CN107604005A - VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建方法 - Google Patents
VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建方法,包括引物的设计与合成、VEGF和Smad7基因的扩增、质粒构建以及鉴定、慢病毒的包装以及滴度鉴定、Western Blot检测等步骤。本发明成功构建了VEGF和Smad7基因的慢病毒载体,具有较高的滴度和转染效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建方法。
背景技术
慢病毒(lentivirus,LV)载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒(HIV-1)为基础而发展的基因治疗载体。与其他病毒载体如腺病毒载体、腺联病毒载体、反转录病毒载体相比,慢病毒具有更广的宿主范围,可感染***细胞以及非***细胞。此外,慢病毒可在体内长期稳定地表达。
目前尚未有VEGF和Smad7双基因的慢病毒载体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有较高的滴度和转染效率的VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建方法。
本发明的技术解决方案是:
一种VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建方法,其特征是:包括下列步骤:
(1)引物的设计与合成
根据GV492慢病毒载体的图谱设计酶切位点为BamHI/AgeI,合成两条引物序列:
fusion gene(22541-1)-P1:5ˊ
-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGTTCAGGACCAAACGATCTGCGC-3ˊ
fusion gene(22541-1)-P2:5ˊ
-TCCTTGTAGTCCATACCCCGCCTTGGCTTGTCACATCTGCAAG-3ˊ;
(2)VEGF和Smad7基因的扩增、质粒构建以及鉴定
以fusion gene(22541-1)-P1和fusion gene(22541-1)-P2为引物进行PCR扩增后获得目的基因产物,琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段;将GV492空载体经BamHI/AgeI双酶切,纯化回收后,将回收的目的片段和进过酶切的GV492载体在重组酶ExnaseTMⅡ作用下进行重组反应,重组后产物转化入大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞;用无菌的枪头挑取单个菌落进行PCR鉴定,将鉴定出的阳性克隆转化子接种于含相应抗生素的LB液体培养基中,37℃培养12-16h,取菌液进行测序;对测序结果与目的基因序列进行比对分析,将鉴定正确的重组质粒转染293T细胞;
(3)慢病毒的包装以及滴度鉴定
用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养293T细胞,转染前24h,用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞,以含10%血清的培养基调整细胞密度约5×106细胞/15ml,重新接种于10cm细胞培养皿,37℃、5%CO2培养箱内培养24h,待细胞密度达70%~80%时即可用于转染;转染前2h更换为无血清培养基;向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液:GV载体质粒20μg、pHelper 1.0载体质粒15μg、pHelper 2.0载体质粒10μg,与相应体积的吉凯转染试剂混合均匀,调整总体积为1ml,在室温下温育15min;混合液滴加至293T细胞的培养液中,混匀,于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养;培养6h后弃去含有转染混和物的培养基,加入10ml的PBS液清洗一次,轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃;加入含10%血清的细胞培养基20ml,于37℃、含5%CO2培养箱内继续培养48-72h;转染后48h收取病毒,方法如下:用40ml离心管收集上清,4℃4000g离心10min去除细胞碎片;以0.45μm滤过器过滤上清液于40ml超速离心管中,4℃25000rpm离心2h;离心结束后,弃去上清,去除残留在管壁上的液体,加入病毒保存液或PBS或细胞培养基,反复吹打重悬;经充分溶解后,高速离心10000rpm,离心5min后,取上清分装;
