CN108203719A - 用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物及其高通量筛选方法 - Google Patents

用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物及其高通量筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种科学合理，适用性强的用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物高通量筛选方法；并提供能够阻断NMO‑IgG与星型胶质细胞膜表面AQP4结合诱发的一系列炎症反应，安全可靠，治疗效果佳的用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物，其化学结构式分别如下。

Description

用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物及其高通量筛选方法
技术领域
本发明属于生物学和药学领域，具体地说，是一种用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物及其高通量筛选方法。
背景技术
视神经脊髓炎(neuromyelitis optica,NMO)是一种选择性的累及视神经和脊髓的中枢神经***炎性脱髓鞘疾病。临床上以视神经和脊髓同时或相继受累为主要特征，呈进行性或缓解与复发交替的病程。该病由Devic(1894)首次描述，又被称为Devic病，既往认为NMO是多发性硬化的一个亚型，但随着水通道蛋白AQP4(aquaporin4，AQP4)自身抗体的发现，NMO是独立于多发性硬化的自身免疫性膜通道病，具有其自身的发病机制和临床特点。流行病学资料显示，NMO的患病率约为十万分之一，在西方国家偏低，而亚洲偏高，在任何年龄均可发病，但以20-40岁的女性多见，NMO呈急性或亚急性起病，病情常进展迅速，出现急性横贯性脊髓炎和双侧同时或相继出现的球后视神经炎，导致截瘫和失明，是亚洲青壮年女性致残的主要自身中枢神经***免疫性疾病之一。
NMO的发病机制尚不完全明确，研究表明NMO的主要发病环节是在血清和脑脊液中出现了针对髓鞘星形胶质细胞膜上的水通道蛋白AQP4的自身抗体NMO-IgG，NMO-IgG与AQP4结合导致星形胶质细胞膜上水通道蛋白功能障碍而发病。某些致病因子引起血-脑屏障破坏，血液中的NMO-IgG通过与血脑屏障和星形胶质细胞足突上的水通道蛋白AQP4结合，募集并激活补体，产生补体依赖的细胞毒性作用(CDC)，或者活化效应细胞(如，自然杀伤细胞)产生抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)引起星形胶质细胞损害。同时激活的补体和星形胶质细胞产生的细胞因子可以诱导炎症细胞(如，嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)移行，进一步损害血脑屏障，导致更多的NMO-IgG进入中枢神经***，加剧CDC和ADCC反应、炎症细胞脱颗粒和星形胶质细胞损害，引起继发性少突胶质细胞损伤、髓鞘脱失和轴索损害，从而产生相应的神经功能缺损表现，见图1。因此如何有效地阻断NMO-IgG与星型胶质细胞膜表面AQP4结合，成为NMO治疗的关键。
目前临床上针对NMO的主要治疗方案包括免疫抑制剂(糖皮质激素、硫唑嘌呤等)，免疫调节剂(利妥昔单抗、托珠单抗)，补体阻滞剂(依库珠单抗)和血浆置换等方法。传统的糖皮质激素治疗主要是针对急性复发期的炎性反应，但对控制病程进展和减少神经功能损害无效，糖皮质激素对视网膜的视神经节细胞的存活产生负面影响，且长期激素治疗副作用较多，故限制其使用。硫唑嘌呤等抗代谢类免疫抑制剂也存在很多的不良反应，包括血液***反应(如贫血，白细胞减少、血小板减少等)，消化***反应(如恶心、呕吐等胃肠道症状)，偶见中毒性肝炎、胰腺炎，以及对生殖***的抑制，长期使用还会增加肿瘤发生的机会。血浆交换在有条件的医疗部门可以开展，用于清除患者体内引起疾病的自身抗体、抗原抗体复合物、细胞因子，以及其他炎性有害物质，血浆交换治疗对于缓解急性期的症状有一定疗效，但并不能控制复发及减轻神经功能缺损程度，非特异性的交换会造成血浆中其他非致病成分丢失，其不良反应包括贫血、与肝素相关的血小板减少、增加感染机会等。
以上的治疗方案主要是针对减少NMO-IgG的数量，虽能减轻临床症状，短期控制病情，但存在特异性差，副作用大的缺点，无法从根本上阻止由于NMO-IgG与其抗原AQP4结合这一关键环节所引发的一系列病理过程。
发明内容
