CN111494316B - 一种载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法及其应用 - Google Patents

一种载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法及其应用，包括：(1)将油相、乳化剂和助乳化剂混合后加入聚乙二醇修饰的磷脂，混合均匀，得第一混合液；(2)在第一混合液中加入双硫仑，待双硫仑完全溶解后，得第二混合液；(3)在所述纳米乳液中加入含有原位凝胶剂的超纯水通过自组装，得到载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂。本发明的载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂显著提高了双硫仑的溶解度，具有理想的缓释效果，提高了双硫仑的体内稳定性，具有较高安全性，而且通过鼻腔给药时具有显著的在脑部的富集的特点。

Description

一种载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法及其应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
脑胶质瘤是大脑中最常见的一种恶性肿瘤，也是大脑发病率最高的肿瘤之一。脑胶质瘤浸润性生长的特点，给手术切除带来了巨大困难，且预后差，95％以上会发生再复发。胶质瘤干细胞可通过优先激活DNA损伤反应促进耐辐射。胶质瘤的生长环境也为化疗带来了巨大的挑战。目前治疗脑胶质瘤的一线药物替莫唑胺也存在恶心、呕吐、脱发、骨髓抑制等毒副作用，且易产生耐药性。因此研究新的治疗策略来提高脑胶质瘤的治疗效果刻不容缓。
双硫仑(DSF)已经在临床前研究中被证实对多种肿瘤有效，其具有抑制肿瘤生长，促进肿瘤凋亡，阻止肿瘤细胞的迁移和侵袭，减少血管生成，逆转肿瘤多药耐药，以及抑制肿瘤干细胞等特点，且药物安全毒性低。双硫仑在临床前研究中表现出极具潜力的抗胶质母瘤活性，并且通过与铜离子鳌合，其抗肿瘤活性明显增加。目前双硫仑与铜联合***正处于临床研究中。
双硫仑最早的剂型为片剂，双硫仑具有溶解度低、易降解半衰期短，脑部药物聚集少、口服生物利用度低特点，为了进一步提高其药效，鼻腔给药的脑靶向研究近年来受到了越来越多国内外研究者的关注。药物经鼻给药可以绕过血脑屏障，直接作用到脑部病灶部位，有利于提高药效同时减少对全身的毒副作用，非入侵的给药方式提高患者的依从性。
发明内容
本发明目的是提高双硫仑的水溶性、稳定性以及促进双硫仑在鼻腔吸收，延长双硫仑在体内半衰期，促进双硫仑在脑肿瘤高度富集，这是提高脑胶质瘤的化疗效果的关键技术之一。为此，本发明提供了一种载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法及其应用。该载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂显著提高了双硫仑的溶解度，提高了双硫仑的体内稳定性，而且具有理想的缓释效果，通过鼻腔给药时具有显著的在脑部富集的特点。
为实现上述目的，本发明公开了下述技术方案。
本发明的第一方面，公开一种载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将油相、乳化剂和助乳化剂混合后加入聚乙二醇修饰的磷脂，混合均匀，得第一混合液。
(2)在步骤(1)得到的第一混合液中加入双硫仑，待双硫仑完全溶解后，得到第二混合液。
(3)在所述第二混合液中加入含有原位凝胶剂的超纯水通过自组装，即得载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂。
进一步地，步骤(1)中，所述油相包括油酸、油酸乙酯、蓖麻油、肉豆蔻酸异丙酯、豆油、菜籽油等中任意一种或几种。
进一步地，步骤(1)中，所述乳化剂包括吐温类、司盘类、聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、乳化剂OP、泊洛沙姆、卵磷脂等中任意一种或几种。
进一步地，步骤(1)中，所述助乳化剂包括乙醇、异丙醇、1,2-丙二醇、PEG 400、Transartol HP、正丁醇等中任意一种或几种。
优选地，步骤(1)中，所述油相为油酸乙酯、或肉豆蔻酸异丙酯。所述乳化剂为聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯、或吐温80。所述助乳化剂为Transartol HP。采用上述油相、乳化剂、助乳化剂时，双硫仑在上述油相、乳化剂、助乳化剂中具有更好的溶解性，且各组分之间具有更好的相容性。
进一步地，步骤(1)中，所述聚乙二醇修饰的磷脂，优选DSPE-PEG 2000。通过加入聚乙二醇修饰的磷脂，纳米乳表面被PEG 2000覆盖，提高了双硫仑的溶解度，避免纳米粒子之间的碰撞聚集，提高纳米乳的生物稳定性和生物相容性，降低毒性，降低免疫原性。