滴度检测:“荧光法测定滴度”:①感染病毒前24h,在96孔板中接种293T细胞,每孔接种细胞密度为2×105/500μl,②根据病毒的预期滴度,准备7-10个无菌的EP管,每管中加入90μl的无血清培养基;③取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中,混匀后,取10μl加入到第二个管中,继续相同的操作直到最后一管;④选取所需的细胞孔,弃去90μl培养基,加入90μl稀释好的病毒溶液,培养箱培养;24h后,加入完全培养基100μl;⑤4天后观察荧光表达情况,计算慢病毒的滴度;
药筛法:步骤①-⑤与“荧光法测定滴度”相同;然后感染后72h加入抗性药物puromycin,维持药物浓度5μg/ml;继续培养1天,观察细胞生长状况;
(4)Western Blot检测
感染48h后收集细胞,用预冷的PBS洗涤两次,加入含有蛋白抑制剂PMSF的细胞裂解液PIPA,冰上反应10-15min,4℃、12000g,离心15min,收集上清总蛋白;将提取的上清总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳;300mA恒流将蛋白转移至PVDF膜上,用含5%脱脂牛奶的TBST溶液的封闭液室温封闭PVDF膜1h;1:3000稀释的FLAG抗体4℃培育过夜;TBST洗膜4次,以1:4000稀释的MOUSE抗体室温孵育1.5h,TBST洗膜4次,放射显影检测目的蛋白。
本发明成功构建了VEGF和Smad7基因的慢病毒载体,具有较高的滴度和转染效率。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是PCR扩增VEGF和Smad7基因后琼脂凝胶电泳的鉴定图。
图2是重组质粒的PCR鉴定图;其中:1#:阴性对照(ddH2O),2#:阴性对照(空载自连对照组),3#;阳性对照(GAPDH)4#:Marker,5-12#:1-8号转化子。
图3是重组质粒的部分测序结果图。
图4是病毒感染293T后GFP表达图;其中:A白光×200B荧光×200。
图5是western blot检测目的蛋白的表达图;其中:M为Marker;阳性为SURVIVIN-3FLAG-GFP;CON为293T细胞;OE为目的基因质粒转染293T后样品。
图6是阳性克隆测序对比结果示意图。
具体实施方式
1材料与方法
1.1主要材料
限制性内切酶(NEB公司);Taq polymerase(SinoBio);Plasmid抽提Kit(Promega);In-FusionTMPCR Cloning Kit(clontech);dNTP(Takara);Primer购于捷瑞生物;GV492载体,BamHI/AgeI酶切,购自上海吉凯基因化学技术有限公司。一抗FLAG购自Sigma公司,二抗Mouse购自santa-cruz公司;1kp DNA ladder Marker购于Fermentas公司。
1.2方法
1.2.1引物的设计与合成
根据GV492慢病毒载体的图谱设计酶切位点为BamHI/AgeI,合成两条引物序列:
fusion gene(22541-1)-P1:5ˊ-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGTTCAGGACCAAACGATCTGCGC-3ˊ
fusion gene(22541-1)-P2:5ˊ-TCCTTGTAGTCCATACCCCGCCTTGGCTTGTCACATCTGCAAG-3ˊ
1.2.2VEGF和Smad7基因的扩增、质粒构建以及鉴定以fusion gene(22541-1)-P1和fusion gene(22541-1)-P2为引物进行PCR扩增后获得目的基因产物,琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段。将GV492空载体经BamHI/AgeI双酶切,纯化回收后,将回收的目的片段和进过酶切的GV492载体在重组酶ExnaseTMⅡ作用下进行重组反应,重组后产物转化入大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞。用无菌的枪头挑取单个菌落进行PCR鉴定,将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素的LB液体培养基中,37℃培养12-16h,取适量菌液进行测序。对测序结果与目的基因序列进行比对分析。将鉴定正确的重组质粒转染293T细胞。
