CN107604005A

CN107604005A - VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建方法

Info

Publication number: CN107604005A
Application number: CN201710838043.0A
Authority: CN
Inventors: 马利民; 李志然; 蔡波; 马强; 邢钱伟; 管扬波
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-09-18
Filing date: 2017-09-18
Publication date: 2018-01-19

Abstract

本发明公开了一种VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建方法，包括引物的设计与合成、VEGF和Smad7基因的扩增、质粒构建以及鉴定、慢病毒的包装以及滴度鉴定、Western Blot检测等步骤。本发明成功构建了VEGF和Smad7基因的慢病毒载体，具有较高的滴度和转染效率。

Description

VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建方法

技术领域

本发明涉及一种VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建方法。

背景技术

慢病毒(lentivirus，LV)载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒(HIV-1)为基础而发展的基因治疗载体。与其他病毒载体如腺病毒载体、腺联病毒载体、反转录病毒载体相比，慢病毒具有更广的宿主范围，可感染***细胞以及非***细胞。此外，慢病毒可在体内长期稳定地表达。

目前尚未有VEGF和Smad7双基因的慢病毒载体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有较高的滴度和转染效率的VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建方法。

本发明的技术解决方案是：

一种VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建方法，其特征是：包括下列步骤：

(1)引物的设计与合成

根据GV492慢病毒载体的图谱设计酶切位点为BamHI/AgeI，合成两条引物序列：

fusion gene(22541-1)-P1：5ˊ

-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGTTCAGGACCAAACGATCTGCGC-3ˊ

fusion gene(22541-1)-P2：5ˊ

-TCCTTGTAGTCCATACCCCGCCTTGGCTTGTCACATCTGCAAG-3ˊ；

(2)VEGF和Smad7基因的扩增、质粒构建以及鉴定

以fusion gene(22541-1)-P1和fusion gene(22541-1)-P2为引物进行PCR扩增后获得目的基因产物，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段；将GV492空载体经BamHI/AgeI双酶切，纯化回收后，将回收的目的片段和进过酶切的GV492载体在重组酶ExnaseTMⅡ作用下进行重组反应，重组后产物转化入大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞；用无菌的枪头挑取单个菌落进行PCR鉴定，将鉴定出的阳性克隆转化子接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养12-16h，取菌液进行测序；对测序结果与目的基因序列进行比对分析，将鉴定正确的重组质粒转染293T细胞；

(3)慢病毒的包装以及滴度鉴定

用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养293T细胞，转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度约5×10⁶细胞/15ml，重新接种于10cm细胞培养皿，37℃、5％CO₂培养箱内培养24h，待细胞密度达70％～80％时即可用于转染；转染前2h更换为无血清培养基；向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液：GV载体质粒20μg、pHelper 1.0载体质粒15μg、pHelper 2.0载体质粒10μg，与相应体积的吉凯转染试剂混合均匀，调整总体积为1ml，在室温下温育15min；混合液滴加至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、含5％CO₂培养箱内继续培养48-72h；转染后48h收取病毒，方法如下:用40ml离心管收集上清，4℃4000g离心10min去除细胞碎片；以0.45μm滤过器过滤上清液于40ml超速离心管中，4℃25000rpm离心2h；离心结束后，弃去上清，去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液或PBS或细胞培养基，反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清分装；

滴度检测：“荧光法测定滴度”：①感染病毒前24h，在96孔板中接种293T细胞，每孔接种细胞密度为2×10⁵/500μl，②根据病毒的预期滴度，准备7-10个无菌的EP管,每管中加入90μl的无血清培养基；③取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中,继续相同的操作直到最后一管；④选取所需的细胞孔，弃去90μl培养基，加入90μl稀释好的病毒溶液，培养箱培养；24h后，加入完全培养基100μl；⑤4天后观察荧光表达情况，计算慢病毒的滴度；