进一步地，步骤(1)中，按质量百分数计算，所述油相占比为14％～29％，乳化剂和助乳化剂总占比为71％～86％，PEG修饰的磷脂为乳化剂和助乳化剂总质量的5％～20％。所述乳化剂与助乳化剂质量比为1:1～3:1。
进一步地，步骤(2)中，所述双硫仑在第二混合液中的浓度为0.1mg/mL～70mg/mL，优选10～40mg/mL。当选择上述浓度时能够保证制备的载双硫仑纳米乳具有良好的稳定性，双硫仑的浓度过高时，会导致纳米乳不稳定而发生沉降，且双硫仑从纳米乳中析出。双硫仑的水溶性仅为4.09μg/mL，制备的载双硫仑脂质体原位凝胶剂的最大浓度为1.5mg/mL，但本发明通过对油相、乳化剂、助乳化剂的选择，能够使载双硫仑纳米乳原位凝胶剂的浓度达到20mg/mL，显著提高了双硫仑的水溶性，是载双硫仑脂质体原位凝胶剂水溶性的13倍以上，从而可以显著降低鼻腔给药的用药量，适宜于鼻腔给药量有限的特点。
进一步地，步骤(2)中，通过搅拌或者涡旋或者超声的工艺使双硫仑完全溶解。
进一步地，步骤(2)中，还包括将得到的第二混合液进行离心的步骤，目的是在双硫仑加入过多的情况下通过离心分离出多余的未溶解的双硫仑。
进一步地，步骤(3)中，所述超纯水中含有的原位凝胶剂包括离子敏感型原位凝胶剂(例如：去乙酰化结冷胶、海藻酸钠)、温度敏感型原位凝胶剂(例如：泊洛沙姆、壳聚糖)、pH敏感型原位凝胶剂(例如：卡波姆)中的任意一种或几种。优选地，所述超纯水中含有的原位凝胶剂为去乙酰化结冷胶，优选地，所述超纯水中去乙酰化结冷胶的含量为0.1％～0.5％。本发明制备的载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂是一种带淡蓝色乳光的溶液，加入模拟鼻液后能够迅速转变成凝胶剂，凝胶剂有利于减少鼻腔对药物的清除作用，进一步提高双硫仑在鼻腔的吸收。
进一步地，步骤(3)中，通过涡旋或者震荡完成自组装过程。乳化剂、助乳化剂和DSPE-PEG 2000自组装成类球形结构，将含有双硫仑的油相包裹在球体内部，PEG 2000溶于水，覆盖在球体的表面向水中伸展。
本发明的第二方面，公开所述载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法制备产品在医疗领域中的应用。
与现有技术相比，本发明至少具有以下几方面的有益效果：
(1)本发明载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备工艺稳定、可行，得到的纳米乳原位凝胶剂形态呈纳米尺寸的类球形，表面光滑，粒径分布均一。
(2)本发明将双硫仑制备成纳米乳显著提高了双硫仑的溶解度，防止药物被氧化降解，将双硫仑溶解在第一混合液中后，会进一步被包裹在乳化剂、助乳化剂以及磷脂形成的球体中而形成纳米乳，磷脂表面覆盖聚乙二醇，聚乙二醇是水溶性的，向水中伸展避免纳米乳粒子之间的碰撞及沉降，提高了双硫仑的溶解度，提高纳米乳的生物稳定性和生物相容性，延长药物的半衰期，降低毒性，降低免疫原性。
(3)本发明中双硫仑纳米乳能够有效避免在通过鼻腔给药时双硫仑降解的问题，因为双硫仑通过鼻腔进入人体后，易发生降解，通过将双硫仑包裹后制成纳米乳能够有效避免上述问题，提高双硫仑的体内稳定性，确保双硫仑能够通过鼻腔给药后迅速向脑部病灶部位富集。另外，纳米乳能够增加角质层脂质双层的流动性，促进透皮吸收。
(4)体外释药研究结果表明，本发明制备的载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂有效地实现了药物的缓慢释放，在12h后基本实现药物的完全释放，维持药物在体内的浓度。
(5)体内外实验研究结果表明，本发明制备的载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂具有较高安全性，在体外有较好抗胶质瘤细胞增殖活性，在体内可以将药物经鼻腔转运到脑肿瘤，有效地实现了大鼠C6原位脑胶质瘤模型的肿瘤生长抑制，延长了癌症大鼠的中位生存期。
综上，本发明制备的载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂显著增加药物溶解度，提高药物吸收，提高生物利用度，药物经鼻给药可以绕过血脑屏障，直接作用到脑部病灶部位，提高疗效同时减少全身的毒副作用，非入侵式给药方式提高患者顺应性。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明第五实施例制备的负载双硫仑的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂(DSF-INEG)的TEM图。
图2为本发明第五实施例制备的负载双硫仑的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂(DSF-INEG)的粒径分布图。
图3为本发明第五实施例制备的负载双硫仑的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂(DSF-INEG)的体外释放曲线。
图4为本发明第五实施例制备的负载双硫仑的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂与铜联用(DSF-INEG/Cu)对人脑胶质母瘤细胞U87细胞的体外48h抗肿瘤细胞增殖活性。