1.2.3慢病毒的包装以及滴度鉴定用DMEM培养基(含10%胎牛血清)培养293T细胞,转染前24h,用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞,以含10%血清的培养基调整细胞密度约5x 106细胞/15ml,重新接种于10cm细胞培养皿,37℃、5%CO2培养箱内培养。24h待细胞密度达70%~80%时即可用于转染。转染前2h更换为无血清培养基。向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(GV载体质粒20μg、pHelper 1.0载体质粒15μg、pHelper 2.0载体质粒10μg),与相应体积的吉凯转染试剂混合均匀,调整总体积为1ml,在室温下温育15min。混合液缓慢滴加至293T细胞的培养液中,混匀,于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。培养6h后弃去含有转染混和物的培养基,加入10ml的PBS液清洗一次,轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃。缓慢加入含10%血清的细胞培养基20ml,于37℃、含5%CO2培养箱内继续培养48-72h。转染后48h收取病毒,方法如下:用40ml离心管收集上清,4℃4000g离心10min去除细胞碎片。以0.45μm滤过器过滤上清液于40ml超速离心管中,4℃25000rpm离心2h。离心结束后,弃去上清,尽量去除残留在管壁上的液体,加入病毒保存液(可用PBS或细胞培养基替代),轻轻反复吹打重悬。经充分溶解后,高速离心10000rpm,离心5min后,取上清按要求分装。滴度检测:①感染病毒前24h,在96孔板中接种293T细胞,每孔接种细胞密度为2×105/500μl,②根据病毒的预期滴度,准备7-10个无菌的EP管,每管中加入90μl的无血清培养基;③取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中,混匀后,取10μl加入到第二个管中,继续相同的操作直到最后一管④选取所需的细胞孔,弃去90μl培养基,加入90μl稀释好的病毒溶液,培养箱培养;24h后,加入完全培养基100μl,小心操作,不要吹起细胞。⑤4天后观察荧光表达情况,计算慢病毒的滴度。药筛法:①-⑤步骤与“荧光法测定滴度”相同,感染后72h加入抗性药物puromycin,维持药物浓度5μg/ml。继续培养1天,观察细胞生长状况。
1.2.4Western Blot检测
感染48h后收集细胞,用预冷的PBS洗涤两次,加入含有蛋白抑制剂PMSF的细胞裂解液PIPA,冰上反应10-15min,4℃、12000g,离心15min,收集上清总蛋白。将提取的上清总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳。300mA恒流将蛋白转移至PVDF膜上,用封闭液(含5%脱脂牛奶的TBST溶液)室温封闭PVDF膜1h。FLAG抗体(1:3000稀释)4℃培育过夜;TBST洗膜4次,以MOUSE抗体(1:4000稀释)室温孵育1.5h,TBST洗膜4次,放射显影检测目的蛋白。
2结果
2.1目的基因的扩增
设计引物fusion gene(22541-1)-P1:5ˊ-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGTTCAGGACCAAACGATCTGCGC-3ˊ;fusion gene(22541-1)-P2:5ˊ-TCCTTGTAGTCCATACCCCGCCTTGGCTTGTCACATCTGCAAG-3ˊ,扩增目的基因,琼脂糖凝胶电泳结果可2495kp处有特异条带,与预设计PCR产物大小一致。见图1.
2.2成功构建了含有目标融合基因(NM_030858-P2A-NM_001110333)
的重组质粒,重组产物直接进行转化,挑取平板上的单克隆PCR鉴定,对阳性克隆进行测序及结果分析。
PCR鉴定引物
ID | seq |
KL22541-P3 | CCGGGCCTCGGTTCCAGAAGG |
FLAG-R-2 | CCTTATAGTCCTTATCATCGTC |
PCR鉴定结果:阳性转化子PCR产物大小:758。
重组质粒的PCR鉴定:见图2.
阳性克隆测序结果及结果分析:
比对结果:见图6。
2.3慢病毒的包装及病毒滴度测定结果三质粒共转染293T细胞后48h,收集浓缩病毒颗粒,将病毒倍比稀释感染293T细胞72h,荧光显微镜可见大量绿色荧光(图4),提示转染成功,经计算病毒滴度为2×108TU/ml。
2.4western blot检测转染的293T细胞中目的蛋白表达情况结果,见图5。
样品说明:
目的蛋白大小:
目的基因融合蛋白大小:44KD
结论(仅供参考):
结果说明:P2A完全剪切,将NM_030858-P2A-NM_001110333结构剪切,并且FLAG标签连接在NM_001110333,所以检测到43-55KD之间存在条带,过表达阳性.