药筛法：步骤①-⑤与“荧光法测定滴度”相同；然后感染后72h加入抗性药物puromycin，维持药物浓度5μg/ml；继续培养1天，观察细胞生长状况；

(4)Western Blot检测

感染48h后收集细胞，用预冷的PBS洗涤两次，加入含有蛋白抑制剂PMSF的细胞裂解液PIPA，冰上反应10-15min，4℃、12000g，离心15min，收集上清总蛋白；将提取的上清总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳；300mA恒流将蛋白转移至PVDF膜上，用含5％脱脂牛奶的TBST溶液的封闭液室温封闭PVDF膜1h；1:3000稀释的FLAG抗体4℃培育过夜；TBST洗膜4次，以1：4000稀释的MOUSE抗体室温孵育1.5h，TBST洗膜4次，放射显影检测目的蛋白。

本发明成功构建了VEGF和Smad7基因的慢病毒载体，具有较高的滴度和转染效率。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是PCR扩增VEGF和Smad7基因后琼脂凝胶电泳的鉴定图。

图2是重组质粒的PCR鉴定图；其中：1#：阴性对照(ddH2O)，2#:阴性对照(空载自连对照组)，3#；阳性对照(GAPDH)4#:Marker，5-12#：1-8号转化子。

图3是重组质粒的部分测序结果图。

图4是病毒感染293T后GFP表达图；其中：A白光×200B荧光×200。

图5是western blot检测目的蛋白的表达图；其中：M为Marker；阳性为SURVIVIN-3FLAG-GFP；CON为293T细胞；OE为目的基因质粒转染293T后样品。

图6是阳性克隆测序对比结果示意图。

具体实施方式

1材料与方法

1.1主要材料

限制性内切酶(NEB公司)；Taq polymerase(SinoBio)；Plasmid抽提Kit(Promega)；In-FusionTMPCR Cloning Kit(clontech)；dNTP(Takara)；Primer购于捷瑞生物；GV492载体，BamHI/AgeI酶切，购自上海吉凯基因化学技术有限公司。一抗FLAG购自Sigma公司，二抗Mouse购自santa-cruz公司；1kp DNA ladder Marker购于Fermentas公司。

1.2方法

1.2.1引物的设计与合成

fusion gene(22541-1)-P1：5ˊ-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGTTCAGGACCAAACGATCTGCGC-3ˊ

fusion gene(22541-1)-P2：5ˊ-TCCTTGTAGTCCATACCCCGCCTTGGCTTGTCACATCTGCAAG-3ˊ

1.2.2VEGF和Smad7基因的扩增、质粒构建以及鉴定以fusion gene(22541-1)-P1和fusion gene(22541-1)-P2为引物进行PCR扩增后获得目的基因产物，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段。将GV492空载体经BamHI/AgeI双酶切，纯化回收后，将回收的目的片段和进过酶切的GV492载体在重组酶ExnaseTMⅡ作用下进行重组反应，重组后产物转化入大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞。用无菌的枪头挑取单个菌落进行PCR鉴定，将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养12-16h，取适量菌液进行测序。对测序结果与目的基因序列进行比对分析。将鉴定正确的重组质粒转染293T细胞。

1.2.3慢病毒的包装以及滴度鉴定用DMEM培养基(含10％胎牛血清)培养293T细胞，转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度约5x 10⁶细胞/15ml，重新接种于10cm细胞培养皿，37℃、5％CO₂培养箱内培养。24h待细胞密度达70％～80％时即可用于转染。转染前2h更换为无血清培养基。向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(GV载体质粒20μg、pHelper 1.0载体质粒15μg、pHelper 2.0载体质粒10μg)，与相应体积的吉凯转染试剂混合均匀，调整总体积为1ml，在室温下温育15min。混合液缓慢滴加至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃。缓慢加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、含5％CO₂培养箱内继续培养48-72h。转染后48h收取病毒，方法如下:用40ml离心管收集上清，4℃4000g离心10min去除细胞碎片。以0.45μm滤过器过滤上清液于40ml超速离心管中，4℃25000rpm离心2h。离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液(可用PBS或细胞培养基替代)，轻轻反复吹打重悬。经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清按要求分装。滴度检测：①感染病毒前24h，在96孔板中接种293T细胞，每孔接种细胞密度为2×10⁵/500μl，②根据病毒的预期滴度，准备7-10个无菌的EP管,每管中加入90μl的无血清培养基；③取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中,继续相同的操作直到最后一管④选取所需的细胞孔，弃去90μl培养基，加入90μl稀释好的病毒溶液，培养箱培养；24h后，加入完全培养基100μl，小心操作，不要吹起细胞。⑤4天后观察荧光表达情况，计算慢病毒的滴度。药筛法：①-⑤步骤与“荧光法测定滴度”相同，感染后72h加入抗性药物puromycin，维持药物浓度5μg/ml。继续培养1天，观察细胞生长状况。