图5为本发明第五实施例制备的负载双硫仑的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂与铜联用(DSF-INEG/Cu)对大鼠脑胶质母瘤细胞C6细胞的体外48h抗肿瘤增细胞殖活性。
图6为本发明第五实施例制备的负载双硫仑的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂与铜联用(DSF-INEG/Cu)对SD大鼠C6原位脑胶质瘤模型的生存期的影响。Control为生理盐水鼻腔给药组，即空白组；Intranasal administration为DSF-INEG/Cu鼻腔给药组。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如前文所述，制备一种性质稳定、在脑肿瘤高度富集、高安全性的双硫仑鼻腔给药制剂是提高脑胶质瘤的化疗效果的关键技术之一。因此，本发明提出了一种载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法；现结合说明书附图和具体实施方式对本发明进一步说明。
第一实施例
一种载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法，包括如下步骤：
将150mg肉豆蔻酸异丙酯、330mg乳化剂OP和220mg Transartol HP混合(乳化剂和助乳化剂的比例3:2)，加入28mg的DSPE-PEG 2000，超声3min使其混合均匀，在得到的混合溶液中加入20mg双硫仑，超声3min使其充分溶解，离心分离。加入含0.2％去乙酰化结冷胶的超纯水至2mL，在1500rpm的速率下涡旋，自组装得到负载DSF的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂。
第二实施例
一种载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法，包括如下步骤：
将98mg油酸乙酯、361mg吐温80和241mg Transartol HP混合(乳化剂和助乳化剂的比例3:2)，加入30mg的DSPE-PEG 2000，超声3min使其混合均匀，在得到的混合溶液中加入20mg双硫仑，超声3min使其充分溶解，离心分离。加入含0.2％去乙酰化结冷胶的超纯水至2mL，在1500rpm的速率下涡旋，自组装得到负载DSF的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂。
第三实施例
一种载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法，包括如下步骤：
将200mg油酸乙酯、300mg吐温80和200mg Transartol HP混合(乳化剂和助乳化剂的比例3:2)，加入100mg的DSPE-PEG 2000，超声3min使其混合均匀。将上述混合溶液中加入20mg双硫仑，超声3min使其充分溶解，离心分离。加入含0.2％去乙酰化结冷胶的超纯水至2mL，在1500rpm的速率下涡旋，自组装得到负载DSF的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂。
第四实施例
一种载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法，包括如下步骤：
将150mg油酸乙酯、275mg吐温80和275mg Transartol HP混合(乳化剂和助乳化剂的比例1:1)，加入55mg的DSPE-PEG 2000，超声3min使其混合均匀。将上述混合溶液中加入30mg双硫仑，超声3min使其充分溶解，离心分离。加入含0.1％去乙酰化结冷胶的超纯水至2mL，在1500rpm的速率下涡旋，自组装得到负载DSF的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂。
第五实施例
一种载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法，包括如下步骤：
将150mg油酸乙酯、330mg吐温80和220mg Transartol HP混合(乳化剂和助乳化剂的比例3:2)，加入28mg的DSPE-PEG 2000，超声3min使其混合均匀。将上述混合溶液中加入20mg双硫仑，超声3min使其充分溶解，离心分离。加入含0.2％去乙酰化结冷胶的超纯水至2mL，在1500rpm的速率下涡旋，自组装得到负载DSF的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂。
第六实施例
一种载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法，包括如下步骤：