本发明的目的是，克服现有技术的不足，提供一种科学合理，适用性强的用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物高通量筛选方法；并提供能够阻断NMO-IgG与星型胶质细胞膜表面AQP4结合诱发的一系列炎症反应，安全可靠，治疗效果佳的用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物。
解决其技术问题之一采用的技术解决方案是，一种用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物高通量筛选方法，其特征是，它包括以下步骤：
1)构建人源AQP4的真核表达载体，选取适合高通量筛选的中国仓鼠肺V79细胞，因为这种细胞贴壁紧，生长速度快，AQP4过表达在其细胞的顶膜上适于筛选阻断抗原抗体相结合的小分子阻断剂，将构建好的人源AQP4的真核表达载体稳定转染到FRT细胞中，在培养基中加入抗生素G418，同时进行有限稀释，直至得到3-5个高表达AQP4的稳定细胞株，利用qPCR、Western Blot以及水通透率检测试验验证稳转细胞株的功能，选取功能性好的稳转细胞株做为筛选的细胞模型；
2)将步骤1)获得的稳转细胞株传代至96孔板上，细胞密度为每孔20000-25000个细胞，培养基为DMEM完全培养液，所述DMEM完全培养液含有10％胎牛血清、2mM/L谷氨酰胺、100U/ml青/链霉素，经12—24小时，细胞汇合度达到90-95％即可检测；
3)弃去DMEM完全培养液，用4％多聚甲醛(w/v)，即4g多聚甲醛/100ml PBS溶液，室温固定5分钟；
4)弃去4％多聚甲醛，用3％BSA(w/v),即3g牛血清白蛋白/100ml PBS溶液作为封闭液，室温封闭30分钟，100ul/孔；
5)每孔中加入0.5μl待筛选的小分子化合物，储液浓度为20mM，终浓度为100μM，室温孵育15分钟；
6)用PBS溶液洗细胞2次，每次1分钟；
7)加入含有NMO-IgG的人源血清,稀释倍数为1:2000)，37℃孵育1小时；
8)用PBS溶液洗细胞3次，每次5分钟；
9)每孔中加入3％H2O2(w/v)溶液50ul，室温孵育45分钟；
10)用PBS溶液洗细胞2次，每次2分钟；
11)加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人二抗,用PBS稀释，稀释倍数为1:1000，室温孵育1小时；
12)用PBS溶液洗细胞3次，每次5分钟；
13)加入辣根过氧化物酶的显色底物ECL，用TECAN多功能酶标仪检测化学发光的强度，其中TECAN的程序设定为：采用终点检测法测定化学发光，整合时间为100毫秒，等待5分钟后，检测每孔的化学发光强度，保存记录。
使用所述用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物高通量筛选方法，其特征是，得到的一种用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物的化学结构式是：
使用所述用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物高通量筛选方法，其特征是，得到的另一种用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物的化学结构式是：
使用所述用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物高通量筛选方法，其特征是，得到的又一种用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物的化学结构式是：
本发明的一种用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物高通量筛选方法的优点在于，细胞筛选模型稳定，构建相对简单；筛选过程不需要高端设备，方法简便易行、结果易于判断，适合对含有大规模的小分子化合物库行进初筛，应用本方法可快速、灵敏和特异地筛选阻断NMO-IgG与AQP4结合的小分子阻断剂，可以经济、高效地获取特异性阻断NMO-IgG与AQP4结合的小分子阻断剂。
本发明的用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物能够阻断NMO-IgG与星型胶质细胞膜表面AQP4结合诱发的一系列炎症反应，用于治疗视神经脊髓炎，具有安全可靠，治疗效果佳等优点。
附图说明
图1为NMO-IgG与AQP4结合的天然小分子阻断剂筛选原理示意图。
图2为pmCherry-N1-AQP4-M23酶切电泳图；
图中，左边为pmCherry-N1-AQP4-M23单酶切电泳，右边为pmCherry-N1-AQP4-M23双酶切电泳。
图3为pmCherry-N1-AQP4-M23测序图；
图中，质粒5’端测序结果显示AQP4-M23成功克隆到载体pmCherry-N1。图中黑框所示为起始密码子。