3讨论
目前基因导入主要有病毒法和非病毒法,后者无论是物理转导(如电穿孔),还是化学转导(如脂质体),均存在转染效率低,基因表达持续时间短等问题,限制其使用。与非病毒载体相比,病毒载体表现出更好的临床潜力,因为它们能够更有效地转移治疗基因并在体内实现长期转基因表达。目前常用的病毒载体主要有腺病毒和慢病毒载体,与前者相比慢病毒除能够感染非***细胞和***细胞外,还具有基因片段容量大,长期表达且安全性较高等优点。基于以上的特点,慢病毒载体逐渐成为最广泛的载体之一。在慢病毒载体中可以根据实验目的不同要求,整合相关的序列标签,通过检测整合标签的表达,可直接检测病毒的转染效率,为目的基因的监测提供了简单有效的方法。传统的慢病毒质粒构建技术必须进行限制性内切酶酶切、连接等复杂的过程,操作非常繁琐,且还需要独一无二兼容的酶切位点。近年来,in-fusion克隆技术的出现使得慢病毒质粒的构建变得简单易行。In-Fusion方法简单高效。首先,设计PCR引物,其与线性化克隆载体末端的序列具有15个碱基的同源性。然后,将这些引物用于PCR扩增***DNA。所得PCR产物用专有的克隆增强子处理,并与In-Fusion克隆反应中的线性化载体组合。与传统克隆技术相比,in-fusion技术不受限制性酶切位点的限制,在一次反应中同时克隆多个片段,无需进行亚克隆等优点。故本研究采用该克隆技术进行慢病毒质粒的构建。
综上,本实验成功构建了VEGF和Smad7基因的慢病毒载体,具有较高的滴度和转染效率。
Claims (1)
1.一种VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建方法,其特征是:包括下列步骤:
(1)引物的设计与合成
根据GV492慢病毒载体的图谱设计酶切位点为BamHI / AgeI,合成两条引物序列:
fusion gene(22541-1)-P1:5ˊ-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGTTCAGGACCAAACGATCTGCGC-3ˊ
fusion gene(22541-1)-P2:5ˊ-TCCTTGTAGTCCATACCCCGCCTTGGCTTGTCACATCTGCAAG-3ˊ;
(2) VEGF和Smad7基因的扩增、质粒构建以及鉴定
以fusion gene(22541-1)-P1和fusion gene(22541-1)-P2为引物进行PCR扩增后获得目的基因产物,琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段;将GV492空载体经BamHI / AgeI双酶切,纯化回收后,将回收的目的片段和进过酶切的GV492载体在重组酶Exnase™Ⅱ作用下进行重组反应,重组后产物转化入大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞;用无菌的枪头挑取单个菌落进行PCR鉴定,将鉴定出的阳性克隆转化子接种于含相应抗生素的LB液体培养基中,37℃培养12-16 h,取菌液进行测序;对测序结果与目的基因序列进行比对分析,将鉴定正确的重组质粒转染293T细胞;
(3) 慢病毒的包装以及滴度鉴定
用含10% 胎牛血清的DMEM培养基培养293T细胞,转染前24 h,用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞,以含10%血清的培养基调整细胞密度约5×106细胞/15 ml,重新接种于10cm细胞培养皿,37 ℃、5%CO2培养箱内培养24 h,待细胞密度达70%~80%时即可用于转染;转染前2 h更换为无血清培养基;向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液:GV载体质粒20 μg、pHelper 1.0载体质粒15μg、pHelper 2.0载体质粒10μg,与相应体积的吉凯转染试剂混合均匀,调整总体积为1 ml,在室温下温育15 min;混合液滴加至293T细胞的培养液中,混匀,于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养;培养6 h后弃去含有转染混和物的培养基,加入10 ml的PBS液清洗一次,轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃;加入含10%血清的细胞培养基20 ml,于37℃、含5% CO2培养箱内继续培养48-72h;转染后48h收取病毒,方法如下: 用40ml 离心管收集上清,4℃ 4000g离心10min 去除细胞碎片;以0.45μm滤过器过滤上清液于40ml超速离心管中,4℃ 25000rpm 离心2h;离心结束后,弃去上清,去除残留在管壁上的液体,加入病毒保存液或PBS或细胞培养基,反复吹打重悬;经充分溶解后,高速离心10000 rpm,离心5 min后,取上清分装;
滴度检测:“荧光法测定滴度”:①感染病毒前24 h,在96孔板中接种293T 细胞,每孔接种细胞密度为2×105/500μl,②根据病毒的预期滴度,准备7-10个无菌的EP管,每管中加入90μl的无血清培养基;③取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中,混匀后,取10μl加入到第二个管中,继续相同的操作直到最后一管;④选取所需的细胞孔,弃去90μl培养基,加入90μl稀释好的病毒溶液,培养箱培养;24 h后,加入完全培养基100μl;⑤4天后观察荧光表达情况,计算慢病毒的滴度;
药筛法:步骤①-⑤与“荧光法测定滴度”相同;然后感染后72 h加入抗性药物puromycin,维持药物浓度5μg/ml;继续培养1天,观察细胞生长状况;
(4)Western Blot检测
