟。然后，将该混合物逐滴置放于孔中。在4-5小时后，将培养基进行更换并用具有抗生素的完全培养基来替代。在转染后48小时，使细胞停止。将培养基抽吸出来并除去，用1X PBS漂洗细胞。然后，可能的是将细胞贮存于-20℃或者直接提取总RNA。

对于每个孔，通过在细胞上置放1ml Tri-Reagent(Euromedex)来提取RNA。抽吸和推出Tri-reagent数次以便正确地裂解细胞，然后将其转移到1.5ml的管中。添加0.2ml水饱和氯仿。通过涡旋振荡进行混合，然后让其在环境温度下静置2至3分钟。在4℃下以15300rpm离心5分钟。在环境温度下温育10分钟并且在4℃下以15300rpm离心15分钟后，用0.5ml异丙醇来沉淀水相。去除上清液，并且将粒状沉淀用1ml的70％乙醇来进行漂洗并在4℃下以15300rpm离心5分钟。再次去除上清液，并且将粒状沉淀在空气中干燥几分钟。

为了最好地去除潜在地残留的基因组DNA，用DNA酶处理RNA。为此，将粒状沉淀重悬浮在170μl的超纯水、20μl的10x DNA酶缓冲液和10μl的RQ1无RNA酶的DNA酶中，并且在37℃下放置30分钟。然后，在37℃下在20分钟期间添加20μl的10％SDS和5μl的蛋白酶K(20mg/ml)。

用225μl的“酚/H₂O/氯仿”混合物进行最后的酚提取，并且在4℃下以15300rpm离心5分钟。

然后，在-80℃下用20μl的3M乙酸钠和600μl的100％乙醇来使水相沉淀20分钟。然后，在4℃下以15300rpm离心15分钟。去除上清液。在1ml的70％乙醇中漂洗粒状沉淀，在4℃下以15300rpm离心5分钟，再次去除上清液，并且让粒状沉淀在空气中干燥几分钟。

然后，将粒状沉淀接纳在15-20μl超纯水中，并且测定RNA的含量。

然后，将10-15μg总RNA在15％丙烯酰胺凝胶[40％丙烯酰胺/双丙烯酰胺的溶液，比例19:1]上(在1x TBE中的7M尿素)通过Northern印迹来进行分析。在预热凝胶后，在作为迁移缓冲液的1xTBE中于400V进行迁移。然后，在转移槽中，在1V和4℃下在2小时期间将RNA电转移到0.45μm的Biodyne Plus尼龙膜上。在转移结束时，以0.124J/cm²在UV下对膜进行照射。然后，在杂交烘箱中，将膜在5x SSPE、1x Denhardt’s、1％SDS和150μg/ml酵母tRNA的缓冲液中于50℃预杂交1小时。然后，添加在5’处用^γ_32P-ATP进行标记的核苷酸探针(0.5至1×10⁶cpm/ml杂交缓冲液)，并且在50℃下杂交过夜。然后，将膜在环境温度下在0.1x SSPE/0.1％SDS中洗涤2次，并且暴露在包含BioMax HE屏(Kodak)和BioMax MS胶片(Kodak)的放射自显影盒中，以便在-80℃下检测微小RNA 24-48小时。

Claims (18)

1.用于检测和鉴定由包含在微小RNA的初级转录物序列中的核苷酸序列所编码的微肽(miPEP)的方法，所述方法包括：

a)检测包含在所述微小RNA的初级转录物序列中的具有12至303个核苷酸的开放阅读框的步骤，然后

b)在下列之间进行比较的步骤：

·在由相对于所述开放阅读框的核苷酸序列而言相同或简并的核苷酸序列所编码的肽存在下，所述微小RNA在表达所述微小RNA的指定真核细胞中的积累，其中所述肽不依赖于所述微小RNA的初级转录物的转录而存在于所述细胞中，和

·在所述肽不存在下，所述微小RNA在与上述表达所述微小RNA的指定真核细胞相同类型的真核细胞中的积累，

其中，相对于所述微小RNA在所述肽不存在下的积累而言所述微小RNA在所述肽存在下的积累的调节表明了由所述开放阅读框所编码的微肽的存在。

2.根据权利要求1的用于检测和鉴定miPEP的方法，其中所述微小RNA的积累的调节为所述微小RNA的积累的减少或增加，特别是增加。

3.根据权利要求1或2的用于检测和鉴定miPEP的方法，其中所述肽在所述细胞中的存在是由于：

-将编码所述肽的核酸引入到所述细胞中，或

-将所述肽引入到所述细胞中。

4.根据前述权利要求之一的用于检测和鉴定miPEP的方法，其中步骤a)的所述开放阅读框被包含在所述微小RNA的所述初级转录物的5’或3’部分中，优选地在5’部分中。

5.根据前述权利要求之一的用于检测和鉴定miPEP的方法，其中所述微小RNA存在于野生型植物细胞中或存在于野生型动物细胞中，并且其中在步骤b)中所使用的所述真核细胞为植物细胞，优选地十字花科植物、豆科植物或茄科植物的细胞，或者为动物细胞，优选地人细胞或果蝇细胞。