图4为中国仓鼠肺V79细胞稳定表达AQP4图；
图中，带有红色荧光的为后转进入细胞的AQP4表达，且表达在细胞膜上。
图5为稳定表达AQP4的V79细胞株水通透性测定示意图；
图中，稳定表达AQP4的V79细胞水通透性明显高于对照组。
具体实施方式
下面利用附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。
参照图1所示的NMO-IgG与AQP4结合的天然小分子阻断剂筛选原理示意图，本发明的一种用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物高通量筛选方法，包括以下步骤：
1)构建人源AQP4的真核表达载体，选取适合高通量筛选的中国仓鼠肺V79细胞，因为这种细胞贴壁紧，生长速度快，AQP4过表达在其细胞的顶膜上适于筛选阻断抗原抗体相结合的小分子阻断剂，将构建好的人源AQP4的真核表达载体稳定转染到FRT细胞中，在培养基中加入抗生素G418，同时进行有限稀释，直至得到3-5个高表达AQP4的稳定细胞株，利用qPCR、Western Blot以及水通透率检测试验验证稳转细胞株的功能，选取功能性好的稳转细胞株做为筛选的细胞模型；如图4所示，中国仓鼠肺V79细胞稳定表达AQP4。
2)将步骤1)获得的稳转细胞株传代至96孔板上，细胞密度为每孔20000-25000个细胞，培养基为DMEM完全培养液，所述DMEM完全培养液含有10％胎牛血清、2mM/L谷氨酰胺、100U/ml青/链霉素，经12—24小时，细胞汇合度达到90-95％即可检测；
3)弃去DMEM完全培养液，用4％多聚甲醛(w/v)，即4g多聚甲醛/100ml PBS溶液，室温固定5分钟；
4)弃去4％多聚甲醛，用3％BSA(w/v),即3g牛血清白蛋白/100ml PBS溶液作为封闭液，室温封闭30分钟，100ul/孔；
5)每孔中加入0.5μl待筛选的小分子化合物，储液浓度为20mM，终浓度为100μM，室温孵育15分钟；
6)用PBS溶液洗细胞2次，每次1分钟；
7)加入含有NMO-IgG的人源血清,稀释倍数为1:2000)，37℃孵育1小时；
8)用PBS溶液洗细胞3次，每次5分钟；
9)每孔中加入3％H2O2(w/v)溶液50ul，室温孵育45分钟；
10)用PBS溶液洗细胞2次，每次2分钟；
11)加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人二抗,用PBS稀释，稀释倍数为1:1000，室温孵育1小时；
12)用PBS溶液洗细胞3次，每次5分钟；
13)加入辣根过氧化物酶的显色底物ECL，用TECAN多功能酶标仪检测化学发光的强度，其中TECAN的程序设定为：采用终点检测法测定化学发光，整合时间为100毫秒，等待5分钟后，检测每孔的化学发光强度，保存记录。
参照图2-图5，实施例1，本发明阻断NMO-IgG及其高通量筛选方法，依次包括如下步骤：
(1)构建人源AQP4-M23真核表达载体，抗性为G418：
以AQP4-M23为例，如图2和图3所示，图2为pmCherry-N1-AQP4-M23酶切电泳图；图3为pmCherry-N1-AQP4-M23测序图；图2中，左边为pmCherry-N1-AQP4-M23单酶切电泳，右边为pmCherry-N1-AQP4-M23双酶切电泳；图3中，质粒5’端测序结果显示AQP4-M23成功克隆到载体pmCherry-N1。图中黑框所示为起始密码子。
(2)将上述载体稳定转染入适合高通量筛选的中国仓鼠肺V79细胞中，使中国仓鼠肺V79细胞高表达AQP4-M23蛋白。并且经过3次有限稀释，获取高纯度和高表达效率的中国仓鼠肺V79细胞稳定转染细胞克隆。如图3所示，AQP4-M23稳定表达于中国仓鼠肺V79细胞膜上。中国仓鼠肺V79细胞由北京普天同创生物科技有限公司提供的市售产品。
(3)将验证过的V79-AQP4-M23稳转细胞株细胞传代到黑壁透明底的96孔板，细胞密度为每孔20000-25000个细胞，36h后细胞汇合度达到90％-95％。
(4)弃去DMEM完全培养基，用4％多聚甲醛(w/v,质量/体积，4克多聚甲醛/100mlPBS溶液)室温固定5分钟。
(5)弃去4％多聚甲醛，用3％BSA(w/v,3克牛血清白蛋白/100ml PBS溶液)封闭液，室温封闭30分钟，100ul/孔；
(6)每孔中加入0.5μl待筛选的小分子化合物(储液浓度为20mM)，终浓度为100μM，室温孵育15分钟；用含钙，镁的PBS溶液洗细胞2次，每次1分钟。
(7)加入含有NMO-IgG的人源血清(稀释倍数为1:2000)，37℃孵育1小时。
(8)用PBS溶液洗细胞3次，每次5分钟。
(9)每孔中加入3％H2O2(w/v,由30％的H2O2经过1：10稀释得到)溶液50ul，室温孵育45分钟。
(10)用PBS溶液洗细胞2次，每次2分钟。