将150mg油酸乙酯、330mg吐温80和220mg Transartol HP混合(乳化剂和助乳化剂的比例3:2)，加入28mg的DSPE-PEG 2000，超声3min使其混合均匀。将上述混合溶液中加入30mg双硫仑，超声3min使其充分溶解，离心分离。加入含0.5％去乙酰化结冷胶的超纯水至2mL震荡，自组装得到负载DSF的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂。
第七实施例
一种载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法，包括如下步骤：
将150mg肉豆蔻酸异丙酯、412.5mg吐温80和137.5mg Transartol HP混合(乳化剂和助乳化剂的比例3:1)，加入28mg的DSPE-PEG 2000，超声3min使其混合均匀。将上述混合溶液中加入0.1mg双硫仑，超声3min使其充分溶解，离心分离。加入含0.3％去乙酰化结冷胶的超纯水至2mL，在1500rpm的速率下涡旋，自组装得到负载DSF的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂。
第八实施例
一种载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法，包括如下步骤：
将150mg油酸乙酯、330mg吐温80和220mg Transartol HP混合(乳化剂和助乳化剂的比例3:2)，加入28mg的DSPE-PEG 2000，超声3min使其混合均匀。将上述混合溶液中加入40mg双硫仑，超声3min使其充分溶解，离心分离。加入含0.2％去乙酰化结冷胶的超纯水至2mL震荡，自组装得到负载DSF的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂。
第九实施例
一种负载DSF的离子敏感型脂质体原位凝胶剂的制备方法，包括如下步骤：
将120mg卵磷脂、24mg胆固醇、6mg双硫仑溶于900μL无水乙醇中，40℃搅拌加热条件下，加入到4mL的含0.2％去乙酰化结冷胶的超纯水中，搅拌5min后超声3min，即得到负载DSF的离子敏感型脂质体原位凝胶剂。
性能测试
以上述第五实施例制备的负载双硫仑的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂为测试对象，测试结果如图1-6所示。
图1中，负载双硫仑的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂呈类球形结构，表面光滑，粒径分布均一。因为加入PEG修饰的磷脂(DSPE-PEG 2000)，制备的负载双硫仑的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂能够均匀、稳定分散。
图2中，粒径过大或者过小均不利于药物在鼻腔的吸收入脑，通过对负载双硫仑离子敏感型纳米乳原位凝胶剂的各组分比例的筛选，依据三个水平包括溶解度、粒径和PDI优选最佳的制备工艺，动态光散射结果表明本发明制备的负载双硫仑的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂平均粒径为64nm左右，有利于药物在鼻腔的吸收。
图3中，纳米乳和原位凝胶剂均可减慢双硫仑的释放，体外释药研究结果表明，本发明制备的载双硫仑的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂有效地实现了药物的缓慢释放，在12h后基本实现药物的完全释放，维持药物在体内的浓度。
图4中，采用MTT实验来评价DSF-INEG/Cu体外对人的恶性胶质母瘤细胞U87的增殖抑制作用。该实验共分为4组，分别为铜(CuCl2)给药组，空白离子敏感型纳米乳原位凝胶剂(INEG)给药组，载双硫仑的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂与铜联用(DSF-INEG/Cu)给药组以及双硫仑与铜联用(DSF/Cu)给药组(DSF/Cu给药组中双硫仑溶于<0.1％的DMSO中)。结果如图所示，空白离子敏感型纳米乳原位凝胶剂对细胞增殖活性几乎没有影响，这是因为离子敏感型纳米乳原位凝胶剂的组分优选了药典批准的辅料，毒性低，安全性高，双硫仑也具有较高安全性，且制备的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂具有较好的稳定性和生物相容性，因此具有较高安全性。铜对U87细胞的增殖活性几乎没有影响，载双硫仑的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂与铜联用48h可以显著抑制U87细胞的增殖，IC50值为41.77μg/L，由于INEG的转运，其活性较DSF/Cu进一步提高。