6.根据前述权利要求之一的用于检测和鉴定miPEP的方法，其中在步骤b)中所使用的所述真核细胞之中，所述微小RNA是内源来源的。

7.根据前述权利要求之一的用于检测和鉴定miPEP的方法，其中在步骤b)中所使用的所述真核细胞之中，所述微小RNA是外源来源的，所述真核细胞包含允许所述微小RNA表达的载体。

8.根据前述权利要求之一的用于检测和鉴定miPEP的方法，其中所述微小RNA的积累通过使用定量RT-PCR、Northern印迹、DNA芯片或RNA芯片来进行测定。

9.由通过实施根据权利要求1至8之一的方法而获得的核苷酸序列所编码的miPEP。

10.具有3至100个氨基酸，优选地4至40个氨基酸的miPEP，其由在包含在微小RNA的初级转录物中的核苷酸序列之中所包含的具有12至303个核苷酸的开放阅读框所编码，所述miPEP能够调节所述微小RNA在真核细胞中的积累，所述核苷酸序列被包含在微小RNA的所述初级转录物的5’或3’部分中，优选地在5’部分中，

其中在观察到在miPEP存在和不存在下的细胞之间微小RNA的数量的变化后，证明了所述miPEP对于所述微小RNA的所述调节。

11.根据权利要求9或10的miPEP，所述miPEP选自由下列组成的肽的组：

-SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:355，

-SEQ ID NO:375至SEQ ID NO:386，或

-SEQ ID NO:424。

12.编码根据权利要求9至11之一所定义的miPEP的核酸分子，所述核酸分子尤其选自由下列组成的核酸的组：

-SEQ ID NO:105至SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:356，

-SEQ ID NO:387至SEQ ID NO:399，或

-SEQ ID NO:425。

13.至少一种：

-根据权利要求9至11之一所定义的miPEP，

-编码所述miPEP的核酸，或

-包含所述核酸的载体，

用于在指定真核细胞中调节基因表达的用途，

所述指定真核细胞能够表达微小RNA，所述微小RNA的初级转录物包含至少一种编码所述至少一种miPEP的核苷酸序列，并且所述微小RNA的积累由所述至少一种miPEP来进行调节，

所述基因的表达由所述微小RNA来进行调控，所述miPEP尤其选自由下列组成的肽的组：

-SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:355，

-SEQ ID NO:375至SEQ ID NO:386，或

-SEQ ID NO:424，

特别地，SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:43、SEQID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:63和SEQID NO:424，

所述核酸尤其选自由下列组成的核酸的组：

-SEQ ID NO:105至SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:356，

-SEQ ID NO:387至SEQ ID NO:399，或

-SEQ ID NO:425，

特别地，SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:425和SEQ ID NO:167，

所述微小RNA尤其选自由下列组成的核酸的组：

-SEQ ID NO:282至SEQ ID NO:354和SEQ ID NO:358，

-SEQ ID NO:412至SEQ ID NO:423，或

-SEQ ID NO:427，

特别地，SEQ ID NO:319、SEQ ID NO:297、SEQ ID NO:305、SEQ ID NO:331、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:322和SEQ ID NO:427。

14.组合物，其包含至少一种：

-根据权利要求9至11之一所定义的miPEP，

-编码所述miPEP的核酸，或

-包含所述核酸的载体，

所述组合物用于其作为人的或兽医学的药物的应用。

15.用于在植物或动物真核细胞，特别是人细胞中调节由微小RNA所调控的基因表达的方法，所述方法包括实施miPEP在所述真核细胞中积累的步骤，

所述miPEP：

-具有3至100个氨基酸，优选地4至20个氨基酸的大小，和

-具有与由包含在调控所述基因的表达的微小RNA的初级转录物中的核苷酸序列所编码的肽序列相同的肽序列，和

-能够调节所述微小RNA的积累，

其中，所述miPEP在所述真核细胞中的积累诱导所述基因的表达相对于在没有所述miPEP的积累的情况下所述基因的表达而言发生调节，

所述方法不用于人或动物身体的手术或治疗性处理，也不用于改变人类的遗传同一性。

16.包含至少一种：

-根据权利要求9至11之一所定义的miPEP，

-编码所述miPEP的核酸，或

-包含所述核酸的载体，

的组合物作为植物药学试剂以便用于下述目的的用途，

-用于促进植物的生长和/或发育，尤其是用于调节植物的生理学参数，特别是生物量、叶表面积、开花、果实大小、植物种子的产生和/或选择，特别地用于控制植物的单性结实或雌雄同株，或用于改变植物种子的生理学参数，特别是萌发、根系建立和对于水分胁迫的抗性，或者

-用于预防或治疗植物疾病，特别地用于促进对于感染性疾病的抗性。

17.包含至少一种：

-根据权利要求9至11之一所定义的miPEP，

-编码所述miPEP的核酸，或

-包含所述核酸的载体，

的组合物作为除草剂以便用于消除植物或减慢其生长的用途。

18.包含至少一种：

-根据权利要求9至11之一所定义的miPEP，

-编码所述miPEP的核酸，或

-包含所述核酸的载体，

的组合物作为杀有害生物剂以便用于消除植物的有害生物或能够被归类为此类的生物的用途，

尤其是作为杀昆虫剂、杀蜘蛛剂、杀软体动物剂或杀啮齿动物剂，

特别地通过将所述组合物施加在植物上或施加在与所述植物相接触的支持物上。