(11)加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人二抗(用PBS稀释，稀释倍数为1:1000，抗体来源：圣克鲁斯生物技术有限公司)室温孵育1小时。抗体来源：圣克鲁斯生物技术有限公司)。
(12)用PBS溶液洗细胞3次，每次5分钟。
(13)加入辣根过氧化物酶的显色底物ECL，用TECAN多功能酶标仪检测化学发光的强度，其中TECAN的程序设定为：采用终点检测法测定化学发光，整合时间为100毫秒，等待5分钟后，检测每孔的化学发光强度，保存记录。辣根过氧化物酶的显色底物ECL为市售产品，由赛默飞生物技术有限公司提供。
(14)计算阻断率：阻断百分比＝100×(阴性对照的化学发光的光强度值－测定孔的化学发光的光强度值)/(阴性对照的化学发光的光强度值－阳性对照的化学发光的光强度值)。阳性对照为不加任何小分子化合物的V79-hAQP4-M23稳定转染的细胞，阴性对照为不加任何小分子化合物的中国仓鼠肺V79细胞。
使用所述用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物高通量筛选方法，得到的一种用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物的化学结构式是：
使用所述用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物高通量筛选方法，得到的另一种用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物的化学结构式是：
使用所述用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物高通量筛选方法，得到的又一种用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物的化学结构式是：
本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物高通量筛选方法，其特征是，它包括以下步骤：
1)构建人源AQP4的真核表达载体，选取适合高通量筛选的中国仓鼠肺V79细胞，因为这种细胞贴壁紧，生长速度快，AQP4过表达在其细胞的顶膜上适于筛选阻断抗原抗体相结合的小分子阻断剂，将构建好的人源AQP4的真核表达载体稳定转染到FRT细胞中，在培养基中加入抗生素G418，同时进行有限稀释，直至得到3-5个高表达AQP4的稳定细胞株，利用qPCR、Western Blot以及水通透率检测试验验证稳转细胞株的功能，选取功能性好的稳转细胞株做为筛选的细胞模型；
2)将步骤1)获得的稳转细胞株传代至96孔板上，细胞密度为每孔20000-25000个细胞，培养基为DMEM完全培养液，所述DMEM完全培养液含有10％胎牛血清、2mM/L谷氨酰胺、100U/ml青/链霉素，经12—24小时，细胞汇合度达到90-95％即可检测；
3)弃去DMEM完全培养液，用4％多聚甲醛(w/v)，即4g多聚甲醛/100ml PBS溶液，室温固定5分钟；
4)弃去4％多聚甲醛，用3％BSA(w/v),即3g牛血清白蛋白/100ml PBS溶液作为封闭液，室温封闭30分钟，100ul/孔；
5)每孔中加入0.5μl待筛选的小分子化合物，储液浓度为20mM，终浓度为100μM，室温孵育15分钟；
6)用PBS溶液洗细胞2次，每次1分钟；
7)加入含有NMO-IgG的人源血清,稀释倍数为1:2000)，37℃孵育1小时；
8)用PBS溶液洗细胞3次，每次5分钟；
9)每孔中加入3％H2O2(w/v)溶液50ul，室温孵育45分钟；
10)用PBS溶液洗细胞2次，每次2分钟；
11)加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人二抗,用PBS稀释，稀释倍数为1:1000，室温孵育1小时；
12)用PBS溶液洗细胞3次，每次5分钟；
13)加入辣根过氧化物酶的显色底物ECL，用TECAN多功能酶标仪检测化学发光的强度，其中TECAN的程序设定为：采用终点检测法测定化学发光，整合时间为100毫秒，等待5分钟后，检测每孔的化学发光强度，保存记录。
2.根据权利要求1所述的用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物高通量筛选方法，其特征是，筛选得到的化合物化学结构式是：
3.根据权利要求1所述的用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物高通量筛选方法，其特征是，筛选得到的化合物化学结构式是：
4.根据权利要求1所述的用于治疗视神经脊髓炎的小分子化合物高通量筛选方法，其特征是，筛选得到的化合物化学结构式是：
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