1.2.4Western Blot检测

感染48h后收集细胞，用预冷的PBS洗涤两次，加入含有蛋白抑制剂PMSF的细胞裂解液PIPA，冰上反应10-15min，4℃、12000g，离心15min，收集上清总蛋白。将提取的上清总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳。300mA恒流将蛋白转移至PVDF膜上，用封闭液(含5％脱脂牛奶的TBST溶液)室温封闭PVDF膜1h。FLAG抗体(1:3000稀释)4℃培育过夜；TBST洗膜4次，以MOUSE抗体(1：4000稀释)室温孵育1.5h，TBST洗膜4次，放射显影检测目的蛋白。

2结果

2.1目的基因的扩增

设计引物fusion gene(22541-1)-P1：5ˊ-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGTTCAGGACCAAACGATCTGCGC-3ˊ；fusion gene(22541-1)-P2：5ˊ-TCCTTGTAGTCCATACCCCGCCTTGGCTTGTCACATCTGCAAG-3ˊ，扩增目的基因，琼脂糖凝胶电泳结果可2495kp处有特异条带，与预设计PCR产物大小一致。见图1.

2.2成功构建了含有目标融合基因(NM_030858-P2A-NM_001110333)

的重组质粒，重组产物直接进行转化，挑取平板上的单克隆PCR鉴定，对阳性克隆进行测序及结果分析。

PCR鉴定引物

ID	seq
		KL22541-P3	CCGGGCCTCGGTTCCAGAAGG
FLAG-R-2	CCTTATAGTCCTTATCATCGTC

PCR鉴定结果:阳性转化子PCR产物大小：758。

重组质粒的PCR鉴定：见图2.

阳性克隆测序结果及结果分析：

比对结果：见图6。

2.3慢病毒的包装及病毒滴度测定结果三质粒共转染293T细胞后48h，收集浓缩病毒颗粒，将病毒倍比稀释感染293T细胞72h,荧光显微镜可见大量绿色荧光(图4)，提示转染成功，经计算病毒滴度为2×108TU/ml。

2.4western blot检测转染的293T细胞中目的蛋白表达情况结果，见图5。

样品说明：

目的蛋白大小：

目的基因融合蛋白大小：44KD

结论(仅供参考)：

结果说明：P2A完全剪切，将NM_030858-P2A-NM_001110333结构剪切，并且FLAG标签连接在NM_001110333，所以检测到43-55KD之间存在条带，过表达阳性.

3讨论

目前基因导入主要有病毒法和非病毒法，后者无论是物理转导(如电穿孔)，还是化学转导(如脂质体)，均存在转染效率低，基因表达持续时间短等问题，限制其使用。与非病毒载体相比，病毒载体表现出更好的临床潜力，因为它们能够更有效地转移治疗基因并在体内实现长期转基因表达。目前常用的病毒载体主要有腺病毒和慢病毒载体，与前者相比慢病毒除能够感染非***细胞和***细胞外，还具有基因片段容量大，长期表达且安全性较高等优点。基于以上的特点，慢病毒载体逐渐成为最广泛的载体之一。在慢病毒载体中可以根据实验目的不同要求，整合相关的序列标签，通过检测整合标签的表达，可直接检测病毒的转染效率，为目的基因的监测提供了简单有效的方法。传统的慢病毒质粒构建技术必须进行限制性内切酶酶切、连接等复杂的过程，操作非常繁琐，且还需要独一无二兼容的酶切位点。近年来，in-fusion克隆技术的出现使得慢病毒质粒的构建变得简单易行。In-Fusion方法简单高效。首先，设计PCR引物，其与线性化克隆载体末端的序列具有15个碱基的同源性。然后，将这些引物用于PCR扩增***DNA。所得PCR产物用专有的克隆增强子处理，并与In-Fusion克隆反应中的线性化载体组合。与传统克隆技术相比，in-fusion技术不受限制性酶切位点的限制，在一次反应中同时克隆多个片段，无需进行亚克隆等优点。故本研究采用该克隆技术进行慢病毒质粒的构建。