图5中，采用MTT实验来评价DSF-INEG/Cu体外对大鼠胶质母瘤细胞C6细胞的增殖抑制作用。该实验共分为4组，分别为铜(CuCl2)给药组，空白离子敏感型纳米乳原位凝胶剂(INEG)给药组，载双硫仑的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂与铜联用(DSF-INEG/Cu)给药组以及双硫仑与铜联用(DSF/Cu)给药组(DSF/Cu给药组中双硫仑溶于<0.1％的DMSO中)。结果如图所示，空白离子敏感型纳米乳原位凝胶剂对细胞增殖活性几乎没有影响，这是因为离子敏感型纳米乳原位凝胶剂的组分优选了药典批准的辅料，毒性低，安全性高，双硫仑也具有较高安全性，且制备的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂具有较好的稳定性和生物相容性，因此具有较高安全性。铜对C6细胞的增殖活性几乎没有影响，载双硫仑的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂与铜联用48h可以显著抑制C6细胞的增殖，IC50值为22.8μg/L，由于INEG的转运，其活性较DSF/Cu进一步提高。
图6中，Control为生理盐水鼻腔给药组，Intranasal administration为DSF-INEG/Cu鼻腔给药组。负载双硫仑的离子敏感型纳米乳原位凝胶剂与铜联用DSF-INEG/Cu可明显延长SD大鼠C6原位脑胶质瘤模型的中位生存期。离子敏感型纳米乳原位凝胶剂，一方面减少鼻腔对药物的清除作用，另一方面纳米乳可以促进药物在鼻腔的吸收，鼻腔给药后药物可绕过血脑屏障直接到达脑肿瘤，实现了药物在脑部的大量富集，有效地实现了肿瘤的生长抑制，从而显著延长原位脑胶质瘤模型大鼠的中位生存期。
对于第九实施例制备的负载双硫仑的离子敏感型脂质体原位凝胶剂，随着双硫仑质量增加，制备的负载双硫仑的离子敏感型脂质体原位凝胶剂的双硫仑的浓度逐渐增加，最高将双硫仑在水中溶解度提升至1.5mg/mL，再增加双硫仑甚至卵磷脂和胆固醇的量，均得到乳白色沉淀，无法得到淡蓝色乳光的离子敏感型脂质体原位凝胶剂。而第五实施例制备的双硫仑离子敏感型纳米乳原位凝胶剂可将双硫仑在水中溶解度提高至20mg/mL，是双硫仑脂质体原位凝胶剂浓度的13倍，从而可以显著降低鼻腔给药的用药量，适宜于鼻腔给药量有限的特点。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将油相、乳化剂和助乳化剂混合后加入聚乙二醇修饰的磷脂，混合均匀，得第一混合液；其中，按质量百分数计算，所述油相占比为14%~29%，乳化剂和助乳化剂总占比为71%~86%，聚乙二醇修饰的磷脂为乳化剂和助乳化剂总质量的5%~20%，所述乳化剂与助乳化剂质量比为1:1~3:1；
（2）在第一混合液中加入双硫仑，待双硫仑完全溶解后，得到第二混合液；
（3）在所述得到第二混合液中加入含有原位凝胶剂的超纯水通过自组装，得到载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂；
其中，所述油相为油酸乙酯或肉豆蔻酸异丙酯；
所述乳化剂为吐温80或乳化剂OP；
所述助乳化剂为Transartol HP；
所述聚乙二醇修饰的磷脂为DSPE-PEG。
2.如权利要求1所述的载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述双硫仑的浓度在第二混合液中为0.1mg/mL~70mg/mL；或者，通过搅拌或者涡旋或者超声的工艺使双硫仑完全溶解。
3.如权利要求2所述的载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述双硫仑的浓度在第二混合液中为10~40mg/mL。
4.如权利要求1所述的载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，还包括将得到的纳米乳液进行离心的步骤。
5.如权利要求1所述的载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述超纯水中含有的原位凝胶剂包括离子敏感型原位凝胶剂、温度敏感型原位凝胶剂、pH敏感型原位凝胶剂中的任意一种或几种。
6.如权利要求5所述的载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法，其特征在于，所述离子敏感型原位凝胶剂包括去乙酰化结冷胶或海藻酸钠，所述温度敏感型原位凝胶剂包括泊洛沙姆或壳聚糖；所述pH敏感型原位凝胶剂包括卡波姆。
7.如权利要求6所述的载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法，其特征在于，所述超纯水中含有的原位凝胶剂为去乙酰化结冷胶。
8.如权利要求7所述的载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法，其特征在于，所述超纯水中去乙酰化结冷胶的含量为0.1%~0.5%。
9.如权利要求1所述的载双硫仑的纳米乳原位凝胶剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，通过涡旋或者震荡完成自组装过程。
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