感染48h后收集细胞,用预冷的PBS洗涤两次,加入含有蛋白抑制剂PMSF的细胞裂解液PIPA,冰上反应10-15min ,4℃、12000 g,离心15 min,收集上清总蛋白;将提取的上清总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳;300mA 恒流将蛋白转移至PVDF膜上,用含5%脱脂牛奶的TBST 溶液的封闭液室温封闭PVDF膜1h;1:3000稀释的FLAG抗体4℃培育过夜;TBST洗膜4次,以1:4000稀释的MOUSE抗体室温孵育1.5h,TBST洗膜4次,放射显影检测目的蛋白。
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108642087A (zh) * | 2018-05-23 | 2018-10-12 | 宁夏医科大学 | 一种能够稳定表达EGFP基因和Purα基因的细胞系的构建方法 |
CN109825527A (zh) * | 2018-10-23 | 2019-05-31 | 深圳市慧思基因科技有限公司 | 一种myct-1基因慢病毒表达载体的构建及鉴定方法 |
CN110447601A (zh) * | 2019-08-09 | 2019-11-15 | 南京医科大学 | 一种靶向巨噬细胞过表达基因小鼠模型的制备方法 |
CN111235115A (zh) * | 2020-02-25 | 2020-06-05 | 南京鼓楼医院 | 一种重组间充质干细胞及其制备方法和在制备治疗急性肝衰竭药物的应用 |
US20220227828A1 (en) * | 2021-01-19 | 2022-07-21 | Institute Of Animal Sciences Of Chinese Academy Of Agricultural Sciences | Method for overexpressing il-15 in porcine skeletal myoblasts and use thereof |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101912618A (zh) * | 2010-08-09 | 2010-12-15 | 祝荫 | 携带nk4基因的骨髓间充质干细胞的制备方法及其应用 |
CN102212535A (zh) * | 2011-04-08 | 2011-10-12 | 单云峰 | 大鼠GSK-3β目的基因过表达慢病毒载体构建与鉴定 |
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2017
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101912618A (zh) * | 2010-08-09 | 2010-12-15 | 祝荫 | 携带nk4基因的骨髓间充质干细胞的制备方法及其应用 |
CN102212535A (zh) * | 2011-04-08 | 2011-10-12 | 单云峰 | 大鼠GSK-3β目的基因过表达慢病毒载体构建与鉴定 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
MANUEL A.等: "Rapid and sensitive lentivirus vector-based conditional gene expression assay to monitor and quantify cell fusion activity", 《PLOS ONE》 * |
YYPJHL: "过表达慢病毒载体构建和包装手册", 《HTTPS://WENKU.BAIDU.COM/VIEW/0BB2042AE2BD960590C67760.HTML?FROM=SEARCH》 * |
崔岳: "Per2节律基因对A549 肺癌细胞侵袭迁移能力的影响及其相关分子的实验研究", 《万方数据库》 * |
连耀国 等: "VEGF对上皮间充质转化的抑制与Smad信号途径及SnoN表达的变化", 《北京医学》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108642087A (zh) * | 2018-05-23 | 2018-10-12 | 宁夏医科大学 | 一种能够稳定表达EGFP基因和Purα基因的细胞系的构建方法 |
CN109825527A (zh) * | 2018-10-23 | 2019-05-31 | 深圳市慧思基因科技有限公司 | 一种myct-1基因慢病毒表达载体的构建及鉴定方法 |
CN110447601A (zh) * | 2019-08-09 | 2019-11-15 | 南京医科大学 | 一种靶向巨噬细胞过表达基因小鼠模型的制备方法 |
CN111235115A (zh) * | 2020-02-25 | 2020-06-05 | 南京鼓楼医院 | 一种重组间充质干细胞及其制备方法和在制备治疗急性肝衰竭药物的应用 |
US20220227828A1 (en) * | 2021-01-19 | 2022-07-21 | Institute Of Animal Sciences Of Chinese Academy Of Agricultural Sciences | Method for overexpressing il-15 in porcine skeletal myoblasts and use thereof |
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PB01 | Publication | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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