综上，本实验成功构建了VEGF和Smad7基因的慢病毒载体，具有较高的滴度和转染效率。

Claims

1.一种VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建方法，其特征是：包括下列步骤：

（1）引物的设计与合成

根据GV492慢病毒载体的图谱设计酶切位点为BamHI / AgeI，合成两条引物序列：

fusion gene(22541-1)-P2：5ˊ-TCCTTGTAGTCCATACCCCGCCTTGGCTTGTCACATCTGCAAG-3ˊ；

（2） VEGF和Smad7基因的扩增、质粒构建以及鉴定

以fusion gene(22541-1)-P1和fusion gene(22541-1)-P2为引物进行PCR扩增后获得目的基因产物，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段；将GV492空载体经BamHI / AgeI双酶切，纯化回收后，将回收的目的片段和进过酶切的GV492载体在重组酶Exnase™Ⅱ作用下进行重组反应，重组后产物转化入大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞；用无菌的枪头挑取单个菌落进行PCR鉴定，将鉴定出的阳性克隆转化子接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养12-16 h，取菌液进行测序；对测序结果与目的基因序列进行比对分析，将鉴定正确的重组质粒转染293T细胞；

（3）慢病毒的包装以及滴度鉴定

用含10% 胎牛血清的DMEM培养基培养293T细胞，转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度约5×10⁶细胞/15 ml，重新接种于10cm细胞培养皿，37 ℃、5%CO₂培养箱内培养24 h，待细胞密度达70%～80%时即可用于转染；转染前2 h更换为无血清培养基；向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液：GV载体质粒20 μg、pHelper 1.0载体质粒15μg、pHelper 2.0载体质粒10μg，与相应体积的吉凯转染试剂混合均匀，调整总体积为1 ml，在室温下温育15 min；混合液滴加至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养；培养6 h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10 ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；加入含10%血清的细胞培养基20 ml，于37℃、含5% CO₂培养箱内继续培养48-72h；转染后48h收取病毒，方法如下: 用40ml 离心管收集上清，4℃ 4000g离心10min 去除细胞碎片；以0.45μm滤过器过滤上清液于40ml超速离心管中，4℃ 25000rpm 离心2h；离心结束后，弃去上清，去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液或PBS或细胞培养基，反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000 rpm，离心5 min后，取上清分装；

滴度检测：“荧光法测定滴度”：①感染病毒前24 h，在96孔板中接种293T 细胞，每孔接种细胞密度为2×10⁵/500μl，②根据病毒的预期滴度，准备7-10个无菌的EP管,每管中加入90μl的无血清培养基；③取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中,继续相同的操作直到最后一管；④选取所需的细胞孔，弃去90μl培养基，加入90μl稀释好的病毒溶液，培养箱培养；24 h后，加入完全培养基100μl；⑤4天后观察荧光表达情况，计算慢病毒的滴度；

药筛法：步骤①-⑤与“荧光法测定滴度”相同；然后感染后72 h加入抗性药物puromycin，维持药物浓度5μg/ml；继续培养1天，观察细胞生长状况；

（4）Western Blot检测

感染48h后收集细胞，用预冷的PBS洗涤两次，加入含有蛋白抑制剂PMSF的细胞裂解液PIPA，冰上反应10-15min ，4℃、12000 g，离心15 min，收集上清总蛋白；将提取的上清总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳；300mA 恒流将蛋白转移至PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶的TBST 溶液的封闭液室温封闭PVDF膜1h；1:3000稀释的FLAG抗体4℃培育过夜；TBST洗膜4次，以1：4000稀释的MOUSE抗体室温孵育1.5h，TBST洗膜4次，放射显影检测目的蛋白。